厚朴萃取物及其制备方法与用途.pdf

本发明涉及厚朴萃取物及其制备方法与用途，该厚朴萃取物包含厚朴木脂体C、厚朴木脂体A、丁香脂素、柳杉二醇及台湾擦木酚等指标活性成份，但不包含厚朴酚及和厚朴酚。该厚朴萃取物可用于制备用以预防或治疗牙周病的医药品或保健品。

1.  一种厚朴萃取物，其包含厚朴木脂体C、厚朴木脂体A、丁香脂素、柳杉二醇及台湾擦木酚，但不包含厚朴酚及和厚朴酚。

2.  如权利要求1所述的厚朴萃取物，其具有如图1中E或F所示的化学指纹图谱。

3.  如权利要求1所述的厚朴萃取物，其藉由以下步骤制备：
(a)以水萃取厚朴以取得水萃取液；以及
(b)将该水萃取液通入大孔吸附树脂柱，以30-60%乙醇洗脱并收取洗脱液。

4.  一种制备如权利要求1所述的厚朴萃取物的方法，其包括：
(a)以水萃取厚朴以取得水萃取液；以及
(b)将该水萃取液通入大孔吸附树脂柱，以30-60%乙醇洗脱并收取洗脱液。

5.  如权利要求4所述的方法，其中步骤(b)的乙醇为40-60%乙醇。

6.  如权利要求4所述的方法，其中步骤(b)的乙醇为60%乙醇。

7.  一种组合物，其包含如权利要求1所述的厚朴萃取物及视情况可接受的载体。

8.  一种如权利要求7所述的组合物用于制备用以预防或治疗牙周病的医药品或保健品的用途。

9.  如权利要求8所述的用途，其中该组合物可减少牙周病患者的牙槽骨流失。

10.  如权利要求8所述的用途，其中该医药品或保健品的形式包括漱口水、牙膏、口腔贴片、口香糖或保健食品。

厚朴萃取物及其制备方法与用途
【技术领域】
本发明涉及植物萃取物及其制备方法与用途，更具体而言，涉及以色谱分离原理配合特定的处理方式来制备植物活性萃取物的量产方法。
【现有技术】
牙周病又称牙周炎，是牙周组织的疾病，为侵犯牙龈、牙周、牙周膜、牙周韧带及牙槽骨等组织的慢性炎症。常见的慢性牙周病一般可分为牙龈炎和牙周炎，这两种临床症状不尽相同的疾病一般笼统合称为牙周病。牙周病是一种破坏性疾病，由积聚在牙龈边缘的牙菌膜所分泌的毒素令牙周组织发炎所致，其主要特征为牙周袋的形成及袋壁的炎症、牙槽骨吸收和牙齿逐渐松动。
厚朴为木兰科植物厚朴(Magnolia officina)或凹叶厚朴(Magnolia biloba)的干燥树皮、枝皮或根皮，呈半环状，淡棕色。厚朴为一种传统中药，性温，味苦辛，入脾、胃、肺、大肠经，其具有燥湿消痰、下气除满的功能，主治湿滞伤中、脘痞吐泻、腹胀便秘、痰饮喘咳。厚朴可以配合木香、干姜、草蔻、陈皮、茯苓、半夏、藿香等同用。如湿邪较重(胸闷少食、舌苔白厚而腻、脉濡、滑、缓)，可再加用苍朮、炒苡米、砂壳等。如寒邪化热，热结肠胃而出现腹部胀满、痞硬不喜按、大便秘结、下午身热、谵语等症，可配枳实、生大黄、芒硝等同用，例如伤寒论中的大承气汤(厚朴、枳实、生大黄、芒硝)、小承气汤(厚朴、枳实、生大黄)等。因厚朴能降气，故对胸腹胀满、气上逆而喘咳之症，也常配用，例如桂枝加厚朴杏仁汤(桂枝、白芍、炙草、生姜、大枣、厚朴、杏仁)，可用于外感风寒、自汗的咳喘；苏子降气汤(苏子、半夏、炙草、前胡、厚朴、陈皮、当归、生姜、肉桂)，可用于痰多气逆、胸满咳喘等症。厚朴目前已被发现的药效有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗溃疡、镇痛抗炎、抗氧化、以及对自主神经活动有抑制作用，其中主要有效成分为厚朴酚(magnonol)及和厚朴酚(honokinol)。
【发明内容】
本发明涉及一种厚朴萃取物及其制备方法与用途；更具体而言，涉及以色谱分离原理配合特定的处理方式来制备植物活性萃取物的方法，该方法包括将厚朴干品以水煮沸萃取后，将水萃取物以大孔吸附树脂吸附处理后再分别以不同比例的水和乙醇混合溶液搅拌处理和分离，最后获得厚朴活性萃取物，产率为0.4%。经细胞试验证实其活性萃取物具有抗菌及抗发炎之功效，且由结扎诱导牙周病动物试验亦证实可有效抑制牙槽骨流失的效果。化学成分分析以HPLC指纹分析图谱证实。经由本制程产出的活性萃取物并不含过去已知成分厚朴酚及和厚朴酚，反之包含其他成分如厚朴木脂体C(Magnolignan C)、厚朴木脂体A(Magnolignan A)、丁香脂素(syringaresinol)、柳杉二醇(cryptomeridiol)及台湾擦木酚(randaiol)等，并且具有有效抑制口腔细菌、发炎及牙槽骨流失的功效。
除非本文另外界定，否则本发明所用的科学及技术术语应具有本领域技术人员通常所理解的含义。这些术语的含义及范畴应为清晰的；然而，
