1.本发明所属领域 本发明涉及复制缺陷性肝炎病毒。具体地说，本发明是涉及自身不能复制的缺陷性肝炎病毒，但其前基因组RNA能够在适当辅助病毒功能存在下被包装并反转录成DNA。在特定实施方案中，这种病毒的基因组DNA可能有env、pol和/或core基因的缺失。本发明还涉及肝炎病毒包装基因组，其编码的前基因组RNA本身不能被包装和/或反转录成双股DNA基因组，但能够反过来为包装提供必要的病毒功能。可将本发明的表达免疫原性抗原决定基的缺陷性肝炎病毒配制成疫苗，作为免疫刺激用以产生抗肝炎病毒抗原的免疫反应。
本发明还涉及包含异源基因顺序的缺陷性肝炎病毒。在本发明的一个实施方案中，可用这些重组病毒对肝脏酶的遗传缺陷进行基因治疗，或由肝脏产生来取代酶缺乏。在本发明的另一实施方案中，可将包含异源基因顺序的重组肝炎病毒配制成疫苗，用以防止由病原微生物或该生物体的抗原引起的感染。
本发明还涉及永久性肝细胞系的产生和维持，这些细胞系已用本发明的缺陷性肝炎病毒进行了稳定转染，并能产生传染性缺陷性肝炎病毒颗粒。
也可将本发明的缺陷性肝炎病毒配制成治疗用地干扰剂，用以阻止野生型病毒感染的扩散和维持。
2.本发明的背景
2.1.肝炎病毒
2.1.1.肝炎病毒的结构
肝炎病毒包括人乙型肝炎病毒（HBV）（Barker et al.，1975，Am.J.Med.Sci.270：189-196），旱獭乙型肝炎病毒（WHBV）（Ogston et al.，1982，Cell 29：385-94）、鸭乙型肝炎病毒（DHBV）（Summers and Nason，1982，Cell 29：403-415），及地松鼠乙型肝炎病毒（GSHBV）（Narion et al.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：2491-2495），这类病毒有肝细胞趋向性，可导致持久性感染并具有共同结构。已在被感染生物体的血液中检出高浓度的肝炎病毒。肝炎病毒颗粒由被膜和核蛋白壳组成，直径约42nm（参见Ganem and Varmus，1987，Ann.Rev.Biochem.56：651-693;Tiollais et al.，1985，Nature（London）317：489-495）。被膜含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及碳水化合物和脂质。核蛋白壳含有环形DNA（3.0-3.3kb）、DNA聚合酶、蛋白激酶活性和乙型肝炎核心抗原（HBcAg）
肝炎病毒基因组是一小的、环状的、部分双股的DNA分子（参见Ganem and Varmus，上述文献;Tiollais et al.，上述文献）。负股是有固定长度的线性DNA，长3-3.2kb。反之，正链则有可变的长度，范围为负股的50-100%。
对肝炎病毒克隆基因组之核苷酸顺序的分析结果表明，除DHBV外负股均含有四个主要开放读码（ORFs），即S、C、P和X（参见Ganem and Varmus;Tiollais et al.，上述文献）。DHBV含有S、C和P ORFs（见图1）。编码HBsAg的ORF S可分为S基因、前S1区和前S2区。相似地，编码HBcAg的ORF C则分为C基因和前C区。ORF P编码病毒聚合酶。ORF X可能编码长154个氨基酸的多肽，有关ORF X的功能目前尚不明了。
肝炎病毒基因组的复制包括四个主要步骤（参见Ganem and Varmus，上述文献;Mason at al.，1987，Adv.Virus Res.32：35-96;Seeger et al.，1986，Nature（London）232：477-484）。第一步是在被感染细胞的核内将病毒粒子中的不对称DNA转化为共价闭环DNA。然后由RNA聚合酶Ⅱ转化共价闭环DNA，产生两种RNA，即基因组和亚基因组RNA。基因组RNA（3.5kb）包含完整的病毒遗传信息，故可用作复制模板和mRNA。亚基因组RNA长2.1和2.4kb，很可能是前S1（2.4kb转录本）和前S2及S蛋白（2.1kb转录本）的mRNA。
然后使用病毒聚合酶和蛋白质引物通过前基因组RNA的反向转录合成负股DNA。一般认为负股DNA合成的起始位点出现了短顺即DRI（直接重复1）内。
最后一步是使用病毒相关聚合酶加寡核苷酸引物经拷贝负股模板而合成正股DNA。DR1和DR2在这一步骤中起着重要作用（详见Ganem和Varmus，上述文献;Seeger et al.，1986，Nature（London）232：477-484;Mason et al.，1987，Adv.Virus Res.32：35-96）。该步骤显然要使用得自前基因组RNA之5′部分的RNA引物。该引物含有已被退火为负股中之DR2顺序的DR1顺序（Madson et al.，1987，Adv.Virus Res.32：35-96），从而得以引导正链合成。正链合成可进行不同的距离，并常常在完全拷贝负链之前终止。
已用重组DNA技术研究了乙型肝炎病毒基因组的结构和表达。英国专利GB2034323A号（1980年6月4日公开）已报导了在用克隆的HBV DNA和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因共转化小鼠细胞后HBV表面抗原的表达和表面抗原颗粒的分泌。Moriarty等人（1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2606-2610）描述含编码HBsAg之HBV DNA片段的重组猴肾病毒的构建和表达;已证明22nm表面抗原颗粒可被分泌到细胞培养基中。欧洲专利公开0020251号（1980年12月10日公开）描述了含有自Dane颗粒中分离的编码有HBV抗原性之蛋白质的HBV DNA片段的重组DNA载体。
2.1.2.肝炎病毒感染的生物学
已观察到HBV感染具有高度多态性，可由不明显的感染（即病人肝脏只受到轻微感染或没有损伤）到急性乙型肝炎（为一种以肝细胞损伤和炎症为特征的较为严重的疾病），以致到严重的慢性肝病（参见Ganem and Varmus，1987，Ann.Rev.Biochem.56：651-693）。病毒本身似乎是无细胞毒性的。宿主对病毒感染之细胞的免疫反应变化，是决定病人肝损伤程度的一个主要因素。在急性和慢性HBV感染期间，可观察到机体对HBcAg和HBsAg的体液和细胞免疫反应（参见Robinson，1986，In Fundamental Virology，Fields，B.N.and Knipe，D.M.（eds.），Raven Press，N.Y.，pp.657-679）。已观察到其他肝炎病毒也主要是趋向肝细胞的，并可导致持久性病毒感染。观察到慢性活动性肝炎是由于HBV和WHBV感染的结果。
除感染肝细胞外，在非肝组织如肾、胰脏及皮肤中也已检测出HBV DNA（Robinson，上述文献）。在被感染之北京鸭的肾和胰脏中也检测到游离的病毒DNA。也发现在外周血白细胞和骨髓细胞中存在HBV DNA，但其拷贝数比在肝细胞中低。
肝细胞中的肝炎病毒DNA可作为游离DNA或整合到宿主细胞染包体内的形式存在（Tiollais et al.，1985，Nature（London）317：489-495）。在HBV感染的急性和某些慢性阶段可检测到游离HBV DNA，并通常代表了复制的中间体形式。与之相反，整合的顺序则大多见于慢性病毒感染及肝细胞癌期间。
除引起急性和慢性肝病之外，流行病学和分子生物学研究的结果还证明了肝炎病毒感染与肝癌之间存在着一定的关联（参见Ganem and Varmus，上述文献;Machowiak，1987，Am.J.Med.82：79-97;Tiollais et al.，1985，Nature（London）317：489-495）。在东南亚和赤道非洲，慢性HBV感染的高发生率与肝癌的发病率之间存在着密切的相互关联。另外，已发现肝癌病人的肝细胞含有HBV DNA和HBsAg。在具有肝炎病毒感染的动物体内也发现了肝癌。而且实验证明，在出生时用WHBV接种旱獭也可诱发肝癌。
已用Southern印迹杂交法研究了存在于人（Dejean et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：5350-5354）、旱獭（Ogston et al.，1982，Cell 29：403-415）、地松鼠（Marion et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：4543-4546）和鸭（Imazeki et al.，1988，J.Virol.62：861-862）肝细胞癌中的肝炎病毒DNA顺序的结构。一般认为，病毒DNA在1至12位被整合到宿主染色体DNA中。病毒一宿主染色体接合点通常位于DR1和DR2之间的粘性末端区域内。
2.1.3.HBV感染的免疫接种和治疗
用于治疗HBV感染的现有方法可分为两类，即使用抗病毒剂和免疫调节剂（参见Hoofnagle，Ann.Int.Med.107：414-415）。阿糖腺苷（腺嘌呤阿糖苷）是已广泛试验的一种对疱疹病毒具有潜在活性的腺嘌呤类似物。虽然已发现该化合物对病毒复制的抑制作用对某些病人是接近完全并持久的，但在另一些病人身上则只部分或暂时起作用。这种药物的一个缺点是极不易溶于水，故必须静脉内给药（持续静脉输注）。阿糖腺苷的一种-磷酸化衍生物，即磷酸阿糖腺苷可经快速静脉内输注或肌肉注射方法给药。虽然磷酸阿糖腺苷治疗可以清除血清乙型肝炎病毒DNA，但它不会持久地改善伴随的肝脏疾病。已试验过的其他用于治疗HBV感染的抗病毒剂包括无环鸟苷和苏拉明（Suramin）。
已对病人用淋巴样母细胞或重组α干扰素进行了1-6个月的治疗效果研究。发现只有25-40%的病人对这种治疗方法起反应。已证明合并使磷酸阿糖腺苷和人白细胞干扰素有毒性。最近研究的其他疗法包括使用白细胞介素2、γ干扰素及短疗程皮质类固醇。
美国专利4，741，901号公开了一种含成熟乙肝表面抗原之22nm多肽颗粒的疫苗。
2.2.缺陷性病毒
2.2.1.缺陷性RNA病毒
在大多数这类RNA病毒如疱疹性口炎病毒（VSV）、付流感病毒、流感病毒、α病毒和呼吸道肠道病毒制剂（参见Holland，1986，In Fundamental Virology，Fields，B.N.and Knipe，D.M.，eds.，Raven Press，NY，pp.77-99）中含有大量缺陷性干扰（DI）颗粒，其因基组中只含有一部分亲本病毒的遗传信息。DI颗粒不能在宿主细胞中自身复制，但当它们与提供丢失基因产物的同型感染性病毒（辅助病毒）一起感染细胞时却能够复制。因为DI颗粒需要有限量由感染性颗粒提供的RNA聚合酶，所以使辅助病毒的复制受到明显的抑制（自动干扰）。
已发现DI颗粒可在急性和慢性感染中起作用。实验表明VSV DI颗粒通过启动VSV在体内生长的周期特征以调节在小鼠体内的毒力（Cave et al.，1985，J.Virol.55：366-373）。另外，新生仓鼠肾细胞内持续性VSV感染的形成和维持也需要DI颗粒（Holland and Villareal，1974，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，71：2956-2960）。
DI颗粒可起源于异常复制过程（Lazzarini et al.，1981，Cell26：145-154）。据推测，在其复制中聚合酶一新生链复合物脱离模板，并在另一模板上或同一模板的不同位置上完成复制过程。
2.2.2.缺陷性反转录病毒
缺陷性反转录病毒与其他缺陷性RNA病毒的主要区别在于缺陷性反转录病毒一般不能调节全长反转录病毒颗粒的感染。缺陷性反转录病毒与其他缺陷性RNA病毒一样，只能在辅助病毒的存在下才能复制。辅助病毒和缺陷性病毒需要的不是同一反转录病毒;例如，白血病病毒可作为缺陷性肉瘤病毒的辅助病毒。
非缺陷性反转录病毒在基因组的5′和3′末端含有一个长的末端重复（LTR）区，以及gag、pol和env基因（参见Watson et al.，1987，In Molecular Biology of the Gene.Vol.2，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Menlo Park，CA;Hanafusa，1977，In Comprehansive Virology，Fraenkel-Conrat，H.and Wagner.R.R.，eds.Plenum Publishing CO.，NY，pp.401-436）。但除Rous肉瘤病毒外，非缺陷性反转录病毒的分离物均不含有致癌基因。非缺陷性反转录病毒在经过相当长的潜伏期后一般可诱发白血病（如HTLVI，猫白血病病毒）。
缺陷性反转录病毒的天然分离物都含有因gag、pol和env基因缺乏而形成的致癌基因（参见Watson et al.，上述文献;Hanafusa，上述文献）。已知这些病毒可作为急性转化病毒，并有经过短潜伏期后在体内诱发肿瘤的能力（如肉瘤病毒）。另外，已表明只要LTR是完整的，就能够使前病毒DNA渐渐整合到宿主基因组内，转录成RNA并继而转化宿主细胞，但还不能产生感染性子代。然而，如果用非缺陷性病毒感染这些细胞，即可产生非感染性和感染性病毒的混合物。在这种情况下常常会产生假型，其中非缺陷性病毒形成的被膜糖蛋白可掺入到产生感染性颗粒的缺陷性病毒内。
缺陷性反转录病毒也已用于基因转导过程，其中缺陷性病毒可携带外来DNA顺序。例如，据报导可使用在组成上表达高水平β半乳糖苷酶的复制缺陷性反转录病毒来转导成年大鼠肝细胞的初级培养物（Wilson et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：3014-3018）。
2.2.3.缺陷性DNA病毒
已发现DI颗粒是通过异常病毒复制过程或同源重组过程（参见Holland，上述文献）由乳多空病毒、疱疹病毒、腺病毒、细小病毒等DNA病毒产生的。如RNA病毒一样，DNA病毒的这些DI颗粒可在用野生型病毒经高滴度感染后产生。如RNA病毒一样，许多不同结构的DI颗粒也可由包含缺失、取代和重复之野生型基因组的DNA病毒产生。
