本发明涉及重组腺病毒DNA顺序、表达该DNA顺序的重组体腺病毒和含该重组体腺病毒的棒状病毒疫苗。 尽管自巴士德时代以来由于接种了抗狂犬病病毒疫苗已经拯救了无数的生命，但是这种病仍继续成为严重的世界性问题。狂犬病是由病毒的棒状病毒科（Rhabdoviridae family）狂犬病毒属（Lyssavirus genera）中的病毒引起的。据估计每年仍有二万多人受狂犬病毒侵袭，主要发生在东南亚地区。即使在该地区人的死亡情况并不严重，但数十万人接种疫苗则令人感到烦脑，而且大量家畜病死造成了严重的经济损失。受过感染的野生生物形成了狂犬病病毒的主要来源，而目前能利用的人和家畜用疫苗都业已证明是安全有效的，然而从经济和实际上来说仅限于将这些疫苗使用于大规模防治狂犬病的计划。此外，已知带有编码狂犬病抗原的基因并表达于感染载体病毒的重组体病毒疫苗具有很大的潜力。表达狂犬病病毒糖蛋白的重组体疫苗病毒载体业已证明可有效地诱导免疫应答和保护各种动物免受致死性狂犬病攻击。人腺病毒已作为一种具有潜在可能的非狂犬病病毒的重组棒状病毒糖蛋白载体进行了研究，并且可有效地诱发对鼠、狗、猪和牛中地疱疹性口炎病毒（VSV）糖蛋白的中和抗体。腺病毒具有诸如被限定寄主范围、稳定性和能通过口服感染等许多性质，使其特别适用于狂犬病病毒疫苗的研制。
本发明的任务之一在于提供含有编码狂犬病病毒抗原的插入DNA顺序的重组腺病毒DNA顺序。腺病毒DNA顺序可由人腺病毒衍生，所述人腺病毒尤以5型人腺病毒为佳。
插入DNA顺序的表达可由腺病毒启动子控制，腺病毒启动子可以是人腺病毒的E3启动子或主晚启动子。
插入DNA顺序可以取代腺病毒DNA顺序和早期腺病毒DNA顺序，插入顺序最好至少取代部分E3腺病毒基因。
插入DNA可以包含在另一种病毒的DNA盒内。所述另一种病毒可以是猿猴病毒，尤以SV40为佳，插入DNA可以插在SV40启动子和早期区的多聚腺核苷酸附加位点之间。
插入DNA顺序可以编码狂犬病病毒抗原，该狂犬病病毒抗原可以是糖蛋白。
本发明的任务之二在于提供含有上述重组腺病毒DNA顺序的重组体病毒，该重组体病毒可以是保藏在ATCC的Ad5RGILP（保藏号为ATCC No.VR2204）。
本发明的任务之三在于提供含有有效量的上述重组体病毒和药物上可以接受的赋形剂的疫苗。病毒的有效量至少为每0.1ml疫苗含有104空斑形成单位（PFU）。
本发明的任务之四在于提供哺乳动物对由狂犬病病毒诱发的疾病的免疫方法，该方法包括给哺乳动物施用上述重组体病毒或疫苗。
上述疫苗可以通过口鼻施用。
现通过实施例并参照附图详细说明表达DNA顺序的重组体腺病毒和含该重组体腺病毒的棒状病毒疫苗。
图1说明重组体腺病毒的构建;
图2说明本发明疫苗药效的试验结果。
1.含有狂犬病病毒糖蛋白基因重组体的5型人腺病毒的构建
用于产生含狂犬病病毒糖蛋白的5型重组体人腺病毒的构建步骤示于图1。
质粒新SV2（Southern，P.J.和Berg，P.在SV40早期区启动子控制下用细菌基因将哺乳动物细胞转化为具有抗菌素抗性，J.Molecular App-lied Genetics，1982，1，327-334）的修饰可通过NdeI（N）位点转化为XbaI（X）位点，通过XbaI联结子取代BamI（B）至EcoRI（E）片段，通过用含HindⅢ、BamHI、EcoRI、SmaI（S）和XhoI（Xh）限制位点的合成多联结子取代HindⅢ至HpaI质粒顺序使所有新基因和SV40顺序缺失。在形成的质粒pSV2X3中，SV40早期启动子顺序（图1中用满盒表示）通过能够插入所需基因的合成多联结子顺序与SV40多聚腺核苷酸附加信号（图1中用不满盒表示）分离。SV40启动子、多联结子和SV40多聚腺核苷酸附加信号通过XbaI位点连接形成一个“盒”。
