溶血栓活性蛋白和抗凝血剂的组合物及其应用 本发明涉及的组合物和方法是用于治疗患有急性闭塞性血管疾病的患者。其特征在于非肝素的抗凝血剂通过静脉快速注射代替长时间的静脉输注，并与通过静脉快速注射和/或静脉输注施用的溶血栓活性蛋白结合使用。
背景和以往的方法
心血管疾病，例如急性心肌梗塞、中风、外周动脉闭塞、肺栓塞、深度静脉血栓形成以及其它的血管栓塞性疾病是主要的患病和死亡的原因。上述的疾病是由于血管中形成的完全或部分闭塞性血栓造成的，它们妨碍组织得到充足的血液供应。血栓是由血细胞，例如血小板、红细胞、白细胞的凝聚物构成的，并由血纤维蛋白网状组织使之稳定。
目前治疗这些栓性血管疾病的方法包括溶解已有的血栓，同时防止导致先前穿通的血管再闭塞的再生血栓的形成。
急性心肌梗塞的溶血栓疗法显著地改善了急性心肌梗塞的自然沿革，死亡率大约降低了30％。(GISSI：Lancet 1986；1：871-874；ISIS-2：Lancet 1988；2：349-360；AIMS：Lancet 1988；1：545-549；Wilcox et al.，Lancet 1988：2：525-539；ISAM：N Engl J Med 1986；314：1465-1471)。最近完成的GUSTO试验(全球性使用链激酶和组织型纤维蛋白溶酶原激活剂治疗冠状动脉阻塞)结果表明激活的组织型纤维蛋白溶酶原激活剂与静脉输注(i.v.)肝素比以前经典的溶血栓疗法提供了更多的生存益处。(GUSTO：N Engl J Med 1993；329：673-682)。更重要的是，这项研究支持这样一个假说：冠状动脉的血液流过梗塞动脉的恢复速度越快、越完全，心室地功能改善得越好，心肌梗塞的患者的死亡率越低。(GUSEO：N Engl J Med 1993；329：1615-1622)。
但是，最近的资料显示现行的重复输注(reperfusion)的策略没有意识到降低死亡率和抢救心室功能的最大的潜力(Lincoff and Topol，Circulation 1993；87：1792-1805)。血栓溶解的益处对于许多患者来说基本上没有体现，原因包括没有及时、迅速地再穿通，TIMI3级流不完全穿通或严重残留狭窄，心外膜动脉穿通但无心肌组织回流，间歇性冠状动脉穿通，后发的再阻塞或重复输注的损伤。因此，人们正在进行努力以使重复输注方法达到最优化。这些努力在很大程度上是以提高溶血栓的速度和质量为目标的。
总的来说，提高溶血栓速度和质量的药物方法的基础是溶血栓剂本身和辅剂，即和溶血栓剂一起施用的其它辅助成分。
总剂量100mg的重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)通过加速方式施用，即在90分钟以内而不是传统的3个小时(ISIS-3：Lancet 1992：339：753-770；GUSTO：N Engl J Med 1993；329：673-682)，已经显示出具有更高的穿通率，从而降低了死亡率。除了修改rt-PA的施用方法，使用新型的溶血栓活性蛋白两次快速注射后也显示了非常高的穿通率，例如重组纤维蛋白溶酶原激活剂BM06.022(又称为rPA)，美国专利5,223,256号，在此引入作为参考(Bode et al.，Circulation 1993；88(suppl.I)：I-292，abstract 1562)。
重输注后的栓塞动脉再阻塞问题被认为与真正的患病率和死亡率有关(Ohman et al.，Circulation 1990；82：781-791)。因此，药物策略的目标在于降低再阻塞和保持栓塞动脉的穿通。由于有证据表明在使用溶血栓剂后，血小板和凝血系统的激活在再阻塞的致病机理中起了很大的作用，因此人们试图通过药物抑制血小板的凝聚和凝血系统。于是，在治疗急性心肌梗塞时，通常推荐使用阿司匹林、抗血小板药、肝素以及抗凝血剂与溶血栓剂一起施用(Popma and Topol，Ann Int Med 1991；115：34-44)。
可是，阿司匹林和肝素的疗效是有限的。这归因于它们的作用方式。阿司匹林只抑制血小板活化的一条路径(通过抑制环氧酶)。肝素的作用依赖于抗凝血酶III。肝素有限的效能还源于血浆中的抑制剂以及它作用于与血块有关的凝血酶的有限的途径。因此，新型的抗血小板药物，例如糖蛋白IIb/IIIa受体的拮抗剂(即抗体、肽或低分子量化学物质)，和新型的抗凝血剂(凝血酶和其它凝血系统成分的肽类和合成的直接抑制剂，例如Xa、IXa、VIIa因子的抑制剂、组织因子等，或凝血系统内源抑制剂的类似物，例如激活的C蛋白或血栓调节素)引起了人们极大的兴趣。
最近，临床试验开始评价t-PA与异源的7E3抗体结合使用的有效性，后者结合在糖蛋白IIb/IIa受体上(Kleiman et al.，J Am Coll Cardiol 1993；22：381-389)。有几个研究溶血栓剂与新型的凝血系统直接抑制剂组合物的效果的临床试验已经开始。激活的t-PA与水蛭素(一种直接抑制与血块有关的凝血酶的重组蛋白)结合使用可以防止再阻塞，并且可以很高的TIMI III级穿通率(Cannon et al.，J Am Coll Cardiol 1993；21：136A and Neuhaus et al.，Circulation 1993；88(suppl.I)：I-292，abstract 1563)。类水蛭素肽hirulog与链激酶输注结合；研究表明当链激酶加入hirulog后血块的溶解速度快多了(Lidon et al.，J Am Coll Cardiol 1993；21：419A)。
