体外再生丙型肝炎病毒(HCV)NS3 蛋白酶的解蛋白活性地方法 描述
本发明的主题是再生与HCVNS3蛋白质相关的丝氨酸蛋白酶活性的方法，其利用了HCV蛋白质NS4A或其中所含的序列作为丝氨酸蛋白酶活性或普遍而言与NS3相关的酶活性的辅助因子的能力。
人们知道，丙型肝炎病毒(HCV)是非A、非B型肝炎(NANB)的主要病原。据估计，HCV引起至少90％的输血后NANB病毒性肝炎和50％的散发性NANB肝炎。虽然在选择血液供体和输血所用血液的免疫学特征鉴定方面取得了重大进展，但在接受输血的人中急性HCV感染的水平仍较高(全世界每年一百万例或更多)。大约有50％HCV感染患者在长达5-40年的期限内会发展为肝硬化。另外，最近的临床研究表明，慢性HCV感染与肝细胞癌变之间具有一定的关系。
HCV是一种含有约9.4kb的RNA阳性基因组的具被膜病毒。这种病毒是黄病毒科的一个成员，该科的其它成员为黄病毒和病虫害病毒。近年来人们绘制出了HCV的RNA基因组图谱。对从世界多处地方分离出的HCV基因组序列的比较表明，这些序列可以是极为异源性的。HCV基因组的大部分为开放式解读密码(ORF)，其为9030至9099个核苷酸不等。这个ORF可为一单个病毒多蛋白编码，其长度为3010-3033个氨基酸不等。在病毒感染周期中，多蛋白被解蛋白性地加工为病毒复制所必需的单个基因产物。编码HCV结构蛋白的基因位于ORF的5’末端，而非结构蛋白的编码区则占据ORF的其余部分。
结构蛋白由C(核心，21kDa)、E1(被膜，gp37)和E2(NS1，gp61)组成。C为-21kDa的非糖基化蛋白，其可能构成病毒的核蛋白壳。蛋白E1为一约37kDa的糖蛋白，据信其为病毒外被膜的结构蛋白。E2是另一61kDa的膜糖蛋白，其可能是病毒外被膜的第二种结构蛋白。
非结构区始于NS2(p24)，这是一种功能尚不清楚的24kDa的疏水蛋白质。NS3是一种68kDa的蛋白质，其在多蛋白中跟随着NS2，预计有两个功能区：前200个氨基末端氨基酸中的丝氨酸蛋白酶区，和羧基末端处的RNA依赖性ATP酶区。与NS4相对应的基因区分别编码NS4A(P6)和NS4B(P26)——两种6和26kDa的疏水蛋白质，它们的功能尚未弄清。与NS5相对应的基因分别编码56和65kDa的NS5A(P56)和NS5B(P65)两种蛋白质。存在于所有RNA依赖性RNA聚合酶中的氨基酸序列可在NS5区中得到识别。这就意味着NS5区含有病毒复制工具的部分。
多项分子生物学研究表明，信号肽酶(与宿主细胞内质网相关的一种蛋白酶)关系到非结构区中的解蛋白加工，这就是说位于C/E1、E1/E2和E2/NS2位点处。NS3中含有的丝氨酸蛋白酶关系到NS3与NS4A之间、NS4A与NS4B之间、NS4B与NS5A之间和NS5A与NS5B之间接合点处的切割。特别是，已经发现，由这种丝氨酸蛋白酶进行的切割在开裂键的氨基末端侧(P1位)留下了半胱氨酸或苏氨酸的残基，而在其羧基末端侧(P1’位)留下了丙氨酸或丝氨酸残基。HCV的第二种蛋白酶活性似乎关系到NS2与NS3之间的切割。这种蛋白酶活性存在于由含有丝氨酸蛋白酶区的NS2部分和NS3部分所组成的区域中，但并不使用同样的催化机制。
按照以上描述，可以认为NS3蛋白酶是用于开发抗HCV治疗剂的一种潜在性目标。然而，对这类治疗剂的探索一直受到阻碍，这是因为体外NS3所表现的丝氨酸蛋白酶活性太低以致无法对抑制剂进行筛选。
人们意外地发现，可通过采用本发明的方法来克服这种至关重大的局限性。本方法还具有下述一些优点。
依据本发明，可通过在反应混合物中利用NS3和NS4A中所含的序列是体外再生HCV蛋白酶NS3的解蛋白活性方法的特征。
当NS4A与NS3的比例为1∶1时，可获得丝氨酸蛋白酶的最佳活性。
NS3和NS4A还可以作为NS3-NS4A前体掺入反应混合物中，因为通过自蛋白水解反应，这个前体将产生等摩尔量的NS3和NS4A。
在前体中使NS3与NS4A之间的切割位点发生突变也是可能的，这样NS4A仍会同NS3共价相连。不影响NS3解蛋白活性的序列随后可从这个非解蛋白前体中除去。
