本发明涉及预防疟原虫属（Plasmodium）寄生虫感染的疫苗，更具体地说，涉及可作为治疗药剂使用以抑制疟疾寄生虫感染的多肽，该多肽包括来自邻接于疟原虫表面蛋白中心重复区的免疫原决定簇，以及来自该重复区的重复的免疫原决定簇（但比其总数要少）;还涉及纯化这些多肽的方法;并涉及编码这些多肽的表达载体;还涉及治疗人体以预防疟疾感染的方法。 疟疾是一种广泛分布的严重疾病，尽管经过了多年的广泛努力，仍然没有研制出一种疫苗。参见Science 226∶679（1984年11月9日）。通过用辐照过的孢子小体接种，已实验性地在哺乳动物（包括人体）中预防过疟疾病原体疟原虫的感染。Clyde等，Am.J.Trop.Med.Hyg.24∶397（1975）和Rieckman等，Bull，WHO 57（Supp.1）：261（1979）。Yoshida等在Science 207∶71（1980）中报道，这种预防作用至少部分是由针对孢子小体表面蛋白的抗体介导的，即孢子小体外周（CS）蛋白;针对CS蛋白的单克隆抗体能在离体中中和感染性，并在活体中保护动物。CS蛋白在种内似乎具有高度的进化保守性，但在种间差别很大。
已知有四种疟原虫能感染人类。即恶性疟原虫（P.falciparum）、间日疟原虫（P.vivax）、卵形疟原虫（P.ovale）和疟疾疟原虫（P.malariae），后面两种的发生率低得多。其他有科学意义地种有Plasmodium barghei和Plasmodium Knowlesi，这些种的宿主分别为啮齿类和猴类。
Kemp等人在WO 84-02917-A中公开了恶性疟原虫cDNA在大肠杆菌中的克隆和表达。
Dame等人在Science 225∶593（1984）中报道了恶性疟原虫CS蛋白在大肠杆菌中的克隆和表达。该蛋白被描述为含有大约412个氨基酸，分子量大约为44，000。它含有41个串联的四肽重复单位。根据该重复区域合成的7、11和15残基肽可与针对CS蛋白的单克隆抗体结合。
以恶性疟原虫CS蛋白的重复四肽为基础的抗孢子小体疫苗一直未获成功，它们只在少数个体中产生免疫作用，而且该免疫作用的持续时间很短。Science 241∶522（1988）。因此，对于预防疟疾寄生虫的有效疫苗的需要仍然存在。
一般说来，本发明涉及一种多肽，它含有一个或多个来自疟原虫表面蛋白中心重复区的第一邻接区的免疫原决定簇，一个或多个来自该重复区的第二邻接区的免疫原决定簇，以及含有（但比其总数要少）或不含有中心重复区的重复的免疫原决定簇。
在一个具体方案中，本发明涉及的多肽含有至少一个疟原虫表面蛋白重复区的重复的免疫原决定簇，但比其总数要少，以及一个或多个疟原虫表面蛋白中邻接重复区的区域中的免疫原决定簇。
在本发明的另一个具体方案中，该多肽含有差不多所有邻接于中心重复区的区域中的免疫原决定簇，但不具有来自中心重复区的免疫原决定簇。另外，该多肽也可含有几乎所有来自邻接区域的免疫原决定簇，并进一步含有至少一个来自中心重复区的免疫原决定簇，但比其总数要少。
可用于本发明多肽的免疫原决定簇优选存在于恶性疟原虫、间日疟原虫、疟疾疟原虫和卵形疟原虫表面蛋白中的决定簇。
在本发明的另一个具体方案中，该多肽通过基因工程与载体蛋白相融合，优选的载体蛋白是能增强多肽表达或增强多肽免疫原性或二者兼备的那些蛋白。
在一个优选的具体方案中，本发明的多肽包括一个免疫原载体蛋白，例如流感病毒非结构蛋白1的81 N端氨基酸（NSl81），它通过合成的接头与疟原虫孢子小体外周（CS）蛋白的第一邻接区融合，后者本身又与CS蛋白的第二邻接区融合。
这种多肽可进一步包括一个以上的来自CS蛋白中心重复区的免疫原决定簇，但比其总数要少，例如，来自含有氨基酸顺序为Asn-X-Y-Pro的四肽的重复区的免疫原决定簇，其中X是Ala或Val，Y是Asn或Asp。来自中心重复区的免疫原决定簇例如可定位于载体蛋白和第一邻接区之间，或定位于第一邻接区和第二邻接区之间。
本发明的另一方面包括编码多肽的表达载体，含有该多肽的疫苗;纯化多肽的方法;利用该多肽治疗人体以预防疟疾感染的方法。
本发明的其他方面和优点公开于下面的详细说明中。
图1（a）和1（b）给出了曲线形式的ELISA数据，表明了两组C3H/HEN小鼠的抗体应答，一组用NSl81RLf△9免疫，另一组用R32tet32免疫;
图2（a）和2（b）给出了曲线形式的ELISA数据，表明了两组C57BL/6小鼠的抗体应答，一组用NSl81RLf△9免疫，另一组用R32tet32免疫;
图3（a）和3（b）是曲线形式的ELISA数据，表明了两组BLAB/C小鼠的抗体应答，一组用NSl81RLf△9免疫，另一组用R32tet32免疫。
疟疾寄生虫疟原虫是一种原生动物，其细胞外表有若干阶段特异性蛋白。发现这些表面蛋白具有三种共同的区域，即重复的中心抗原决定簇区和成对的邻接区域。其中第一邻接区与中心重复区的羧端融合，第二邻接区与中心重复区的氨端融合。
本发明的多肽来自疟原虫表面蛋白的一部分。它含有（但比其总数要少）或不含有第一和第二邻接区之间的中心重复区的免疫原决定簇，并以足以用作治疗药剂以抑制疟疾寄生虫感染的数量进行表达。
换言之，本发明的多肽在第一和第二邻接区之间的串联重复单位比野生型重复区数目要少。因此，将此多肽用于预防人体的恶性疟原虫感染时，该多肽可包括完整的第一邻接区，也即恶性疟原虫孢子小体外周蛋白（PfCSP）的N端邻接区，完整的第二邻接区，也即PfCSP的C端邻接区，以及在第一和第二邻接区之间少于41个的来自PfCSP的串联重复单位，亦即少于41个的结构式为Asn-X-Y-Pro的四肽，其中X是Ala或Val，Y是Asp或Asn。
在野生型疟原虫的表面蛋白中，重复区域具有免疫优势。在本发明的多肽中，以这样的方式来选择串联重复或重复单位的数目和定位，使其不致掩盖第一和第二邻接区的免疫应答。最好是，本发明多肽中的重复单位不多于野生型蛋白中重复单位的一半。更优选的是，本发明多肽中的重复数目不多于野生型蛋白中重复数目的大约四分之一。
已知有四种疟原虫感染人类，最常见的是恶性疟原虫，其次是间日疟原虫，而疟疾疟原虫和卵形疟原虫则较少见。
恶性疟原虫孢子小体阶段的孢子小体外周（CS）蛋白的中心重复区含有41个串联的重复四肽，其中有31个的氨基酸顺序为Asn-Ala-Asn-Pro，其中有4个的顺序为Asn-Val-Asp-Pro。在中心重复区的两侧是含有区域Ⅰ和区域Ⅱ的所谓邻接区，CS蛋白的这两个区域的氨基酸顺序几乎与P.knowlesi（一种猴疟疾）CS蛋白的相应区域完全一致（Dame等，Science 225∶593，1984）。