由于在血栓溶解后，在不使用阿司匹林和肝素的情况下，t-PA的使用与高再阻塞率(10-20％)相关(Neuhaus et al.，J Am Coll Cardiol 1989；14：1566-1569 Cheseboro et al.，Circulation 1987；76：142-154；Neuhaus et al，J Am CollCardiol 1988；12：581-587；Califf et al.，Circulation 1991；83：1543-1556；Neuhaus et al.，J Am Coll Cardiol 1992；19：885-891)，新型的辅剂水蛭素和hirulog的施用需要36、48或96小时的长时间的输注。长时间的输注过程意味着需要大量的重组蛋白(＝水蛭素)或合成肽(＝hirulog)：532mg或546mg的水蛭素，或1008mg的hirulog，计算方法是用剂量(mg/kg/h)乘以人的平均体重(70kg)，再乘以如上文摘要所述的输注时间。大量的蛋白或合成肽是非常昂贵的，它反过来又导致了高额的费用以及医学上的缺点，因为抗凝血剂的高昂的价格妨碍了推广使用。而且输注施用也提高了成本，因为这以技术需要输注机，需要监视抗凝血剂的效果，还需要医务人员控制输注。这些困难限制了水蛭素的广泛使用和推广，因此许多患者不能从中获益。
大型试验GISSI-2(Lancet 1990；336：65-71)和ISIS-2(Lancet 1988；2：349-360)的联合结果证明了“在溶血栓/阿司匹林疗法中加入肝素会显著增加脑出血和非脑出血的发病率”，这对医疗是非常不利的(Lincoff and Topol，Circulation 1993；87：1792-1805)。由于早期的水蛭素临床实验表明在使用水蛭素、t-PA、阿司匹林以后会发生自发性出血，并且导管部位的出血增加(Neuhaus et al.，Circulation 1993；88(suppl.I)：I-292，abstract 1563)，似乎用水蛭素输注代替肝素输注并没有减少出血的危险。
对水蛭素与溶血栓活性蛋白结合使用的效果进行的实验评估都是用输注水蛭素进行的。有关例子是一些关于t-PA加水蛭素(Haskel et al.，Circulation1991；83：1048-1056)、链激酶加水蛭素(Rigel et al.，Circ Res 1993；72：1091-1102)和BM06.022加水蛭素(Martin et al.，Int J Hematol 1992；56：143-153)的报告。所有的实验研究显示重输注后在冠状血液流动方面，水蛭素输注优于肝素输注。肝素单次快速静脉注射施用加溶血栓剂BM06.022并不优于肝素输注加BM06.022(Martin et al.，J Am Coll Cardiol 1993；22：914-920)。
临床实验表明再阻塞发生在重输注完成到重输注后7-21天患者出院时，发病率的高峰期在溶血栓后的几天里(Ohman et al.，Circulation 1990；82：781-791)。这一发现阐明了溶血栓治疗后有效的抗凝血剂必须持续施用若干天的原因。
药代动力学分析表明水蛭素在狗体内的半衰期只有短短的10-15分钟(Biomed Biochim Acta 1987；46：237-244 and Folia Haematol 1988；115：70-74)，在人体内是9-50分钟(Thromb Haemost 1984；52：160-163)。
前文讨论的实验、临床和药代动力学数据显示在治疗急性血管疾病时，为了达到可靠的、足够的血浆水平的抗凝血作用，抗凝血剂的持续静脉输注施用是必要的。现在对水蛭素作为一种新型的抗凝血剂与溶血栓活性蛋白结合使用的评估都是遵循这条逻辑线索。
虽然有这些结论，在溶血栓治疗中对减少蛋白、肽或化学物质用量的需求，以及通过把药物的药效和抗凝血作用限制在最优程度的方法降低出血危险性的需求也是存在的。最优程度还意味着需要最大限度地延长改善冠状血液流动状况效果的时间，以及最大限度地缩短不希望出现的副作用(例如不严重的和严重的出血和脑内出血)的时间。
发明概述
本发明为治疗血栓性疾病患者提供药物组合物和治疗方法。按照这个发明，用于治疗血栓性疾病患者的有药物效果的组合物和治疗方法的特征在于：非肝素的有效的抗凝血剂与溶血栓活性蛋白结合施用是通过静脉单次快速注射而不是长时间的静脉输注，溶血栓活性蛋白可以通过静脉单次快速注射或静脉输注施用。
这一方法是实用的，因为它在保证药物预期的增强重输注和防止再阻塞的疗效前提下，减少了抗凝血剂的用量。而且，最令人意想不到的是它减少了出血的危险，也就是说，它提高了治疗的安全性。更低的治疗价格(有可能是由于使用更少量的蛋白)和更好的风险/收益比使得这种方法可以被广泛使用，从而降低死亡率。另外，这种方法简化了新型抗凝血剂的施用过程，因此不仅提供了更多的方便，而且可以增加患者的治疗次数，提高有效性，从而可以挽救更多的生命。
优选实施方案的详细描述
本发明涉及用于治疗或防止血栓性疾病的治疗的或预防的组合物和方法。更详细地说，本发明涉及用于治疗和预防血栓性疾病的有药物疗效的组合物和方法，其特征在于除肝素以外的其它抗凝血剂是通过静脉单次快速注射，代替长时间的静脉输注施用，同时结合通过静脉单次快速注射和/或静脉输注施用的溶血栓活性蛋白使用。
本发明提供了用于治疗血栓性疾病患者的组合物和方法，它具有低剂量新型抗凝血剂的优点，同时也保持了预期的药物效果，即降低治疗成本、使新型抗凝血剂的施用更方便，最重要的是降低了出血的危险。所有这些优点对溶血栓疗法的广泛使用极有帮助，这可以挽救更多的生命。