由Connaught医学研究实验室得到的狂犬病病毒ERA株的糖蛋白基因在pBR322中的完全cDNA拷贝用作插入到pSV2X3的狂犬病病毒糖蛋白基因源。克隆的狂犬病病毒DNA已由Malek，L.T.，Soostmeyer，G.，Gar-vin，R.T.和James.E.作过介绍。狂犬病病毒糖蛋白基因在大肠杆菌（E.coli）中表达为变性多肽（参阅Chanock，R.和Lerner，R.编：ModernApproaches to Vaccines，Cold Spring Harbor Laboratoy，1984，203-208）。通过用EcoRI和BamHI消化质粒分离出基因，并在用克列诺夫聚合酶填满钝端后将分离得到的基因插入到pSV2X3的多联结子的SmaI位点中。
形成的质粒之一pSV2X3RG具有狂犬病病毒DNA，在正确的方向上能够由SV40启动子进行转录。含有插入狂犬病病毒糖蛋白的盒可通过XbaI消化去除并通过琼脂糖分离方法进行分离。然后将盒插入到质粒pFGDX1的XbaI位点中（Haj-Ahmad，Y.和Graham，F.L.Development of a helper-independent humen adenovirus vector and its use in the transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene，J.of Virology，1986，57，267-274）。质粒pFGDX1含有5型人腺病毒的基因组，包括59.5%-100%的BamHI位点（78.5%-84.3%的XbaID片段除外）上的E3启动子。
在由此形成的质粒之一pBCRG中，含狂犬病病毒糖蛋白基因的盒被插入到正确的方向上，使SV40的转录方向与腺病毒E3启动子保持相同的方向。选择质粒pBCRG进行培养和纯化。293细胞（Graham，F.L.，Smiley，J.，Russell，W.C.和Nairn，R.，Characteristics of a human Cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.J.of General Virology，1977，36，59-72）采用磷酸钙沉淀技术和pBCRG及EcoRI消化的5型腺病毒DNA进行转染。具有所需狂犬病病毒基因插入的重组体腺病毒（A5RGILP）通过用HindⅢ、XbaI和EcoRI限制酶分析进行鉴定并纯化。重组体腺病毒A5RGILP在293细胞中进行两次空斑纯化。最终的空斑分离物在KB细胞（参阅H.Eagle在“Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.，1955，89，362”中所著“Human，oral，epidermoid carcinema，HeLamarkers（ATCC CCL 17KB）悬浮培养物中展开和生长。A5GRILP由感染细胞中提取，并在CsCl密度梯度上通过两次结合进行纯化。重组体病毒在使用前进行渗析和滴定。狂犬病病毒基因插入是在与取代形成重组体病毒的腺病毒E3基因的相同方向上。A5RGILP中的狂犬病病毒基因是在腺病毒E3启动子或主晚启动子的转录起点上表达的。
2.施用Ad5RGILP病毒后的抗体应答
动物试验开始时将重组体Ad5RGILP病毒引入鼠和狗中。通过口服或非经肠道接种在鼠上，通过经皮或鼻内将病毒给予狗。接种前后，采取血清样品，在分析前先进行编号，通过荧光抑制微量测定法（FIMT）测定狂犬病病毒中和抗体的滴定度。如表1所示，两者对非经肠道施用疫苗的应答均很好。在对口服疫苗应答的鼠中，由于在拔去管子期间某些接种物在动物体内可以引起反胃或贮存在口腔中，因此不能肯定口服或经肠给药是否会引起血清转化。特别重要的是观察到了通过鼻腔将病毒施用于狗对诱发中和抗体非常有效。用表达疱疹性口炎病毒糖蛋白的腺病毒载体同样也获得上述观察。由于后者的重组体在诱发牛和猪中疱疹性口炎病毒抗体也是有效地，因此认为Ad5RGILP病毒也可在许多动物中用作非常有效的免疫原。