还观察到可减轻乳多空病毒（Brochman，1977，Proc.Med.Virol.23：69-95）和腺病毒（Larsen，1982，Virology，116：573-580）中的急性病毒感染。但也如RNA病毒一样，一般认为DNA病毒的DI颗粒与持续感染有关。例如，DI基因组可在BK病毒（一种人乳多空病毒）转化的细胞内自动复制（Yoga et al.，1980，Virology 103：241-244）。
2.3.疫苗
2.3.1.失活和减毒的病原体
制备疫苗的传统方法包括使用失活的或减毒的病毒。病毒失活后使之无害，可用作生物学制剂，但又不致于破坏其免疫性。将这些“被杀死的”病毒颗粒注入宿主体内即可诱发能中和肝脏病毒进一步感染的免疫反应。但使用死疫苗（即失活的病毒）的一个主要问题是不能灭活所有的病毒颗粒。即使作到这一步，由于被杀死的病毒不能在其宿主中增殖，故常常缩短免疫力期限并须作附加免疫接种。最后，失活过程可改变病毒蛋白而使之减小作为免疫原的效力。
减毒可看作是产生基本上失去其致病能力之病毒株的过程。一种方法是使病毒生长于异常条件下和/或在细胞培养物中多次传代。然后选择已失去毒力但仍能够引发免疫反应的病毒突变体。经减毒的病毒只能够在宿主细胞内复制并诱发长期免疫力，故可用作良好的免疫原。然而，如果减毒不彻底，则会造成一系列问题。
2.3.2.亚单位疫苗
可代替上述方法的是使用亚单位疫苗（如参见Blumberg和Millman的美国专利3636191号），这包括只用含有相关免疫学材料的蛋白质进行免疫接种。亚单位疫苗的一个优点是去掉了无关的病毒材料。对许多被膜包裹的病毒来说，病毒编码的糖蛋白含有能引起中和抗体作用的抗原决定基。HBV亚单位疫苗含有由慢性感染携带者血液中纯化的乙型肝炎表面抗原（Krugman，1982，J.A.M.A.247：2012-2015）。已证明这种疫苗对高危险成年人群如吸毒者、同性恋者及新生儿是有效且安全的。但由于血清来源有限、纯化与灭活过程复杂，以及在其生产和审批中须在黑猩猩身上作致死性安全试验等，所以其价格十分昂贵。
还可使用代表表面抗原上免疫学引入区的合成肽来制备亚单位疫苗。已经使用许多病毒如口蹄疫病毒（Bittle et al.，1982，Nature（London）298：30-33）、流感A病毒（Muller et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：569-573）、脊髓灰质炎病毒（Emini et al.，1983，Nature（London）304：699-703）和HBV（Itoh et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83：9174-9178）尝试了这一方法。将肽偶联到载体（如血兰蛋白、聚DL-丙氨酸）上并与一种佐剂一起使用。但该方法也存在某些缺点。如这些肽的抗原性较差，所以一般需要使用弗氏佐剂（一种致癌物）以增强产生免疫反应的能力。
使用重组DNA技术生产亚单位疫苗包括在适当载体内分子克隆和表达编码这些蛋白质的病毒遗传信息，以在宿主动物体内引发中和反应。
就HBV和其他病毒而言，已发展了许多在真核细胞内产生病毒表面抗原的方法。其中之一是用一种重组体转染酵母细胞，在所说的重组体中，已将HBsAg基因在可诱导启动子的下游插入到酵母表达载体内（参见Valenzuela et al.，1988，美国专利4722841号）。但该方法中必须破碎酵母细胞才能释放出HBsAg，然后再用等密度及区带离心法结合免疫亲合层析法纯化之。
已使用重组病毒在哺乳动物细胞内试验了一些相似方法。一般是将用作载体以表达外来基因的病毒插入其基因组中。导入宿主动物体内后，重组病毒即可表达被插入的外来基因并因而可引发抗这些基因产物的宿主免疫反应。已使用重组牛痘病毒（Smith et al.，1983，Nature（London）302：490-495）、具有复制起点缺陷的SV40重组病毒（Burnette et al.，1984，In：Modern Approaches to Vaccines，Lerner，R.A.and Chanock，R.M.（eds.）Cold Spring Harbor，NY，pp.245-250）、腺病毒（Morin et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4626-4630）和牛乳头状瘤病毒（Statowa et al.，上述文献，pp.239-243）产生了HBsAg及其他表面抗原。另外，已构建了一种用HBsAg取代其中之SV40VP1蛋白编码区的SV40重组体（Levinson et al.，1988，美国专利4741901号）。
2.4.基因治疗
基因治疗是指为治疗疾病或功能失调而向细胞内转移并稳定地插入新的遗传信息。通常是将外来基因转移到能够增殖并将新的基因扩散到整个群体的细胞内。因此通常用于细胞或原始细胞作为基因转移的靶细胞，因为它们是能产生各种强有力地表达外来基因之子代连锁的增殖性细胞。
有关基因治疗的研究大多集中在使用造血干细胞上。已研究了用于造血原始细胞转化的高效率基因转移系统（Morrow，1976，Ann.N.Y.Acad.Sci.265：13;Salzar et al.，1981，In Organization and Expression of Globin Genes，A.R.Liss，Inc.，New York，p.313;Bernstein，1985，In.GeneticEngineering：Principles and Methods，Plenum Press，New York，p.235;Dick et al.，1986，Trends in Genetics 2：165）。关于开发病毒载体系统的报导指出，该系统较DNA介导的基因转移方法（如磷酸钙沉淀和DEAE葡聚糖）有更高的效率，而且能够在多种类型的细胞中稳定地整合被转移的基因。重组反转录病毒载体在实验中已广泛地用于转导造血干细胞和原始细胞。在用反转录病毒载体转移后，在小鼠体内成功地表达的基因包括人次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（Miller et al.，1984，Science 255：630）和人β珠蛋白（Dzierzak，E.A.et al.，1988，Nature（London）331：35-41基因。也已作为将细胞抗药基因转化到实验模型内的形式，将细菌基因转移到了哺乳动物细胞内。已使用以重组反转录病毒为基础的载体系统，用真核细胞病毒载体将造血原始细胞转化为药物抗性细胞（Hock and Miller，1986，Nature（London）320：275-277;Joyner et al.，1983，Nature（London）305：556-558;Williams et al.，1984，Nature（London）310：476-480;Dick et al.，1985，Cell 42：71-79;Keller et al.，1985，Nature（London）318：149-154;Eglitis et al.，1985，Science 230：1395-1398）。已成功地用腺相关病毒载体转导哺乳动物细胞系使之成为新霉素抗性细胞（Hormonat and Muzyczka，1984，上述文献;Tratschin etal.，1985，Mol.cell Biol.5：3251）。已研究过的、用于基因转移的其他病毒载体系统包括乳多空病毒和牛痘病毒（见Cline.1985，Pharmac.Ther.29：69-92）。
基因转移的其他方法包括微量注射、电穿孔、脂质体和染色体转移以及转染技术（Cline，1985，上述文献）。Salser等人使用磷酸钙沉淀转染法将氨甲嘌呤抗性二氢叶酸还原酶（DHFR）或单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，以及人珠蛋白基因转移到小鼠造血干细胞内。已证明DHFR和胸苷激酶基因可以在干细胞子代细胞内表达（Salser et al.，1981，In Orgamzation and Expresion of Globin Genes，Alan R.Liss，Inc.，New York，pp.313-334）。
也已在小鼠模型中研究了有关酶取代治疗的基因治疗方法，为此，用得自供体小鼠的正常干细胞重新构建无β半乳糖苷酶的小鼠造血细胞系统（Yatziv et al.，1982，J.Lab.Clin.Med.90：792-797）。因为提供了天然基因，故不必再使用重组干细胞（或基因转移技术）。
3.本发明的技术概要
本发明涉及复制缺陷性肝炎病毒，特别是涉及两种类型的缺陷性肝炎病毒DNA及其核酸顺序。其中第一种类型（本文中称之为“颗粒缺陷性”肝炎病毒基因组）不能提供复制所需的所有肝炎病毒功能，但能够产生具有适当顺式作用（cis acting）信号的前基因组RNA，这些信号是为将RNA包含于病毒颗粒中（包装）和反转录成DNA所必需的。在一特定实施方案中，含有这类颗粒缺陷性基因组的肝炎病毒可能在核心抗原（HBcAg）、病毒聚合酶和/或表面抗原（HBsAg）的产生中是有缺陷的。本发明的第二种类型缺陷性肝炎病毒基因组（本文称之为“包装基因组”）是能够转录成前基因组RNA的基因组，所说的RNA不能（ⅰ）反转录成双链基因组DNA，和/或（ⅱ）自身包装;但该基因组能被转录成编码蛋白质的mRNA，所说的蛋白质反过来可为将第二种RNA包装到病毒颗粒中或将第二种RNA转录成病毒颗粒DNA提供必要的病毒功能。在本发明的特定实施方案中，这种包装基因组包括但不只限于在直接重复（DR）区即DR1内有缺失的基因组DNA。
可通过共表达颗粒缺陷性基因组和“辅助”肝炎病毒包装基因组来产生含有颗粒缺陷性基因组的肝炎病毒颗粒。也可以通过共表达颗粒缺陷性基因组和编码肝炎病毒包装功能（如反转录酶、核心、被膜）的核酸载体（如质粒）来产生这种病毒颗粒。然后可用所得到的含有颗粒缺陷性基因组（“已包装的颗粒缺陷性基因组”）的肝炎病毒感染肝细胞，颗粒缺陷性DNA被运到细胞内并在其中表达。但因为该病毒DNA的缺陷，故不能引起再次肝炎病毒感染。因此，在不存在进一步的肝炎病毒增殖及所导致的疾病时，被感染的肝细胞即可表达该颗粒缺陷性肝炎病毒基因组。
本发明还涉及包装的颗粒缺陷性基因组和包装基因组产物的治疗应用。可将表达免疫原性抗原决定基（如HBsAg）的被包装的颗粒缺陷性基因组和肝炎病毒包装基因组产物配制成疫苗，用于防止肝炎病毒感染或用作免疫治疗剂。在一个实施方案中，可将这种疫苗用作治疗肝炎病毒感染或其后遗症的免疫刺激剂。
本发明还涉及含有异源基因顺序的包装的重组颗粒缺陷性基因组以及这类病毒在治疗中的应用。在本发明的一个实施方案中，可以使用当引入已知生物体时能够在病毒或其他调节顺序控制下表达的异源基因顺序取代肝炎病毒基因组的各个区域，这些区域包括但不仅限于编码能反过来由包装基因组补充之病毒功能的顺序。可用这类重组病毒对那些能通过肝脏酶的产生得以治疗的酶缺乏症（如凝血因子）进行基因治疗。在本发明的另一实施方案中，可将含有异源基因的重组肝炎病毒配制成疫苗，用于防止病原微生物的感染或因存在其抗原而引起的病理状态或失调。
在本发明的再一个实施方案中，可使用包装的颗粒缺陷性基因组干扰野生型病毒感染的传播或维持，和/或减轻与消除野生型病毒感染。
本发明的进一步的实施方案涉及用缺陷性肝炎病毒稳定转染的永性性肝细胞系。稳定掺入有一个或多个缺陷性肝炎病毒基因组的细胞系能够提供缺陷性肝炎病毒基因组的必需功能，并能够产生传染性缺陷性颗粒。在一个具体的实施方案中，用肝炎病毒的包装基因组稳定地转染永久性细胞系，从而使这些细胞系能够永久性表达对第二种缺陷性基因组进行反式包装和逆转录所需的产物（本文称为“包装细胞系”）。在包装细胞系中导入颗粒缺陷性基因组，则可回收到包装有颗粒缺陷性基因的后代。
3.1.定义
本文中所使用的有关术语的含义如下：
dp＝碱基对
DHBV＝鸭乙型肝炎病毒
DR＝肝炎病毒基因组的直接重复区，即DR1或DR2
FBS＝胎牛血清
GSHBV＝地松鼠乙型肝炎病毒
HBV＝乙型肝炎病毒（人）
HBcAg＝DHBV、GSHBV、HBV或WHBV的表面抗原
kb＝千碱基
Kd＝千道尔顿
NTP＝三磷酸核苷
WHBV＝旱獭乙型肝炎病毒
△DR1＝为-DHBV包装基因组，缺失为完全合成双链病毒DNA分子所必需之12bp直接重复顺序的DR1，
颗粒缺陷性＝为一并不编码所有包装功能的缺陷性肝炎病毒基
肝炎病毒基 因组DNA，但能够转录成带有适当顺式作用信
因组 号的前基因组RNA，所说的信号是为将RNA
包涵于病毒颗粒中（包装）并反转录成DNA所
必需的
肝炎病毒包＝为一可转录成前基因组RNA的缺陷性肝炎病毒
装基因组 基因组DNA，所说的前基因组RNA不能（
a）被包装和/或（b）反转录成双链DNA基
因组，但它们所编码的信使RNA可编码一种或
多种蛋白质，以便为将合适的第二种前基因组
RNA包装到病毒颗粒中并将第二种RNA转录
成病毒颗粒DNA提供必要的病毒功能
包装细胞系＝稳定掺入有至少一个肝炎病毒包装基因组的永久性细胞系，该细胞系能够表达这样的病毒产物，这些产物是反式包装合适的第二前基因组RNA至病毒粒子中和逆转录第二RNA至病毒DNA所必需的。
生产细胞系＝一种永久性细胞系，含有基本上持续生产含有缺陷性肝炎病毒基因组的传染性肝炎病毒颗粒所必需的遗传信息。
4.附图说明
图1图解显示了DHBV DNA及主要转录本的结构和功能特征（a）;颗粒缺陷性DHBV基因组的结构（b）;△DR1包装基因组的结构（c）;及-DHBV重组基因组的结构（d）。
图2显示用颗粒缺陷性DHBV DNA转染的HuH7细胞的免疫荧光染色结果。其中细胞分别用下列DNA转染：RV-718（pol-）、RV-2650（core-）、Kpn-（pol-env-）或Kpn-Spn-（pol-env-core-），并于5天保温后着染核心（a-c）或表面（a-s）抗原。放大40倍。
图3显示用Southern印迹杂交法检测由pol-env-和pol-env-core-病毒突变体及-DHBV重组体的DNA转染的HuH7细胞中出现的病毒复制DNA。其中各平皿（60mm）的HuH7细胞（2-3×10个细胞/皿）分别是用野生型DHBV（泳道1，3）、野生型+Kpn-Sph-（pol-env-core-）（泳道2，4）、△DR1（泳道5）、△DR1+Kpn-+1000（泳道7）、△DR1+Kpn-+180（泳道8）、△DR1+Kpn-Sph-（pol-env-core-）（泳道9）的DNA转染的。Southern杂交分析是按下文6.4.2.节中所述方法，用一个正极的DHBV RNA探针进行的。泳道10为含有1微微克已克隆之DHBV DNA的杂交标准品。泳道11含有-HindⅢ分子大小标志物。曝光时间为4小时（泳道1和2）或48小时（泳道3-11）。图左侧标示了松弛环（RC）和单股（SS）形式之细胞内病毒DNA的位置。