血栓性疾病在本发明中的含义包括急性心肌梗塞、中风、外周动脉阻塞、肺栓塞、深度静脉血栓形成，以及其它的有可能造成溶血栓后再阻塞或再生血栓形成危险的血管血栓性疾病。
发明的优点是显而易见的。除肝素以外的其它无肝素抗凝血剂的方便的施用方式极有助于推广使用，甚至可以在入院前的治疗过程中使用，并且可以增加治疗患者的次数、提高有效性，从而可以挽救更多的生命。
更重要的是，把非肝素抗凝血剂，即水蛭素的施用限制于只通过静脉单次快速注射，代替以往的单次快速注射加上长达几小时的持续的静脉输注，可以减少出血的危险，大大提高患者的安全性。出血危险性的减少来自于对凝血系统更短的抑制时间、凝血系统更快的恢复速度，以及对流血时更小的影响。正如实施例的结果所示，活化部分凝血激酶时间(aPTT)是对凝血系统一个固有特性的量度，它在溶血栓活性蛋白施用后2小时(＝3小时+静脉单次快速注射新型抗凝血剂水蛭素后10分钟)时几乎恢复到治疗前的水平，然而，持续静脉输注抗凝血剂组的aPTT仍然在延长。这预示着在静脉单次快速注射后抗凝血作用的有限作用时间对防止再阻塞是足够长的，对避免出血是足够短的。流血时间是临床流血的有力的预测值(Gimple et al.，Circulation1989；80：581-588)，相应的，静脉单次快速注射新型抗凝血剂组的流血时间明显比持续静脉输注该抗凝血剂的组短。
而且令人意想不到的是，正如实施例所示，把新型抗凝血剂的施用限制于只通过静脉单次快速注射，代替单次快速注射加上持续的静脉输注(单次快速注射加上输注是以往的方法)，保持了使用新型抗凝血剂静脉单次快速注射加输注的防止再阻塞的良好效果，这是与传统的使用阿斯匹林加肝素的辅助疗法比较而言，后者仍然与再阻塞有关。
本发明涉及的除肝素以外的抗凝血剂包括肽类和合成的凝血酶直接抑制剂和凝血系统其它组分的抑制剂，例如XIIIa因子、Xa因子、IXa因子、VIIa因子、组织因子、冯·维勒布兰德因子(糖蛋白Ib)等的抑制剂，或凝血系统内源性抑制剂的类似物或重组形式，例如血栓调节素或激活的C蛋白。
这些是优选的蛋白、肽或低分子量的化学物质，它们是用重组DNA技术，用从天然原料中分离和纯化物质的方法、肽合成法、化学修饰或传统的化学合成的方法生产出来的。
优选的抗凝血剂是天然形式的水蛭素(arkwardt，Methods Enzymol 1970；vol.19：924-932 and Markwardt，Biomed Beochim Acta 1985；44：1007-1013)更确切地说是重组形式的水蛭素，例如脱硫酸水蛭素(它在天然水蛭素的第63个残基酪氨酸上缺少一个硫酸，但是与天然水蛭素有相同的氨基酸序列)(变构体1)，CGP 39393(Thromb Haemost 1989；61：77-80)，或1和2位氨基酸(亮氨酸和苏氨酸)与天然水蛭素不同的其它形式，例如HBW023(Markwardt et al.，Thromb Res 1988；52：393-400 and Rothig et al.，Hamostaseologie 1991；11：132-136)。脱硫酸水蛭素可以在真核细胞中产生，如酿酒酵母，或细菌细胞，如大肠杆菌。其它有用的细胞系包括枯草芽孢杆菌属、幼小仓鼠肾细胞、昆虫细胞等。水蛭素和脱硫酸水蛭素由一个有3个二硫键的65个氨基酸的多肽单链组成，分子量约为7,000。
本发明还涉及修饰形式的水蛭素，象水蛭素的缺失或取代变构体，和异源的或有化学变化的变构体，例如PEG水蛭素或PEG水蛭素片段。本发明还具体涉及到hirulog和类hirulog肽(Maraganore et al.，Biochemistry 1990；29：7095-7101 and Bourdon et al.，FEBS letters 1991；294：163-166)。Hirulog是一个有20个氨基酸的凝血酶抑制剂合成肽(D-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-[甘氨酸]4与HV2水蛭素变构体的第53-64位残基偶联)。
水蛭素和hirulog，与相关的多肽形式一样，是通过对凝血酶直接的和特异性的抑制而起作用的。本发明也涉及可用作抗凝血剂的合成的低分子量凝血酶直接抑制剂，如Argatroban(＝MD-805和MCI9038)(Clarke et al.，Circulation 1991；83：1510-1518)，GYKI-14766(＝LY294468)(Jackson et al.，J Pharm Exp Ther 1992；261：546-552)，DuP 714(Knabb et al.，ThrombHaemost 1992；67：56-59)或其它肽类，如硼精氨酸(Kettner et al.，J Biol Chem1990；265：18298-18297)或SDZ217766(Tapparelli and Metternich，ThrombHaemost 1993；69：668 abstract 455)。其它合成的凝血酶直接抑制剂是3-脒基苯丙氨酸的衍生物(Sturzebecher et al.，Thromb Haemost 1993；69：1316，abstract2773)，或新型的凝血酶抑制剂“RT1”(Tschopp et al.，ThrombHaemost 1993 69：668，abstract 456)，和其它合成的凝血酶直接抑制剂。