血液阶段的恶性疟原虫的各种表面蛋白也具有重复的抗原决定簇，例如S抗原（Pro-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Gly-Leu-Glu-Asp）;RESA抗原（Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala）;FIRA抗原（Val-Thr-Thr-Gln-Glu-Pro）;以及PF-11抗原（Glu-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Val-Val-Pro）。
间日疟原虫的孢子小体外周蛋白含有重复的抗原决定簇（Gly-Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala），疟疾疟原虫的孢子小体外周蛋白含有重复的抗原决定簇（Asn-Asp-Ala-Gly）和（Asn-Ala-Ala-Gly）。
本发明的多肽包括一个或多个来自疟原虫表面蛋白中心重复区的第一邻接区的免疫原决定簇，一个或多个来自重复区的第二邻接区的免疫原决定簇，以及含有（但比其总数要少）或不含有来自中心重复区的重复的免疫原决定簇。
免疫原决定簇即诱导B细胞或T细胞应答的氨基酸顺序。免疫原决定簇一般至少包括6个氨基酸。可通过标准技术精确鉴别蛋白质中的免疫原决定簇，包括单克隆抗体定位法和/或使氨基酸缺失后进行活性检测。优选的是，本发明的多肽包括至少大约15个来自第一和第二邻接区的各15个氨基酸;更优选的是至少大约30个;最优选的是完整的第一和第二邻接区，但不包括信号顺序。
在一个具体方案中，本发明的多肽包括至少一个来自疟原虫表面蛋白中心重复区的免疫原决定簇，但比其总数要少，以及一个或多个来自邻接于表面蛋白重复区的区域的免疫原决定簇。
在另一个具体方案中，本发明的多肽包括几乎所有来自中心重复区的邻接区域的免疫原决定簇，但缺乏来自中心重复区的免疫原决定簇，或者也可以含有至少一个来自中心重复区的免疫原决定簇，但比其总数要少。“几乎所有”是指差不多完整的第一和第二邻接区，但不包括信号顺序;优选的是，每个区域中缺少的氨基酸不多于大约20个，更优选的是，使用完整的第一和第二邻接区，但不包括信号顺序。
优选的是，本发明的多肽是杂交多肽，即由一部分表面蛋白和载体蛋白构成的基因融合的蛋白质。
更优选是这样的杂交多肽：其中的载体蛋白遗传融合于恶性疟原虫孢子小体外周（CS）蛋白的一部分，此部分含有（但比其总数要少）或不含有构成中心重复区的重复四肽。
尤其优选的是这样的杂交多肽：其中的载体蛋白不仅增强携带多肽的免疫原性，而且增强转化体对多肽的表达。这种载体蛋白的其他有利性质包括促进多肽的纯化或配制。这种载体蛋白的实例包括NSl81（流感病毒（A/PR/8/34）非结构蛋白的81 N端氨基酸）（Baez等，Nucleic Acids Research 8∶5845，1980）;R32（〔Asn-Ala-Asn-Pro）15-（Asn-Val-Asp-Pro）〕2）（Young等，Science 228∶958，1985）;和galK。
本发明的多肽类型的具体例子包括：
NSl81-RLf△9。一种包括流感病毒非结构蛋白1（NSl81）81 N端氨基酸的融合多肽;以及恶性疟原虫CS蛋白含有区域Ⅰ的邻接区，但不包括信号顺序（18个N端氨基酸），和含有区域Ⅱ的邻接区，但不包括其最初9个N端氨基酸（RLf△9）。NSl81和RLf△9的融合通过合成的DNA人工接头顺序完成，该顺序编码Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-;
NSl81-RLfAuth，此融合多肽包括NSl81;恶性疟原虫CS蛋白含有区域Ⅰ的邻接区，但不包括信号顺序，和含有完整区域Ⅱ的邻接区（RLfAuth）;
NSl81-（Asn-X-Y-Pro）n-RLfAuth，此融合多肽包括NSl81、RLfAuth和（Asn-X-Y-Pro），其中X是Ala或Val，Y是Asn或Asp，n是大于或等于1的整数，并小于或等于100，最好是小于50;此外，其中的（Asn-X-Y-Pro）定位于NSl81和RLfAuth之间;
NSl81RLfAuth+（Asn-X-Y-Pro）n，此融合多肽包括NSl81;RLfAuth;以及（Asn-X-Y-Pro），其中X和Y如上述所定义，n小于41;而且，其中的（Asn-X-Y-Pro）定位于恶性疟原虫CS蛋白含有区域Ⅰ的邻接区和含有区域Ⅱ的邻接区之间，亦即原来由中心重复区所占据的区域。
然而，这些多肽只是作为举例说明。根据本专利申请公开的内容，本领域的专业人员将会知道如何构建和测试本发明范围内的其他多肽，例如，含有来自表面蛋白顺序的多肽，包括恶性疟原虫以外的各种疟疾寄生虫的孢子小体外周蛋白，含有多于或少于来自表面蛋白的氨基酸的多肽，经过化学修饰的多肽，以及与其他或额外氨基酸或蛋白顺序融合的多肽。这种多肽很容易通过基因工程和/或蛋白合成的标准技术构建，并能基本上如下所述在动物模型中进行测试。例如，本发明的蛋白可包括来自表面蛋白邻接区域的氨基酸顺序，例如缺乏中心重复区的几乎完整的孢子小体外周蛋白，并在融合蛋白中与乙型肝病毒表面抗原（HBsAg）融合，该融合蛋白能够形成杂交的HBsAg颗粒，如1988年8月17日公开的欧洲专利申请EP278，940中所述。
本领域的专业人员利用已知技术很容易得到表面蛋白邻接区域、四肽、合成的DNA人工接头顺序和载体蛋白的基因编码顺序。这些技术包括合成，最好是通过信使RNA的反转录合成，或通过基因组DNA完整基因的直接克隆得到。恶性疟原虫信使RNA的反转录记载于Ellis等，Nature 302∶536（1963）中。恶性疟原虫基因组DNA的完整基因的直接克隆记载于Dame等的同上文献中。含有重复区的多肽的克隆和表达记载于1988年10月11日提交的07/256，229号共同未决专利申请中，该申请的公开内容作为本文的参考文献。
在克隆了所有或部分疟原虫DNA以后，可以通过已知技术制备编码所有或部分表面蛋白的片段。
合成DNA的技术是公知的，并可利用市售可得的DNA合成仪来完成。
多肽的编码顺序可插入大肠杆菌表达载体中，其中有许多都是公知的，并且很容易得到。用大肠杆菌实施本发明时，编码本发明多肽的DNA顺序在用于转化大肠杆菌的DNA载体中以可操作方式与调节单元连接。许多包括这种调节单元的革兰氏阴性细菌表达载体都可使用。该调节单元包括促进RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选为可调节的启动子，即可诱导或可阻抑的启动子。有大量启动子可用于在大肠杆菌中表达异源多肽。包括trp启动子和λPL启动子（参见US 4，578，355和Courtney等，Nature 313∶149，1985）。正如下面所详细描述的，已经发现，本发明的多肽的编码顺序尤其适于通过大肠杆菌表达载体pMG-1进行表达。也可利用pMG-1的衍生物，它们编码NSl81以外的载体蛋白，例如R32和galK。
