制备青霉素和头孢菌素的改进的酶催化方法 本发明涉及一种制备式(I)和(II)和青霉素和头孢菌素的改进的酶催化方法其中X是S或CH2，R是被选择性取代的六元烃环R1是氢原子，卤原子，甲基，甲氧基，C1-C4链烯基或通过氧原子，硫原子或氮原子键合于有机基团上的亚甲基。
CS-A-3816253公开了一种通过将一种α-取代的α-氨基酸和一种从7-氨基头孢烷酸或7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸衍生的化合物在含水介质中在一种活性微生物或酶存在下于+5℃至+50℃的温度，尤其是+20℃至+40℃的温度下进行反应，制备一种青霉素或头孢菌素的方法。现已发现当按照所引用的美国专利的建议操作时，所需要的最终产物的产率被引起形成特别难于从反应混合物中分离的副产物的同时存在的平行反应大大地降低了。
为了克服或减少上述缺点，EP-A-0473008提出了一种制备式(I)或(II)青霉素或头孢菌素的方法，根据这种方法一种6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸与一种如式R-CH(NH2)-COOH的α-取代地α-氨基酸或它的一种反应性衍生物在一种固定化青霉素酰基转移酶存在下进行反应，反应在水溶液介质中于-5℃至+20℃的温度，优选大约+4℃下进行。
在EP-A-0473008的说明书中清楚地给出了全部反应条件，它还给出了一系列计25个详细的实施例，表明所需要的最终产物具有非常好的产率(最高至90％或更高)。
在这一点上值得注意的是一种方法当产率足够高(大约90％)和当最终产物能很容易地被纯化时是工业上切实可行的。
EP-A-0473008一般性地提到了式R-CH(NH2)-COOH的α-取代的α-氨基酸和可以被用作反应试剂的它们的反应性衍生物，但特别举例说明的唯一的氨基酸是D-苯基甘氨酸甲基酯。
本发明的申请人按照EP-A-0473008的实施例中所公开的方法进行了非常精确的和重复的试验，但结果令人泄气的。实际上现已发现在反应介质中如果所引用的氨基酸的摩尔此相对于每1摩尔的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸少于4摩尔氨基酸，所需要的最终化合物的产率非常低(低于大约60％)和，如此的话，是工业上不能接受的。
只有在D-苯基甘氨酸甲基酯的摩尔数每1摩尔的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸是4至6时才能得到良好的和可接受的产率(大约90％)。但是，在这种情况下不仅费用的增加是不可接受的(D-苯基甘氨酸甲基酯的价格很高)而且形成了非常难于或不可能从所需要的最终的青霉素或头孢菌素中分离的副产物。
已经进行了使用其它类型的D-苯基甘氨酸酯或其它氨基酸酯的尝试，但全部努力都是不成功的。使用氨基酸的许多其它的反应性衍生物得到的是同样的副结果。
德国专利申请DOS2214444叙述了将7-ADCA与苯基甘氨酰胺在青霉素酰基转移酶存在下进行反应的头孢菌素(尤其是头孢氨苄)的酶催化合成：得到的产率非常低。
PCT/DK91/00188(WO92/01061)和PDT/DK92/00388(WO93/12250)公开了用酶催化酰化的β-内酰胺抗菌素的制备方法，根据该方法一种式(III)的酰胺在一种固定化青霉素酰基转移酶存在下与一种6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸进行反应。这类方法证明是切实可行的，但是现已发现可见量的酰胺(III)被同样的酶水解，因此增加了所需要的最终产物的杂质：还有一部分最终产物也被酶水解。
按照两个上面引用的PCT案例所教导的，本发明的申请人已经进行了几个实验，但使用不同的酰胺作为酰化剂，不同的酶作为细菌源和不同的固态基质用于酶的固定化。
已经将所得到的结果进行了互相间的比较，结果表明酰胺和最终产物总是同时有可见的水解。
现已惊人地发现按照所说的WO92/01061和WO93/12250中所公开的相同方法，但是将酶固定在特殊的载体上，该载体是一种吖内酯聚合物(一种本身是已知的聚合物，通常在亲合色谱中用作生物载体介质，由Minnesota Mining and Manufacturing10.以FMPHAZE商品名销售)，酰胺(HI)和最终产物的水解基本上被降低了。这一降低可以被定量为降低了大约30％，其重要性不仅可从方法的经济性角度来看，而且特别是由于最终产物能以更高的纯度来制得且还由于避免了水解的产物(苯基甘氨酸和它的衍生物)结晶化的危险。在这一点上值得注意的是在使用已被试验过的所有其它固定化基质时结晶化能很容易地发生。