十四天后，第二次给狗以0.5ml剂量的疫苗。在第一次接种疫苗后的2周和4周时测定血清抗体滴定度。给由查理士河得到的3周令雌鼠以0.1ml的接种物。在氟乙咱轻度麻醉下，用带肺结菌苗注射管的23号计量针将疫苗加到微量管中给予口服用药。管子插在超过其咽喉1cm处。四周后，通过鼠尾抽血，分别测定各血清。老鼠抗体滴定度以各组血清正结果示于表1;括号内的数字表示各组血清正结果的动物总数。抗体滴定度用荧光抑制微量测定单位表示，以荧光焦点形成法测定，一单位表示ERA狂犬病攻击病毒的血清抑制复制最高稀释2倍时至少为50%。测定前所有血清都在56℃下加热减活30分钟。
3.Ad5RGILP病毒疫苗减至最低量后老鼠对狂犬病病毒的防护
在开始获得成功后，对Ad5RGILP重组体病毒疫苗在鼠体内的药效作了进一步的研究。在这些研究中，将5周令老鼠分组，一只笼内关5只鼠，随意喂给Purina侵蚀性食物，并给以滴定度为104-107空斑形成单位（PFU）0.1ml经纯化的梯度重组体病毒，腹膜内一次给药。对照组仅给0.1ml病毒稀释液（PBS/2%胎牛血清）。三周后，在鼠尾上抽血（每只鼠抽0.2-0.3ml），将各血清样品汇中，加热减活（56℃下30分钟），用FIMT方法测定狂犬病病毒中和抗体。采集血清后三天，用0.3ml的狂犬病病毒的ERA株（20 TCID 50/剂量）通过大脑内给药进行攻击，观察21天。死亡主要发生在10至14天内。所有老鼠均出现典型的病症，包括鼠毛杂乱，姿态失控，体重减轻，抽搐增加和/或四肢瘫痪及死亡。该攻击研究的结果示出图2。如图2所示，注射107PFU/鼠（只）量的Ad5GRILP病毒，在所有老鼠上都能诱发高滴定度的中和抗体。以10倍稀释液的低剂量在老鼠体内产生的应答则降低，并且抗体的滴定度和应答鼠数也相应降低。尽管对照（未免疫）组的老鼠在狂犬病病毒攻击后，100%均死亡，但是所有老鼠在施用疫苗后，在21天观察期内并没有出现狂犬病病毒感染的症状，以至可检测到的抗体应答也极低。施用低剂量Ad5GRLIP病毒的三只老鼠并未检测到中和抗体，并且在狂犬病病毒攻击后仍然存活，这被认为是由可检测量很低的抗体提供了保护，或是由于某些其他的防御机理的刺激产生了保护作用。由Ad5GRLIP病毒产生的这种免疫系统的防护刺激具有狂犬病专一性，因为15只老鼠仅接种5型腺病毒，在2周后用狂犬病病毒攻击仍然很容易受感染（数据未给出）。
本发明的疫苗还证明了给臭鼬和狐口服后也能有效地诱发大量的中和抗体，并且在用致死剂量的狂犬病病毒攻击后能免于死亡。
重组体Ad5GRILP病毒的样品按布达佩斯条约于1988年3月4日保藏在国际公认的用于专利程序的微生物保藏单位美国典型培养物保藏中心（ATCC，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852，U.S.A.），在1988年3月15日公布的保藏号为ATCC No.VR 2204。
表1：施用Ad5RGILP病毒后的抗体应答
动物 剂量 接种疫苗方式 抗体滴定度
（PFU） 第一次 第二次 0周 2周 4周
狗1 5×105经皮 经皮 少量 256 512
狗2 经皮 经皮 少量 1024 1024
狗3 鼻内 经皮 少量 256 512
狗4 鼻内 鼻内 少量 256 4096
鼠 1×107口服 口服 少量 - 1124（4/10）
鼠 1×106口服 口服 少量 - 424（4/10）
鼠 1×107肌内 肌内 少量 - 2925（10/10）
鼠 1×106肌内 肌内 少量 - 1312（8/10）