在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优于任何辞典或外在定义。
除非另外指出，否则如本公开内容所用的以下术语应理解为具有以下含义。
如本文所用的术语“大孔吸附树脂”或“大孔树脂”(彼此可互换使用)意指一种吸附树脂，其由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。大孔吸附树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在约50nm至2000nm之间。大孔吸附树脂的一个实例为(包括但不限于)DiaionHP20树脂。
如本文所用的术语“大孔吸附树脂柱”意指主要利用“大孔吸附树脂”或“大孔树脂”的色谱柱，例如(包括但不限于)HP-10、HP-20、HP-30、HP-40、HP-50、XAD-4、XAD-6、XAD-7、XAD-16、XAD-1180或XAD-1600。
如本文所用的术语“萃取物”意指针对一物质进行萃取所得的产物，通常是藉由将所欲萃取的物质浸泡或混合于溶剂中而获得的溶液或浓缩制剂。典型地，萃取物制备自新鲜植物或经研磨或干燥的植物样本。本领域 已知有各种萃取方法，包括但不限于浸渍、渗滤、再渗滤、消解、逆流萃取、涡轮萃取、挤压/压挤/压榨或超临界流体二氧化碳萃取。适当的溶剂包括但不限于水、乙醇、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、正丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或其他溶剂。可视需要选择溶剂的种类或调配溶剂的浓度，以达适当极性而进行萃取，例如，低极性溶剂包括但不限于石油醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、70-100%乙醇；高极性溶剂包括但不限于水、50%或以下的乙醇、甲醇、丁醇、异丁醇、80%或以下的丙酮。待萃取物质与溶剂的比例可为约1:1至约1:100(w/v(g/ml))，优选为约1:1至约1:50(w/v(g/ml))，更优选为约1:1至约1:20(w/v(g/ml))，甚至更优选为约1:15或1:10(w/v(g/ml))。萃取可在适当温度下进行，例如，在约5℃至约100℃、约10℃至约100℃、约20℃至约100℃、约40℃至约100℃、约60℃至约100℃下进行，优选为室温25℃或在100℃下煮沸。不同阶段的萃取物可相互合并，亦可于后续再进行浓缩步骤，例如蒸发，或纯化或分离步骤，例如过滤、离心和色谱分析。在一实例中，将新鲜植物或干燥的植物样本的全部或部分(视需要经切碎或磨碎)与适当的溶剂混合或浸泡于其中并搅拌达一段足够的时间，例如4小时或以上、6小时或以上、8小时或以上、10小时或以上、12小时或以上、14小时或以上、或16小时或以上，在室温下进行或加热进行，经由过滤移除固体残留物(滤渣)，然后收集所获得的汁液(萃取液)；视需要重复浸泡或混合步骤，合并所得汁液，进一步予以浓缩、纯化或分离。
如本文所用的术语“预防”是指延迟罹患疾病个体的症状发作或减少疾病出现。
如本文所用的术语“治疗”表示缓解或改善感病个体的症状。
术语“载体”是指本领域技术人员所熟知的用以制备组合物的稀释剂、赋形剂、接纳体或类似物。
当本文中提及乙醇浓度时，其指的是乙醇与乙醇水溶液的体积比(v/v)，例如，60%乙醇指的是100ml的乙醇溶液里有60ml的乙醇。
除非本文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
本发明提供各种形式的厚朴萃取物及其制备方法，其中这些厚朴萃取 物均含有厚朴木脂体C、厚朴木脂体A、丁香脂素、柳杉二醇及台湾擦木酚，但不含厚朴酚亦不含和厚朴酚。本发明的厚朴萃取物藉由以下步骤制备：(a)以水萃取厚朴以取得水萃取液；以及(b)将该水萃取液通入大孔吸附树脂柱，以30-60%乙醇洗脱并收集洗脱液。优选地，步骤(b)的乙醇是40-60%乙醇。更优选地，步骤(b)的乙醇是60%乙醇。
在优选实施方案中，该厚朴萃取物具有如图1中E或F所示的化学指纹图谱。
本发明亦提供一种组合物，其包含本发明的厚朴萃取物及视情况可接受的载体。
本发明还提供一种上述组合物用于制备用以预防或治疗牙周病的医药品或保健品的用途，其中该医药品或保健品的形式包括但不限于漱口水、牙膏、口腔贴片、口香糖或保健食品。
在一优选实施方案中，该组合物可减少牙周病患者的牙槽骨流失。