本发明还涉及一种新的组合物，其特征在于它包含序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的蛋白质或其中所含的或自其中衍生的序列。可以理解，因为所有的RNA病毒都表现高度的变异性，所以这些序列在不同的HCV分离物中可有所变化。这种新的组合物具有获得数种非结构HCV蛋白质的蛋白水解突变所必需的蛋白水解活性。
本发明的主题还在于使用这些组合物以准备能够鉴定用于治疗目的化合物的酶促测定，这些化合物能抑制与NS3相关的酶活性，其中包括NS3与NS4之间相互作用的抑制剂。
关于这一点，已经给出了本发明的一般性描述。借助于下列实施例，将给出本发明具体实施方案的更详细的描述，以便能更清楚地理解本发明的目的、特征、优点和操作方法。
附图表明了活化培养细胞中和体外(实施例1和实施例2)的HCVNS3蛋白酶的方法所用的质粒载体。
实施例1培养细胞中HCVNS3丝氨酸蛋白酶的活化方法
构建质粒载体用于在Hela细胞中表达NS3、NS4A和其它非结构性HCV蛋白质。所构建的质粒如图1所示。对应于HCV BK分离物(HCV-BK)基因组的选择的cDNA片段在质粒载体pCite-1R(Novagen)中的噬菌体T7启动子下游被克隆。这个表达载体含有脑心肌炎病毒的内核糖体进入位点，以便甚至在缺少CAP结构时也能确保由启动子T7所转录的信使RNA的有效转译。
利用分子生物学实践中已知的方法将HCV-BK cDNA的各种片段克隆到质粒pCite-1R中。pCite(NS3)含有核苷酸3351至5175(多蛋白的氨基酸1007-1615)所含的部分HCV-BK基因组。pCite(NS4B/5A)含有核苷酸5652至7467(氨基酸1774-2380)所含的部分HCV-BK基因组。pCite(NS3/4A)含有核苷酸3711至5465(氨基酸991-1711)所含的部分HCV-BK基因组。pCite(NS4A)含有核苷酸5281至5465(氨基酸1649-1711)所含的部分HCV-BK基因组。PCite(NS5AB)含有核苷酸6224至9440(氨基酸1965-3010)所含的部分HCV-BK基因组。以上编号与Takamizawa等人对HCV-BK给出的基因组和多蛋白序列相一致，见“structure and organization of the hepatitis C virus genome isolatedfrom human carriers，(1991)，J.Virol.65，1105-1113。
为了获得HCV多蛋白各个部分的有效表达，用vTF7-3感染Hela细胞。vTF7-3是一种重组牛痘病毒，其可以使噬菌体T7的RNA聚合酶在所感染细胞的胞质中进行合成。这些细胞在感染之后又受到选自如图所示的质粒载体的转染。然后这样感染和转染的Hela细胞被[35S]甲疏氨酸代谢标记，而由各种质粒所编码的重组蛋白质可通过与多克隆免抗体(其可以识别NS3，NS4或NS5A)的免疫沉淀作用加以鉴定。本实施例中所述的用于重组HCV蛋白质分析的方法已由L.Tomei等人提出，见“NS3是加工丙型肝炎病毒多蛋白所需的丝氨酸蛋白酶”，J.Virol.(1993)67，1017-1026，及其中所提及的文献。
通过将质粒pCite(NS3)转染到被vTF7-3感染的Hela细胞中，有可能观察到含有HCV NS3蛋白酶催化区的蛋白质的合成。PCite(NS4B5A)编码含肽键的部分HCV多蛋白，位置在NS4B与NS5B接合处，该肽键预计会被与NS3相关的丝氨酸蛋白酶活性所水解。不过，当pCiteNS3被pCiteNS4B5A协同转染时，完全没有蛋白水解性裂解的迹象。相反，当NS3丝氨酸蛋白酶区与NS4A协同表达时，通常会发生由pCite(NS4B5A)编码的前体的蛋白水解性裂解。例如，可以通过用等摩尔量的质粒pCite(NS3)和pCite(NS4A)转染，通过编码含有NS3和NS4A二者的前体的质粒[pCite(NS34A)]的转染，或通过所有与蛋白水解无关的序列都已删除的后一质粒衍生物[pCite(NS34A)]的转染，或通过所有与蛋白水解无关的序列都已删去的后一质粒衍生物[pCite(NS3Δint1237-1635)]的转染来实现NS3丝氨酸蛋白酶区及4A的共同表达。这样在Hela细胞中短暂表达的NS4A就能激活与NS3相关的解蛋白活性，否则这种活性是观察不到的。实施例2用于体外转译测定中的HCV丝氨酸NS3蛋白酶的激活方法