用链霉菌（Streptomyces）实施本发明时，本发明多肽的DNA编码顺序在用于转化链霉菌的DNA载体中以可操作方式与调节单元连接。该调节单元包括促进RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选的是可调节的启动子，即可诱导或可阻抑的启动子。有大量启动子可用于在链霉菌中表达异源多肽。包括链霉菌半乳糖操纵子的半乳糖可诱导的启动子（Fornwald等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84∶2130，1987），变铅青链霉菌（S.lividans）β-半乳糖苷酶基因的组成启动子（Eckhardt等，J.Bacteriol.169∶4249，1987;Brawner等，US 4，717，666）以及长孢链霉菌（S.longisporus）胰蛋白酶抑制剂基因的组成启动子（欧洲专利申请87 307 260.7号），或瞬时调节型启动子如在棘孢小单孢菌（M.echinospora）中报道的启动子（Baum等，J.Bacteriol.170∶71，1988）。在链霉菌中的转录终止区来自若干种链霉菌基因的3′端，例如在链霉菌半乳糖操纵子末端的终止信号，或在弗氏链霉菌（S.fradiae）新霉素磷酸转移酶基因末端的终止信号（Thompson和Gray，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80∶5190，1983）。链霉菌中负责蛋白输出的顺序包括从变铅青链霉菌β-半乳糖苷酶基因、变铅青链霉菌LEP-10基因（欧洲专利申请87 307 260.7号）和长孢链霉菌胰蛋白酶抑制剂基因中分离的顺序。
本发明多肽的编码基因被掺入一个更大的DNA分子中，其中包括一个基因选择标记系统。选择标记系统可以是已知的标记系统中的任一种，使得该标记基因赋予转化细胞可选择的新表型即可。其实例包括链霉菌药物抗性基因如硫链丝菌肽抗性核糖体甲基化酶（Thompson等，Gene 20∶51，1982）、新霉素磷酸转移酶（Thompson等，同上）和红霉素抗性核糖体甲基化酶（Thompson等，同上文献）。DNA分子还可含有在链霉菌中自动复制的顺序，例如pIJ101衍生物（Keiser等，Mol.Gen.Genet.185∶223，1982）或SLP1衍生的载体（Bibb等，Mol.Gen.Genet.184∶230，1981）。DNA分子还可含有允许基因扩增的标记。这种标记物在链霉菌中帮助扩增基因拷贝数，包括壮观霉素抗性基因（Hornemann等，J.Bacteriol.169：2360，1987）和精氨酸营养缺陷型（Altenbuchner等，Mol.Gen.Genet.195∶134，1984）。
利用酵母实施本发明时，本发明多肽的DNA编码顺序在用于转化酵母的DNA载体中以可操作方式与调节单元连接。具有转化、克隆和表达系统的任何酵母宿主都可使用。具体实例包括汉逊酵母属（Hansenula）、毕赤酵母属（Pichia）、Kluveromyces、裂殖酵母属（Schizosacharomyces）、假丝酵母属（Candida）和酵母属（Saccharomyces）的酵母。优选的酵母宿主是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
调节单元包括促进RNA聚合酶结合和转录的启动子。优选的是可调节的启动子，即可诱导或可阻抑的启动子。有大量启动子可用于在酵母中表达异源多肽。包括铜可诱导的金属硫因基因（CPU1）启动子和糖酵解基因甘油醛-3磷酸脱氢酶（TDH3）和乙醇脱氢酶（ADH）的组成启动子。酵母中的转录终止区来自数种酵母基因中任一种的3′端，例如异-1-细胞色素C（CYC1）基因。
本发明多肽的编码基因被掺入一个更大的DNA分子中，其中包括一个基因选择标记系统。选择标记系统可以是已知的标记系统中的任一种，使得该标记基因赋予转化细胞可选择的新表型即可。其实例包括生物合成酶的酵母基因，例如磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶（TRP1）或乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶（URA3）或异源药物抗性基因例如G418抗性或苯菌灵邻氨基苯甲酸异构酶（TRP1）或苯菌灵抗性（BEN1）。DNA分子还可含有在酵母中自动复制的顺序，例如酵母2微米环形ori区或染色体自动复制区（ARS），例如ARS1，以及酵母着丝粒（CEN），例如CEN3，使得质粒能在酵母中自动复制。
还有其他一些表达系统也是已知的，并很容易得到。例如，有大量昆虫细胞及其表达系统可以用来表达异源蛋白，例如用于在鳞翅目细胞中表达异源蛋白的棒状病毒（baculovirus）表达系统。如果需要在真核表达系统中表达，也许有必要去掉表面蛋白的羧端固着区。例如，可能需要使氨基酸392-412缺失，此顺序包括恶性疟原虫的羧端固着区（见1988年12月21日提交的共同未决的美国专利申请07/287，934，该申请公开的内容作为本文参考文献）。
另一个可以例举的表达系统公开于1988年7月28日提交的07/222，202号美国专利申请中，该公开文本作为本文的参考文献，该申请涉及用选择的异源基因转化的沙门氏菌（Salmonella）菌株，所述基因以可操作方式与大肠杆菌的启动子顺序连接，该转化体能够组成性地表达异源基因的产物。
利用标准的蛋白分离技术，从生产细胞培养液中分离和纯化这样表达的多肽，这些技术大部分都是本领域公知的。作为举例，可以采用的纯化程序包括（1）细菌细胞的破碎，（2）细胞碎片的澄清，（3）使本发明的多肽从澄清的细胞提取液的其他多肽中分离出来，（4）最终纯化以去除残留杂物，包括残留多肽、碳水化合物、核酸、脂多糖和内毒素。
在本发明的疫苗中，可以直接使用多肽的含水溶液，最好缓冲至生理pH。此外，可使多肽与多种已知佐剂中的任一种相混合，或吸收在其中。这种佐剂例如包括氢氧化铝、胞壁酰二肽和saponons例如Quil A。作为进一步的举例，可使多肽包囊于微型颗粒如脂质体中。作为进一步的选择方案，本发明的多肽可与免疫刺激性大分子相结合，例如杀死的博德特氏菌（Bordetella）或破伤风类毒素。