图4显示用包装基因组△DR1转染之HuH7细胞的免疫荧光染色结果。其中染色显示了用野生型DHBN（WT）或△DR1 DNA（△DR1）转染的细胞的核心（a-c）或表面（a-s）抗原。PC：相差图。放大40倍。
图5显示用包装基因组和颗粒缺陷性DHBV基因组转染后HuH7细胞内的病毒复制形式。按图3所述方法检测病毒DNA。分别用野生型DHBV（泳道1）、△DR1（泳道2）、△DR1+Kpn-（pol-env-）（泳道3）、△DR1+RV-718（pol-）（泳道4）、△DR1+RV-2650（core-）（泳道5）、RV-2650（core-）（泳道6）、RV-2650（core-）+Kpn-（pol-env-）（泳道7）、RV-718（pol-）（泳道8）、RV-2650（core-）+RV-718（pol-）（泳道9）的DNA转染细胞。图中左侧标示了细胞内松弛环（RC）和单链（SS）形式病毒DNA的位置。
图6显示检测感染后HuH7细胞培养物上清中感染性病毒的结果。自1.5、3和6μg野生型DHBV DNA（泳道1、2、3）或3μg △DR1 DNA（泳道4、5）、Kpn-（pol-env-）（泳道6、7）或Kpn-Spn-（pol-env-core-）（泳道8、9）DNA转染的HuH7细胞培养物各分离2ml上清液，并与初级鸭肝细胞的培养物保温过夜。将感染的肝细胞保温12天，提取总DNA并用如图3中所述的Southern印迹杂交法分析病毒复制DNA的存在形式。泳道10含有λ-HindⅢ分子大小标志物。图中左侧标示了松环（RC）和单链（SS）DNA的位置。
图7显示DHBV突变DNA在共转染HuH7细胞中对感染性病毒的抑制作用。以图6所述的Southern印迹杂交法分析用病毒DNA感染的HuH7细胞上清液的感染性。分别用野生型DHBV（泳道1、2）、野生型+Kpn-（pol-env-）（泳道3、4）、野生型+Kpn-Spn-（pol-env-core-）（泳道5、6）、野生型+△DR1（泳道7、8）或野生型+pSP65（泳道9、10）的DNA转染HuH7细胞，分离培养液并与肝细胞一起保温以感染肝细胞，然后从感染的肝细胞中提取病毒DNA。
图8（a）在1326位与1350位之间的野生型DHBV基因组的核苷酸顺序，和颗粒缺陷性基因组lS的相应顺序，在下文6.7节中有述。
（b）病毒复制型，在泳道1和2中，HuH7细胞用二聚体形式的颗粒缺陷性基因组lS转染后进行Southern印迹杂交测定。用二聚突变lS基因组转染的HuH7细胞的上清液（泳道5）或用lS二聚体加上△DRl二聚体转染的HuH7细胞的上清液（泳道7）被用来感染初级鸭肝细胞，然后测定细胞中的病毒DNA。
Southern印迹杂交测定如图3所述进行。泳道3，4，6和8分别代表对照：泳道3-用来自患有活性DHBV肝炎的鸭的血清感染的鸭肝细胞;泳道4-用来自WT转染的HuH7细胞的液体感染的鸭肝细胞;泳道6-用来自WT+△DRl转染的HuH7细胞的上清液感染的鸭肝细胞;泳道8-未转染的鸭肝细胞。
图9.初级鸭肝细胞在用野生型DHBV感染（第1列），和用从与缺陷性基因组△DRl和lS共转染的HuH7细胞回收的上清液感染（第2列）后的免疫荧光染色，核心抗原被染色。放大率：40倍。
图10.质粒pHBV△DRl Neo，示出了方向和二聚体△DRl顺序，可选择标记物，和某些限制性位点的相对位置。R＝ECoRl，B＝BamHI，SV＝SV40调节DNA。
图11.制备质粒pHBV△DRlNeo的构建步骤流程图解。AmpR＝氨苄青霉素抗性基因;CAMR＝氯霉素抗性基因;R＝EcoRI;限制性位点如图所示。
图12.用透射式电子显微镜检查HepB1-2细胞薄切片。放大率：125，000倍。
图13.推断的△DRl DNA顺序图解，△DRl DNA衍生于质粒pHBV△DRlNeo，其在HepB1-2细胞中整合到宿主细胞DNA中。R＝EcoRI;B＝BamHI;pBR＝pBR322顺序;锯齿状线＝细胞顺序。
图14.利用缺口转移HBV探针，对分离自HepB1-2细胞培养物上清液的不同密度梯度部分的核酸进行Southern印迹杂交分析。通过在氯化铯中离心分离上清部分，然后从上清部分中分离出核酸，在下文8.2节中有述。梯度范围值以g/ml计。
图15.分离自用颗粒缺陷性基因组（X-）转染的HepB1-2细胞上清液的核酸的Southern印迹杂交分析。用5mg（泳道1-3）和1mg（泳道4-6）的X-质粒DNA进行转染。分级分离上清液，然后从各级分中分离核酸，在下文8.2节中有述。
5.本发明的详细描述
本发明涉及复制缺陷性肝炎病毒，特别是涉及两种类型的缺陷性肝炎病毒基因组及其核酸顺序。第一种类型（本文称之为“颗粒缺陷性”基因组）不能自身提供复制所需的所有肝炎病毒功能，但能够产生带有适当顺式作用信号的前基因组RNA，所说的信号是使RNA包含于病毒颗粒内（包装）并反转录成DNA所必需的。在特定实施方案中，含有这种颗粒缺陷性基因组的肝炎病毒可能在核心抗原（HBcAg）、病毒聚合酶和/或表面抗原（HBsAg）的合成上是有缺陷的。根据本发明的第二种类型的缺陷性肝炎病毒基因组（本文称之为“包装基因组”）是能够转化成前基因组RNA的基因组，所说的前基因组RNA不能反转录成双链DNA基因组和/或自身包装，但该基因组能转录成编码一种或多种蛋白质的信使RNA，所说的蛋白质能够为将第二种前基因组RNA包装到病毒颗粒中或将第二种RNA转录成病毒颗粒DNA提供必要的病毒功能。因此，包装基因组能为包装颗粒缺陷性基因组提供“辅助功能”。包装基因组包括但不只限于在直接重复（DR）区即DR1和/或DR2中有缺失的肝炎病毒基因组。
可通过表达反向包装所需要的肝炎病毒蛋白质（如核心、反转录酶、被膜）来包装本发明含有异源基因顺序的颗粒缺陷性肝炎病毒基因组，因为该颗粒缺陷性基因组本身不能以功能化形式提供上述蛋白质。这一表达过程导致了含颗粒缺陷性基因组之肝炎病毒颗粒（本文称之为“已包装的颗粒缺陷性基因组”或“颗粒缺陷性病毒”）的产生。在一个实施方案中，可通过一种或多种编码提供这些功能的核酸载体（如质粒）的表达来提供反向包装功能。在另一实施方案，通过表达一个或多个肝炎病毒包装基因组来包装颗粒缺陷性基因组。在一特定实施方案中，当使用基因转移技术在体外将包装基因组和颗粒缺陷性基因组一起导入适当细胞内时，包装基因组的表达便提供了为将颗粒缺陷性基因组包涵于继后由细胞内释放之病毒颗粒内所需要的功能。在另一特定实施方案中，可通过将颗粒缺陷性基因组导入其中已稳定地掺入并表达了“辅助”包装基因组的细胞系内来完成颗粒缺陷性基因组的包装。
然后可用已产生的含颗粒缺陷性DNA的病毒颗粒（“颗粒缺陷性病毒”）于体外或体内感染肝细胞或其他敏感细胞，颗粒缺陷性DNA被输入细胞并可在其中表达，但该病毒DNA因自身的缺陷而不能引起再次肝炎病毒感染。因此，可在没有进一步的肝炎病毒增殖及所产生之疾病的情况下，由感染的肝细胞表达颗粒缺陷性肝炎病毒。
在一特定的实施方案中，可通过给予一种条件复制缺陷性肝炎病毒（如在可诱导的启动子控制下的辅助病毒基因组，其只能在某些条件下起“辅助”病毒的作用），在掺入颗粒缺陷性基因组的宿主细胞中诱导有限周期的肝炎病毒增殖。这种有限的病毒增殖可使颗粒缺陷性病毒DNA向宿主细胞作进一步但有限的非致病性扩散。在本发明的一个实例中，可使用重组颗粒缺陷性病毒DNA进行基因治疗，这种条件病毒增殖作用可能是优选的。
在本发明的特定实施方案中，可将缺陷性肝炎病毒作为抗病毒剂用于治疗肝炎病毒感染。可将这种病毒配制成抑制野生型病毒增殖和生存的干扰剂。
在另一实施方案中，可将表达免疫原性抗原决定基（如HBsAg）的包装的颗粒缺陷性病毒或肝炎病毒包装基因组产物配制成防止肝炎病毒感染的疫苗，或用作免疫刺激剂。
本发明还涉及包含异源基因顺序的颗粒缺陷性重组肝炎病毒基因组、含有该基因组的病毒及这类病毒在治疗上的应用。可用异源基因顺序取代肝炎病毒基因组的各个区域，这些区域包括但不只限于编码能反过来由包装基因组弥补之病毒功能的区域。这样，当异源顺序被导入适当细胞内时即可在肝炎病毒或异源调节顺序的控制下表达。在一个实施方案中，对于因异源DNA顺序编码的酶的缺乏而引起的疾病或紊乱，可使用含有这些重组基因组的病毒通过诱导肝脏酶的产生来进行基因治疗。在本发明的另一实施方案中，可将含有编码免疫原性抗原决定基之异源基因顺序的重组肝炎病毒配制成疫苗，用以防止异种生物体的感染，或防止因存在抗原而引起的病理状态或功能紊乱。5.1.缺陷性肝炎病毒基因组的产生和应用
本发明涉及复制缺陷型肝炎病毒基因组，后者包括但不只限于可由包装基因组反过来提供的功能包装的颗粒缺陷性基因组，以及能够反过来提供包装功能的包装基因组。本发明还涉及编码颗粒缺陷性基因组或包装基因组顺序的核酸顺序。
被包装的颗粒缺陷性肝炎病毒基因组包括但不只限于有合成核心抗原（HBcAg）、病毒聚合酶和/或表面抗原（HBsAg）之缺陷的肝炎病毒基因组。在一特定实施方案中，这种合成上的缺陷可能是由于缺失给定蛋白质的部分或全部编码区。在本发明的特定实施方案中，已包装的颗粒缺陷性基因组不能编码产生一种、二种或三种上述肝炎病毒蛋白质。
本发明的肝炎病毒包装基因组包括但不只限于在顺式病毒DNA合成所需的区域中或在前基因组RNA的顺式识别与包装所需的区域中有突变或缺失的基因组。在一个实例中，这种包装基因组可在DR1（直接重复1）或DR2区域中有缺失。在另一实例中，肝炎病毒基因组在DR1区域中有缺失。还有一个实例中，包装基因组在DR1和DR2区域均有缺失。已证明DR1和DR2区域参予病毒DNA合成的起始。
5.1.1.缺陷性病毒基因组的产生
可使用重组DNA技术制得本发明的缺陷性肝炎病毒基因组。可使用的缺陷性肝炎病毒包括但不仅限于对人和高等灵长类有致病性的乙型肝炎病毒（HBV）、地松鼠乙型肝炎病毒（GSHBV）、鸭乙型肝炎病毒（DHBV）和旱獭乙型肝炎病毒（WHBV）。
为便于叙述起见，可将制备本发明缺陷性肝炎病毒基因组DNA的方法分为下列几个步骤。第一步包括分离野生型肝炎病毒DNA。可使用已知技术（参见Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York），由肝炎病毒感染的肝细胞或克隆的DNA中得到肝炎病毒DNA。第二步是处理已分离的肝炎病毒DNA，使之产生可导致病毒复制缺陷的突变。必要时可在重新连接病毒基因组并感染或转化敏感细胞之后，根据（a）核酸杂交，（b）是否存在“标志”基因功能，或（c）缺陷性肝炎病毒基因的表达来鉴定该缺陷性病毒。
可由肝炎病毒如HBV、DHBV、GSHBV及WHBV中制得野生型肝炎病毒基因组DNA。已克隆了这些基因组DNA并测定了它们的核苷酸顺序（Seeger et al.，1984，J.Virol.51：367-375;Mandart et al.，1984，J.Virol.49：782-792;Galibert et al.，1982，41：51-65;Valenzuela et al.，1980，In：Animal Virus Genetios，Field，B.N.，Jaenisch，R.and Fox，C.F.，eds.，Academic Press，NY，pp.57-70）。如果不容易从市场上买到已克隆的肝炎病毒DNA，则可以由肝炎病毒感染的肝细胞中制得肝炎病毒DNA（如参见Tuttleman et al.，1986，J.Virol.58：17-25）。另外，可使用本领域内已知的方法由纯化的病毒制得HBV、GSHBV、DHBV或WHBV DNA（如参见Mason et al.，1980，J.Virol.36：829-836）。然后可按本领域已知的标准方法克隆肝炎病毒DNA（如参见Maniatis，T.et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY）。
可使用本领域内已知的多种不同的方法分析克隆基因的核苷酸顺序，如Maxam和Gilbert的方法（1980，Meth.Enzymol.65：499-560），Sanger的双脱氧方法（Sanger，F.et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463），或使用自动DNA顺序分析仪（如Applied Biosystems，Foster City，CA）。
可使用多种已知的战略构建颗粒缺陷性基因组和肝炎病毒包装基因组。在制备颗粒缺陷性基因组时，可用酶学或化学方法处理病毒DNA以使之产生有复制缺陷的突变，但仍保留顺式包装所需要的信号。在一优选实施方案中，用一种或多种限制性酶处理病毒DNA，以在特定位点上切断并重新连接之。如果经限制性核酸内切酶消化后产生了有粘性DNA末端的适当缺失，便不必在连接之前进一步修饰DNA。但如果限制性酶消化后未产生粘性末端，或期望缺失另外的顺序，则可在经过限制性酶切后用核酸酶如核酸酶Bal 31、核酸外切酶Ⅲ、λ核酸外切酶、绿豆核酸酶或T4DNA聚合酶的核酸外切酶活性消化之，以除去部分DNA顺序。可用多种已知方法修饰经过酶处理的DNA末端，以利于病毒DNA的连接。例如可在限制性切割后，先经回头消化或充填单股DNA末端等修饰过程产生平头，然后再进行连接。可将编码一个或多个限制性酶切点的寡核苷酸顺序（接头）连接到已切断的病毒DNA末端上。然后在体外使肝炎病毒DNA顺序相互连接，或连接到适当的表达载体顺序上。
在一优选的实施方案中，颗粒缺陷性肝炎病毒的制备包括删除编码表面抗原、核心抗原和/或聚合酶/表面抗原的基因。编码聚合酶的部分区域也编码表面抗原。在造成缺失时可使用一种以上的限制酶。在本发明的一个实施方案中，经限制酶消化除去编码两种病毒蛋白的肝炎病毒DNA。在另一实施方案中，经限制酶消化除去编码所有三种蛋白质的DNA。另外，也可以只经限制性酶消化除去一部分编码HBsAg、HBcAg或聚合酶蛋白的肝炎病毒DNA，致使所得突变体只能表达无功能产物，或不能表达由减毒基因编码的蛋白质。还可在一个、两个或三个上述肝炎病毒基因上造成缺失。
