复合TΒ4的胶原壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用.pdf

本发明涉及生物制品领域，公开了一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和在制备皮肤替代品中应用。本发明的制备方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架能够明显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。

1.  一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法，其特征在于，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中，所述制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法包括：配制胶原-壳聚糖溶液，使得胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，优选均为2-3mg/mL；然后将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，优选为6.2-6.4；再将胶原-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理和冷冻干燥处理；
进一步优选地，所述胶原-壳聚糖溶液为胶原-壳聚糖的醋酸溶液。

3.  根据权利要求2所述的方法，其中，所述孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。

4.  根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，Tβ4溶液的浓度为10-60ng/mL，优选为25-35ng/mL。

5.  根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，浸泡的条件包括：温度为0-4℃，时间为18-30h。

6.  根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述化学交联处理的条件包括：将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为20-30℃，浸泡时间为8-18h，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。

7.  根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。

8.  根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述胶原的来源为猪、牛、羊、猴或鼠，优选为牛，进一步优选为牛肌腱。

9.  根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制备得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。

10.  权利要求9所述的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。

复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体地，涉及一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用。
背景技术
由于糖尿病患者机体的组织细胞长时间处于高糖环境，使局部皮肤组织细胞、蛋白质等被糖基化，引起血管内皮功能异常，反应受损；巨嗜细胞的功能减弱，炎症反应延长失衡；生长因子缺乏或者受损，胶原组织的减少、表皮屏障功能的失调，以及肉芽组织的减少等，导致溃疡难以修复。且治疗糖尿病引起的皮肤难愈合创面的研究仍未取得重大突破。
以胶原和壳聚糖两种高分子生物为基础的胶原-壳聚糖组织工程支架是运用多学科的方法和手段制备的一种较为完善的工程化组织，是能够恢复、保持或改善皮肤功能的皮肤替代品，它可以模拟细胞外基质，构建组织再生的框架，支架的形态和微观结构直接影响细胞的粘附、生长、迁移、增殖和代谢功能，最终使组织得以重建，完成创面的修复与再生。但是，其治疗糖尿病皮肤难愈合创面的效率较低，不利于促进皮肤难愈合创面的修复进程与皮肤附件的再生。
生长因子可以作为调节细胞行为的重要营养物质，应用于组织工程皮肤支架中。作为一种多功能的生长因子，胸腺素β4(以下简称为Tβ4)在促进创伤愈合方面是通过多种途径来实现的。Tβ4是存在于真核细胞中的一种肌动蛋白螯合分子，在机体内广泛分布，具有调节多种生长因子的表达以及趋化新生细胞迁移的特性，在皮肤的创伤愈合过程中，Tβ4可以刺激内皮细胞迁移，促进血管形成；调节某些炎症介质表达，抑制炎症反应；促进角质细胞 迁移进而加速创面再上皮化；与纤维蛋白和胶原交联，促进胶原纤维重排与基底膜重建。
随着难愈合创面研究的进一步深入，Tβ4的独特作用使它在难愈合创面研究上有了逐步发展，但如何安全、稳定、快速、高效地将Tβ4运用在皮肤难愈合创面的修复与再生上，仍是亟需解决的难题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架及其制备方法和应用，该复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架能够明显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。
因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
第三方面，本发明提供了复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。
本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架具有以下有益效果：
(1)本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架为治疗难愈合创面并加快其再生程度提供了有效手段，适用于难愈合创面的高效安全愈合。该支架在炎症期(即皮肤损伤后第1-4天)的Tβ4累积释放率高达70％，且之后以稳定的速度持续缓慢的释放Tβ4，并在损伤后12天Tβ4的累积释放率 高达96％，能够明显促进皮肤损伤部位的完美再生。
(2)该支架拥有合理的孔径、孔隙和三维多孔结构和优良的生物降解率和溶胀属性，在体内可以较好的模拟正常皮肤微环境，有利于细胞增生迁移以及生长因子的浸润，可以有效促进损伤部位移植后的快速血管新生及再上皮化，促进难愈创面修复再生，提高移植效率。
(3)该支架可以有效抑制损伤部位的炎症反应，促进损伤皮肤生成毛囊等附属结构，从而使损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
(4)该支架可以应用于糖尿病溃疡、严重创伤、烧伤患者等缺乏可供移植的自体皮肤，以及创面修复困难、严重影响肢体功能的难愈慢性创面，为促进皮肤创面愈合，解决移植皮源问题提供了新的出路。
(5)该支架揭示了糖尿病等皮肤难愈合损伤部位治疗的新的作用机制，为糖尿病皮肤损伤的治疗提供新思路，也可以作为体外皮肤模型进行一些相关的基础医学领域比如皮肤生理学及皮肤病理学方面的研究。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1显示的是本发明的胶原-壳聚糖多孔支架的特性，其中，(A)为胶原-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片，(B)、(C)、(D)分别为扫描电镜(200×倍数)下的实施例6、1和7的胶原-壳聚糖多孔支架的显微图片。
图2-4显示的是糖尿病皮肤损伤部位的大体观察及组织学评估情况。其中，图2和图3分别为将实施例1的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架和对比例1的支架移植于糖尿病皮肤损伤部位后21天内的皮肤愈合情况图和伤口面积比率，图4为将实施例1的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架和对比例1的支架移植于糖尿病皮肤损伤部位后第21天的组织学观察图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，并将胶原-壳聚糖多孔支架浸泡在Tβ4溶液中，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架；然后将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架依次进行化学交联处理和冷冻干燥处理。