疫苗制备的一般描述可参见《疫苗新趋势及其发展》，Voller等编，University Park Press，Baltimore.MD，USA（1978）。在脂质体中的包囊例如可参见Fullerton的4，235，877号美国专利。蛋白质与大分子的结合公开于Likhite的4，372，945号美国专利和Armor等的4，474，757号美国专利中。Quil A的应用例如可参见Dalsgaard等，Acta Vet.Scand.18∶349（1977）。
每剂量份疫苗中的多肽用量为能诱导免疫预防应答而无显著副作用的量。此用量根据所用的具体多肽和疫苗中是否有佐剂而不同。一般说来，每剂量份可含有1-1000μg多肽，优选为10-200μg。通过观察主体内的抗体滴度和其他应答等常规研究，能够确定具体疫苗中的最佳用量。在最初的接种之后，最好使主体在大约四星期内接受加强剂量，然后每6个月再加强一次，只要存在感染危险就不停止。
一般优选采用肌肉、皮下或静脉内注射方式，但在某些情况下，也可采用其他途径。例如，使用重组的沙门氏菌时，优选途径为口服。
下述实例是说明性的，并不限制本发明。CS蛋白的编码顺序由James Weber，Walter Reed Army Institute for Research提供，其形式为λmPF1的2337碱基对EcoRⅠ片段（Dame等，Science 225∶593，1984），插在pUC8的EcoRⅠ位点中，这是一个标准的大肠杆菌克隆载体（例如可得自Bethesda Research Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD）。所产生的pUC8衍生物称为pUC8克隆1。
实例1 pNSl81RLf△9的构建
pNSl81RLf△9的构建简单概括如下。pCSP（见下述）是一种大肠杆菌的表达载体，它含有1216碱基对的片段，它编码除最前面的18个氨基酸以外的完整的恶性疟原虫孢子小体外周（CS）蛋白。使第一等分试样的pCSP用限制性核酸内切酶FokⅠ消化。填平（Klenow片段）后用限制性核酸内切酶BamHⅠ消化。通过电泳洗脱回收产生的318 bp（碱基对）片段，它编码CS蛋白的氨基酸19（Leu）至123（Pro）。
用限制性核酸内切酶TthlllⅠ消化第二等分试样的pCSP，填平后用限制性核酸内切酶SalⅠ消化。通过电泳洗脱回收产生的655 bp（碱基对）片段，它编码CS蛋白的氨基酸297（Gly）至412（Asn）。（此顺序缺乏含有区域Ⅱ的邻接区的9个N端氨基酸，即288号（Pro）至296号（Gln））。
用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化大肠杆菌表达载体pUC18（见下述），然后将CS蛋白基因的318 bp（碱基对）和655 bp（碱基对）片段连接在其中。产生的载体称为pUCRLf△9。
用限制性核酸内切酶BamHⅠ消化pUCRLf△9，填平后用限制性核酸内切酶SalⅠ消化。通过电泳洗脱回收产生的1035 bp片段，它编码CS蛋白的氨基酸19至123和297至412。
用限制性核酸内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ消化表达载体pMG-1（见下述），它含有流感病毒非结构蛋白1的N端氨基酸1（Met）至81（Met）的DNA编码片段和合成的DNA人工接头顺序。将预先从pUCRLf△9中分离的1035 bp片段连接在pMG-1中。产生的表达载体称为pNS1 RLf△9，它编码的蛋白具有如下顺序：
NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412
下面详述pNSl81RLf△9的构建。
A.pCSP的构建
用限制性核酸内切酶StuⅠ和RsaⅠ（各100单位）在400μl中缓冲液（含有50mM Tris，50mM NaCl，1mM二硫苏糖醇（DTT），10mM MgCl2，pH为7.5）中，使纯化的pUC8的克隆1质粒DNA（40μg），于37℃消化1.5小时。产生的1216 bp片段编码除最前面18个氨基酸以外的（据信为CS蛋白的信号顺序）完整的孢子小体外周（CS）蛋白，在6%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上电泳分离，通过电泳洗脱回收。
用限制性核酸内切酶BamHⅠ（25单位）在200μl中缓冲液（如上述）中使10μg表达载体pASl（ATCC 39262，详情参见M.Rosenberg的4，578，355号美国专利）在37℃消化1.5小时。然后，使切割的质粒在25℃用DNA聚合酶Ⅰ大片段处理15分钟（在20mM Tris-HCl pH7.5中含有5单位Klenow片段，7mM MgCl2，60mM NaCl，6mM2-巯基乙醇，四种脱氧核苷三磷酸各0.25mM，以填平BamHⅠ位点）。
然后，在30μl连接缓冲液中（含有50mM Tris，1mM DTT，10mM MgCl2，100μM rATP，pH7.5），用1单位T4-DNA连接酶使孢子小体外周蛋白的基因片段（1μg）连接至此载体（100ng）中，连接反应于4℃进行16小时。
用连接混合物转化大肠杆菌MM294Cl+株。得到氨苄青霉素抗性集落后，筛选pASl中插有CS基因片段的集落。鉴别到正确构建的质粒（pCSP）。
B.pUCRLf△9的构建
用限制性核酸内切酶FokⅠ（100单位）在400μl中缓冲液（见上述）中使纯化的pCSP质粒DNA（100μg）于37℃消化3小时。然后，质粒用DNA聚合酶Ⅰ大片段（上述）处理以填平FokⅠ位点。然后，用限制性核酸内切酶BamHⅠ（100单位）在400μl中缓冲液（上述）中使质粒于37℃消化3小时。产生的318bp片段编码CS蛋白的氨基酸19-123，在6%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上电泳分离，通过电泳洗脱回收。
用限制性核酸内切酶TthlllⅠ（100单位）在400μl中缓冲液（上述）中使另一等分试样的pCSP（100μg）于65℃消化3小时。然后，质粒用DNA聚合酶Ⅰ大片段（上述）处理以填平TthlllⅠ位点。然后，用限制性核酸内切酶SalⅠ（100单位）在400μl中缓冲液中使质粒消化3小时，产生的655 bp片段编码CS蛋白的氨基酸297-412，在6%聚丙烯酰胺凝胶上对其进行电泳分离，通过电泳洗脱回收。