在本发明的一个可代用的方法中，可经体外或体内突变制得颗粒缺陷性肝炎病毒基因组。其中的一个例子是，这种颗粒缺陷性基因组可能因转录（如启动子）或转译的缺陷而不能表达病毒蛋白质。在另一实例中，肝炎病毒可能因病毒蛋白质的突变（如点突变或移码），阻止了蛋白质发挥正常功能而成为颗粒缺陷性的。如产生一种不能装配的核心蛋白。可使用本领域内任何已知的诱变技术，如体外定点诱变（Hutchinson，C.，et al.，1978，J.Biol.Chem.253：6551），及使用TAB接头（Pharmacia）等。
可通过在DR1区中造成突变来制备肝炎病毒包装基因组（见6.3节）。还可预期通过删除DR2区来制得这种突变体。可使用上文公开的制备颗粒缺陷性基因组的技术制得肝炎病毒包装基因组。在一优选方案中，可经限制性酶消化删除DR1区域或其部分。可使用已知技术如限制性酶切图和/或顺序分析法来确定是否产生了适当的基因突变。
必要时可将颗粒缺陷性基因组及包装基因组插入各种核酸载体内。在本发明的一个优选实施方案中，颗粒缺陷性基因组或肝炎病毒包装基因组被插入到用于转化适当宿主细胞的质粒克隆载体中，以复制DNA并产生许多所需肝炎病毒顺序的拷贝。这可通过将肝炎病毒顺序连接到具有互补粘性末端的克隆载体内来完成。但如果经限制性酶消化不能得到粘性末端，或优先产生了其他不同的位点，则可使用本领域内已知的多种技术在所需位点上连接缺陷性肝炎病毒DNA。例如，如上所述，可在用限制性酶切割之后进行修饰，即通过进一步消化或充填将单链DNA末端修成平头，然后再进行连接。另外，可使用核酸酶“回头嚼断”已切断的缺陷性肝炎病毒DNA的末端，以除去部分顺序。可通过连接到DNA末端上将编码一个或多个限制性切点的寡核苷酸顺序（接头）插入肝炎病毒DNA的某区域中。也可使用接头（Linker）在肝炎病毒顺序中产生适当的限制性切点。另外，可在体外或体内造成肝炎病毒顺序的突变，形成新的限制性酶切点或破坏已有的酶切点，以便进行体外连接。
在本发明的一个特定实施方案中，可使用已知方法（参见Maniatis，T.，et al.，1982，Molecular Cloning：A Laborafory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York）使缺陷性肝炎病毒的基因组二聚化。例如，可在连接反应中使用相对于载体DNA大大过量的缺陷性肝炎病毒DNA。
用掺入了肝炎病毒DNA顺序的重组DNA分子转化宿主细胞即可产生多个肝炎病毒DNA拷贝。从而可经培养转化体、由转化体中分离重组DNA分子，及必要时由分离的重组DNA中回放插入的基因而大量获得肝炎病毒DNA。
一旦分离出制备肝炎病毒颗粒缺陷性基因组或包装基因组所需的顺序，即可将其插入适当表达载体即含有转录和转译蛋白编码顺序所需之必要构件的载体内。可利用多种宿主载体系统来表达蛋白编码顺序，其包括但不只限于病毒（如牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、SV40等）感染的哺乳动物细胞系统;病毒（如杆状病毒）感染的昆虫细胞系统;微生物如含有酵母载体的酵母;或由噬菌体DNA、质粒DNA可装配型质粒DNA转化的细菌。这些载体的表达元件依据其强度和特异性而异。根据使用的宿主-载体系统不同，可使用任何一种适宜的转录和转译元件。例如，当在哺乳动物细胞系统内克隆时，可使用自哺乳动物细胞基因组分离的启动子（如小鼠金属硫因启动子），或自生长于这些细胞内的病毒分离的启动子（如牛痘病毒7.5kb启动子）。也可使用以重组DNA或合成技术制得的启动子来转录被插入的顺序。
为有效地转译已插入的蛋白编码顺序，还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和其相邻顺序。起始密码子必须与蛋白编码顺序的读码同步协调，以确保整个插入段的转译。这些外源性转译控制信号和起始密码子可以是各种不同来源的，即天然与合成的。
可使用不同的方法将缺陷性肝炎病毒DNA插入载体内，对于质粒和噬菌体等表达载体可使用体外重组DNA与合成技术;对于病毒表达载体如牛痘病毒和腺病毒可使用体内重组（即基因重组）方法。
如果最终目的是将肝炎病毒顺序插入病毒表达载体如牛痘病毒、腺病毒或反转录病毒中、则可修饰掺入颗粒缺陷性肝炎病毒或肝炎病毒包装基因组的重组DNA分子，使基因侧接于可在病毒表达载体感染的细胞内进行基因重组的病毒顺序上，从而将肝炎病毒DNA插入其他病毒基因组中。
可用下列三种通用方法鉴定含有颗粒缺陷性肝炎病毒基因组或肝炎病毒包装基因组顺序的载体：（a）核酸杂交，（b）是否存在“标志”基因功能，及（c）被插入顺序的表达。第一种方法中，使用与肝炎病毒有同源顺序的探针以核酸杂交法检测是否存在已插入表达载体内的修饰的肝炎病毒基因组。在第二种方法中，可基于是否存在某些因在载体内插入了外来基因而产生的“标志”基因功能（如胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、杆状病毒中闭合体形成等）来鉴定和选择重组载体/宿主系统。例如，如果将修饰的肝炎病毒DNA顺序插入在载体的标志基因顺序内，可根据标志基因功能的存在来鉴定含有经过修饰之肝炎病毒基因组的重组体。在第三种方法中，可通过检测由重组体表达的外来基因产物来鉴定重组表达载体。所用的检测法可以是基于基因产物之物理学、免疫学、或功能特征的。例如，可用ELiSA法检测是否存在与抗HBsAg、HBcAg或肝炎病毒聚合酶蛋白抗体反应的抗原决定基。
一旦鉴定了肝炎病毒顺序，即可将含有肝炎病毒顺序的表达载体转移到适当宿主内。所用的方法包括但不只限于转化（如当载体是质粒时）、噬菌体转导、磷酸钙介导的转染（如使用哺乳动物细胞病毒载体时）或微量注射等。可选择一种宿主细胞株，借以调节插入顺序的表达，或以特定方式修饰与加工嵌合基因产物。存在某些诱导剂（如用于诱导金属硫因启动子的锌和钙）时可以提高某些启动子启动表达的能力。另外，修饰（如糖基化）和加工（如切割）蛋白质产物对于被编码之蛋白质的功能是很重要的。不同的宿主细胞具有转译后加工与修饰蛋白质的不同特性和机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保对已表达的外来蛋白质进行必要的修饰与加工。
5.1.2.颗粒缺陷性基因组的包装
可通过提供反向包装所需要的肝炎病毒基因产物将颗粒缺陷性肝炎病毒基因组包装到肝炎病毒颗粒（本文称之为“包装的颗粒缺陷性基因组”）中。为此，可使用表达这些肝炎病毒基因产物的核酸载体（表达载体）反过来提供包装功能。在另一实施方案中，可使用包装基因编码的产物包装颗粒缺陷性基因组。可通过将包装基因组与颗粒缺陷性基因组共转染到敏感细胞（如肝细胞、白细胞）中，或将颗粒缺陷性基因组输送（如通过转染）到其中已稳定地掺入并表达了包装基因组的包装细胞系中来提供这些包装基因组产物。然后可分离出代表已包装之颗粒缺陷性基因组的病毒颗粒。可使用本领域内已知的方法（如参见Tuttleman et al.，1986，J.Virol.58：17-25）纯化病毒颗粒。另外，尽管已克隆到给定的载体内，仍可将肝炎病毒DNA用于治疗等目的。
5.1.3.缺陷性肝炎病毒基因组和包装的颗粒缺陷性基因组的应用
可使用颗粒缺陷性肝炎病毒基因组、肝炎病毒包装基因组及其基因产物预防和/或治疗因肝炎病毒引起的疾病或紊乱。在本发明的一个实施方案中，可用表达肝炎病毒免疫原性抗原决定基的包装的颗粒缺陷性基因组（如借助包装基因组表达而包装的）或缺失核酸的肝炎病毒颗粒（由包装基因组表达而产生的）配制疫苗。可使用的病毒包括但不只限于HBV、DHBV、GHBV和WHBV。
在本发明的另一实施方案中，可用含有异源基因顺序的缺陷性肝炎病毒颗粒配制疫苗，用以对抗异源病原体或进行基因治疗。
在本发明的再一个实施方案中，可用包装的颗粒缺陷性基因组作为治疗剂，以治疗因肝炎病毒感染引起急、慢性肝炎。该实施方案中，这些缺陷性病毒的作用在于干扰野生型肝炎病毒的复制（参见下文6.7.节）。
5.1.3.1.用于预防感染的肝炎病毒疫苗
可根据本发明，由表达免疫原性抗原决定基（如核心抗原和/或表面抗原的一个或多个抗原决定基）的缺陷性肝炎病毒配制用于防止肝炎病毒感染的疫苗，为宿主提供保护性免疫力。如在一优选实例中，使用疫苗后表达了表面抗原的抗原决定基。
在本发明的一个实施方案中，可用肝炎病毒包装基因组表达的蛋白质产物配制疫苗。例如可使用“空”病毒颗粒（即由于包装基因组不能包装其自身的前基因组RNA和/或合成其自身的基因组DNA而形成的缺少基因组DNA的病毒颗粒）制备疫苗。其中一个例子是由包装基因组DNA转染的细胞上清液中收获这种空病毒颗粒。
在本发明的另一实施方案中，可由已包装的颗粒缺陷性基因组配制疫苗。该方案中，抗抗原决定基的免疫反应是在已包装基因组被导入敏感细胞并在其中表达之后产生的。颗粒缺陷性基因组一旦被导入这类细胞，即可在其中得以表达，但因其自身的缺陷而不会引发再次感染。一个例子是用于配制疫苗的已包装的颗粒缺陷性基因组中编码核心抗原的基因有缺失。另一个例子是编码病毒聚合酶蛋白之基因的5′区域有缺失，从而可抑制这种蛋白质的表达，但不影响表面抗原的表达。还有一个实例是用于配制疫苗的已包装的颗粒缺陷性DNA的核心抗原编码区及聚合酶基因5′末端均有缺失。
5.1.3.1.1.基于缺陷性肝炎病毒表达的抗原决定基之免疫能力的测定
可在用包装的颗粒缺陷性基因组或肝炎病毒包装基因组颗粒作免疫接种后，通过监测试验动物的免疫反应来确定由疫苗制剂中含有已包装之颗粒缺陷性基因组的病毒颗粒或“空”（即缺少基因组核酸）病毒颗粒（通过表达肝炎病毒包装基因组产生的）表达的抗原决定基的免疫能力。试验动物可包括黑猩猩和其他灵长类动物以及人（接种HBV）。引入免疫原的方法包括口服、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、鼻内给药及其他常规免疫接种途径。
可用各种方法分析试验对象的免疫反应，如（a）使用酶联免疫吸附法（ELiSA）、免疫印迹法、放射免疫沉淀法等已知技术检测所得免疫血清对肝炎病毒抗原或其含有肝炎病毒抗原决定基的片段或分离的天然肝炎病毒的反应活性;（b）使用胚变反应检测法、细胞毒性检测法及迟发性超敏反应性等已知技术检测由被免疫对象体内分离的淋巴细胞对肝炎病毒抗原或其片段、或病毒的反应活性;（c）免疫血清体外中和肝炎病毒感染性的能力，以及（d）被免疫动物的抗病能力及感染症状的减轻情况。
5.1.3.1.2.疫苗的配制
本发明中这一实施方案的目的是配制一种疫苗，其中免疫原包含给定之肝炎病毒的抗原决定基，从而可引发抗肝炎病毒抗原决定基的免疫（体液和/或细胞介导的）反应，以防止肝炎病毒感染或由肝炎病毒引起的疾病或失调。这样一种疫苗可以是单价或多价的。
可由表达一个或多个肝炎病毒抗原决定基的一种或少数几种肝炎病毒颗粒制备多价疫苗。此外，当将缺陷性肝炎病毒基因组克隆到哺乳动物或昆虫细胞病毒载体中时，可配制多价疫苗，以得到肝炎病毒基因产物和/或重组病毒。
本发明的疫苗制剂中使用的两种主要类型的免疫原是：（ⅰ）肝炎病毒颗粒，或（ⅱ）分离的肝炎病毒蛋白（用于亚单位疫苗）。在一个实施方案中，肝炎病毒颗粒可含有已包装的颗粒缺陷性基因组，而得到只能对其自身造成一次感染的病毒颗粒。在该实施方案中，免疫原性抗原决定基是基于导入感受态细胞后表达已被包装的肝炎病毒基因组而产生的。在另一实施方案中，用作免疫原的肝炎病毒颗粒可包含没有病毒DNA的“空壳”（经导入细胞并在其中表达肝炎病毒包装的基因组而产生的）。与已包装的颗粒缺陷性基因组不同，这种空的病毒颗粒将不会在导入宿主细胞后合成肝炎病毒蛋白。
可用许多方法引入本发明的疫苗制剂;这些方法包括但不仅限于口服、皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、透皮和鼻腔内途径，还包括亲本野生型肝炎病毒的自然感染途径。
5.1.3.1.3.抗缺陷性肝炎病毒抗体的使用
用本发明的缺陷性肝炎病毒颗粒或其蛋白质进行免疫接种所产生的抗肝炎病毒抗体也可用于免疫诊断、被动性免疫治疗及产生抗个体基因型抗体。
可用本领域内已知的标准技术（如免疫亲合层析法、离心法、沉淀法等）分离所产生的抗体并用于诊断性免疫分析。也可使用抗体监测治疗和/或疾病进程。本领域内已知的任何免疫检测系统（如上文中列出的）均可用于这一目的，它们包括但不仅限于使用放射免疫法、ELiSA法（酶联免疫吸附法）、夹心免疫检测法、沉淀素反应法、凝胶扩散沉淀素反应法、免疫扩散法、凝集法、补体结合法、免疫放射测定法、荧光免疫法、蛋白A免疫测定法及免疫电泳法等的竞争性和非竞争性检测系统。
本发明的疫苗制剂也可用于产生进行被动免疫治疗的抗体，其对宿主的短期保护作用是经给予预先生成的抗异种生物体的抗体而达到的。
本发明的疫苗制剂产生的抗体也可用于制备抗个体基因型抗体。抗个体基因型抗体本身又可用于免疫接种，以产生与病原微生物之起始抗原结合的抗体亚群（Jerne，1974，Ann.Immunol.（Paris）125c：373;Jerne.et al.，1982，EMBO J.1：234）。
5.1.3.2.用作免疫治疗剂
在本发明的这一实施方案中，有效量的本发明之肝炎病毒颗粒（如5.1.2.1.2节中所述），或由缺陷性肝炎病毒基因组编码的蛋白质（其含有一免疫原性抗原决定基）均可用于免疫治疗。在一个实施方案中，免疫原性抗原决定基可以是核心抗原的抗原决定基。在一优选实施方案中，抗原决定基可以是表面抗原的抗原决定基。
因肝炎病毒颗粒或肝炎病毒蛋白能够刺激抗肝炎病毒的免疫反应，故在预防肝细胞瘤中是有效的。实验结果表明，肝炎病毒感染和肝细胞瘤的发生之间在流行病学和分子水平上具有一定的关联。可以单独使用该免疫原，也可以结合使用其他疗法（如化学疗法、放射疗法等）。
在本发明的一个特定实施方案中，可将缺陷性肝炎病毒颗粒或含有免疫原性抗原决定基的蛋白质用作免疫刺激剂，以刺激宿主的免疫系统，增强细胞介导的免疫力并有利于清除特定的感染因子（为甲型肝炎病毒、细胞肥大病毒）。在一优选实施方案中，因为肝炎病毒大多以高浓度见于被感染个体的肝细胞、血和骨髓内，所以可单独使用包装的颗粒缺陷性基因组或与其他疗法结合治疗那些感染上述类型细胞的疾病（如由甲型肝炎病毒、疟疾寄生虫、细胞肥大病毒、EB病毒等引起的疾病）。
5.1.3.3.治疗肝炎病毒感染