优选的抗凝血剂还包括血液凝集因子Xa的选择性、紧密结合的抑制剂天然的和特殊重组形式，如Antistasin(Nutt et al.，Arch Biochem Biophys 1991；285：37-44)，和Xa因子的慢速、紧密结合的特异性抑制剂的天然和重组形式，如蜱抗凝血肽(Waxman et al.，Science 1990；248：593-596)以及其它的Xa因子的肽类抑制剂。Xa因子还能被DX9065a所抑制，它是一种具有苯甲嘧啶类结构的口服合成活性抗凝血剂(Kim et al.，Thromb Haemost 1993；69：672，abstract471)以及其它的Xa因子的合成的直接抑制剂。
IXa因子的抑制剂(例如，Benedict et al.，J Clin Invest 1991；88：1760-1765)，XIIIa因子的抑制剂(例如，Shebuski et al.，Blood 1990；75：1455-1459)，VIIa因子的抑制剂(例如，Meluch et al.，Thromb Haemost 1993；69：887，abstract 1244)，组织因子的抑制剂(例如，Ragni et al.，Circulation 1993；88(suppl.I)：I-615，abstract 3309)，糖蛋白Ib或冯·维勒布兰德因子的抑制剂(例如，Yao et al.，Clinical Research 1993；41：228A)和凝血系统的其它组分的抑制剂也包括在本发明中。本发明中其它有用的抗凝血剂是凝血系统的内源性抑制剂的类似物或重组形式，如重组血栓调节素(例如，Gomi et al.，Blood 1990；75：1396-1399)，重组组织因子途径抑制剂(例如，Haskel et al.，Circulation 1991；84：821-827)，重组活化C蛋白(例如，Gruber et al.，Circulation 1990；82：578-585)以及其它内源性抑制剂的类似物。
本发明的抗凝血剂的施用剂量为0.01至10毫克/千克，是在初次使用溶血栓活性蛋白前或之后不久通过静脉单次快速注射在0.5至5分钟内施用的。水蛭素、hirulog和其它有关肽的优选施用方法是在初次使用溶血栓活性蛋白前或之后5分钟内，剂量为0.3至6毫克/千克的药物通过静脉单次快速注射在0.5至3分钟内施用。具体地说，在使用溶血栓活性蛋白前，剂量为0.5至6毫克/千克的水蛭素 、hirulog和其它有关的肽在1至2分钟内通过静脉单次快速注射施用。低分子量的新型化学物质和与药物释放系统结合的肽在施用时可以用口服代替静脉单次快速注射。
与本发明中抗凝血剂结合使用的溶血栓活性蛋白是那些专业人员所知的药剂，象重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂，例如Alteplase和silteplase，以及其它的如anistreplase、链激酶、尿激酶和尿激酶前体。本发明涉及的溶血栓剂还有重组纤维蛋白溶酶原激活剂(rPA)BM06.022，吸血蝙蝠纤维蛋白溶酶原激活剂(例如，Mellott et al.，Arterioscler Thrombos 1992；12：212-221)和纤维样(吸血蝙蝠)涎液纤维蛋白溶酶原激活剂DSPA(例如，Witt et al.，Blood 1992；79：1213-1217)或组织型纤维蛋白溶酶原激活剂的相关形式和TNK变构体(例如，Refino et al.，Thromb Haemost 1993；69：841，abstract1074)。最优选的是上文提及的溶血栓活性蛋白BM06.022。这是无糖基的蛋白，它包括野生型人类t-PA的1-3和176-527位氨基酸。其它的溶血栓活性蛋白如下文件所描述：USP4,970,159；EP-A-0,207,589；AU61804/86；EP-A-0,231,624；EP-A-0,289,508；JP-63133988；EP-A-0,234,051；EP A0,263,172；EP-A-0,241,208；EP-A-0,292,009；EP-A-297,066；EP-A-0,302,456；EP-A-0,379,890。所有的都可以用于本发明，如E-6010(Suzuki et al.，J CardiovascPharmacol 1991；17：738-746)，YM-g66(Kawasaki et al.，Japan J Pharmacol1993；63：135-142)和SUN-9216(Umemura et al.，Stroke 1993；24：1077-1082)。其它有用的溶血栓活性蛋白包括LY210825(＝来自中国仓鼠卵巢细胞中的K1K2P，Blood 1988；71：216-219)，FEK1(来自鼠C127细胞中的K2P，J Cardiovasc Pharmacol 1990；16：197-209)，t-PA变构体(ThrombHaemost 1989；62：542)，K2P和D-K2P(Thromb Haemost 1989；62：393)，MB-1018(FK2K2P)，Thromb Haemost 1989；62：543)，FK2P(FASEB J1989；3：A1031，abstract 4791)，1X(Circulation 1988；78：II-15，abstract 59)，K1K2P(Thromb Res1988；50：33-41)，FK1K2P(J Biol Chem 1988；263：1599-1602)。