图1所示质粒还可用于使用纯化的噬菌体T7(Promega)的RNA聚合酶体外合成编码各个HCV蛋白质的mRNA。
衍生自pCite-1R的质粒一般可利用适当的限制性酶来线性化，可通过生产商(Promega)提供的方案来转录。这些合成的mR-NA，可以在有犬胰腺微粒体膜的情况下，以后用来在兔网状细胞提取物中合成相应的蛋白质。网状细胞提取物、犬胰腺微粒体膜象所有其它所需的材料一样，均可购自Promega，其还可以提供用于上述蛋白质体外合成方法的指导。
利用转录自pCite(NS3)的mRNA来编制体外转译混合物的程序，这使得人们有可能观察到具有预期分子量(68kDa)的蛋白质(含有整个NS3丝氨酸蛋白酶区)的合成。转录自pCite(NS5AB)的mRNA可指导115kDa前体(含NS5A和NS5B)的合成，因而也是与NS3相关的解蛋白活性的底物。
然而，当在相同反应混合物中合成两种蛋白质(其含有NS3丝氨酸蛋白酶区和具有对应于NS5A与NS5B间接合位点的底物)，尚无NS3解蛋白活性的明显迹象。
相反，转录自pCite(NS34A)的mRNA被转译为前体蛋白质(约76kDa)，这种体外解蛋白性自我过程可产生等摩尔量的两种蛋白质(70kDa和6kDa，分别含有NS3和NS4A)。
除了转录自pCite(NS34A)的mRNA之外，如果使转录自PCite(NS5AB)的mRNA包括在体外转译混合物中，那么，除了NS3与NS4A间位点的自我蛋白水解作用，还可以观察到生成两种56kDA和65kDA的新蛋白质(分别含有NS5A和NS5B)。这些蛋白质代表着利用NS3而进行的前体(含NS5A和NS5B)的蛋白水解产物。与此类似，如果将转录自pCite(NS3Δint1237-1635)的mRNA与转译自pCite(NS5AB)的mRNA共同转译，那么就可以得到通过NS5AB前体的蛋白水解而生成的56kDa和65kDa蛋白质产物。
这一结果可综述为：在体外，仅有NS3的蛋白酶区不能对含NS5A和NS5B的底物表现出蛋白酶活性。然而，如果除了NS3蛋白酶区之外还存在着另一种含NS4A的蛋白质序列，NS3的丝氨酸蛋白酶活性就会变得很明显。实施例3利用含NS4A序列的合成肽活化HCVNS3蛋白酶的方法
在固相上合成出含序列SEQ ID NO：3的合成肽。该序列衍生自SEQ ID NO：2的C末端部分。依据本领域所熟知的操作方法，肽的合成在固相上进行。在该肽中，羧基末端的半胱氨酸被α-氨基丁酸(Abu)所取代。
将该肽加入到体外转译混合物中，后者是用转录自质粒pCite(NS3)和pCite(NS5AB)的mRNA来同时编程的。
这样就可能观察到与NS3丝氨酸蛋白酶区相关的解蛋白活性，其导致了在含蛋白质NS5A和NS5B的两种产物中底物的蛋白水解性裂解。这种活性有赖于NS3丝氨酸蛋白酶区及具有SEQ ID NO：3序列的合成肽的同时存在。实施例4对肽底物上重组HCVNS3丝氨酸蛋白酶的检测方法
构建图1和实施例4所述的质粒pT7-7NS3(1027-1206)，以使含在SEQ ID NO：1的氨基酸1与氨基酸180之间的蛋白质片段在大肠杆菌中得以表达。据实验测定，该片段含有NS3丝氨酸蛋白酶区。将编码上述NS3片段的HCVcDNA片段在PT7-7质粒中克隆，后者是含有T7RNA聚合酶启动子10和T7基因10蛋白质转译起始位点的表达载体[研究者和Moffatt，“利用噬菌体T7RNA聚合酶指导克隆基因的选择性高水平表达”，(1986)，J.Mol.Biol.189，P.113-130.]。将如上所定义的编码NS3丝氨酸蛋白酶区的cDNA片段在噬菌体T7启动子下游和具有T7基因10蛋白质的第一个ATG密码子的框架中进行克隆，使用的方法为分子生物学实践中熟知的方法。PT7-7质粒还含有3-内酰胺酶基因，其可以用作以质粒(用PT7-7衍生的)转化的大肠杆菌细胞的选择标记物。