因于包装的颗粒缺陷性肝炎病毒基因组能够干扰野生型肝炎病毒的复制，故可作为抗病毒剂用于治疗急性或慢性肝炎病毒感染。本发明的一个实施方案包括可产生缺陷性表面抗原、核心抗原或病毒聚合酶蛋白的肝炎病毒。在本发明的一优选实施方案中，颗粒缺陷性肝炎病毒不能合成病毒聚合酶蛋白，并可编码剪切的表面抗原蛋白和剪切的核心抗原蛋白。该种颗粒缺陷性肝炎病毒可以单独使用，也可以与其他抗病毒剂如α-干扰素和Vidarabine Phosphate等一起使用。
5.2.含有异源顺序之包装重组体颗粒缺陷性基因组的产生和应用
本发明还涉及含异源基因顺序之包装颗粒缺陷性基因组。在本发明的一个实施方案中，可用异源克隆的基因取代肝炎病毒基因组的各种区域（它们包括但不仅限于可通过包装基因组而反过来补充编码病毒功能的区域），这样，当导入某生物体内时，异源基因将在病毒或其他调节顺序的控制下得以表达。在本发明的一个实施方案中，异源DNA顺序被插入肝炎病毒的表面抗原编码区。在本发明的另一实施方案中，异源DNA顺序则被插入肝炎病毒的核心抗原编码区。这样异源基因即可在肝炎病毒启动子控制下得以表达。在另一可供选择的实施方案中，可通过构建适当的重组DNA得以使用异源转录调节区。
这些重组肝炎病毒在治疗上有许多方面的应用。在本发明的一个实施方案中，可使用这些重组肝炎病毒对影响肝脏的疾病或紊乱以及可通过肝脏内酶的产生得以治疗的疾病进行基因治疗（见下文5.2.2.1节）。例如用于治疗因遗传上肝脏酶缺乏、凝血因子缺乏或病原微生物感染引起的疾病。在本发明的另一实施方案中，异源基因可编码肝脏酶或某种对病原因子有毒性的产物。
5.2.1.含异源顺序之重组肝炎病毒基因组的产生
可使用本领域内已知的重组DNA技术产生重组肝炎病毒基因组。可使用的肝炎病毒基因组包括但不仅限于乙型肝炎病毒（HBV）（其可感染人及高等灵长类动物）、地松鼠乙型肝炎病毒（GBHBV）、鸭乙型肝炎病毒（DHBV）和旱獭乙型肝炎病毒（WHBV）。
为便于描述起见可将重组肝炎病毒基因组的产生方法分为下列三个步骤：1）异源顺序的分离;2）重组肝炎病毒DNA的构建;及3）重组肝炎病毒基因组的表达。
5.2.1.1.异源顺序的分离
可分离、使用任何编码蛋白质产物并能在肝细胞内表达的异源DNA顺序。本发明与治疗酶缺乏有关的一个实施方案中（5.2.2.1节），可分离使用任何编码功能性酶（其缺乏构成了机能失调的基础）的异源DNA顺序（这些酶的非限制性举例参见下文5.2.2.1节表Ⅱ）。在本发明的另一个特定实施方案中，使用可编码凝血因子的DNA顺序对遗传性凝血功能紊乱进行基因治疗，因为肝脏恰是生物合成这类因子的正常场所。分离的DNA顺序可编码给定酶的整个蛋白质顺序或代表活性部位之顺序的功能性部分。
异源DNA顺序可编码用于缓解疾病的基因产物。在一个涉及治序因感染病原微生物而引起的肝炎病变的实施方案中，异源基因顺序可编码对病原体有毒性但对宿主无明显损害的产物，而在另一实施方案中，异源DNA顺序则编码可干扰病原体生活史的蛋白质产物。这类DNA顺序可编码某种病原体之改变了的基因产物或“反义”顺序（即可与病原体的功能性核酸杂交的顺序）。
本发明与疫苗的应用有关的另一个实施方案（见下文5.2.2.2节）包括分离一编码异源生物抗原决定基的DNA顺序，当将其引入适当宿主内时，可产生对抗该生物体或由其抗原引起之病理状态的保护性免疫力。在本发明的这一实施方案中，可将包含异源基因顺序的包装重组颗粒缺陷性基因组制成疫苗，用以预防因含有异源基因顺序之病原生物体引起的疾病。这些病原生物体的例子如表1所示。
表1
可由重组肝炎病毒编码抗原决定基的病原生物体
E-B病毒
甲型肝炎病毒
非甲非乙型肝炎病毒
细胞肥大病毒
疟原虫（Plasmodium Spp.，疟疾寄生虫）
在一优选方案中，重组肝炎病毒的异源顺序编码亲肝细胞病原微生物的抗原决定基。
在一特定实施方案中，可分离出编码疟原虫属疟疾寄生虫抗原决定基（其对脊椎动物有免疫原性）的DNA顺序，并可按本发明的方法使用之。可用作DNA来源的疟原虫属寄生虫包括但不仅限于人疟原虫P.falciparum，P.malariae、P.ovale、P.vivax，及动物疟原虫P.berghei、P.yoelii、P.knowlesi和P.cynomolgi。可由重组肝炎病毒表达的抗原或其片段是由疟疾寄生虫在其生活史的任何阶段表达的抗原决定基。在一特定实施方案中，将被表达的异源抗原决定基是疟原虫的环形子孢子（CS）蛋白的抗原决定基（如参见Dame et al.，1984，Science 225：593;Arnot et al.，1985，Science 230：815;Weber et al.，1987，Exp.Parasitol.63：295）。
其他可由重组肝炎病毒表达的抗原决定基包括但不仅限于：A型肝炎病毒抗原的抗原决定基（von der Helm et al.，1981，J.Virol.Methods 3：37-43）;CMV之64-66衣壳糖蛋白上的中和抗原决定基（Plotkin，1985，In The Herpesviruses，Roizman，B.and Lopez，C.，Plenum Press，N.Y.，pp.297-312）;以及EBV膜抗原蛋白（gp340）上的中和抗原决定基（North et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7504-7508）。
可按已知技术分离依据本发明表达之编码异源抗原决定基的基因顺序，这些技术包括但不仅限于由微生物的基因组DNA中纯化、由微生物的RNA进行cDNA合成、重组DNA方法（Maniatis T.et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.）或化学合成。
5.2.1.2.重组肝炎病毒基因组的构建
根据本发明的这一实施方案，重组肝炎病毒基因组的构建包括用编码异源生物体之一个或多个抗原决定基的顺序取代肝炎病毒基因组内的顺序。在本发明的一个实施方案中，异源基因顺序取代了编码表面抗原和病毒聚合酶蛋白的基因。在本发明的另一实施方案中，异源基因顺序取代了编码表面抗原的基因。该方案中的重组肝炎病毒DNA可保留前S顺序，顺序中含有启动表面抗原表达的启动子。本发明的再一个实施方案中，异源基因取代了编码核心抗原的基因。该方案的重组肝炎病毒DNA也可包含启动核心抗原表达的前C顺序。
本领域内已知的许多战略均可用于构建重组肝炎病毒基因。例如可用已知技术，用限制性核酸内切酶在适当位点切断肝炎病毒基因组或异源DNA的相关顺序，然后分离并于细胞外连接之。如果限制性消化后产生了粘性末端，即不必作进一步修饰即可连接。但如果限制性消化后没有产生可利用的粘性末端，或产生优选的方便位点以外的其他位点，则可采用现有技术中的任何一种方法，在如上所述的预期位点（见5.1.1.节）来完成异源DNA的连接。
构建基因融合体的具体战略将取决于被取代或向其中插入异源顺序的特定肝炎病毒顺序，以及欲插入的异源顺序。
5.2.1.3.重组肝炎病毒基因组的表达
用三种通用方法鉴定含有异源基因插入段的肝炎病毒基因组：（a）核酸杂交，（b）有无“标志”基因功能，以及（c）插入序列的表达。第一种方法中，可使用含有与外源插入基因有同源顺序的探针，通过核酸杂交法来检测在肝炎病毒载体中插入的外来基因。第二种方法中，可基于有无因在肝炎病毒载体中插入外来基因而产生的“标志”基因功能来鉴定并选择重组载体/宿主系统。例如，如果外源基因插入到了肝炎病毒的聚合酶基因顺序中，即可根据没有聚合酶活性鉴定含有异源插入段的重组体。第三种方法中，可通过检测由重组体表达的外来基因产物来鉴定重组肝炎病毒。这些检测法可以是基于基因产物的物理学、免疫学或功能特性而建立的。
在下文实施例中详述的本发明特定实施方案中，描述了取代肝炎病毒聚合酶和表面抗原基因之含异源基因顺序重组肝炎病毒基因组的构建、表达和包装。这种包装的重组颗粒缺陷性基因组要求在其增殖的同时将一“辅助”肝炎病毒包装基因组引入给定的细胞系内。6.3节中详细描述了构建这种包装基因组的一个实例，其可为将适当的前基因组RNA包装到病毒粒子中并将RNA转录成病毒粒子DNA提供必要的病毒功能。
一旦鉴定了表达异源基因的肝炎病毒重组体，即可分析基因产物。可使用本领域内基于产物之物理学、免疫学或功能性质的方法进行上述分析。可使用包括层析（如离子交换层析、亲合层析及分子筛柱层析）、离心、差分溶解度及纯化蛋白质的其他常规方法分离并纯化之。
5.2.2.含异源顺序之重组肝炎病毒的应用
5.2.2.1.基因治疗
含有异源基因顺序的重组颗粒缺陷性基因组及其重组体肝炎病毒（即包装的重组颗粒缺陷性基因组）可具有治疗价值。将含有能由宿主细胞表达之异源基因顺序的重组肝炎病毒稳定地掺入宿主细胞（如肝细胞），可能在治疗疾病和功能紊乱上具有很大价值。
为达到基因治疗的目的，可使用许多已知技术将缺陷性重组肝炎病毒DNA导入细胞（如肝细胞）中。使用的技术应能将肝炎病毒顺序稳定地转移到宿主细胞（其包括但不仅限于肝细胞、淋巴细胞和白细胞）内，以使重组肝炎病毒顺序在上述细胞内得以表达。且不致于破坏受体细胞所必备的发育和生理功能。在一优选实施方案中，将重组颗粒缺陷性肝炎病毒DNA包装在病毒颗粒中（如通过使用辅助包装基因组表达来实现），然后这种病毒颗粒即可通过正常肝炎病毒感染途径将其所包含的重组DNA稳定地转移到宿主细胞内。病毒颗粒的使用途径包括但不仅限于肝内、口服、静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内、真皮内及鼻腔内等。
在本发明的具体实施方案中，可使用重组肝炎病毒治疗肝功能代谢失调性疾病。其中一个实施方案中，可用这些重组肝炎病毒治疗因遗传性肝脏酶缺乏引起的肝脏疾病。这些遗传性病征包括但不仅限于表Ⅱ中所列出者（有关对这些病征的详细讨论详见Sharp，1985，In Gastroenterology，Berk，J.E.，ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.3236-3258）。
表Ⅱ
可通过含异源基因顺序之颗粒缺陷性基因
组的表达治疗的疾病或功能紊乱
1.肝脏酶的遗传性缺乏
A.血氨过多
1.遗传性尿素循环酶缺乏症
a.N-乙酰谷氨酸（AGA）合成酶缺乏症
b.氨甲酰磷酸合成酶（CPSI）缺乏症
c.鸟氨酸氨甲酰转移酶（OCT）缺乏症
d.瓜氨酸血症
e.精氨琥珀酸尿症
2.来自分支链氨基酸、奇数链脂肪酸和胆甾醇侧链分解代
谢的遗传性有机酸血症
a.丙酸血症
b.甲基丙二酸血症
c.异戊酸血症
B.婴幼儿胆汁郁积
1.半乳糖血症
2.α-抗胰蛋白酶缺乏症
3.三羧基粪甾烷酸血症
C.Hematomegaly（肝肿大）
1.糖原贮藏性疾病：根据酶缺乏情况分为4个类型
2.果糖不耐受性疾病
3.酪氨酸血症
4.酸性脂肪酶缺乏症
D.少年期后肝脏疾病
1.血色素沉着症
2.威尔逊氏病
Ⅱ.遗传性凝血机制紊乱
A.血友病A-因子Ⅷ缺乏症
B.血友病B-因子Ⅸ缺乏症
C.罕见的遗传性凝血机制紊乱（如血纤维蛋白原缺陷、因子Ⅴ缺陷，因子Ⅺ缺陷等）
可由重组肝炎病毒基因组编码的其他蛋白质包括但不只限于补体成分、中等链酰基辅酶A脱氢酶、低密度脂蛋白受体、胰岛素、消化酶等。
在本发明的另一实施方案中，可使用编码凝血因子之重组肝炎病毒基因的表达来治疗遗传性凝血机制障碍（其例子如表Ⅱ所示，有关这些疾病或紊乱的详细描述可参见Jandl J.H.，1987，In Blood，Textbook of Hematology，LittleBrown and Co.，Boston，MA，pp.1095-1140）。目前的治疗方法是从具有正常因子水平者的血浆内分离特定因子进行取代治疗。但这样接受取代治疗的病人便有可能同时感染供体携带的血源病毒。使用本发明的疗法则可消除这种危险。肝脏是生物合成各种凝血因子如因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ和ⅩⅢ，以及纤维蛋白溶酶原的场所。在一特定实施方案中，重组肝炎病毒颗粒缺陷性基因组的表达可提供一种或多种这类因子。
在本发明涉及治疗酒精中毒性肝脏疾病的特定实施方案中，可使用表达对乙醇有较低km值之突变型醇脱氢酶的重组肝炎病毒，以加速乙醛的生成，因乙醛可使饮酒者恶心呕吐，从而抑制其嗜酒习性。
本发明的另一实施方案涉及用重组肝炎病毒治疗因感染病毒微生物而引起的肝脏疾患。这种重组肝炎病毒可包含表达利于疾病缓解之产物的异源基因，所说的产物对病原体有毒性但对宿主则无明显的不良影响，或者可干扰病原体的生命周期等。根据本发明的这一实施方案，可用重组肝炎病毒治疗之疾病的病原体包括但不只限于表1中所示者。异源基因可编码病原微生物的改变了的基因产物。另外有可能构建表达肝细胞病原体核酸之“反义”顺序的重组肝炎病毒。这种与病原体的RNA或DNA互补的顺序可与病原体RNA或DNA杂交并使之失活，从而抑制病原体核酸的功能或表达，并干扰其生命周期。
为了进行基因治疗，可由本发明的重组颗粒缺陷性DNA表达许多其他异源顺序。例如，为了治疗某种因特定产物过多引起的疾病，可以表达该产物的抑制剂或降解酶，或其合成抑制物。为阻断特定基因的转录过程，可用重组肝炎病毒DNA表达反义寡核苷酸。
5.2.2.2.疫苗应用
根据本发明的这一实施方案，将包含异种生物体之免疫原性抗原决定基的重组肝炎病毒颗粒或蛋白质制成疫苗使用。可使用这类疫苗对抗异种病原微生物的感染（如包括但不仅限于上文表Ⅰ中所示者），或对抗由微生物抗原引起的病理状态或紊乱。这类疫苗可包括活的颗粒缺陷性肝炎病毒疫苗或亚单位疫苗制剂。可使用适当的肝炎病毒包装基因组或其他来源的肝炎病毒蛋白包装肝炎病毒重组体，并将所得病毒颗粒制成疫苗，或者可纯化已表达的含异源抗原决定基的蛋白质用作亚单位疫苗。本发明的疫苗制剂可用于动物和/或人体。
5.2.2.2.1.重组肝炎病毒表达之异源抗原决定基的免疫效
能检测
可在用重组肝炎病毒免疫接种后测试验动物的免疫反应，以检测活疫苗制剂中重组肝炎病毒表达之异源抗原决定基的免疫效能。亚单位疫苗中可用适当佐剂配制以提高免疫反应能力，并可在用分离的重组肝炎病毒的异源产物免疫动物后检测被试动物的免疫反应情况。适用的佐剂包括但不只限于矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼多元醇、聚阴离子、油乳剂、肽类及可用于人体的佐剂如BCG（卡介苗）和微小棒状杆菌（Corynebacterium Parvum）。试验动物包括黑猩猩及其他灵长类，如果肝炎病毒是HBV则可以是人类受试者。也可将经基因重组构建的含有异种生物抗原决定基的其他肝炎病毒如DHBV、GSHBV和WHBV用于疫苗制剂中，分别免疫鸭、地松鼠或旱獭，以对抗异种生物体的感染。引入免疫原的方法包括但不只限于口服、皮内注射、肌肉注射、腹腔内注射、静脉注射、皮下注射、滴鼻及其他常规免疫接种法。