本发明的制备方法中，对于制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种制备方法。但是，本发明的发明人在研究中发现，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，控制胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的特定的浓度和胶原-壳聚糖溶液的pH值对包被的Tβ4的累积释放率有影响，因此，为了进一步提高制得的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的Tβ4累积释放率，优选情况下，制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法包括：配制胶原-壳聚糖溶液，使得胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，进一步优选均为2-3mg/mL；然后将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，进一步优选为6.2-6.4；再将胶原-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理和冷冻干燥处理。更进一步优选地，胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度比为1:1。
本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的溶剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种溶剂，优选情况下，所述溶剂为醋酸溶液，即，胶原-壳聚糖溶液为胶原-壳聚糖的醋酸溶液，进一步优选地，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.01-1mol/L。
本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的方法没有特别的限定，只要能够配制得到前述特定浓度的胶原-壳聚糖溶液即可，例如可以包括：分别将胶原粉末和壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，配制2-10mg/mL优选 3-7mg/mL的胶原溶液和2-10mg/mL优选3-7mg/mL的壳聚糖溶液，然后以适当的体积比例将两种溶液混合。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
本发明的制备方法中，为了进一步提高制得的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的Tβ4累积释放率，优选情况下，Tβ4溶液的浓度为10-60ng/mL，进一步优选为25-35ng/mL。
本发明的制备方法中，为了进一步提高制得的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的Tβ4累积释放率，优选情况下，浸泡的条件包括：温度为0-4℃，时间为18-30h。
本发明的制备方法中，优选情况下，化学交联处理的条件包括：将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为20-30℃，浸泡时间为8-18h。对于交联剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种交联剂，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。
本发明的制备方法中，在化学交联处理之后可以用去离子水洗涤支架2-4次，每次5-10min。
本发明的制备方法中，在将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架进行冷冻干燥处理时，优选情况下，冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
本发明的制备方法中，优选情况下，胶原的来源为猪、牛、羊、猴或鼠， 进一步优选为牛，更进一步优选为牛肌腱。制备胶原粉末的方法可以为本领域技术人员所公知的各种方法，在此不再赘述。
本发明的制备方法中，本领域技术人员应该理解的是，所有操作均在无菌条件下进行。
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
第三方面，本发明提供了上述复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架在制备皮肤替代品中的应用。
本发明的应用中，对于皮肤替代品没有特别的限定，可以为本领域常用的各种皮肤替代品。
利用本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架制备得到的皮肤替代品能够明显促进皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合，明显促进皮肤难愈合损伤部位新生血管的再生、再上皮化和减少炎症细胞浸润，以及明显促进真皮毛囊等附属结构再生和胶原重排，在最大程度上促进皮肤难愈合损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例和对比例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可市售获得。
壳聚糖粉末购自Sigma公司。
Tβ4购自ProSpec公司。
扫描电镜购自日本日立公司，型号为TM100。
EDC/NHS交联剂的配制方法为：将EDC、NHS分别溶于95％乙醇溶液中至浓度为33nmol/L和8nmol/L，得到EDC溶液和NHS溶液，然后将EDC 溶液和NHS溶液等体积混合。
制备例
本制备例用于说明胶原粉末的提取方法。
(1)取新鲜牛肌腱10g，去除周围结缔组织，将牛肌腱剪成1-2mm大小的组织块。
(2)将组织块放入0.1％Na₂CO₃溶液中浸泡2h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。
(3)将组织块放入含1mol/L NaCl的0.5％Tris-HCl(pH＝7.5)溶液中浸泡12h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。
(4)将组织块放入250mL含500mg胃蛋白酶的0.05mol/L的醋酸溶液中，4℃浸泡72h，期间反复搅拌至充分消化成透明糊状。
(5)将混合液在4℃，5000g下离心20min，取上清。
(6)将步骤(5)中的离心沉淀再进行步骤(4)、(5)的操作，重复操作2次。
(7)向所得上清溶液中加入其体积1％的双氧水，4℃静置4h，去除沉淀杂质。
(8)向所得溶液中加入NaCl至沉淀不再析出，4℃静置12h。
(9)将混合液在4℃，5000g下离心20min，收集沉淀。
(10)将步骤(9)中的上清液再进行步骤(8)、(9)的操作一次。
(11)将所得沉淀溶解于100ml浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中，用0.05mol/L醋酸溶液透析2天，再用超纯水透析3天，每天换液一次至胶原溶液中盐离子浓度为0.02-0.06mol/L之间。
(12)将透析后的所得溶液通过真空冷冻干燥机在-80℃下干燥24h，获得固体粉末胶原。
实施例1
本实施例用于说明本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为5mg/mL的胶原溶液。
(2)将2mL壳聚糖溶液和2mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.3。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，37℃孵育30min。
(4)-80℃冷冻24小时后，置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，得到胶原-壳聚糖多孔支架。
(5)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为30ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中，4℃放置24小时，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
(6)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，25℃放置12h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(7)将水洗后的复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架于-80℃冷冻24小时后，再置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，即获得复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
实施例2
本实施例用于说明本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为4mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为6mg/mL的胶原溶液。
(2)将2mL壳聚糖溶液和2mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.2。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，38℃孵育25min。