随后将质粒PT7-7NS3(1027-1206)在大肠杆菌菌株BL21(DE53)中转化，后者通常用于克隆至表达载体(含T7启动子)之基因的高水平表达。在大肠杆菌的这一菌株中，在噬菌体入DE53上携带着T7基因聚合酶，将其整合到BL21的染色体中。所感兴趣的基因的表达是通过将异丙硫基半乳糖苷(IPTG)加入培养基中而诱导的，依据的程序如前述[研究者与moffatt，“利用噬菌体T7RNA聚合酶指导克隆基因的选择性高水平表达”，(1986)，J.Mol.Biol-189，P.113-130]。
含有丝氨酸蛋白酶区的重组NS3片段可通过下述方法由以质粒PT7-7NS3(1027-1206)转化的大肠杆菌BL21(DE53)纯化。
简言之，含PT7-7NS3(1027-1206)质粒的大肠杆菌BI21(DE53)在37℃下生长在600nM处达到约0.8吸光度单位的光密度。其后，将培养基冷却至22℃，加入IPTG而诱发生成所需蛋白质使终浓度达到0.4mM。在存在IPTG条件下，在22℃下4-6小时之后收集细胞并在含20mM磷酸钠(PH6.5)、0.5％(W/V)的(3-[(3-胆酰氨丙基)-二甲基氨]1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、50％(V/V)的甘油、10mM二硫苏糖醇和1mM乙二胺四乙酸的缓冲液(细胞溶解缓冲液)中借助于弗氏压碎器溶解细胞。经离心(120000xg，时间1小时)除去细胞碎片，将生成的沉淀再悬浮于细胞溶解缓冲液中，用DNAseI消化，并同上述进行再均化和再离心处理。将在细胞溶解缓冲液中预平衡的S-琼脂糖高流离子交换树脂(Pharmacia)加入收集的上清液中(30％V/V)，对悬浊液在4℃下搅拌1小时。使树脂沉降，用细胞溶解缓冲液充分洗涤后倾入层析柱中。应用O-1M Nacl梯度将NS3蛋白酶从树脂中洗脱出来。用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)、10％(V/V)的甘油、0.5％(W/V)的CHAPS和2mM二硫苏糖醇来平衡含蛋白酶的部分。经这个步骤之后蛋白质达到90-95％的纯度。经随后的肝素琼脂糖层析使纯度达到＞98％，层析柱用50mM Tris(pH7.5)、10％(V/V)甘油、0.5％(W/V)CHAPS和2mM二硫苏糖醇加以平衡。通过应用线性0-1M NaCl梯度来实现将NS3从该柱中洗脱出来。
通过Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad cat.500-0006)来确定纯化蛋白的浓度。
依据上述程序在大肠杆菌中生成的重组NS3丝氨酸蛋白酶可通过裂解能提供可检测裂解产物的底物来测定其活性。优选用比色法或荧光法来检测信号。诸如HPLC等方法也是适用的。
例如，我们使用合成肽作为底物，其对应于HCV多蛋白的NS4A/4B接合点，含有氨基酸序列SEQ ID NO：4或其一部分。
另外还有肽酯，其含有SEQ ID NO：5中所示的一般结构。
活性测定如下进行：在缓冲液中温育5-1000μM底物和0.05-1μM蛋白酶，时间为1-3小时，温度为22℃，缓冲液中含有25mM Tris/HCL(PH7.5)，3mM二硫苏糖醇、0.5％(W/V)CHAPS和10％(V/V)甘油。通过加入三氟乙酸达到0.1％(W/V)的终浓度来停止反应。
然后，通过C18反相柱上的HPLC来分离反应产物，并根据其对远紫外线的吸光度来进行定量分析。
当如上述进行活性测定时，由重组NS3丝氨酸蛋白酶(提纯自大肠杆菌)而显示的解蛋白活性是很低的。然而，我们发现，增加如SEQ ID NO：3所述的合成肽量可促进重组NS3丝氨酸蛋白酶的解蛋白活性，使其增加20倍。当重组NS3丝氨酸蛋白酶和合成肽以等摩尔量存在时达到最高活性。