可用各种方法分析受试者的免疫反应，如：（a）用已知技术，如酶联免疫吸附法（ELiSA）、免疫印迹法、放射免疫沉淀法等分析所得免疫血清对含有异源抗原决定基的天然抗原或其片段、或天然存在之异种生物体的反应活性;（b）用已知技术，如胚变反应测定法、细胞毒性检测法、迟发型超敏感性检测法等分析自免疫受体内分离之淋巴细胞对天然抗原或其片段、或异种生物体的反应活性;（c）免疫血清体外中和生物体感染性或天然抗原生物学活性的能力，以及（d）免疫接种动物对抗疾病的能力和/或感染症状缓解情况。
5.2.2.2.2.疫苗的配制
在本发明的一个实施方案中，将表达异种生物体抗原决定基的重组肝炎病毒配制成活疫苗使用。在另一实施方案中，则可将这种重组体病毒的蛋白质产物配制成亚单位疫苗。活疫苗或亚单位疫苗可以是多价或单价的。本发明的疫苗制剂可用于人和/或动物。
5.2.2.2.2.1.活疫苗制剂
该实施方案的目的是配制一种疫苗，其中的免疫原是一种包装的重组颗粒缺陷性基因组，其包含编码异种生物体之抗原决定基的顺序并能在体内表达，从而引发对异源抗原决定基的免疫反应（体液免疫和/或细胞免疫），以对抗该生物体的感染或由该生物体之抗原引起的疾患。这种活疫苗将使颗粒缺陷性基因组导入敏感细胞并在其中表达，但不会发生再次感染。
活疫苗制剂可以是单价或多价的。可由单个或少数几个编码一个或多个异源抗原决定基的包装的重组颗粒缺陷性基因组（其可以是不同生物体的）制备多价疫苗。单个重组肝炎病毒基因组可编码同一或不同抗原的一个以上的抗原决定基。
可用许多方法引入本发明的活疫苗，这些方法包括但不只限于口服、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、皮下植入、经鼻腔途径以及亲本野生型肝炎病毒的自然感染途径。
5.2.2.2.2.2.亚单位疫苗制剂
作为配制活疫苗的另一方法，可使用异源肽或蛋白质作为亚单位疫苗制剂（其可以是多价的）中的免疫原。如前所述，亚单位疫苗只含有免疫宿主所必需的相关免疫原性材料。因此可使用现有技术中的已知方法，由表达异种抗原决定基的重组肝炎病毒中纯化这些可以是重组融合蛋白的异种蛋白质。
将纯化的蛋白质调到适当浓度，加入适当的疫苗佐剂配制并包装备用。适用的佐剂包括但不仅限于上文5.2.2.2.1.节所述者。疫苗制剂中的免疫原也可以与脂质体、或与多糖和/或其他聚合物合并使用。
可用许多方法引入上述疫苗制剂，这些方法包括但不只限于口服、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下及鼻腔内途径等。
5.3.重组肝炎病毒抗体的使用
也可将用本发明的重组肝炎病毒进行免疫接种而产生的抗异种生物体抗体用于免疫诊断、被动免疫治疗、及产生抗个体基因型抗体。
可使用现有技术中的标准方法（如免疫亲合层析法、离心法、沉淀法等）分离所产生的抗体，并用于诊断性免疫检测法中以检测存在于人或动物组织、血液、血清内具有医学或兽学重要性的病毒颗粒、细菌或寄生虫。也可用所得抗体监测治疗和/或疾病的进程。为此目的而使用的已知免疫检测系统包括但不仅限于使用放射免疫法、ELlSA（酶联免疫吸附法）、“夹心”免疫检测法、沉淀素反应法、凝集法、凝胶扩散沉淀素反应法、免疫扩散法、补体结合法、免疫放射测定法、荧光免疫法、蛋白A免疫检测法及免疫电泳法等的竞争性和非竞争性检测系统。
本发明的疫苗制剂还可用于产生进行被动免疫治疗的抗原，其中对宿主的短期保护是通过给予抗异种生物体的预制抗体达到的。
由本发明的疫苗制剂产生的抗体也可用于生产抗个体基因型抗体。然后可反过来再用抗个体基因型抗体免疫接种，以产生与病原微生物之起始抗原结合的抗体亚群（Jerne，1974，Ann.Immunol.（Paris）125c：373;Jerne.et al.，1982，EMBO J.1：234）。
6.缺陷性肝炎病毒的产生
在本文详述实施例中，使用鸭模型系统，通过构建两种类型的缺陷性鸭乙型肝炎病毒基因组进一步阐明了本发明。第一种类型的颗粒缺陷性DHBV基因组缺失编码聚合酶蛋白、核心抗原和/或表面抗原的基因（见图1）。这些基因组不能自身复制，但在各种情况下均可产生具有适当顺式功能信号的前基因组RNA，以适应在病毒颗粒中包涵RNA并反向转录为DNA的需要。第二种类型的缺陷性DHBV基因组即包装基因组，其缺失DHBV基因组的DR1区域。这些突变体基因组反过来可为病毒提供将适当前基因组RNA包装到病毒颗粒内及将RNA转录成病毒粒子DNA所必需的所有功能。但突变的基因组本身并不能反向转录成基因组DNA。
6.1.通用方法
6.1.1.细胞
由C.Koiki愽士（Department of GeneResearch，Cancer Institute，Tokyo，Japan）处得到人肝肿瘤细胞系HuH7（Nakabayaski et al.，1982，Cancer Res.42：3858-3863）并在Dulbecco 氏改良的Eagle培养基（DMEM）：加有10%胎牛血清的F12（FBS）（G1BCO，Grand Island，NY）中扩增。用胶原酶灌注法（Tuttleman et al.，1986，J.Vorol.58：17-25）从2周令北京鸭（得自W.Mason愽士，Fox Chase Cancer Center，Philadelphia，PA）的肝脏中分离用于建立初级鸭肝细胞培养物的肝细胞。在加有10mM碳酸氢钠、1.5%（V/V）二甲亚砜（DMSO）、5%FBS及前述添加物（Tuttleman et al.上述文献）的无血清L15培养基（G1BCO，Grand Island，NY）中增殖初级鸭肝细胞。然后在含5%CO2（V/V）的孵箱内于37℃下保温。
6.1.2.质粒
由在EcoRⅠ位点，p5.2Gal×1处克隆到质粒pSP65载体中的DHBV基因组DNA得到用于构建缺陷性DHBV基因组的DHBV顺序，该顺序衍生于Mandart等人用来测定DHBV DNA核苷酸顺序的病毒颗粒DNA克隆（Mandart et al.，1984，J.Virol.49：782-792）。
6.1.3.DNA的制备、限制性消化和修饰
限制性酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶及大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段均购自New England Biolabs（Beverly，MA）。除特别指出外，酶反应均按提供者建议的条件完成。
限制性酶消化后分离DNA片段，并在TBE缓冲液（0.01MTris-硼酸盐、PH8.2，1mMEDTA）中使用5%聚丙烯酰胺凝胶，或在Tris-醋酸盐缓冲液（0.02M Tris-醋酸盐、0.05M醋酸盐、1mM EDTA、PH7.4）中使用0.8%或1.5%琼脂糖凝胶经凝胶电泳纯化之。可在紫外光下观察于PEI（聚乙烯亚胺）薄层层析板上显现的DNA片段负性阴影、亦可用溴化乙锭染色直接观察DNA片段。可在TBE缓冲液中以200V室温下电洗脱2小时，或者用苯酚提取液化的凝胶，由低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段。
采用β-氰乙基氨基磷酸酯化学法（Sinha et al.，1984，Nucl.Acids Res.12：4539-4544），在Applied Biosystems公司生产的380B型合成仪中基于0.2微摩尔规模合成寡核苷酸。在TBE缓冲液中使用聚丙烯酰胺/8M尿素凝胶经凝胶电泳分离并纯化寡核苷酸，然后在紫外光照射下在PEI薄层层析板上显示出寡核苷酸的负性阴影。在TBE缓冲液中以200V室温电洗脱2小时以回收寡核苷酸。
6.2颗粒缺陷性DHBV基因组的构建
用Kpn I消化野生型基因组，在四种dNTP存在下用T4聚合酶处理，再用T4DNA连接酶闭合质粒环（见图1b）以产生缺失聚合酶和表面抗原（即被膜）基因（pol-，env-）区的颗粒缺陷性DHBV基因组。先用Kpn′I消化DHBV基因组、导致KpnI限制性切点丢失并产生Kpn-基因组，得到缺失所有三个病毒基因编码区的pol-env-core-突变DNA（称为Kpn-Sph-）（图1b）。再用SpnI消化Kpn-基因组，并在四种dNTP存在下用T4聚合酶处理之。然后用T4 DNA连接酶闭合质粒环。
用EcoRV部分消化野生型基因组以产生pol-突变基因组（称为RV-718）或core-突变基因组（称为RV-2650）（图1b）。为此目的，于37℃下用2单位EcoRV将5μg野生型DHBV DNA消化15分钟。然后在dGTP存在下于T4 DNA聚合酶反应混合物中保温此部分消化产物。
可采用下列战略使所有颗粒缺陷性DHBV基因组二聚化。第一是使用部分EcoRI消化，其中于37℃下用2单位EcoRI消化5μg DHBV DNA，从而在侧接基因组的两个EcoRI位点之一处切断质粒。在1%琼脂糖中经溴化乙淀荧光染色法鉴定线性化的DNA，并在TBE缓冲液中室温下以150V电洗脱2小时回收之。然后用细菌碱性磷酸酶处理分离出的线性质粒并与在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上纯化的相应EcoRI酶切的单体基因组相连接。二聚化的第二种战略是使3至10倍过量的EcoRI酶切并经电泳纯化的单体与EcoRI-细菌碱性磷酸酶处理的pSP65DNA相连接。
经转化到大肠杆菌HB101细胞内以扩增克隆到pSP65中的缺陷性DHBV基因组。然后对质粒DNA进行限制性酶切分析以鉴定二聚体克隆。
6.3.DHBV包装基因组的构建
首先将包含在野生型基因组BamHI位点（在1658位核苷酸处）和EcoRI位点（在3021位核苷酸处）之间的远端部分插入到没有AccI限制性位点的pBR322衍生物中，以产生在称为△DR1基因组的DR1中有缺失的（见图1c）DHBV基因组。此可通过AccI消化、用Klenow酶充填并使用T4连接酶连接而完成，如此删除pBR322核苷酸651和2246之间的顺序。然后用Af1Ⅱ和AccⅠ自重组质粒上切下（分别在核苷酸2526和2577处切断质粒DNA）含DR1区域（核苷酸2535-2546）的野生型DHBV基因组部分，并用准确缺少DR1之12个碱基对的双链合成DNA片段取代之。最后，将DHBV基因组含上游端连接质粒顺序的近端部分作为BamHI片段插入唯一BamHI位点。
同减毒的DHBV基因组一样，也可采用6.2.节中所述的任一种战略使△DR1基因组二聚化。通过转化到大肠杆菌HB101细胞内来扩增已克隆到pSP65中的△DR1基因组。可根据DR1缺失位置上是否存在新的HinfI位点来鉴定二聚体克隆。
6.4.缺陷性DHBV基因组的表达
用钙沉淀法（Graham and van der Eb，1973，Virology 52：456-467）将颗粒缺陷性和包装基因组DHBV DNA（3μg）转移到HuH7细胞上。五天后，根据HBcAg和/或HBsAg的存在监测颗粒缺陷性和包装基因组DHBVDNA的表达情况。在95%（V/V）乙醇：5%（V/V）冰醋酸中于-20℃下固定细胞。使用兔抗HBcAg或HBsAg抗血清（由W.Mason愽士提供，Fox Chase Cancer Center Philadelphia，PA）和若丹明结合的羊抗兔IgG（Tuttleman et al.，1986，J.Virol.58：17-25），以间接免疫荧光法检测HBcAg和/或HBsAg。
6.4.1.颗粒缺陷性DHBV基因组的表达
用免疫荧光素染色法进一步证明了缺失核心抗原编码区（图2，RV-2650）的颗粒缺陷性DHBV DNA不能产生核心抗原（参见图2）。还使用免疫荧光素染色法进一步证实了缺失表面抗原和聚合酶蛋白编码区（Kpn-DNA）以及缺失核心抗原、表面抗原和聚合酶蛋白编码区（Kpn-Spn-DNA）的颗粒缺陷性DHBV DNA不能产生表面抗原。RV-2650突变DNA能产生表面抗原，而缺失聚合酶蛋白编码区（RV-718）和Kpn-基因组的颗粒缺陷性DHBV能产生预期的核酸衣壳（核心）蛋白。Kpn-Sph-编码剪切的表面抗原和剪切的核心抗原，但并不能用免疫荧光法检测出来。
6.4.2.包装基因组的表达
如上所述，包装基因组缺失了一特定的病毒顺序即称为DR1的12碱基对直接重复顺序，而该顺序是全合成双链病毒DNA所必需的。用磷酸钙沉淀法（Graham and van der Eb，1973，Virology 52：456-467）将包装基因组转染到HuH7细胞内。五天后用HBS（12mM Hepes、0.15M NaCl、PH7.45）洗细胞，并向细胞内直接加入1ml溶解缓冲液（10mM Tris-HCl（PH7.9）、1mMEDTA、0.1%（W/V）NP-40、50mM NaCl、8%（W/V）蔗糖）。于37℃保温10分钟后除去溶胞产物，并在Beckman B型微量离心机中以13，000rpm离心2分钟沉淀核及其他不溶性材料。然后用下述方法分离出含有DHBV DNA合成中所有中间体的病毒核心颗粒。除去上清液并加入醋酸镁（MgAc2）至终浓度为6mM。在100μl含50mM Tris-HCl（PH7.9）6mM MgAc2的溶液内加入脱氧核酸酶I（DNase Ⅰ-Sigma Ⅱ型）至浓度为100μg/ml。悬浮液于37℃消化10分钟后加入8%聚乙二醇-8000和0.5M NaCl沉淀病毒核心。在微型离心机中4℃离心收集沉淀物并溶解于含50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、0.1M NaCl和100μg/ml DNase I的0.3ml缓冲液中。37℃保温30分钟后，将反应混合物调整为含15mM EDTA、0.5%SDS和500μg/ml链霉蛋白酶（pronase）。37℃保温30分钟后，用等体积苯酚提取样品。用乙醇从水相中沉淀核酸，溶解于10mM Tris-HCl（PH7.5）、1mM EDTA中，并使用Tuttleman等人（1986，J.Virol.58：17-25）所述的条件在1.5%（W/V）琼脂糖凝胶中电泳。电泳后，将凝胶在0.5N NaOH、1.5M NaCl中浸泡30分钟并使用Southern吸印转移法（Southern，1975，J.Mol Biol.98：503-517）将其转移到0.2M Tris-HCl（PH4.0）、1.5M NaCl中的尼龙薄膜（Hybond N，Amersham）上。转移后用2×SSC简单冲洗滤膜，然后风干并暴露于紫外光源（240-390nm）下5分钟，以使DNA共价交联到滤膜上。于50℃使滤膜与加有链极性的32P标记的DHBV核苷酸探针杂交。于-80℃下使用柯达X-OMAT胶片和增光屏进行放射自显影。