表达载体pUC18（Yanish-Perron等，Gene 33∶103，1985）是标准的大肠杆菌克隆载体（例如可得自Bethesda Research Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD），用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ（各20单位）在200μl中缓冲液（上述）中使10μg pUC18于37℃消化2小时。然后，在30μl连接酶缓冲液（上述）中，用1单位的T4-DNA连接酶使318 bp BamHⅠ末端填平的/FokⅠ片段（1μg）和655bp TthlllⅠ末端填平的/SalⅠ片段（1μg）连接至pUC18中，连接反应于4℃进行16小时。鉴别到正确构建的质粒（pUCRLf△9）。
C.pMG-1的构建
用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SacⅠ（各50单位）在200μl中缓冲液（上述）中使10μg表达载体pMG27N-（M.Gross等，Mol.Cell.Biol.5∶1015，1985）于37℃消化3小时。
表达载体pAPR801（Young等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 80∶6105，1983）含有流感病毒（A/PR/8/34）非结构蛋白1（NS1）的编码区（Baez等，Nucleic Acids Research 8∶5845，1980），用限制性核酸内切酶NcoⅠ和BamHⅠ（各20单位）在200μl高缓冲液（50mM Tris-HCl，1mM DTT，10mM MgCl2，100mM NaCl，pH7.5）中使10μg pAPR801于37℃消化2小时。产生的230 bp片段编码NS1的前面81个N端氨基酸，在6%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上对其进行电泳分离，通过电泳洗脱回收。
使40ng BamHⅠ/SacⅠ切割的pMG27N-（见上述）与80ng 230 bp的NcoⅠ/BamHⅠ NSl81编码片段和80ng具有如下顺序的合成的人工接头连接：
Asp His Met Leu Thr Asp
BamHI 5′CATGGATCATATGTTAACAGATATCAAGGCCTGACTGACTGAGAGCT 3′
3′CTAGTATACAATTGTCTATAGTTCCGGACTGACTGACTC 5′SacI
鉴别到所产生的质粒pMG-1，其中，NSl81编码顺序的BamHⅠ位点与pMG27N-的BamHⅠ位点相连;NSl81编码顺序的NcoⅠ位点与合成人工接头的NcoⅠ位点相连;而合成人工接头的SacⅠ位点与pMG27N-的SacⅠ位点相连。此载体中导入了单一的限制性位点，从而能够在三个解读框的任一个插入DNA片段，能在cⅡ核糖体结合位点处的ATG起始密码下游的所有三个解读框中插入TGA终止密码，而在表达以后，则可从所有三个解读框中产生NSl81融合蛋白。如上述用限制性核酸内切酶NdeⅠ消化pMG-1然后使载体连接，则导致非融合蛋白的表达（也即未与NSl81融合）。
D.pNSl81RLf△9的构建
用限制性核酸内切酶BamHⅠ（100单位）在400μl高缓冲液（上述）中使表达载体pUCRLf（100μg）于37℃消化3小时。然后，用DNA聚合酶Ⅰ大片段（上述）处理切割的质粒以填平BamHⅠ位点的末端。然后，用限制性核酸内切酶SalⅠ（20单位）在400μl中缓冲液（上述）中使质粒于37℃消化3小时。在6%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上电泳分离产生的1035 bp片段，通过电泳洗脱回收。
用限制性核酸内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ（各25单位）在400μl中缓冲液（上述）中使表达载体pMG-1（10μg）于37℃消化3小时。然后，在30μl连接酶缓冲液（上述）中，用1单位T4-DNA连接酶使来自pUCRLf的1035 bp BamHⅠ末端填平的/SalⅠ片段（400μg）连接至此载体（100ng）中，连接反应于4℃进行16小时。
用连接混合物转化大肠杆菌MM294Cl+株。得到氨苄青霉素抗性集落之后，筛选含有正确定向的插入基因的克隆。鉴别到正确构建的质粒（pNSl81RLf△9），将其转化至大肠杆菌AR58株（CIts857）中，检测孢子小体外周蛋白基因产物的表达，该产物缺乏最初18个N端氨基酸（CS1-18）、中心重复区和含有区域Ⅱ的邻接区的9个N端氨基酸（CS248-296）（RLf△9），并通过来自连接在pMG-1表达载体中的合成人工接头的6个氨基酸（Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp），与流感病毒非结构蛋白1的81个N端氨基酸即NS181相融合。NS181RLf△9具有如下顺序：
NS181-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412
使Asp（合成人工接头的C端）与RLf△9（CS19-123-CS297-412）分开的脯氨酸是填平pCSP的BamHⅠ/FokⅠ片段的BamHⅠ位点时产生的伪迹。
使细胞在Luria-Bertani肉汤（LB）中于32℃培养至650nm处的吸光率（A650）为0.6，然后在42℃温度诱导3小时，以启动表达质粒中RL启动子的转录，以及随后的NS181CS蛋白衍生物转译。取1ml细胞的等分样品，沉淀后再悬浮于溶胞缓冲液中（10mM Tris-HCl pH7.8，25% vol/vol甘油，2% 2-巯基乙醇，2% SDS，0.1%溴酚蓝），在105℃热阻断5分钟。
通过SDS-PAGE（13%丙烯酰胺，30∶0.8丙烯酰胺∶二丙烯酰胺的比例）分离蛋白质。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，通过Western印迹分析检测在大肠杆菌中产生的NS181RLF△9蛋白质，在分析中使用与CS蛋白的区域1反应的多克隆抗体（Dame等，Science 225∶593，1984），以及与NS181蛋白反应的多克隆抗体。实验还表明，大肠杆菌产生的NS181RLf△9蛋白与混合的5种单克隆抗体没有反应活性，这些抗体针对恶性疟原虫CS蛋白的四肽重复区。
实例2 pNS181RLfAuth的构建