可利用上述测定法来发现蛋白酶抑制剂。由于在这种测定法中NS3蛋白酶的活性有赖于NS3丝氨酸蛋白酶区与衍生自NS4A的氨基酸序列的相互作用，利用上述测定法也有可能发现NS3与NS4A之间互作的颉顽剂，其最终可抑制与NS3相关的解蛋白活性。实施例5唯一附图中质粒的详细构建
pCite(NS3)含有核苷酸3351与5175之间(多蛋白的氨基酸1007-1615)的部分HCV-BK基因组。这种质粒的构建如L.Tomei等人所述。见“NS3是加工丙型肝炎病毒多蛋白所必需的丝氨酸蛋白酶”，J.Virol(1993)67，1017-1026。
如Tomei等人所述，通过将衍生自质粒pCite(NS4-5)的ScaI-BamHI片段克隆至pCite(NS3)事先用MscI和BamHI进行消化)中而得到pCite(NS4B/5A)。pCite(NS4B/5A)含有核苷酸5652与7467之间(多蛋白的氨基酸1774-2380)的部分HCV基因组。
pCite(NS5AB)为一种含HCV-BK多蛋白氨基酸1965-3010序列的蛋白质编码。为了构建这个质粒，对如Tomei等人(1993)(见上)描述的质粒pCite(SX)先用AseI消化，再用DNA聚合酶的Klenow片段进行处理。在Klenow酶失活之后，用XbaI消化质粒。所生成的cDNA片段含有核苷酸6224与9400之间的区域，用T4DNA聚合酶纯化由BstXI产生的末端之后，对其进行纯化并插入载体pCite-1R的BstXI和XbaI位点。
如下得到pCite(NS3/4A)。cDNA片段对应于HCV-BK基因组的核苷酸3711-5465的区域，用序列特异性寡核苷酸作为引物，通过聚合酶链反应(PCR)进行合成。UAG终止密码子被适当地包括在反义寡核苷酸中。在PCR扩增之后，用SALI在5’末端切割所生成的cDNA，并在用DNA聚合酶Klenow片段纯化NheI末端以后，将750个碱基对的产物定向克隆至质粒pCite(SX)的SaiI和NheI位点。所生成的质粒为氨基酸991与1771之间的部分HCV-BK多蛋白编码。
为了构建pCite(NS4A)，用序列特异性寡核苷酸作为引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到了对应于HCV-BK基因组的核苷酸5281与5465之间(氨基酸1649-1711)区域的cDNA片段。在用噬菌体T4的DNA聚合酶纯化BstXI消化的末端之后，随后将由PCR扩增生成的cDNA克隆至质粒pCite-1R的BstXI和StuI位点。
pCite(NS3Δint1237-1635)是pCite(NS3/4A)的衍生物，其中所有在核苷酸4043与5235之间的序列都已被删除掉。它是通过用BsteII特别是ScaI消化pCite(NS3/4A)而得到的。通过使用T4DNA连接酶使含有缺失的感兴趣片段发生环化。该质粒为具有与pCite(NS3/4A)所编码的蛋白质相同的氨基和羧基末端的蛋白质编码，但氨基酸1237与1635之间的所有氨基酸残基(实验发现其为丝氨酸-蛋白酶NS3活性所必需的)都已被删除掉。
PT7-7[NS3(1027-1206)]含有来自核苷酸3411至3951的HCV序列，其编码氨基酸1027与1206之间的HCVNS3片段。为了获得这种质粒，利用被称为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的寡核苷酸，通过由聚合酶链反应(PCR)扩增HCVcDNA生成了DNA片段。将用PCR获得的cDNA片段磷酸化，用NdeI消化。然后在噬菌体T7启动子的下游进行克隆，T7启动子紧接在事先已用NdeI和SamI消化过的载体PT7-7中的T7基因10蛋白质的第一个ATG密码子后面，(研究者及Moffatt，“利用噬菌体T7RNA聚合酶指导克隆基因的选择性高水平表达”(1986)，J.Mol.Biol.189，P.113-130。要注意的是，琥珀密码子紧随着HCV衍生的序列插入。
序列表一般信息
(i)申请人：ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIAMOLECOLARE P.ANGELETTI S.P.A.