因此，本发明涉及制备如上文所指定的式(I)和(II)的青霉素和头孢菌素的改进的酶催化方法，其中将一种如式(IV)或(V)的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸其中X和R1是如上文所定义的，在水溶液介质中于从-5℃至+35℃的温度下和在一种固定化青霉素酰基转移酶存在下与一种如式(HI)的酰胺其中R是如上所说明的，和R2和R3彼此互相独立地为氢或线性或支化的1至3碳原子的烷基，或它们的盐，以每1摩尔所说的酸(IV)或(V)从1.5至3摩尔所说的酰胺(III)的摩尔比进行反应，其特征在于所说的酶被固定在吖内酯聚合物上。
尤其是所说的酰胺(III)是D-苯基甘氨酰胺或它与一种有机或无机酸生成的一种盐。
本发明也涉及含有根据本发明的方法制备的青霉素或头孢菌素，以及一种药物上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
含有青霉素或头孢菌素的药物组合物通常按常规方法制备并以一种药物上的适当形式服用。
关于式(I)和(II)，R可以是，例如，未被取代的或被一个或几个羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、硝基或氨基取代的苯基、环己二烯基、环己烯基或环己基。
依次地R′可以是氢原子、卤原子、甲基或键合到有机基团尤其是烷氧基、烷氧基羰基上或键合到含有1至4个选自O、S或N的杂原子的五元或六元杂环上的亚甲基，所说的杂环经过一个O、S或N原子与亚甲基连接和选择性地带有一个或几个选自下列的取代基：羟基、卤素、烷基、烷氧基、羰基、羧基、氰基和氨基等。
在此所用的术语“烷基”和“烷氧基”是指1至6个碳原子的基团，优选1至4个碳原子基团。
关于其酰胺具有式(III)的α-氨基酸，可以提到的实例是D-苯基甘氨酸、D-对-羟基苯基甘氨酸、和D-1，4-环己二烯-1-基甘氨酸。
酰胺的适当的盐是与无机酸如盐酸、氢氟酸、氢溴酸、硫酸或硝酸所成的盐或与有机酸如乙酸、甲酸或马来酸所成的盐。
在式(IV)和(V)的化合物中下列酸是特别有益的：6-氨基青霉烷酸、7-氨基头孢烷酸、7-氨基-3-脱乙酰氧基-头孢烷酸、7-氨基-3-氯-头孢烷酸。
在本发明的方法中所用的酶可以是一种青霉素酰基转移酶或青霉素酰胺酶。青霉素酰基转移酶或酰胺酶可以从任何已知的微生物源衍生。其中特别值得提出的是下列微生物：黄单孢菌属、假单孢菌属、产气单孢菌属、大肠杆菌属、节细菌属、醋杆菌属、枝原体属、精朊杆菌属、kluyvera、棒状杆菌属和芽孢杆菌属。从大肠杆菌衍生的酶是特别优选的，因为它们可很容易和很便宜地以游离的或固定化的形式从商业上得到。
尤其可以使用分类为EC3、5、1、11的青霉素酰基转移酶或酰胺酶。
下列实施例说明了本发明。
实施例1
青霉素G酰基转移酶在吖内酯功能支持物上的固定化
将在pH7.5的2毫升0.1M磷酸盐溶液中的138.8毫克的青霉素酰基转移酶与28毫升pH7.4的由1.1M硫酸钠和0.1M磷酸钠组成的偶合缓冲剂相混合。向一个50毫升的离心管中加入1克的吖内酯功能支持物(EMPHAZETM)。向干燥的珠粒中加入在偶合缓冲剂中的酶并在摇动式平台上，于室温下往复振荡混合3小时。排去过量的偶合缓冲溶液，和用10毫升PBS(20mM磷酸盐、0.9％氯化钠，pH7.4)的等分试样洗涤珠粒5次。固定在这种支持物上后这样形成的酶的活性＞90％。
实施例2
酶反应器中有β-萘酚存在的头孢克罗
将11.69克(49.82mmoles)的3-氯-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(3Cl/Nu)和15.22克(101.47mmoles)的D-苯基甘氨酰胺(FGA)溶于水使总体积为196毫升。然后，将8克(55.44mmo/es)精细研磨的β-萘酚加入到在同一反应器中的那种溶液中。用21.2克(3700I.U.)的青霉素G酰胺酶(如在实施例1中制得(PGA)在下列条件下进行酰化：在10℃的温度下用4N硫酸将pH稳定地保持在6.8。2小时后，98％的3Cl/Nu转化成与β-萘酚复合的头孢克罗〔7-(D-2-氨基-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸〕。3Cl/Nu转化率达到98％后，头孢克罗的合成产物与D-苯基甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为4.12(相比之下，对于固载于聚丙烯酸环氧乙烷珠粒上的PGA为3.56)。