(4)-70℃冷冻30小时后，置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，得到胶原-壳聚糖多孔支架。
(5)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为25ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中，3℃放置18小时，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
(6)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，20℃放置18h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(7)将水洗后的复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架于-90℃冷冻18小时后，再置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，即获得复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
实施例3
本实施例用于说明本发明的复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架的制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为6mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为4mg/mL的胶原溶液。
(2)将2mL壳聚糖溶液和2mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.4。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，30℃孵育40min。
(4)-90℃冷冻18小时后，置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，得 到胶原-壳聚糖多孔支架。
(5)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为35ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中，0℃放置30小时，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
(6)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，30℃放置8h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(7)将水洗后的复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架于-70℃冷冻30小时后，再置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，即获得复合Tβ4的胶原-壳聚糖组织工程支架。
实施例4
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(5)中，将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为10ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中。
实施例5
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(5)中，将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为60ng/mL的Tβ4溶液，然后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖多孔支架浸泡于Tβ4溶液中。
实施例6
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，将1mL壳聚糖溶液和3mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液。
实施例7
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，将3mL壳聚糖溶液和1mL胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液。
实施例8
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6。
实施例9
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)中，用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至7。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(2)-(5)为：
(3)将Tβ4溶于1×PBS中得到浓度为1mg/ml的储存液，然后将其逐滴加入步骤(2)的胶原-壳聚糖溶液中至Tβ4浓度为30ng/mL，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖溶液。
(4)将复合Tβ4的胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，37℃孵育30min。
(5)-80℃冷冻24小时后，置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，得到复合Tβ4的胶原-壳聚糖多孔支架。
试验例1
对本发明的胶原-壳聚糖多孔支架和复合Tβ4胶原-壳聚糖组织工程支架的生物学性能和机械性能进行评估，评估内容和方法如下：
(1)本发明的胶原-壳聚糖多孔支架的宏观和微观结果评估。本发明的 胶原-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片如图1(A)所示，扫描电镜下的实施例1、6和7的胶原-壳聚糖多孔支架的显微图片分别如图1(C)、图1(B)和图1(D)所示。
由图1(B)-(D)可以看出：本发明实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为110-140μm、孔隙约为95％，为相互交联、高度均一的三维多孔网状结构；本发明实施例6的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为50-80μm、孔隙约为60％，为含有较多竖状纤维的三维多孔结构；本发明实施例7的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为190-220μm、孔隙约为80％，为不均匀的三维多孔片状结构。另外，本发明实施例2和3的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径、孔隙和三维多孔结构与实施例1类似，在此不再赘述。本发明实施例8的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为70-90μm、孔隙约为75％，为不均匀的、含有部分竖状纤维的三维多孔结构；本发明实施例9的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为80-100μm、孔隙约为86％，为不均匀的、含有少量絮凝沉淀的三维多孔结构。即本发明的方法得到的胶原-壳聚糖多孔支架均具有合理的孔径、孔隙和三维多孔结构。将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的孔径、孔隙和三维多孔结构。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的孔径、孔隙和三维多孔结构。
(2)对实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架进行支架溶胀率测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在室温下浸泡到去离子水中一定时间(如1、3、6、9、12天)，然后再称重，计为W2，计算支架溶胀率(％)＝(W2-W1)/W1×100％。
实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀率如表1所示，由表1数据可 以看出：本发明的方法得到的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀性能良好，对水的平衡溶胀度达到25.8％-36.7％。将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的溶胀性能。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的溶胀性能。
表1