用限制性核酸内切酶BamHⅠ和FokⅠ在中缓冲液中消化大肠杆菌表达载体pCSP（见上述）。通过电泳洗脱回收产生的DNA片段，它编码含有区域Ⅰ的邻接区，但没有前面18个N端氨基酸。
用限制性核酸内切酶Tth111Ⅰ和SalⅠ在中缓冲液中消化第二等分试样的pCSP。通过电泳洗脱回收产生的DNA片段，它编码含有区域Ⅱ的邻接区，但没有前面9个N端氨基酸。
用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ在中缓冲液中消化大肠杆菌表达载体pUC18（见上述）。
为了恢复CS蛋白中心重复区C端侧的区域Ⅱ的9个N端氨基酸（CS288-296）（它们是在用限制酶TthlllⅠ消化pCSP时丢失的），制备一个含有FokⅠ和TthlllⅠ末端的合成的DNA片段，它具有如下顺序：
Asp Pro Gly Asn Lys Asn Asn GLn Gly Asn Gly Gln
Fok I 5′ATCCCGGGAATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA 3′
3′GCCCTTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT 5′Tth 111 I
将BamHⅠ/FokⅠ片段、TthlllⅠ/SalⅠ片段和合成片段都连接至BamHⅠ/SalⅠ消化的pUC18中。
用限制性核酸内切酶BamHⅠ在中缓冲液中消化产生的质粒pUCRLfAuth，填平末端后用限制性核酸内切酶SalⅠ消化。通过电泳洗脱回收产生的DNA片段，它编码真正的孢子小体外周蛋白，但缺乏前面的18个N端氨基酸和中心重复区。
然后，使分离的BamHⅠ末端填平的/SalⅠ片段连接至编码NSl81的大肠杆菌表达载体pMG-1（见上述）中，后者已预先用限制性核酸内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ消化。产生的表达载体是pNSl81RLfAuth，它表达具有如下顺序的蛋白：
Nsl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412
使区域Ⅰ和含有区域Ⅱ的CS邻接区（CS19-123和CS288-412）分开的甘氨酸是合成的FokⅠ/TthlllⅠ DNA人工接头顺序的伪迹。
NSl81RLfAuth的完整的核苷酸和氨基酸顺序如下：
实例3 pNSl81RLfAuth+（NANP）2的构建
用限制性核酸内切酶SmaⅠ在中缓冲液（见上述并含有KCl）中使pNSl81RLfAuth（上述）于25℃消化3小时。
将具有如下顺序
AsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro
5′AACGCAAACCCAAATGCAAACCCC 3′
3′TTGCCTTTGGGTTTACGTTTGGGG 5′
的合成的DNA人工接头连接至SamⅠ消化的pNSl81RlfAuth中。合成的DNA人工接头编码（NANP）（代表氨基酸的单字母符号，N＝天冬酰胺（Asn）;A＝丙氨酸（Ala）;P＝脯氨酸（Pro）），此四肽包括CS蛋白中具免疫优势的重复区的所谓共感顺序。用限制性核酸内切酶SmaⅠ消化pNSl81RLfAuth后，使得任意数目的由合成的DNA人工接头编码的重复四肽可连接至CS蛋白中原来由具免疫优势的重复区所占据的区域。通过这种方式，可在载体中连接进更多的编码四肽的DNA片段。产生的质粒称为pNSl81RLfAuth+（NANP）2，它编码具有如下顺序的蛋白质：
Nsl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-(NANP)2
-Gly-CS288-412
实例4 pNSl81（NANP）4RLfAuth的构建
用限制性核酸内切酶BamHⅠ消化表达载体pUCRLfAuth（见上述）。
将编码（NANP）4的合成的DNA片段连接至BamHⅠ消化的pUCRLf中。该合成的DNA片段具有如下顺序：
产生的质粒称为pUC18（NANP）4RLfAuth。
用限制性核酸内切酶BamHⅠ消化表达载体pUC18（NANP）4RLfAuth，填平末端（Klenow片段）后用限制性核酸内切酶SalⅠ消化，通过电泳洗脱回收产生的DNA片段。
将BamHⅠ末端填平的/SalⅠ片段连接至编码NSl81的表达载体pMG1（上述）中，该载体已预先用限制性核酸内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ消化。产生的质粒称为pNSl81（NANP）4RLfAuth，在它所编码的蛋白质中，由合成的DNA片段编码的重复四肽插在NSl81的氨基酸81（Met）和NcoⅠ/SacⅠ合成DNA人工接头的N端Asp之间：
Nsl81-(NANP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123
-Gly-CS288-412
实例5 pNSl81（NVDP）4RLfAuth的构建
pNSl81（NVDP）4RLfAuth的构建与上述pNSl81（NANP）4RLfAuth的构建基本相同，只是编码（NVDP）4（CS蛋白中心重复区的另一种四肽顺序）的合成的DNA人工接头具有如下顺序：
所产生的质粒编码具有如下顺序的蛋白：
Nsl81-(NANP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123
-Gly-CS288-412
实例6 从大肠杆菌中分离NSl81RLf△9
在温度敏感的λ溶素原（CIts857）中诱导NSl81RLf△9的合成之后，通过离心收集细菌细胞，产生的沉淀在-70℃温度冷冻。用120ml溶胞缓冲液（pH8）稀释大约12g浓缩的冷冻细胞以使其融解，该缓冲液含有50mM Tris，10mM EDTA，5%甘油和10mM DTT。在稀释细胞中加入最终浓度为0.2mg/ml的溶菌酶（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO），使溶液在4℃搅拌30分钟。用Branson声波仪处理细胞，直到溶液外表显现液化为止。加入最终浓度为0.1%（v/v）的10%脱氧胆酸溶液，用Sorvall RC 5B离心机（Dupont）使溶液在4℃以15，600XG离心30分钟。