实施例3
在分离结晶反应器中连续地与β-萘酚复合的头孢克罗
将47.71克(203，37mmoles)的3Cl/Nu和87.3克(582.53mmoles)的FGA溶于水中使总体积为1070毫升。然后将30克(207.90mmoles)精细研磨的β-萘酚加入到结晶反应器中。使溶液通过酶催化反应器循环到结晶反应器中，在酶催化反应器中用25克(4500I.U.)的PGA进行高酰化。过滤掉复合产物和使母液返回到酶催化反应器中以便转化完全。该方法在下列条件下进行：在10℃的温度下用4N的硫酸将pH稳定保持在6.8。循环大约3小时后，94％的3Cl/Nu转化成头孢克罗，在结晶反应器中与β-萘酚复合。在3Cl/Nu转化率达到94％以后，头孢克罗的合成产物与D-苯基甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为3.05(相比之下，对于固载于聚丙烯酸环氧乙烷珠粒上的PGA为2.37)。
实施例4
在分离反应器中连续结晶的头孢克罗二水合物
与实施例3相同的起始溶液。使溶液通过酶催化反应器循环到结晶反应器中，在酶催化反应器中用25克(4500 I.U.)的PGA进行了酰化，在结晶反应器中pH被降低至6.4以促进头孢克罗2H2O的沉淀。过滤掉结晶产物和使母液返回到酶催化反应器中以使转化完全。该方法在下列条件下进行：两个反应器的温度都是2℃在结晶反应器中用4N硫酸将pH稳定地保持在6.4。循环大约3小时后，在结晶反应器中93％的3Cl/Nu转化成头孢克罗2H2O。3Cl/Nu转化93％。以后，头孢克罗的合成产物与D-苯基甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为2.61相比之下，对于固载于聚丙烯酸环氧乙烷珠状体上的PGA为2.02。
实施例5
在两步的酶催化和结晶化方法中用FGA将FADCA酰化成头孢氨苄
将25.05克(117.05mmoles)的7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)，30.05克(198.99mmole)的FGA溶于水中使总体积为498毫升。在下列条件下用21.0克(3750I.U.)的PGA进行酰化：第一步的起始pH是6.57，温度为3℃。大约1小时后，61.9％的7-ADCA转化成头孢氨苄〔7-(D-2-氨基-2-苯基乙酰氨基)-3-甲基-3-头孢烯-4-羧酸〕。从使之与11.5克(79.70mmoles)的β-萘酸复合的富母液中分离出大部分头孢氨苄。随后通过用与上面相同的PGA处理母液完成了第二步反应。大约2小时后，总共两步反应后，94.5％的7-ADCA转化成头孢氨苄。从使之与7.50克(51.98mmoles)的β-萘酸复合的第二步的富母液中分离出大部分头孢氨苄，7-ADCA转化94.5％后，头孢氨苄的合成产物与D-苯基甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为2.27相比之下，对于固载于聚丙烯酸环氧乙烷珠粒上的PGA为1.53。
实施例6
用FGA将7-氨基-3-氯-碳酰头孢烯酸酰化成loracarbef
将3.32克(15.31mmoles)的3-氯-7-氨基碳酰头孢烯酸(3Cl/CNu)和8.65克(57.70mmoles)的FGA溶于水使总体积为190毫升。在下列条件下用5克(895I.U.)的PGA进行酰化：在3℃的温度下用1N盐酸将pH稳定地保持在6.2。大约2小时后，89.5％的3Cl/CNu转化成loracarbef〔7-(D-2-氨基-2-苯基乙酰氨基)-3-氯-3-碳酰头孢烯-4-羧酸〕。3Cl/CNu转化89.59％后，loracarbef的合成产物与D-苯基甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为2.76相比之下，对于固载于聚丙烯酸环氧乙烷珠粒上的PGA为2.15。