溶血栓剂的剂量和施用方法包括那些已被卫生机构所批准的，例如100mg的alteplase或1.5百万单位的链激酶。剂量和施用方法可以不同。优选的是总剂量为15至25百万单位(MU)的重组纤维蛋白溶酶原激活剂BM06.022。最优选的方法是10+10MU的BM06.022快速注射。溶血栓剂的施用方式可以通过静脉注射、单次或多次快速注射或静脉输注，或它们的组合。优选的是两次快速静脉注射BM06.022或其它的溶血栓活性蛋白。当使用半衰期长于t-PA的溶血栓活性蛋白时(参考WO92/18157，在此引入作为参考)，这些蛋白最好的施用方式是两次快速注射。一般说来，溶血栓活性蛋白的注射间隔为15至60分钟，最好是20至40分钟，最优选的间隔时间是30分钟。
优选的方法是作为非肝素的新的、药力更强、更有效的抗凝血剂的水蛭素和作为溶血栓活性蛋白的BM06.022通过静脉单次快速注射，剂量如前所述。Hirulog作为非肝素的新的、药力更强、更有效的抗凝血剂和作为溶血栓活性蛋白的BM06.022通过静脉单次快速注射的方法也是优选的。
本发明中的抗凝血剂的施用方法是在初次使用溶血栓活性蛋白前或之后不久，通过静脉单次快速注射施用。这种非肝素抗凝血剂和溶血栓活性蛋白的注射间隔可以从1至30分钟，最好是在2至10分钟，优选的时间间隔是约5分钟。抗凝血剂的施用最好是在溶血栓活性蛋白施用前。如果抗凝血剂的施用是在溶血栓活性蛋白施用之后，抗凝血剂施用的时间间隔最好是在2至10分钟，优选时间间隔是在溶血栓活性蛋白施用后约5分钟。
非肝素的抗凝血剂作为静脉单次快速注射治疗急性心肌梗塞时，施用可在标准肝素疗法后1至2小时进行，即肝素静脉输注然后皮下施用，或直接在肝素的皮下施用之后。
非肝素抗凝血剂的施用途径包括除阿司匹林(乙酰水杨酸＝ASA)外的抗血小板药。抗凝血剂和抗血小板药一样，在临床上都是作为抗血栓剂，只是它们的作用方式不同，即两种作用(抑制凝血和抑制血小板)都防止血栓形成和再阻塞。抗血小板药与阿司匹林不同，是通过静脉单次快速注射施用，伴随溶血栓活性蛋白，即溶血栓活性蛋白施用前或30分钟内，几天以后也可以，用阿司匹林来代替延迟或长时间施用的新型的、药力更强、更有效的抗血小板药。
新型的、药力更强、更有效的非肝素抗血小板药是血小板上糖蛋白IIb/IIIa受体的优选抑制剂，该受体介导了血小板的凝集反应。血小板糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)受体的这类抑制剂可以是GP IIb/IIIa受体、肽或肽类似物的抗体、抗体的片段、接近人类的抗体或接近人类的抗体片段，它们的作用是GP IIb/IIIa拮抗剂的拮抗剂，以及能抑制GP IIb/IIIa拮抗剂的低分子量的合成的新化学物质。
优选的GP IIb/IIIa的受体的抑制剂是单克隆抗体7E3或化学抗体7E3(片段)，它们作用于GP IIb/IIIa(Tcheng et al.，Circulation 1993；88(suppl.I)：I-506，abstract 2727)、多肽GP IIb/IIIa的拮抗剂Integrelin(Tcheng et al.，Circulation1993；88(suppl.I)：I-595，abstract 3200)以及多肽MK-852(Theroux et al.，Circulation 1993；88(suppl.I)：I-201，abstract 1075)，还有非肽的GP IIb/IIIa的类似物MK-383(Peerlinck et al.，Circulation 1993；88：1512-1517)。
其它的GP IIb/IIIa受体的拮抗剂包括Ro 43-5054(J Pharmacol Exp Ther1993；264：501-508)，Ro44-9883(Thromb Haemostas1993；70：817-821)，BIBU104(Thromb Haemostas1993；69：975，abstract1557)和BUBI52(ThrombHaemostas1993；69：1072，abstract1887)，SC49992(J Pharmacol Exp Ther1993；267：1191-1197)和SC54684(Thromb Haemostas1993；69：975，abstract1558)，DMP728(Circulation1994；80：3-12)，GR144053(Thromb Haemostas1993；69：1071，abstract1884)，FR144633(Thromb Haemostas1993；69：706，abstract598)，SKF-106760(Nichols et al.，presented at the Am Soc PharmacolExp Ther Meeting，July30-August3，1993in Dan Francisco，Ca，USA)。其中有些抑制剂可以用单剂量口服代替单剂量静脉快速注射施用。
本发明还包括这里没有特别提到的其它的GP IIb/IIIa抑制剂。
本发明涉及的治疗血栓性疾病患者的组合疗法、组分和方法可以包括其它附加药品的伴随使用，有抗血小板药，例如阿司匹林，抗凝血剂，例如肝素或低分子量肝素，或其它药物，例如β阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、抗重输注损伤剂以及其它。