在一优选实施方案中，该医药品或保健品用于给药每公斤体重约1至1000毫克的本发明的厚朴萃取物。在一更优选实施方案中，该医药品或保健品用于给药每公斤体重约25至200毫克的本发明的厚朴萃取物。在一又更优选实施方案中，该医药品或保健品用于给药每公斤体重约50至100毫克的本发明的厚朴萃取物。
【附图说明】
图1为不同厚朴萃取物的化学指纹图谱，A至G依序为MO-W、MO-W-F1、MO-W-F2、MO-W-F3、MO-W-F4、MO-W-F5及MO-W-F6的HPLC图谱。
图2说明不同厚朴萃取物的分离流程。
图3为电脑断层扫描图及牙槽骨高度变化的测量结果，DCB1是指结扎线诱发+MO-W(100mpk,p.o.)组，DCB2是指结扎线诱发+MO-W-F5(100mpk,p.o.)组，DCB3是指结扎线诱发+MO-W-F6(100mpk,p.o.)组。
图4为电脑断层测量图，显示厚朴活性萃取物(MO-W-F5)对结扎诱导牙周病动物实验与临床用药多西环素的比较结果。
图5为HPLC分析结果，显示活性萃取物MO-W-F5中含量最大的两 个主要成分集中在分离部分(9)，其他较小的则集中在(8)和(10)。
图6为使用HPLC紫外线检测器(UV波长为254nm)所显示的厚朴活性萃取物(MO-W-F5)中化学成分的分离鉴定结果，其中所检测出的指标成分为厚朴木脂体C、厚朴木脂体A、丁香脂素及台湾擦木酚。
图7为使用HPLC高灵敏激光计数检测器(NQAD)所显示的厚朴活性萃取物(MO-W-F5)中化学成分的分离鉴定结果，其中所检测出的指标成分为柳杉二醇。
【具体实施方式】
本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下文中所提及的实施例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例1：材料与方法
药品与材料
实施例中所使用的厚朴中药材是木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干燥树皮、枝皮或根皮，经炮制后而得；大孔吸附树脂(DiaionHP20树脂)购自三菱化学公司(Mitsubishi Chemical Corporation)；乙酸乙酯、丙酮及甲醇购自台湾友和贸易股份有限公司；95%乙醇购自台湾糖业公司及医强科技股份有限公司；TLC盘购自Merck编号第1.05715号及第5554号。
仪器与设备
实施例中所使用的减压浓缩机为Rotavapor RE111；分析仪为Thermo Spectra SYSTEM AS3000；色谱柱为Cosmosil5C18-MS-II,4.6×250mm。
厚朴萃取分离方法
取厚朴粉碎药材，加入10倍去离子水(w:v=1:10(g/ml))，搅拌沸腾萃取1小时，抽气过滤；过滤出的粉末再次以10倍体积去离子水搅拌沸腾萃取1小时，抽气过滤；两次滤液合并减压浓缩至浸膏并将该产物简称为MO-W。
将大孔吸附树脂以乙醇静置12小时后，以去离子水清洗去除乙醇，配制初始浓度溶媒洗脱三倍柱体积，使柱完全维持在初始浓度状态。
取厚朴水萃浸膏(MO-W)307.06g，以4倍水回溶(w:v=1:4(g/ml))，小心倒入以水充填的大孔吸附树脂柱(8L HP20)上层，调整流速为每小时0.5 倍柱体积，一开始的1/5倍柱体积不收集。接着调整流速至每小时1倍柱体积，且在收集1倍柱体积后，调快至每小时2倍柱体积，依序以水、10%乙醇、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇及95%乙醇等极性梯度洗脱各约五倍柱体积，同时以薄层色谱法(TLC)确认成分差异，收集洗脱液后浓缩干燥后秤重量，取得不同划分部。其中以水洗脱出的产物简称为MO-W-F1、10%乙醇洗脱出的产物简称为MO-W-F2、20%乙醇洗脱出的产物简称为MO-W-F3、40%乙醇洗脱出的产物简称为MO-W-F4、60%乙醇洗脱出的产物简称为MO-W-F5且95%乙醇洗脱出的产物简称为MO-W-F6。图2为上述流程的示意图。厚朴木脂体C、厚朴木脂体A、丁香脂素、柳杉二醇及台湾擦木酚等活性成份主要集中在30～60%的乙醇洗脱液中。
厚朴萃取成分的高效液相色谱(HPLC)分析方法
HPLC仪器：泵为SpectraSYSTEM P100；自动进样器为SpectraSYSTEMAS1000；检测器为FINNIGAN SURVEYOR PDA Plus Detector；柱为Cosmosil5C18-MS-II,4.6×250mm。
HPLC设定条件：样本浓度为10mg/mL于50%MeOH/H₂O中；进样量为10μL；流速为每分钟1mL；UV波长为254nm；时间程序如下表一所示：
表一