倾弃上清液，留下的含有蛋白的沉淀悬浮于100ml缓冲液（pH10）中，其中含有50mM甘氨酸，2mM EDTA和5%甘油。悬浮液如上述用声波处理，加入最终浓度为1%（V/V）的TritonX-100（Sigma）。声波处理后的溶液在4℃搅动30分钟，然后如上述离心。
在含有蛋白的上清液中加入最终浓度为8M的脲，用50%的乙酸溶液将样品液滴定至pH5.5。使样品用25ml QAE SepharoseFast Flow（Pharmacia）色谱柱层析，该柱已预先用含有20mM乙酸钠，1% TritonX-100和8M脲的缓冲液（pH5.5）平衡，流速为300cm/小时。将未结合组分中的蛋白加到10ml SP SepharoseFast Flow（Pharmacia）色谱柱中，该柱已预先用含有20mM乙酸钠和8M脲的缓冲液（pH5.5）平衡，流速为120cm/小时。通过280nm处的光吸收率监测流出液。用含有100mM Tris和8M脲的缓冲液（pH8）从此柱中洗脱蛋白。
产物的SDS-PAGE显示出一个表观分子量为40，000kD的主带，纯度约为80%。纯化过程产生12mg蛋白质，每毫克蛋白质中含有大约14单位内毒素。
实例7 从大肠杆菌中分离NSl81RLf△9
在温度敏感的λ溶素原中诱导NSl81RLf△9的合成之后，通过离心收集细菌细胞，产生的沉淀在-70℃温度冷冻。用2200ml缓冲液（pH8.0）稀释大约636g浓缩的冷冻细胞以使其融解，该缓冲液含有60mM Tris，12mM EDTA，6%甘油和12mM DTT。使融解细胞在6000-7000psi条件下两次通过Manton Gaulin均化器。加入最终浓度为0.1%（v/v）的10%脱氧胆酸溶液，溶胞液在4℃搅动30分钟，使其在Sorvall RC 5B离心机（Dupont）中以10，000XG在4℃离心60分钟。
弃去沉淀，在含有蛋白的上清液中每毫升加入25μl 1050或2100 Biocryl小珠混合物（Supelco）。搅动溶液，并如上述离心。
弃去沉淀，在剩下的含有蛋白的上清液中加入固体硫酸铵，在5分钟的期间内加至20%饱和度。
如上述使样品搅动和离心。沉淀悬浮于400ml含有20mM乙酸钠、1% TritonX-100和8M脲的缓冲液（pH5.5）中。使悬浮液离心，上清液在含有100mM Tris和8M脲的缓冲液（pH8.0）中透析。将滞留液调节至pH5.5，并在100ml SP SepharoseFast Flow（Pharmacia）色谱柱中层析，该柱已预先用含有20mM乙酸钠、1% TritonX-100和8M脲的缓冲液（pH5.5）平衡，流量为10ml/分。用平衡缓冲液洗涤柱子，然后用含有0.1MTris和8M脲的缓冲液（pH8）洗涤。柱子用500ml 0.0至0.5M氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，该梯度洗脱液配制于含有0.1M Tris和8M脲的缓冲液（pH8）中。
蛋白质在0.3M氯化钠浓度处被洗脱。合并含有产物的组分，用YM10膜在Amicon搅动池中使其浓缩，用含有20mM Tris的缓冲液（pH3.0）作为透析液，然后在磷酸盐缓冲液（pH7.0）中透析。
产物的SDS-PAGE分析揭示出一个表观分子量为40，000kD的主带和一系列次要组分。纯化后产生25mg蛋白，每毫克蛋白中含有144单位内毒素。
实例8 从大肠杆菌中分离R16CSP
在大肠杆菌中表达的R16CSP是如下制备的：将从pUC8克隆1中分离的XhoⅡ片段（上述）连接至预先用限制性核酸内切酶BamHⅠ消化的pCSP（上述）中。R16CSP在实例9中用作ELISA捕获抗原，它是如下述纯化。
在大肠杆菌中诱导R16CSP的合成之后，通过离心收集细菌细胞，产生的沉淀在-20℃温度冷冻。大约373g浓缩的冷冻细胞在1.43升缓冲液（pH3.0）中融解，该缓冲液含有50mM Tris，10mM EDTA，5%甘油和10mM DTT。加入最终浓度为0.1%（v/v）的10%脱氧胆酸（w/v）溶液，然后使细胞在7，000psi条件下两次通过Manton-Gaulin均化器。在均化液中加入最终浓度为0.5%的10%聚吖丙啶（polyethyleneimine）（BRL）溶液，此溶液在0.5M Tris pH8.0缓冲液（w/v）中。使溶液在4℃搅拌1小时，在Sorvall RC 2B离心机（Dupont）中在4℃以13000xG离心45分钟。
弃去沉淀，在上清液中加入固体硫酸铵，在5分钟内加至35%的饱和度。搅动溶液，并如上述离心。
沉淀悬浮在含有300ml 20mM Tris和10mM EDTA的缓冲液中（pH8.0）。加入含有300ml 8M脲、2.7升10mM乙酸钠和4M脲的溶液，将pH立即调至4.0。使样品如上述离心。
将上清液加在50ml SP-SepharoseFast Flow（Pharmacia）色谱柱中，该柱已用含有20mM乙酸钠和4M脲的缓冲液（pH4.0）平衡。用含有20mM乙酸钠的缓冲液（pH5.0）洗涤柱子，然后用250ml含有0.0-1.0M氯化钠线性梯度浓度的洗涤缓冲液洗脱。在大约0.3M氯化钠浓度处洗脱出产物。
50ml一份离子交换产物的试样用10%三氟乙酸（TFA）（v/v）调至pH2.3，在用0.1% TFA平衡的C4反相柱（Vydac，1×25cm）上进行色谱层析。在45分钟内流过在0.1% TFA中的0-60%乙腈（ACN）线性梯度浓度的溶液，在大约60% ACN浓度处洗脱出产物。通过加入25μl/ml 1M碳酸氢铵来中和反相产物。
大约45ml反相产物在含有2M盐酸胍的缓冲液（pH5.0）中透析，在YM30膜（Amicon）上浓缩至20ml。10ml试样在2.5×50cm Superose12（Pharmacia）色谱柱中层析，该柱用含有2.0M盐酸胍的缓冲液（pH5.0）平衡。在表观分子量358kD处洗脱的蛋白在含有20mM乙酸钠的缓冲液（pH4.5）中透析。
Superose产物的考马斯（Coomassie）染色的SDS-PAGE显现出两个主带，表观分子量为72kD和70kD。最终产物的氨基酸分析和N端顺序在期望值的15%之内。
实例9 小鼠对NSl81RLf△9的抗体应答
为了评价其免疫原性，将纯化的NSl81KLf△9抗原接种至3个小鼠品种中，即C57BL/6（H-2b）;BALB/C（H-2d）;C3H/HEN（H-2k）。以前已经表明，只有H-2b单倍型小鼠针对恶性疟原虫孢子小体外周蛋白重复的抗原决定簇产生抗体。抗原与Freund氏佐剂一起注射，利用酶联免疫吸附检测（ELISA）法筛选免疫动物的血清样品。对照动物用R32tet32免疫，这是一种含有CS蛋白重复四肽的抗原。3个品种的小鼠在用NSl81RLf△9接种后，都产生了与孢子小体外周蛋白的非重复（邻接）区反应的抗体。免疫原性检测的详情和结果如下。