本发明也涉及药物组合物，它包括封装于适当容器中的一种溶血栓活性蛋白和在另一单独容器中的抗凝血剂，这些将按照上述的治疗方法使用。在第一个容器中的溶血栓活性蛋白的剂量原则上依赖于用于治疗血栓性疾病患者的蛋白的疗效。例如，在这种容器中封装的rPA蛋白的量是5-20MU(它相当于8-36毫克的蛋白)。也可能这些溶血栓活性蛋白被封装在两个或更多的单独的容器中，这样适当剂量的溶血栓活性蛋白就可以以两次或多次快速注射的方式施用了。根据所需要的治疗方法，这两个容器中封装的溶血栓活性蛋白的量可以相同或不同。在使用rPA的情况下，这两个容器最好都装有有效剂量10MU。其它的需要以更高剂量施用的溶血栓活性蛋白，如t-PA，它的用量更大，比如50-150毫克。第一个容器里可以是直接用于注射的溶液，或者是用于注射的冻干剂，它可以通过加入适当的溶液，多数情况是注射用水，重新恢复成前者使用。冻干剂和溶液可能含有其它的药物载体或辅料，它们有助于形成等渗溶液，或为使蛋白在上述药物组合物中保持稳定或溶解状态。
根据本发明制备的药物的包装单元包括一个的含有溶血栓活性蛋白的适当施用剂型，和一个含有抗凝血剂的适当包装单元。包装单元中的这两种活性成分最好封装在不同的容器中，例如玻璃安瓿。可是，根据活性组分的不同，两种组分也可能制备成一个单剂型。在非肝素的抗凝血剂如以两次快速或多次快速注射施用的情况下，药物包装单元包括两个或多个单独的容器，每个容器中含有用于单次快速注射的适当剂量的非肝素抗凝血剂。另外，药物包装中有说明，例如以包装说明书的形式对药物进行描述，其中有与抗凝血剂单次快速注射结合施用时，溶血栓活性蛋白具有疗效的施用剂量。
药物包装单元可能还有一个单独的容器，其中含有药物疗效剂量的肝素。至此，这样一个药物包装单元共包含三种不同的药物组分：其一，溶血栓活性蛋白，其二，抗凝血剂，其三，肝素。根据本发明，这样一个药物包装单元在紧急情况下，在需要全套的药物来进行有效的血栓栓塞治疗时是非常有用的。
抗凝血剂的施用可以在溶血栓活性蛋白施用之前、同时或之后。现已发现，溶血栓活性蛋白以两次或多次快速注射的形式施用与早期的抗凝血治疗结合特别好，即抗凝血剂在溶血栓活性蛋白施用前施用。还有，已经发现当溶血栓活性物质以两次或多次快速注射施用时，结合早期的抗凝血治疗来防止已穿通的血管再阻塞，疗效也非常好。已经清楚使用附加的肝素效果更好，那样可以在溶血栓活性蛋白施用时保持足够的血清浓度。
有关使用方式的信息既可以通过说明书，也可以通过外包装上印刷的内容给出，这些是药物准备的信息：哪些可以混合，哪些封装有溶血栓活性蛋白。一方面，只包含有溶血栓活性蛋白适当剂型的药物包装单元可以包含这些信息，例如以包装说明书的形式提及本发明涉及的与抗凝血剂结合使用的方法。另一方面，只包含有抗凝血剂的药物包装单元可以包含这样的信息，其中提及本发明涉及的与溶血栓活性蛋白结合使用的方法。第三个选择是药物包装单元包括溶血栓活性蛋白、抗凝血剂以及结合使用的适当信息，例如通常的包装说明书。另外，包装说明书可以包括有关溶血栓活性蛋白、非肝素抗凝血剂与肝素结合使用的说明。
上面提及的药物的使用方法的适当说明对这种包含非抗凝血剂-溶血栓活性蛋白，或肝素，或其组合等的商品化来说是基本的。制药公司生产的某种药物以及特殊的使用方法只有在特定的国家卫生机构如美国的FDA或欧洲的CPMP批准后才能成为商品。这包括但不限于在监督下按照设置好的程序对日后要商品化的药物进行临床实验。这还包括将临床结果上报给特定的卫生机构，以便获得上市许可。在许多情况下，这种许可仅限于某种施用方案或方法，它必须印刷在附带说明书的药剂处方中。
作为溶血栓活性蛋白或抗凝血剂施用的恰当形式，优选使用在适当容器，如安瓿中的盖仑制剂冻干剂或溶液。作为一个规定，这些药物制剂包括一般的用于制备等渗液而使用的适当的医药辅剂，可能也包括其它的稳定剂或助溶剂。制备好的抗凝血剂溶液或使用前需加水重新恢复的冻干剂可以用相同的方式标明处方。
发明的其它方面对技术人员应该是清楚的，此处不必重复。
应该理解，本发明的说明和实施例只是引证而非限制，本发明主旨和范围内的实施方案将介绍给本领域的技术人员。
实施例
本实施例为药物学有效的组合物及方法在治疗急性血管阻塞疾病时具有的意想不到的，出色的效果提供了药理学的依据。实例中的动物模型模拟了由急性冠状动脉血栓形成引起的急性心肌梗塞，并且可以对溶血栓治疗后再阻塞和出血的危险进行评价。
各种性别的成年小猎犬用苯巴比妥钠麻醉(35毫克/公斤体重)，插管并进行人工呼吸。为了药物的使用和血液的回收，股静脉和肱静脉分别施行导管插入术。通过右侧股动脉连续检测动脉血压。胸腔从左侧第五肋间打开，心脏悬于心包支架。一段2厘米的弯曲冠状动脉血管被分离出来并如文献所述装备仪器(Martin et al.，J Cardiovasc Pharmacol 1991；18：111-119)。使用一个电磁流速探针进行连续血液流速监测。血压、脉搏和冠状血液流速被连续记录在一个多道描记器上。
按如下方法造成一个左侧弯曲冠状动脉血栓：旋紧咬合在左侧弯曲冠状动脉上的可调节的螺钉，产生对充血血流90％的抑制，造成冠状动脉20秒的阻塞。在埋于动脉腔中和附着于冠状动脉内表面的电极上施加150μA持续的阳极电流，直至左侧弯曲冠状动脉的血液流速降至0毫升/分钟并保持至少3分钟。电刺激解除至少15分钟。溶血栓活性蛋白施用前，血栓可以保持1小时的时间。
本例中用作溶血栓治疗的溶血栓活性蛋白是BM06.022，公开于美国专利第5,223,256号。本实验研究中使用的BM06.022的活性是575000单位/毫克。联合使用的抗凝血剂是Hansenula polymorpha生产的水蛭素(BK-HV变构体)。
对照组的附属治疗是用阿司匹林和肝素进行的。阿司匹林是在血栓形成后45分钟，即溶血栓活性蛋白施用前15分钟，通过静脉单次快速注射按20毫克/公斤施用的。5分钟以后(即血栓形成后50分钟-溶血栓活性蛋白施用前10分钟)，肝素通过静脉单次快速注射按120IU/公斤施用，随后紧接着80IU/公斤/小时的持续静脉输注。