不同厚朴萃取物的HPLC分析图谱如图1所示。其中A至G依序为MO-W、MO-W-F1、MO-W-F2、MO-W-F3、MO-W-F4、MO-W-F5及MO-W-F6的HPLC图谱。图1A中的厚朴酚约占0.060%；图1G中的厚朴 酚约占0.726%。
实施例2：厚朴水萃物的小量制备
厚朴药材1Kg加10倍水10L加热沸腾1小时，过100#筛网，药渣再加10倍水10L，加热沸腾1小时，过100#筛网，合并两次过筛所得液体部分，离心3000rpm，15分钟，过NO.1滤纸，定量得到约18L，经浓缩后可得约116.84g干浸膏产物，产率为11.7%。
实施例3：厚朴水萃物的大量制备
厚朴药材6Kg分4次萃取，药材加10倍水60L加热沸腾1小时，过100#筛网，剩余药材再加10倍水60L，加热沸腾1小时，过100#筛网，合并两次过筛所得液体部分，再过NO.1滤纸，定量得到水萃液体积，取样测固形物含量，浓缩到适量体积，浓缩后约可得628.12g干浸膏产物，产率10.5%。
实施例4：结扎线诱发牙周病动物实验
采用Sprague Dawley(SD)品系的雄性大鼠进行实验，大鼠体重约为280-310公克。结扎线诱发牙周病方法参考Cai等人于2008年所发表的文献(Cai X,Li C,Du G,Cao Z.Protective effects of baicalin on the ligature-induced periodontitis in rats.J Periodont Res2008;43:14-21)。
结扎线诱发牙周病模型(Ligature-induced periodontal disease model)：将大鼠以腹腔注射的方式给予麻醉，将结扎线放置在下颚两侧第一大臼齿齿颈部及上颚第二大臼齿齿颈部，并将线结放置在颊侧近心面(第0天)。实验组的大鼠在第3-10天依组别需要口服(p.o.)给予不同的厚朴萃取物或药物。在第11天处死大鼠，以断层扫描观察牙槽骨高度改变的情形(Cheng W-C,Huang R-Y,Chiang C-Y,Chen J-K,Liu C-H,Chu C-L,Fu E.Ameliorative effect of quercetin on the destruction caused by experimental periodontitis in rats.J Periodont Res2010;45:788-795)。
牙槽骨高度测量：将大鼠的下颚去除剩余的软组织后，确认出釉质牙骨质界(cemento-enamel junction,CEJ)的位置。以断层扫描测定CEJ到牙槽骨顶(CEJ-alveolar bone crest)的距离，观察牙槽骨高度的变化。
实施例5：厚朴水萃物(MO-W)、活性萃取物(MO-W-F5)及含有厚朴酚及和厚朴酚的萃取物(MO-W-F6)对结扎诱导牙周病动物实验结果
本实施例目的在于确认本发明不含厚朴酚及和厚朴酚的活性萃取物在结扎线诱发牙周病的动物实验中可降低牙槽骨破坏萎缩。以实施例4所述方式进行动物试验，实验动物随机分为五组，组别如下：1)正常组(对照组)，2)结扎线诱发组，3)结扎线诱发+MO-W(100mpk)组(简称DCB1)，4)结扎线诱发+MO-W-F5(100mpk)组(简称DCB2)，5)结扎线诱发+MO-W-F6(100mpk)组(简称DCB3)。
电脑断层测量图(图3)显示在结扎线诱发牙周病的组别中，不管是从舌侧或颊侧观测并与正常组相比较，都有着严重骨基质吸收的情况。而给予MO-W-F5(100mg/kg)则在第3天与第6天都观察到具有降低牙槽骨破坏的能力。然而，含有厚朴酚及和厚朴酚的萃取物组别(MO-W-F6)对于牙槽骨破坏并无显著影响。
实施例6：厚朴活性萃取物(MO-W-F5)对结扎诱导牙周病动物实验与临床用药多西环素比较结果
本实施例目的在于确认厚朴活性萃取物(MO-W-F5)不同剂量与临床用药多西环素对于结扎线诱发牙周病动物试验中的效果比较。
以实施例4所述方式进行动物试验，试验动物随机分为五组，组别如下：1)正常组(对照组)，2)结扎线诱发组，3)结扎线诱发+多西环素(100mpk)组，4)结扎线诱发+MO-W-F5(50mpk)组，5)结扎线诱发+MO-W-F5(100mpk)组。
电脑断层测量图(图4)显示在结扎线诱发牙周病的组别中，不管是从舌侧或颊侧观测，都有着严重骨基质吸收的情况。在给予MO-W-F5(50mg/kg)后，改善牙槽骨流失与给予多西环素(100mg/kg)具有相似效果。而给予MO-W-F5(100mg/kg)则更具有降低牙槽骨破坏的能力。
实施例7：厚朴活性萃取物(MO-W-F5)的高效液相色谱分析
以高效液相色谱分析仪分析厚朴活性萃取物(MO-W-F5)的成分，高效液相色谱的条件如下表二：
表二