三个品种的小鼠各分为两个组，每组有4至5只小鼠。第一组动物用NSl81RLf△9免疫，第二组用R32tet32免疫（J.Young等，Science 228∶958，1985）。R32tet32含有两个XhoⅡ片段，每个片段编码具有如下顺序的肽〔（Asn-Ala-Asn-Pro）15（Asn-Val-Asp-Pro）〕2。tet32是一种32氨基酸的肽，它是由解读框中的四环素抗性基因编码的。
根据实例6纯化NSl81RLf△9，施用前使其与完全的Freund氏佐剂混合。每只小鼠（6-8星期龄）用50μg抗原皮下免疫，以200μl的剂量施用于右后角。对小鼠进行两次免疫，第一次用在完全的Freund氏佐剂中含有50μg抗原的单一的200μl剂量。加强注射在4星期后进行，注射方法与第一次注射基本相同，只是使抗原乳化于不完全的Freund氏佐剂中。
第二次免疫7天之后使动物放血。合并一个组内所有动物的血液，在4℃温度凝结过夜，离心分离血清，然后贮存于-70℃。利用ELISA测定合并的血清，看是否存在针对R32tet32、NSl81RLf△9或R16CSP产生的抗体。（R16CSP如上述制备和纯化。）
“夹层”ELISA作为捕获抗原掺入有R32tet32、R16CSP和NSl81RLf△9，它们吸附在微量滴定板的小穴壁上。
通过在小穴中加入50μl含有0.75μg捕获抗原和0.2μg煮沸过的酪蛋白的PBS溶液，使捕获抗原吸附在微量滴定板的小穴壁上。此溶液如下制备：将8μl（3.76μg）捕获抗原加在2，5ml的溶液中，此溶液含有4μl 0.5%煮沸过的酪蛋白溶液（见下述）对5ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲液（PBS）（一种含水溶液，包括0.8% NaCl;0.217% Na2HPO4·7H2O;0.02% KH2PO4和0.02% KCl，pH7.4）。
在室温保温过夜后，吸出小穴内容物，平板上剩余的活性结合位点用煮沸的0.5%酪蛋白溶液阻断（5g/升酪蛋白（J.T.Baker Chemical Co.）;0.1g/升Thimersol（Sigma Chemical Co.）;0.02g/升苯酚红（Sigma Chemical Co.）;900ml PBS pH7.4;100ml 0.1N NaOH），此溶液是与1% Tween 20（Sigma Chemical Co.）的混合液（99∶1）。
小鼠血清样品在含有0.025% Tween 20的0.5%煮沸的酪蛋白溶液中稀释为1∶100;1∶1000;1∶10，000;1∶100，000和1∶1，000，000。然后将受试血清加至穴中，保温2小时后，除去血清，用含有0.05% Tween 20的PBS溶液将小穴洗涤两次。在小穴中加入与过氧化物酶结合的抗小鼠IgG Ab，用与血清相同的稀释液稀释为1∶2000。保温1小时后，吸出小穴内容物，用含有0.05% Tween 20的PBS溶液洗涤3次，加入纯净的过氧化物酶底物溶液（Kirkegaard & Perry，根据厂家说明书制备）。过氧化物酶与底物的反应导致形成深绿色产物，色泽强度与血清样品中的抗体量成正比。15分钟后，用ELISA平板读数仪在405至414nm处读取结果，以光密度（O.D.）单位记录。
结果示于图1（a）和1（b）（在C3H/HEN中的抗体应答）;图2（a）和2（b）（在C57BL/6中的抗体应答）;图3（a）和3（b）（在BALB/C中的抗体应答）。
用NSl81RLf△9抗原对所有3个品种的小鼠C3H/HEN（H-2k）、BALB/C（H-2d）、C3H/HEN（H-2b）进行接种，导致形成与孢子小体外周蛋白非重复区强烈反应的抗体。对NSl81RLf△9捕获抗原的反应活性比对R16CSP的活性稍强。（R16CSP捕获抗原只检测出针对CS蛋白非重复区的抗体，而NSl81RLf△9捕获抗原能够检测抗NSl81和抗RLf△9抗体二者）。正如所期望的那样，C3H/HEN小鼠不产生对于R32tet32的抗体应答，而C57B1/6小鼠却产生。虽然BALB/C小鼠对R32tet32的抗体应答比C57BL/6的抗体应答弱得多（差别为1个对数值），但此应答却是在期望之外的，而且与文献中关于这种单倍型小鼠对于（NANP）40的阴性应答的报道相反（Del Giudice等，J.Immunol.137∶2952，1986报道，在14个携带有9个不同的H-2单倍型的小鼠品种中（其中包括BALB/C（H-2d）），用没有载体蛋白的（NANP）40免疫后，只有H-2b小鼠产生了针对（NANP）40的抗体应答。H-2d小鼠（BALB/C）根本没有应答。但用（NANP）40与作为载体蛋白的钥孔血蓝蛋白结合后免疫BALB/C小鼠却的确能产生抗（NANP）40的抗体。
实例10 孢子小体侵染的抑制（ISI）
在此研究中，测定用NSl81RLf△9免疫的家免血清抑制恶性疟原虫孢子小体侵入肝细胞的性能，孢子小体发育和成熟为红细胞外阶段的位点。
用NSl81RLf△9免疫3个小鼠品种，BALB/C、C57BL/6、A/J，在完全的Freund氏佐剂或氢氧化铝中施用，结果产生针对CS蛋白非重复区的高滴度抗体。然而，根据Hollingdale，M.R.等人，J.Immunol.132（7）∶909（1984）所描述的孢子小体侵染的抑制检测法检测时，这些小鼠的血清都不能阻抑孢子小体侵入培养的人类肝癌细胞（HepG2-A16）。
与此相反，用100μg NSl81RLf△9免疫新西兰白家兔后，即在第0、3和7星期在完全的Freund氏佐剂中施用，能诱导出针对CS蛋白非重复区的高滴度抗体（尽管低于在小鼠中测到的值）。然而，根据Hollingdale的ISI检测法测定时，证实用NSl81RLf△9免疫的家兔血清能显著抑制孢子小体对肝癌细胞的侵入（在一个动物中为98%，平均抑制为大约60%）。
来自用NSl81RLf△9免疫的家兔的血清，显著抑制恶性疟原虫氯奎抗性株（7G8株）和恶性疟原虫氯奎敏感株（BF54株）的孢子小体侵入肝癌细胞。ISI测定的结果表明，恶性疟原虫7G8株的孢子小体侵入肝癌的抑制率（平均为85%）高于NF54菌株的抑制率（平均为60%）。
正常的人类肝细胞代替人类肝癌细胞进行ISI研究时发现，用NSl81RLf△9免疫的家兔血清抑制恶性疟原虫NF54株孢子小体浸入肝细胞（一只家兔的血清抑制89%，平均抑制率为大约45%）。
这些研究提示，孢子小体的存在将中和在NSl81RLf△9抗原上的抗原决定簇。