新型人肿瘤坏死因子突变体 本发明涉及基因工程技术
肿瘤坏死因子(TNF)主要是由巨噬细胞产生的一种非糖基化可溶性多功能细胞因子，由157个氨基酸组成，其主要生物学活性是能够较为特异性地杀伤多种肿瘤细胞，引起肿瘤细胞坏死，这就使得人TNF成为一种潜在的抗肿瘤药物，其开发前景在国内外引起了广泛的重视。但是，临床试验研究表明，全身大剂量应用人TNF可产生严重的毒副作用，而小剂量又难以达到治疗效果。因此，如何提高天然TNF对肿瘤细胞的杀伤活性，降低对组织器官的毒副作用已成为TNF研究的一个重要组成部分，是TNF能否作为抗肿瘤药物应用于临床的关键问题。
本发明应用基因工程技术对TNF基因进行了改造，构建了工程菌，对工程菌表达水平、表达产物的纯度及生物活性均进行了研究，取得了满意的效果，将此工程菌进一步应用到临床可为恶性肿瘤的治疗提供一种安全有效的药品。
本发明的目的是通过以下步骤实现的：
1.nrhTNF基因克隆：
采用亚磷酰胺法合成2条引物，引物1的序列及组成为：
5′GC GAATTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC 3′
EcoR I起始码Arg Lys Arg hTNF11-14位氨
基酸编码序列
引物2的序列及组成为：
5′CG GACGTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC 3′
Pst I终止码Phe hTNF156-153位氨
基酸编码序列
应用含hTNF cDNA的质粒pBVINF202为PCR扩增模板，经PCR反应，扩增出一长约470bp的DNA片段。将扩增片段经EcoR I和Pst I双酶切后，克隆入pUC18和pUC19的EcoR I和Pst I酶切位点之间，测定扩增片段的DNA序列，结果表明，该PCR扩增片段与天然人TNF相比较，5′未端缺失了7个氨基酸的编码序列，天然人TNF基因中编码Pro8Ser9Asp10的编码序列由ArgLysArg的编码序列取代，157位Leu的密码子被Phe的密码子取代。
2.高效表达载体的构建
将含人TNF突变基因的pUC19经EcoR I和Pst I双酶切，低熔点琼脂糖回收470bp地DNA片段，插入原核高效表达载体pBV220中。
3.工程菌的建立
宿主菌为大肠杆菌DH5a。将连接好的pBVnrhTNF用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a株，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，LB培养液扩大培养，提取质粒，用EcoR I和Pst I双酶切，筛选出目的菌株。
4.pBV nrhTNF在大肠杆菌中的表达
将经筛选后的pBVnrhTNF/DH5a30℃培养，42℃诱导5小时，菌体经载样缓冲液处理，进行SDS-PAGE电泳，染色，脱色，干胶后扫描分析，在分子量16.5KD左右处有明显表达条带，此带占菌体总蛋白的67.4％。
5.nrhTNF实验室纯化
pBVnrhTNF/DH5a表达菌经诱导后收集菌体。菌体用溶菌酶裂解，取裂菌上清加入(NH4)2SO4达50％饱和度，上清用10mmol/Tris·ClpH8.5，1mmol/L EDTA充分透析。粗提液经Q--Sepherose柱层析，0-0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集含有nrhTNF的第一峰。透析除盐后，经S-Sepherose柱层析，0-1mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集nrhTNF活性峰，稀释，过滤，分装，冷冻干燥。
经菌株稳定性检测，实验室规模发酵、分离纯化后表明：此工程菌株具有良好的稳定性，表达量占菌体蛋白的67.4％。层析纯化后比活性达1×109U/mg蛋白，说明此工程菌株适合于开发生产。
生物活性分析：应用中性红摄入法测定nrhTNF对L929细胞的杀伤活性，结果表明，nrhTNF杀伤活性大于4×108/ml，比活性大于8×108/mg蛋白。
蛋白含量测定：应用Lowry′S法测定nrhTNF蛋白含量约为0.5mg/ml。
纯度分析：SDS-PAGE和HPLC鉴定nrhTNF半成品纯度大于95％。
等电点测定：平板等电聚焦法测定nrhTNF等电点为7-8。
N端氨基酸序列分析：1-4位氨基酸为Met Arg Lys Arg，其后为天然hTNF第11位以后的氨基酸序列。
肽图测定：nrhTNF与天然hTNF之间的大部分色谱峰是一致的，仅在25min和30min时有一定的差别，初步说明nrhTNF与天然hTNF大部分结构是一致的，两者的差别可能是N端不一致造成的。此外，nrhTNF的肽图具有良好的批间重复性。
nrhTNF半成品紫外扫描呈蛋白质吸收曲线，未测出氨苄青霉素活性，残余DNA含量在100pg以下。
试验采用小鼠肉瘤180(S180)、肝癌H22、黑色素瘤B16等动物移植性肿瘤对新型基因工程人肿瘤坏死因子(nrhTNF)进行抑瘤作用观察，并与重组人肿瘤坏死因子(TNF)同时进行疗效比较，实验结果显示：37.5、75、150万U/kg剂量对动物每日一次，连续8天肌肉注射给药，nrhTNF对各瘤株生长均显示了较明显的抑制作用，剂量反应关系及重现性较好，相同剂量下疗效明显好于重组人TNF。
临床前药理、毒理研究表明，与天然重组人TNF相比，nrhTNF的毒性明显降低(急毒nrhTNF LD50为1.149mg/kg，天然重组人TNFLD50为0.412mg/kg，毒性降低2.7倍)；对肿瘤细胞的杀伤活性和对荷瘤小鼠的抑瘤作用明显增强；nrhTNF对小鼠的自主活动、行为活动、犬的呼吸系统、心血管系统无明显影响；对小鼠外源性脾结节生成单位无抑制作用；可激活恒河猴PBMC T淋巴细胞。nrhTNF无致突变作用，无肌肉刺激和全身致敏作用。药代动力学研究表明，nrhTNF肌肉注射后吸收很快，0.5h达高峰，T1/2为1h，其分布以血、肾、肺、肝、小肠、心浓度较高，主要从尿中排泄。