结果显示MO-W-F5成分中不含厚朴酚及和厚朴酚这两种成分。
实施例8：厚朴活性萃取物(MO-W-F5)中活性化合物分离纯化及结构鉴定
取厚朴活性萃取物浸膏(MO-W-F5)约8.63g，加入3倍重量体积(约25g)的硅胶制作干粉，以120g的硅胶柱(极性梯度在60分钟内从100%乙酸乙酯渐变为100%甲醇)分离后，依照TLC合并成12个分离部分，活性分离物极性约为40%～80%甲醇/乙酸乙酯。以HPLC分析，结果显示于图5，活性萃取物MO-W-F5中含量最大的两个主要成分集中在分离部分(9)，其他较小的则集中在(8)及(10)。分离部分(8)、(9)及(10)以低极性(EA、CH₂Cl₂或MeOH)或高极性(MeOH及H₂O)溶媒混和进行正相或逆相等梯度开放柱分离纯化取得五个纯化合物(MO-1～MO-5)。取适量纯化合物测质谱(MS)、¹H NMR及¹³C NMR谱，推测分子式、骨架类别及官能基，并与文献比对，确认其结构。比对结果，MO-1～MO-5分别为厚朴木脂体C、厚朴木脂体A、丁香脂素、柳杉二醇及台湾擦木酚，如图6所示。紫外线检测器及激光 计数检测(NQAD)HPLC的分析结果如图6及图7所示。
本领域技术人员能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的萃取物、组合物、其制造程序与方法及其用途乃优选实施方案的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。本领域技术人员将会想到其中可修改之处及其他用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在权利要求书中界定。
本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，使得任何本领域技术人员能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明之精神及范围。
说明书中提及的所有专利及出版物，都以和发明所属技术领域的一般技术为准。所有专利和出版物都在此被纳入相同的参考程度，就如同每一个个别出版物都被具体且个别地指出纳入参考。
在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明的特点或其部份的名词及表达，但需认清的是，在本发明的权利要求书范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据优选实施方案及任意的特点来具体揭示本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明权利要求书的范围内。