(ii)发明名称：体外再生丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白酶的解蛋白活性的方法
(iii)序列数目：7
(iv)联系地址：
(A)地址：Societa Italiana Brevetti
(B)街道：Piazza di Pietra，39
(C)城市：罗马
(D)国家：意大利
(E)邮政编码：I-00186
(v)计算机可读形式
(A)媒介类型：Floppy disk 3.5”1.44 MBYTES
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS Rev.5.0
(D)软件：Microsoft Wordstar 4.0
(viii)律师信息
(A)姓名：DI CERBO，Mario(Dr.)
(C)参考：RM/X88350/PCT-DC
(ix)通讯信息
(A)电话：06/6785941
(B)传真：06/6794692
(C)电报：612287 ROPAT(1)SEQ ID NO：1信息 (i)序列特性
(A)长度：631个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链况：单链
(D)拓扑：线性 (ii)分子类型：蛋白质 (iii)假拟：无 (iv)反义：无 (v)片段类型：内部片段 (vi)原始来源：
(A)生物体：丙型肝炎病毒
(C)分离物：BK (vii)直接来源：cDNA克隆pCD(38-9.4)，如Tomei等人所述(1993) (ix)特征：
(A)名称：NS3丝氨酸蛋白酶区
(B)定位：1-180
(C)鉴定方法：实验 (xi)序列描述：SEQ ID NO：1Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys1 5 10 15Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu
20 25 30Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val
35 40 45Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu
50 55 60Ala Ala Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Cal Asp Gln65 70 75 80Asp Leu Val Gly Trp Pro Lys Pro Pro Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro
85 90 95Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp
100 105 110Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser
115 120 125Pro Arg Pro Cal Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu
130 135 140Cys Pro Phe Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr145 150 155 160Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Met Glu
165 170 175Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala
180 185 190Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser
195 200 205Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys
210 215 220Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala225 230 235 240Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val
245 250 255Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Val Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys
260 265 270Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile
275 280 285Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly
290 295 300Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu305 310 315 320Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile
325 330 335Glu Lgu Val Ala Leu Ser Ash Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys
340 345 350Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys
355 360 365His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Ser Gly Leu
370 375 380Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile385 390 395 400Pro Thr Ile Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr
405 410 415Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val
420 425 430Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr
435 440 445Thr Thr Val Pro Gln Aps Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg Arg Gly Arg
450 455 460Thr Gly Arg Gly Arg Arg Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu465 470 475 480Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp
485 490 495Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg
500 505 510Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His
515 520 525Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala
530 535 540His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu545 550 555 560Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro
565 570 575Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu
580 585 590His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu
595 600 605Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Ala Cys Met Ser
610 615 620Ala Asp Leu Glu Val Val Thr625 630(2)SEQ ID NO：2信息 (i)序列特性
(A)长度：54个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链况：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：多肽
(iii)假拟：无
(iv)反义：无
(V)片段类型：内部
(Vii)直接来源：cDNA克隆(见SEQ ID NO：1)
(ix)特征：
(A)名称：NS4A蛋白质
(C)鉴定方法：实验
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr1 5 10 15Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser
20 25 30Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Leu Leu Tyr Gln Glu Phe
35 40 45Asp Glu Met Glu Glu Cys
50(3)SEQ ID NO：3的信息
(i)序列特征
(A)长度：34个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链况：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：多肽
(iii)假拟：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部
(vii)直接来源：
(A)合成：固相肽合成
(ix)特征：
(A)名称：NS3丝氨酸蛋白酶辅助因子
(C)鉴定方法：实验
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala1 5 10 15Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu
20 25 30Glu Abu