(3)对实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架进行支架降解率测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的降解率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在37℃将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架置于含l mg/mL的I型胶原酶的1×PBS溶液中，一定时间后(如第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天)取出支架，去离子水漂洗后烘干称重，计为W2，计算残余质量(％)＝W2/W1×100％。
实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架的残余质量如表2所示。生物材料 在体内的降解速度，应该满足细胞对支架的降解要求，以促进修复细胞的增殖及迁移。由表2可以看出，本发明的胶原-壳聚糖多孔支架均具有较为优良的生物降解性能以配合组织修复再生。将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的生物降解性能。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架具有更优的生物降解性能。
表2

(4)对实施例1-9的胶原-壳聚糖多孔支架进行机械性能测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的测定为例，测定方法包括：将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架剪裁为40mm×5mm×0.3mm的条形，采用KES-G1材料试验机测试其干燥状态下的机械性能，拉伸速度为10mm/min。同时将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架在去离子水中浸泡24h后取出，滤纸吸去表面水分后相同条件下测定支架在湿性状态下的机械性能。
本发明实施例1-9中的胶原-壳聚糖多孔支架在干燥状态和湿性状态的拉伸强度如表3所示。由表3中数据可知，本发明的方法得到的胶原-壳聚 糖多孔支架均具有较好的机械性能，在干燥状态下，随着壳聚糖浓度的增加，支架材料的断裂程度逐渐增强，表明支架的机械性能逐渐增强；但在干燥及湿性两种状态进行对比后发现(干湿状态相差较少时比较好)，同时，将实施例1与实施例6-7进行比较可以看出，当胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为2-3mg/mL时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架的拉伸强度较大且干湿状态下可变范围较小，说明该支架具有更优良的柔韧度。将实施例1与实施例8-9进行比较可以看出，当将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6.2-6.4时，得到的胶原-壳聚糖多孔支架的拉伸强度较大且干湿状态下可变范围较小，说明该支架具有更优良的柔韧度。
表3