实验组的附属治疗是用阿司匹林和BK-HV水蛭素进行的。阿司匹林是在血栓形成后45分钟，即溶血栓活性蛋白施用前15分钟，通过静脉单次快速注射按20毫克/公斤施用的。5分钟以后(即血栓形成后50分钟＝溶血栓活性蛋白施用前10分钟)，BK-HV水蛭素通过静脉单次快速按6毫克/公斤在1分钟之内施用的。
还进行了一个用阿司匹林和BK-HV水蛭素进行的对照实验。阿司匹林是在血栓形成后45分钟，即溶血栓活性蛋白施用前15分钟，通过静脉单次快速注射按20毫克/公斤施用的。5分钟以后(即血栓形成后50分钟＝溶血栓活性蛋白施用前10分钟)，BK-HV水蛭素通过静脉单次快速注射按2毫克/公斤施用，随后紧接着2毫克/公斤/小时的BK-HV水蛭素持续静脉输注。
所有的狗都接受了溶血栓活性蛋白BM06.022的两次快速注射。第一次静脉快速注射是在血栓形成后60分钟施用的。第二次静脉快速注射是在30分钟之后，即两次静脉快速注射的间隔是30分钟。每次静脉快速注射的剂量是140kU/公斤，即BM06.022的总剂量为280kU/公斤。
实验观察期是第一次BM06.022静脉快速注射后3.5小时。实验测量了平均和阶段性的冠状血液流速。重输注时间定义为溶血栓治疗开始至冠状血液流速恢复到阻塞前水平的33％时的时间。循环流速减少定义为完全再阻塞(零流速)后，重输注的循环数。血样的获得是在辅剂施用前和溶血栓治疗中重复地进行，目的是测量活化部分凝血激酶时间(aPTT)，是用BoehringerMannheim，(Mannheim Germany)生产的测试盒根据Larrieu et al.的方法进行的(Rev Hemato1957；12：199-210)。流血时间的测量是通过狗颊粘膜上的一个弹性容量设备(Simplate I from Organon Teknika Eppelheim，Germany)进行的。切口是用Simplate I设备在狗内唇的粘膜上做成的，以次记录流血的时间。
这些代表实验中所有的狗都表现出重输注。用阿司匹林加水蛭素单次快速注射的辅助治疗达到了比阿司匹林加肝素输注更快的重输注(表1：15分钟比25分钟)。BM06.022加阿司匹林和水蛭素单次快速注射后的重输注时间与对照实验中BM06.022加阿司匹林和水蛭素输注是相似的。因此，水蛭素静脉单次快速注射与水蛭素输注的重输注时间是一样快的(分别是15分钟和14分钟)。
另外，阿司匹林加水蛭素静脉单次快速注射与阿司匹林加肝素输注相比，能够令人信服地防止再阻塞，如图1中所示的这两组的冠状血液流速的时间变化。在防止再阻塞方面，阿司匹林加水蛭素单次快速注射的效果与阿司匹林加水蛭素输注是相同的(图2)。因此，阿司匹林加水蛭素单次快速注射与阿司匹林加肝素输注相比，显著减少了循环流速降低的数量(图3，表1)，循环流速从6.3减少到0.6。在减少循环流速降低方面，水蛭素单次快速注射与水蛭素输注是一样的。
以单次快速注射或输注的形式施用水蛭素与肝素输注相比会使活化部分凝血激酶时间(aPTT)少量延长(图4)。当水蛭素单次快速注射的aPTT与水蛭素输注的aPTT相比时，本实验发现水蛭素单次快速注射延长aPTT的程度明显要比水蛭素输注低(2小时时为治疗前的138％比203％)(表2)。使用水蛭素单次快速注射的aPTT结果与已公开发表的有关BM06.022和水蛭素输注结合使用的实验(Martin et al.Int J Hematol 1992；56：143-153)相比较也肯定了水蛭素单次快速注射后aPTT的少量延长(表2)。
报告中90分钟流血时间是临床流血的一个有力的预测值(Gimple et al.，Circulation 1989；80：581-588)。本实验令人意想不到地表明水蛭素单次快速注射后，与治疗前相比的流血时间的延长量比用肝素输注和水蛭素输注要少(分别为100％比135％或133％；表3和图5)。水蛭素单次快速注射与水蛭素输注在流血时间上的不同还表现在与公开发表的关于BM06.022与水蛭素输注结合使用的报告相比较的结果(Martin et al.，Int J Hematol 1992；56：143-153；表3)。
这里讨论的实验结果和与公开发表的数据的比较的结果表明：与肝素输注相比，水蛭素静脉单次快速注射结合BM06.022施用在加速重输注和防止再阻塞方面达到了良好的效果，这与使用水蛭素持续静脉输注与BM06.022结合施用是有可比性的。更好的是，把水蛭素限于静脉单次快速注射来代替持续的静脉输注施用可以带来更高的治疗安全性，因为它明显地减少了时延并更快地使aPTT恢复正常，还有，它可以减少90分钟流血时间延长。另外，本实验中把水蛭素限于静脉单次快速注射(220分钟输注)与水蛭素输注相比，达到必要的药效可以节省35％的水蛭素用量。表1 功效
BM06.022加辅剂施用后的功效 辅剂N 重输注 率重输注时间(分 钟)循环流速下降 (n) ASA+肝素输注3 3/3 25 6.3ASA+水蛭素单次快速注 射3 3/3 15 0.6 ASA+水蛭素输注1 1/1 14 1
均值：重输注的狗数/狗总数
表2 安全性
BM06.022单次快速注射加辅剂施用后活化部分凝血激酶时间(aPTT) 辅剂 N aPTT (秒)(治疗前数值的百分比) pre 2h 2h ASA+肝素输注 3 12 42 360 ASA+水蛭素单次快速注射 3 12 17 138 ASA+水蛭素输注 1 12 25 203 文献：水蛭素输注 7 - - 767
aPTT：活化部分凝血激酶时间；
pre：治疗前值，均值。
文献：Martin et al.，Int J Hematol 1992；56：143-153(用同样的狗模型进行的关于BM06.022与水蛭素输注结合使用的研究)。
表3 安全性