图3泳道5所显示的结果表明，尽管形成了一些单股负链DNA（SS），但该突变DNA并不产生完整的松环DNA（RC）。泳道3的比较实验显示，用同等量野生型病毒DNA转染细胞后产生了复制性中间体。
用固定细胞的间接免疫荧光素染色法检测病毒衣壳和壳包核酸蛋白的产生，以分析这些转染后的细胞（图4）。似乎△DR1转染的细胞产生的核心（C）和表面（S）抗原量与野生型细胞产生者相当。
6.5.△DB1对DNA合成所需病毒功能的补偿
在共转染实验中，试验了△DR1补充病毒DNA合成功能的能力。将在核心抗原（RV-2650）、病毒聚合酶（RV-718）、病毒RNA聚合酶和表面抗原合成（Kpn-）中有缺陷的简单移码突变DNA及不足以合成所有这三种已知病毒蛋白（Kpn-Sph-）的突变DNA（见图1b）连同包装基因一起共转染到HuH7细胞中。所有这些情况下，△DR1均能弥偿这些缺陷性基因组，以产生完整的松环病毒DNA（见图3和5）。
另外还显示，这些颗粒缺陷性DHBV基因组也可以相互补偿。例如，当core-突变DNA与pol-突变或Kpn-突变DNA共转染时，它能够补偿这些DNA的缺陷，以产生病毒DNA（图5，泳道7和9）。
6.6.由转染的HuH7细胞及缺乏感染性的△DR1、Kpn-和Kpn-Spn-上清液转染的细胞产生感染性病毒颗粒
培养的HuH7人肝细胞瘤细胞可产生能够感染初级鸭肝细胞的病毒颗粒。用大约5×106个HuH7细胞接种100mm平皿，24小时后用1.5、3和6μg克隆的野生型二聚DHBV DNA转染之。转染后48小时换培养基（DMEM：F12+10%FBS）（G1BCO，Grand Island，NY），继续培养3天后除去培养基，等量分配到含初级鸭肝细胞（48小时前制备的）的3×60mm平皿上。于37℃用HuH7培养基感染肝细胞20小时。感染后第12天用Tuttleman等人（1986，J.Virol.58：17-25）所述的方法收获细胞，用Southern印迹杂交法（见6.4.2节）根据DHBV DNA复制中间体的存在分析总细胞内DNA。图6显示培养物中出现了病毒DNA，表明HuH7培养物上清中已存在感染性病毒。单用△DR1 DNA，或用Kpn-或单用Kpn-Sph-突变DNA转染，没有显示存在复制性中间体（图6）。因此，HuH7细胞能够由野生型克隆的DHBV DNA产生感染性DHBV，且如所期望的，这些细胞没有由△DR1、Kpn-或Kpn-Spn-突变DNA产生感染性病毒，因为前者是有复制缺陷的。
6.7.细胞与△DR1基因组和颗粒缺陷性基因组共转染之后感染性病毒的产生
为了检测由与包装基因组和颗粒缺陷性基因组共转染的细胞感染性病毒的产生，构建了另一个颗粒缺陷性基因组，命名为S1。基因组S1被专门设计为被膜产生缺陷性，而DNA合成完全胜任性的（例如，env-pol+）。在S1突变型中保持了聚合酶功能，从而使病毒DNA的复制和病毒基因产物的产生比被膜和聚合酶功能均缺失的颗粒缺陷性基因组（例如，Kph-）有所提高。
S1颗粒缺陷性基因组是由野生型DHBV基因组DNA（见上文，6.1.2节）通过用相应大小的合成连接子取代位于野生型顺序的1290位和1358位之间的核苷酸来制备的，合成连接子在1326与1350位之间含有特异的核苷酸取代，如图8（a）所示。对野生型顺序进行了特殊的突变以生成S1，见图8（a），突变后在被膜开放读码内产生了终止密码子，而未改变重叠聚合酶开放读码的氨基酸编码，用6.2节所述的方法，通过使1S基因组在pSP65载体内形成二聚体构建了质粒形式的1S颗粒缺陷性基因组，命名为pSPDHBV.1S。
含有质粒pSPDHBV.1S的二聚体在HuH7细胞中通过钙沉淀转染（上文，6.1.1.节）。用6.4.2节所述的方法，通过Southerm印迹杂交测定转染的细胞中的病毒复制型，结果示于图8（b），泳道1和2。如图8（b），泳道1和2所示，用1S缺陷性基因组转染的HuH7细胞基本上含有野生型水平的松环（RC）和单股（SS）复制型病毒DNA。转染的HuH7细胞的免疫染色分析（未示出）呈现了核心抗原的累积和可检测表面抗原的缺乏。
由于在1S转染的HuH7细胞中缺乏可检测水平的表面抗原，所以转染子不能产生感染性病毒颗粒。通过从培养的转染子中回收上清液和用它感染初级鸭肝细胞的培养物（见上文，6.1.1节）证实了感染性颗粒在1S转染的HuH7细胞中的缺失。用Southern印迹杂交法测定感染的鸭肝细胞培养物中的病毒复制型，未测出病毒DNA，图8（b），泳道5。
为了估价1S缺陷性基因组被包装基因组△DR1的互补，△DR1质粒二聚体（见上文，6.3.节）与质粒pSPDHBV.1S一起共转染到HuH7细胞中。三天以后，回收培养基上清液并用于感染初级鸭肝细胞培养物。在感染后第12天，收集感染的鸭肝细胞并通过Southern印迹杂交（6.4.2节）测定总胞内DNA中DHBV复制中间体的存在。如图8（b），泳道7所示，在感染的鸭肝细胞中能检测到新合成的病毒DNA以松环和单股两种形式并存。有核心抗原存在的感染的鸭肝细胞层的免疫染色（图9）呈现了可检测的核心抗原水平等于或大于在用野生型DHBV感染的对照细胞中观察到的水平。具有抗被膜抗血清的同样细胞群体的免疫染色未呈现任何可检测的表面抗原，其与1S基因组的env-基因型一致。结果表明△DR1可反过来提供颗粒缺陷性1S基因组所缺少的被膜功能，并且HuH7细胞能够在与颗粒缺陷性基因组和包装基因组共转染之后产生感染性颗粒。产生的感染性颗粒可感染初级鸭肝细胞以在鸭肝细胞内产生病毒复制型。
6.8.干扰野生型病毒的产生
为了将重组DHBV基因组用作转导异源DNA的载体，在缺陷性转导基因组中必须存在前基因组转录、包装和反向转录所不可少的DHBV顺序。因为可通过△DR1的DNA合成反过来补偿突变基因组pol-env-（Kpn-）、pol-env-core-（Kpn-Sph-）、pol-和core-等缺陷，所以它们须包含这些必要的顺序。然而，其中某些依赖于病毒开放读码的突变似乎以一种优势方式干扰由野生型病毒合成DNA和感染性颗粒。图3中（泳道1、2或3、4）显示了这种干扰的一个例子。当使用6.6节中所述方法将Kpn-Sph-突变DNA与野生型DNA一起共转染到HuH7细胞内时，病毒DNA合成被抑制约20倍。我们还观察到（如用免疫荧光素染色法检测到的）核心抗原的产生也受到抑制。当根据初级鸭肝细胞的感染性分析这种共转染得到的培养液时，我们发现与野生型转染的细胞相比，由Kpn-Sph-+野生型共转染的细胞释放的感染性病毒的效价明显降低（图7，与泳道5和6相比较的泳道1和2）。用Kpn-突变基因组则可见到相似但较弱的效果（图7，泳道1和2与泳道3和4比较）。某些突变DNA干扰野生型病毒复制可以解释为什么我们观察到各种突变体能以不同的效率相互补偿。
7.λ-DHBV重组体的产生
在这些实施例中我们描述了含异源λ基因序列之重组DHBV基因组的产生、表达和包装。在DHBV基因组编码表面抗原和病毒聚合酶蛋白的区域中造成缺失，然后将不同大小的噬菌体λ基因组DNA的片段插入该区域内。
7.1.一般方法
7.1.1.细胞
由Koiki愽士（Department of Gene Research，Cancer Institute，Tokyo，Japan）处得到人肝细胞瘤细胞系HuH7（Nakabayashi et al.，1982，Cancer Res.42：3858-3863），并在加有10%FBS的DMEM：F12（1∶1，V/V）（G1BCO，Grand Island，NY）中增殖之。
7.1.2.DNA制备、限制性酶切与修饰
由在EcoRI位点克隆到质粒pSP65载体中的DHBV基因组DNA得到用于构建重组体的DHBV顺序。λ基因组DNA、限制性酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段均购自New England Biolabs（Beverly，MA）。除特别指出者外，酶反应均在提供者指定的条件下进行。
经限制性酶消化后，在TBE缓冲液（0.01M Tris-硼酸盐（PH8.2）、1mM EDTA）中用5%聚丙烯酰胺凝胶以凝胶电泳法分离并纯化DNA片段。可在紫外光下通过PEI（聚乙烯亚胺）薄层层析板肉眼观察DNA片段所显示的负性阴影。室温下在TBE缓冲液中以200V电洗脱2小时以回收DNA片段。
7.2.λ-DHBV重组体的构建
经用Kpn I消化野生型DHBV基因组删除编码聚合酶蛋白和表面抗原的顺序，以产生λ-DHBV重组体。用大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段填补线性化的质粒。然后用T4DNA连接酶将噬菌体λ的片段连接到该质粒（在核苷酸1290处）中。含有180bp HaeⅢλ片段或1000bp HaeⅢλ片段的λ-DHBV重组体分别被定名为Kpn-+180和Kpn-+1000。
同颗粒缺陷性DHBV基因组和△DR1突变体一样，也使用6.2节简述的两种战略之一使λ-DHBV重组体二聚化。通过转化到大肠杆菌HB101细胞内扩增已克隆到SP65中的λ-DHBV重组体。然后用质粒DNA的限制性酶切分析法鉴定二聚体克隆。
7.3.重组体λ-DHBV基因组的表达
使用磷酸钙沉淀法（Graham and van der Ed，1973，Virology 52：456-467）将λ-DHBV基因组与包装基因组共转染到HuH7细胞中，以表达重组的λ-DHBV基因组。使用6.4.2节中描述的方法经Southern吸
印杂交监测λ-DHBV重组体的表达。如图3泳道8所示，含有λ（Kpn-+180）之180bp HaeⅢ的λ-DHBV重组体被包装在病毒颗粒中，但其包装能力约低于Kpn-突变体达50倍。含有λ（Kpn-+1000）之1000bpHaeⅢ片段的λ-DHBV重组体则未被包装（见图3泳道7）。这些结果表明对包装基因组有一个大小约束，而且就这个系统来说，对包装约3000bp之基因组的最大长度有着严格的限制。为了插入较大的异源片段，应删除较大的DHBV片段和/或将DHBV DNA克隆到可能对大小限制较小的其他载体中。
8.0能够生产缺陷性肝炎病毒的稳定细胞系的产生
暂时表达系统有一些固有的缺陷，主要是转染效率太低。因此，希望将本发明的一个或多个缺陷性肝炎病毒基因组掺入永久性的稳定转染细胞系中。含有正确的遗传信息的稳定转染的永久性细胞系可以基本上持续的方式生产病毒颗粒。
本发明的范围包括用肝炎病毒包装基因组稳定转染的永久性细胞系，从而产生“包装细胞系”。包装细胞系稳定地转染了对病毒功能提供反式互补作用的遗传信息，这些功能是转染至包装细胞系中的第二缺陷性肝炎病毒基因组所必需的。更具体地说，将颗粒缺陷性基因组转染至包装细胞系中，能够通过“包装的”基因组提供所需的反式辅助功能，使得输入的基因组被包装和反转录，以产生携有颗粒缺陷性基因组的传染性缺陷性病毒颗粒。存在于包装细胞系中的包装基因组本身不能以传染性颗粒的形式回收，因为包装基因组缺乏顺式作用的顺序，而不能自我复制成双链DNA。
与此相似，携有异源基因顺序的颗粒缺陷性肝炎病毒基因组（5.2节，见上），在基因组导入包装细胞系及互补了颗粒缺陷性基因组所需的功能后，能够以传染性病毒颗粒的形式增值和回收。
本发明进一步涉及永久性细胞系的产生和使用，它稳定地含有一个以上的缺陷性肝炎病毒基因组，以及使用这种细胞系作为“生产”细胞系以产生缺陷性肝炎病毒颗粒。具体地说，生产细胞系可含有稳定地掺入其中的包装基因组的颗粒缺陷性基因组。生产细胞系能以基本上连续的方式包装和产生包装的颗粒缺陷性基因组，而不需要进行重复转染。
在所有细胞系都能够包装和产生传染性缺陷性基因组颗粒的情况下，用已知方法可从转染细胞的培养上清中回收颗粒。
8.1方法
8.1.1.细胞
HepG2细胞系是可得自许多实验室的人肝癌细胞系。
HepG2细胞保留了许多初级肝细胞的形态特征。以前已经证实，HepG2系用二聚体形式的野生型HBV DNA转染后能够产生野生型病毒。例如参见Sells等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84：1005，1987。迄今为止已经确定，HepG2细胞系的细胞不含有内源HBV DNA顺序。
8.1.2.含有包装基因组二聚体和选择标记的质粒载体的制备为了用包装基因组△DR1转染HepG2细胞系，首先构建称为pHBV △DR1 Neo（图10）的质粒载体。载体pHBV△DR1 Neo含有二聚体形式的人HBV△DR1包装基因组，并进一步含有在SV40启动子调控下的抗生素（新霉素）抗性基因。
图11和下面的描述说明了利用已知的实验程序构建pHBVDR1Neo的可重复的方法。由大肠杆菌质粒pSP65上切下携有氨苄青霉素抗性的479bpXmnI-BglI片段，质粒骨架用DNA聚合酶I的Klenow片段填平，使平头末端与来自pBR328并携有氯霉素抗性的2057bpClaI-XmI片段连接。用得到的质粒构建体转化大肠杆菌HB101，使之变为氯霉素抗性。构建体pSPCAM没有限制性酶FspI的限制位点，但携有一个来自pSP65的多人工接头区。
然后，用一个266bp的片段取代pSPCAM多人工接头区域中的Hinc-XbaI片段，该266bp片段相应于野生型HBV基因组的1726-1992位，它是由野生型HBV二聚体质粒中作为DraI-XbaI片段得到的。用得到的CAMR构建体转化大肠杆菌HB101，使之成为氯霉素抗性。将CAMR构建体中266HBV顺序的一部分作为FspI-StyI片段切下来，这部分顺序中在1826-1837位（包括两头）含有DR1顺序，所切下的片段包括1804-1884位核苷酸。用一个同源的合成片段取代切下的片段，该合成片段精确地缺失了1826-1837位核苷酸，而且，其中精确地再生有FspI和StyI位点，以用于将合成片段以正确定向插入质粒构建体中。去掉1826-1837位核苷酸使构建体中缺失了DR1顺序。
利用应用生物系统公司（Applied Biosystems）的L80A型合成仪通过互补链合成法制备FspI-StyI合成片段。利用标准方法使链去阻断，并进行凝胶纯化和磷酸化，最后退火。为了从产生的克隆中鉴别正确的缺失片段，用32P标记的片段原位探测重组体，该探针含有连在一起的来自DR1缺失两端各10个碱基。在降低的温度下（在T融解10℃以下）进行杂交，在此温度下，探针不能与野生型HBV杂交。然后在测序凝胶上分析携有正确缺失的阳性克隆，以隆定DR1顺序的精确缺失，从而鉴别出△DR1突变体。
使携有合成片段的CAMR重组体与XbaⅠ和HindⅢ反应，以切下含有包括△DR1区域的加入的HBV顺序的大片段，以及在片段末端邻接HindⅢ限制位点的额外的构建顺序。用此片段取代pSP65中的HindⅢ-XbaI片段。在pSP65重组载体中插入来自野生型HBV二聚体的含有2143-3182位核苷酸的XbaI-EcoRI片段，以及来自野生型HBV二聚体的含有1992-2143位核苷酸的XbaI片段。以图11所示的定向使片段连接。利用相应的标记的野生型HBV探针通过杂交法鉴别含有所有片段的阳性重组体，通过顺序分析以证实定向。
从重组体中切下含有1804-3182位核苷酸的FspI-EcoRI片段。首先使此片段与野生型HBV二聚体质粒的HindⅢ-FspI消化产生的HBV5′片段连接，然后如图11所示通过三分子反应使其插入pBR322的骨架中。pBR322骨架是如下制备的，从pBR322中切下EcoRI-HindⅢ片段以在骨架上产生EcoRI和HindⅢ的粘性末端。利用相应于两种顺序的探针，由三分子反应中鉴别含有正确的3′和5′HBV顺序的重组体。通过如下方式使△DR1基因组二聚化，即用EcoRI部分消化重组单体，然后插入第二个EcoRI-EcoRI片段，它相应于来自另一个单体的第二个△DR1基因组。通过微量质粒DNA制备和琼脂糖凝胶分离鉴别二聚体质粒，并利用限制性分析证实正确的结构定向。
从完整的二聚体上切下ClaI-SalI片段，该片段位于二聚体中串联的△DR1之外并且不干扰它。用含有细菌新霉素抗性基因的ClaI-SalI片段取代此片段，该基因在SV40启动子的调控下。含有受SV40启动子调控的细菌抗生素抗性基因的质粒源是可以得到并众所周知的。参见例如Southern和Berg，1982，J.Mol.Applied Genet.1：327。产生的载体命名为pHBV△DR1Neo。
当然，通过已知方法可以制备其他载体，这些载体包括缺陷性病毒基因组二聚体和选择标记。载体pHBV△DR1Neo在这儿只是作为一个合适载体的例子进行了描述。
8.2人包装细胞系的生产和分析
为了说明本发明包装细胞系的生成，用质粒pHBV△DR1Neo转染永久性人肝癌细胞系HepG2。
在转染之前，将培养的HepG2细胞以2×106个细胞接种在10cm培养皿上，其中含有Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基（DMEM：F12）（Gibco，Grand Island，New York）及10%小牛血清。用此培养基作为HepG2系的正常载体。转染前的早晨更换培养基，通过磷酸钙沉淀法进行转染。在3个10cm的培养皿中，每个用8μg质粒DNA转染，在8小时后更换培养基。转染两天后，从汇合平皿上胰酶消化下细胞，然后以每平板350，000细胞，每平板175，000细胞和每平板75，000细胞的密度接种在含有750μg/ml G418的培养基（Gibco：Grand Island，New York）中。每3-4天用含有新鲜药物的培养基饲喂细胞3周，3周以后，只有存活的细胞以分离的集落存在。然后从培养基中去掉G418再饲喂细胞一周，一周以后，用克隆环挑出集落，并在含有5mMEDTA的PBS中于37℃下保温几分钟。然后将细胞转移至24孔微量滴定板上，其中含有DMEM：F12及10%小牛血清，细胞每3-4天饲喂一次。
为了筛选转染细胞以生产乙肝表面抗原，使微量滴定板孔中的细胞持续生长，直到足以产生呈酸性的培养基，表明达到了合适的细胞密度。然后收集细胞培养基以检测其中的乙肝表面抗原，并用新鲜的培养基取代。利用市售可得的固相放射免疫检测药盒（Connaught Laboratories）基本上按照商品说明进行培养基的乙肝表面抗原检测。通过放射免疫检测法分析了大约200个不同孔中的转染子，鉴别出了5个阳性克隆，它们的计数两倍于本底之上。然后，进一步检测阳性克隆生产乙肝“e”抗原（前核心蛋白;“HBeAg”）的能力。
测试孔中对乙肝表面抗原呈阳性的培养基，用抗eAg抗体夹层法（Abbott Laboratories Diagnostic Kit-Abbott Laboratories，Abbott Park，Ill.）检测HBeAg。在5个检测为HBsAg阳性的克隆中，只有一个克隆表现产生HBeAg的强烈阳性。这个克隆定名为HepB1-2，通过再克隆进行扩增。再次测定HepB1-2产生HBsAg和HBeAg的能力时都呈现强烈阳性。
对HepB1-2细胞系进行分析以进一步对该细胞系定性，包括培养上清的免疫荧光分析、电镜分析及核酸分析。
HBsAg的免疫荧光染色分析在固定的HepB1-2细胞上进行。用同样的方法检测HepG2细胞作为对照。在每一种情况中，细胞用95%冷乙醇/5%冰醋酸固定在玻片上。平板于-20℃置于固定溶液中两天，然后用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤并风干。然后，使玻片与山羊多克隆抗HB表面抗原（DAKO，Santa Barbara，Cal.）溶液于37℃保温2小时，用PBS洗涤，然后与荧光素偶联的兔抗山羊抗血清（DAKO）于37℃保温2小时。然后用表面荧光显微镜检查细胞。在所有测试的细胞中，HepB1-2细胞都呈现一致的胞质免疫荧光图型，表明HepB1-2克隆扩增的所有细胞都是来自同一个原始克隆。作为对照的HepG2细胞检测不出荧光。
由于HepB1-2细胞中同时存在有HBsAg和HbeAg，因此通过电镜检查细胞是否产生Dane颗粒。如图12所见，HepB1-2细胞薄切片的电镜检查表明，细胞表面存在有可见的突出的包膜颗粒。颗粒直径（大约40nm）正如相当于Dane颗粒的直径。对HepG2亲本细胞作类似检查时，未观察到类似的突出颗粒。
利用密度梯度离心法检测HepB1-2细胞的培养上清，看是否存在有颗粒。为了制备来自HepB1-2细胞的培养基以进行分析，40ml来自汇合培养液的培养基样品与氯化铯（1g/3ml）合并，置于顶部密封的梯度管中，然后在Ti50.2转子（Beckman Ⅰnstruments）中以49，000rpm离心60小时。从离心管顶部系列收集组分（1.4ml），用20μl样品和折光仪（Bausch和Lomb）通过折光指数来测定每一组分的密度。然后利用放射免疫检测法检测每一组分样品的HBsAg。在CsCL密度梯度中，在大约1.20g/ml密度处检测到一个抗原峰，它相应于所期望的Dane颗粒的沉降密度。如Sells等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.USA84：1005所述，通过电镜分析1.20密度的组分，结果表明存在有包膜颗粒，它们基本上类似于图12所示的HepB1-2细胞的突出。在其他的邻接的密度组分中未观察到颗粒。
用EcoRⅠ、SacⅠ、HindⅢ和PstⅠ消化后对HepB1-2基因组DNA进行Southern印迹杂交分析，结果表明，这些细胞含有完整单拷贝的△DR1HBV二聚体顺序，并且整合进了染色体DNA中。图13显示了整合质粒在细胞DNA顺序中的构型。
用各种方法分析由HepB1-2细胞系产生的颗粒，以确定颗粒中是否含有传染性HBVDNA。可以预测，颗粒中不应含有传染性DNA，因为HepB1-2细胞系只含有包装基因组（△DR），它缺乏重要的顺式作用的复制区。如前面的6.4节所述，△DR1包装基因组转染到HuH7细胞中不能产生松环DNA，但如图3泳道5所示，显然能产生少量但可测量的单股负链DNA。少量可检测的ssDNA可能是由于第一DNA链合成的异常启动造成的。可以期望，由于在用于制备包装细胞系HepB1-2的质粒DNA中存在的DR1重复区的相似突变，由包装细胞系产生的颗粒将主要由不能完成dsDNA复制的前基因组RNA分子组成。
为了分析包装细胞系上清中存在的颗粒的核酸含量，使上清液在氯化铯梯度中分级分离。然后从不同级分中分离出核酸，方法是用15mMEDTA，0.5%十二烷基硫酸钠和200μg/ml蛋白酶K（Boehringer Mannheim）在51℃处理90分钟。然后使各级分进行苯酚萃取和乙醇沉淀。利用缺口转译的野生型HBV探针，通过印迹杂交法分析不同的级分。如图14所示，在所有检测的级分中，都未测出大小相应于HBV基因组的3.0kb分子。在1.18-1.25g/ml和1.26-1.32g/ml的级分中，检测出了轻度杂交的大约3.5kb和5kb的分子，在1.33-1.42g/ml密度级分中观察到一个沿3.5kb向下延伸的大拖尾。这些分子的特性还有待确定，它们由于含量少而很难进行分析。它们很可能代表了转录至HepB1-2细胞中的△DR1RNA的反转录产物，因此应当含有启动反转录的异常位点。它们几乎肯定是缺陷性的。8.3包装细胞系提供反式功能以互补转染至包装细胞系中的颗粒缺陷性基因组
根据△DR1突变的特性及HepB1-2细胞系产生可测的胞质病毒抗原的能力（上述8.2节），可以期望，该细胞系将能够提供反式包装功能，以从导入该细胞中的第二缺陷性HBV基因组包装和反转录RNA。例如，包装细胞系应当完全反式互补所有颗粒缺陷性HBV基因组所需的病毒功能。将颗粒缺陷性基因组转染至包装细胞系中，应当导致产生可在细胞上清中回收的包装的颗粒缺陷性基因组。
为了转染HepB1-2包装细胞系，再产生一个颗粒缺陷性二聚体基因组。缺陷性基因组用X-表示，它是用XhoI消化野生型HBV基因组而产生的，此酶在129位核苷酸处切断基因组。用Klenow片段填平通过XhoI消化产生的粘性末端，将含有SalⅠ限制位点的10bp合成连接子平头连接在XhoⅠ位点上。如前面所述，将产生的X-缺陷性基因组二聚化在pSP65质粒骨架中。
然后，通过两种不同的方法用X-二聚体质粒转染HepG2细胞。在第一个方法中利用磷酸钙沉淀法，在转染前一夜接种细胞，用20μg质粒DNA进行转染。在转染后的3，4和5天，由转染细胞收集培养基以进行分析。
在第二个方法中涉及脂转染（lipofection），以低密度接种细胞，并使其生长几天直至差不多汇合。如下所述，使用Lipofectin（Bethesda Research Laboratories;Gaithersburg，MD）在细胞中平均导入5μg质粒DNA，在不同的一个实验中，导入1μg质粒DNA。质粒DNA在聚苯乙烯管中与150μl水混合。然后加入150μlLipofectin，轻轻摇动试管以混合DNA。受体细胞用粒DMEM（较低血清）洗涤两次。在每个平皿中加入9ml含有巯基乙醇的Optimem（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD）。室温下15分钟后，DNA混合物变为轻度混浊，此时将其滴加到细胞中。使DNA混合物在细胞上停留24小时，然后用PBS洗涤细胞5次，然后在DMEM加10%小牛血清中培养。第二天再用PBS洗涤细胞5次，再过一天后，再用PBS洗涤3次。然后，在转染后第4，5和6天收集培养基，回收的培养基在4℃下冷却。
由转染的HepB1-2细胞上清中回收的基质在氯化铯梯度上分级分离，并如前述分离核酸。采用随机缺口转译的HBV探针，通过Southern印迹杂交法分析核酸。
图15显示了用X-二聚体质粒转染两次的HepB1-2细胞上清的Southern印迹杂交结果。在一次转染中，采用了5μg质粒DNA，在第二次转染中，采用了1μg质粒DNA。通过氯化铯分级分离来自转染子的培养上清，并如8.2节所述处理每一级分以分离核酸。图15显示，在两个转染子上清中，在1.20g/ml密度级分中都存在有3.0kb的可杂交分子，它相当于Dane颗粒中携带的HBV基因组的期望大小。观察到一个比3.0kb片段迁移稍快的分子，它可能代表闭环形式的HBV基因组。在9kb大小和更大处观察到的其他分子代表输入的质粒DNA的残缺片段。在整个密度梯度中都观察到这些较大的分子，限制性分析证实了它们的特性。
为了确定3.0kb片段的性质，将3.0kb片段从低熔点琼脂糖凝胶（Seakem，FMC）中切下，使凝胶片段在65℃下熔化4分钟，然后在1μg载体小鼠DNA的存在下，用SalI和NcoI于37℃消化2小时。用缺口转译的HBV探针对消化产物进行Southern杂交分析。正如从包装的突变X-基因组所期望的那样，观察到了1900bp和1200bp的杂交片段。
根据本发明，生产细胞系可通过用一个以上的缺陷性肝炎病毒基因组转染永久性细胞系如HepG2来制备。例如，如果包装细胞系HepB1-2进一步用颗粒缺陷性基因组（如X-）稳定转染，产生的细胞系可能是包装形式的缺陷性基因组的永久性生产者。以这样的方式，转染群体中的每个细胞都变为颗粒缺陷性基因组的生产者，而在暂时表达系统中，可得到的共转染子的百分比很低。以这样的方式，无需进行重复的转染步骤，即可回收到更大滴度的缺陷性肝炎病毒颗粒。
9.微生物的寄存
下列携带所示质粒的大肠杆菌已于1988年7月12日寄存在Agricultural Research Culture Collection（NRRL），Peoria，IL：
大肠杆菌 质粒 寄存登记号
HB101 pSP65DHBV5.2Ca1×2 B-18383
（野生物DHBV）
HB101 pSP65DHBVRV-B-18384
2650×2（core-DHBV）
HB101 pSP65DHBVKpn-Sph-B-18385
×2（pol-env-core-DHBV）
HB101 pSP65DHBV△DR1×2 B-18386
（DR1-DHBV）
本发明不限于这些已寄存的微生物，因为它们只是用来具体阐明本发明的，而具有同等功能的其他微生物或病毒亦应落入本发明的范围之内。对本文描述的内容的改进是本领域内普通技术人员很容易作到的，这样的改进亦应是本发明之权利要求范围之内的。
还应明确的是，所述核苷酸的所有碱基对大小只是约近值，并只为了便于描述之目的。