BM06.022单次快速注射加辅剂施用后流血时间(BT) 辅剂 N BT (分钟)(治疗前数值的百分比) pre 90min at2h ASA+肝素输注 3 2.0 2.7 135 ASA+水蛭素单次快速注射 3 2.33 2.33 100 ASA+水蛭素输注 1 1.5 2.0 133 文献：水蛭素输注 7 - 6.9 -
BT，流血时间；pre，治疗前值，均值。
文献：Martin et al.，Int J Hematol 1992；56：143-153(用同样的狗模型进行的关于BM06.022与水蛭素输注结合施用的研究)。
如上所示，与传统的抗凝血剂治疗加肝素输注的方法相比，在溶血栓后防止再阻塞方面，溶血栓活性蛋白在施用前通过静脉单次快速注射在1分钟内按6毫克/公斤注射施用的水蛭素作用于狗的效果明显好于前者。现有技术表明，在用狗进行的冠状动脉栓塞的实验研究中，6毫克/公斤/小时剂量的水蛭素输注(与t-PA结合使用：Sitko et al.，Circilation 1992；85：805-815)或2毫克/公斤剂量的初始静脉单次快速注射加2毫克/公斤/小时静脉输注(与链激酶结合使用：Rigel et al.，Circ Res1993；72：1091-1102)伴行施用的效果比用肝素输注的对照组要好得多。在狗的实验中，如果实验观察期为3.5小时，假设狗的体重为10公斤，水蛭素的用量如下： 研究溶血栓剂水蛭素使用3.5小时的剂量总量(毫克)单次快速注射 量(毫克)输注量(毫克) 本发明BM06.022 60 - 60 Rigel et al. 链激酶 20 70 90 Sitko et al. t-PA - 210 210
这比较清楚地说明：即使是在3.5小时这样一个很短的观察期，水蛭素的单次快速注射也减少了水蛭素的用量，分别减少1.5或3.5倍。减量的水蛭素仍足以达到防止再阻塞的药理学效果，它优于肝素但与水蛭素输注效果相似。在前文背景介绍和现有技术引述中提及的水蛭素试验中都是将水蛭素进行36、48或96小时的输注，这将显著增加初始单次快速注射和持续静脉输注之间水蛭素必需用量的差距。
应当注意到，在人体中水蛭素的剂量要低于在狗体内的，这是因为人的凝血酶对水蛭素的抑制作用的敏感程度要高(约10倍)。Neuhaus et al.(Circulation 1993；88(suppl.I)：I-292，abstract 1563)以0.4毫克/公斤初始静脉单次快速注射加0.15毫克/公斤48小时持续静脉输注使用水蛭素。Cannon etal.(J Am Coll Cardiol 1993；21：136A)通过0.6毫克/公斤初始静脉单次快速注射，随后是0.2毫克/公斤36小时的静脉输注水蛭素。但是，这些方法的相对差异(水蛭素单次快速注射与水蛭素单次快速注射加输注)在各物种中保持不变。
附图的简要说明
图1.冠状动脉栓塞的狗接受140和140kU/公斤BM06.022两次快速注射，间隔30分钟，并辅以乙酰水杨酸(ASA＝阿斯匹林；20毫克/公斤静脉单次快速注射)和肝素(120IU/公斤静脉单次快速注射，随后为80IU/公斤的肝素持续静脉输注)或ASA(20毫克/公斤静脉单次快速注射)和静脉单次快速注射6毫克/公斤水蛭素的治疗时冠状血液流速随时间的变化过程。各组数据是n＝3时的平均值。
图2.冠状动脉栓塞的狗接受140和140kU/公斤BM06.022两次注射注射，间隔30分钟，并辅以乙酰水杨酸(ASA＝阿斯匹林；20毫克/公斤静脉单次快速注射)和水蛭素(2毫克/公斤静脉单次快速注射，随后为2毫克/公斤/小时的水蛭素持续静脉输注)或ASA(20毫克/公斤静脉单次快速注射)和静脉单次快速注射6毫克/公斤水蛭素的治疗时的冠状血液流速随时间的变化过程。各组数据分别是n＝1或n＝3时的平均值。
图3.冠状动脉栓塞的狗重输注后接受140和140kU/公斤BM06.022两次快速注射，间隔30分钟，并辅以乙酰水杨酸(ASA＝阿斯匹林；20毫克/公斤静脉单次快速注射)和肝素(120IU/公斤静脉单次快速注射，随后为80IU/公斤的肝素持续静脉输注)或ASA(20毫克/公斤静脉单次快速注射)和静脉单次快速注射6毫克/公斤水蛭素的治疗时，作为再阻塞指标的循环流速降低数。各组数据是n＝3时的平均值。
图4.冠状动脉栓塞的狗接受140和140kU/公斤BM06.022两次快速注射，间隔30分钟，并辅以乙酰水杨酸(ASA＝阿斯匹林；20毫克/公斤静脉单次快速注射)和肝素(120IU/公斤静脉单次快速，随后为80IU/公斤的肝素持续静脉输注)或乙酰水杨酸(ASA＝阿斯匹林；20毫克/公斤静脉单次快速注射)和水蛭素(2毫克/公斤静脉单次快速，随后为2毫克/公斤/小时的水蛭素持续静脉输注)，或ASA(20毫克/公斤静脉单次快速注射)和静脉单次快速注射6毫克/公斤水蛭素的治疗时，作为安全性指标的活化部分凝血激酶时间(aPTT)随时间的变化过程。各组数据分别是n＝1或n＝3时的平均值。
图5.冠状动脉栓塞的狗接受140和140kU/公斤BM06.022两次快速注射，间隔30分钟，并辅以乙酰水杨酸(ASA＝阿斯匹林；20毫克/公斤静脉单次快速注射)和肝素(120IU/公斤静脉单次快速，随后为80IU/公斤的肝素持续静脉输注)或乙酰水杨酸(ASA＝阿斯匹林；20毫克/公斤静脉单次快速注射)和水蛭素(2毫克/公斤静脉单次快速注射，随后为2毫克/公斤/小时的水蛭素持续静脉输注)，或ASA(20毫克/公斤静脉单次快速注射)和单静脉单次快速注射6毫克/公斤水蛭素的治疗时，作为安全性指标的90分钟的流血时间(治疗前数值的％)。各组数据分别是n＝1或n＝3时的平均值。