硫代乙烯酮衍生物用于预防或治疗乙型肝炎的用途 【发明领域】
本发明涉及硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐用于预防或治疗乙型肝炎的新用途。
现有技术
已知许多类型的致病病毒会引起各种病毒性肝脏疾病。特别是乙型肝炎病毒(HBV)的传染可以诱发严重的、被称为急性和慢性乙型肝炎的肝脏疾病，它可以引发致死的疾病，如肝硬化或肝细胞癌症。据报道世界上有将近3亿患者遭受着乙型肝炎的折磨。因此，人们做了多种努力来开发预防或治疗乙型肝炎的有效药物。
U.S.4,035,387揭示了马洛替雷特(malotilate)及其衍生物在治疗肝脏疾病方面是有效的。在本发明以前，本发明人已经开发了对肝脏疾病具有优异治疗和预防活性的硫代乙烯酮衍生物及其无毒性的盐(参见U.S.5,103,013和U.S.5,158,950)。
尽管它们在用于治疗由CCl4诱发的急性肝损伤时基本无毒且特别有效，但它们的抗HBV活性仍是未知的。
发明概述
因此，本发明的首要的目的是提供一种硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐用于预防或治疗乙型肝炎的新用途。发明的详细描述
本发明提供了下式(I)的硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐的新用途：其中，
Y是-CH2-或-CH＝CH-；
A是NH或O；
R1是有1-4个碳原子的直链或支链烷基；和
当A是0时，R2是具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，当A是NH时，R2是苄基，2-吡啶基，2-噻唑基，4-甲基噻唑-2-基，4-羧基-噻唑-2-基或1，3，4-噻二唑-2-基。
本发明优选使用地式(I)硫代乙烯酮衍生物是：
2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基)丙二酸二异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基(dithio1-2-ylidene))-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基)-2-[N-(1，3，4-噻二唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基)-2-[N-(2-吡啶基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基(di thietan-2-ylidene))-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(2-吡啶基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-羧基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸乙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(2-噻唑基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯或其药物可接受的盐；
2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-(N-苄基氨基甲酰基)乙酸异丙酯或其药物可接受的盐。
硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐的抗HBV活性可以用传统的方法测定，其中使用Sells，M.A.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.,84,1005-1009(1 987)中描述的2.2.15细胞系。
2.2.15细胞系是用HBV DNA转染Hep G2(人的肝胚细胞瘤)细胞制备的培养细胞系。故其具有HBV的基本特征，用它进行效力评价有如下的优点，如筛分容易，病毒复制水平高，DNA形式稳定。此外，病毒特异性RNA转录本和由其得到的蛋白质以适宜的大小和形式存在，使HBV病毒粒子以高的水平释放。因此，2.2.15细胞系特别适于评价一种药物的抗HBV效力(Korba and Milman，Antiviral Research，15，217-228(1991))。
式(I)硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐能有效地抑制HBV DNA在2.2.15细胞系中的复制，又由于其细胞毒性低而具有宽的安全区，如试验实施例所述。因此，式(I)硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐可以用于预防或治疗乙型肝炎。
式(I)硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐能通过U.S.4,327,223,5,103,013和5,158,950所述的方法容易地制得。
本发明还提供了一种预防或治疗乙型肝炎的药物组合物，包括有效量的式(I)硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐和药物可接受的载体。
用药物可接受的载体可以将本发明药物组合物制备成各种制剂形式。本发明可以使用的药物可接受的载体包括但不限于，适宜的稀释剂、溶剂、填充剂、粘合剂、分散剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂和湿润剂。如果需要，本组合物可以进一步包括增溶剂、缓冲剂、防腐剂、着色剂、香料、甜味剂等等。
本组合物的药物组合物可以根据所希望的治疗方式配制。例如，诸如配制成口服形式的片剂、胶囊和颗粒剂；可以通过任何常规的方法使用稀释剂(如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、淀粉、甘露糖醇)，粘合剂(如，糖浆、阿拉伯树胶、山梨醇、黄耆胶、羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、淀粉浆)；崩解剂(如，淀粉、羧甲基纤维素或其钙盐、微晶纤维素、交联吡咯烷酮(crospovidone)、淀粉-甘醇酸钠)；润滑剂(如，滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、二氧化硅)；湿润剂(如，十二烷基硫酸钠、甘油)等制备。
本发明进一步提供了一种预防或治疗某一对象的乙型肝炎的方法，包括向该对象给人有效量的式(I)硫代乙烯酮衍生物或其药物可接受的盐。
剂量可以根据给药方式和配剂类型以及患者的年龄、体重、敏感度和状况而定。在口服给药的情况下，有效日剂量可以在20mg-1.0g的范围。含有20mg-200mg式(I)化合物或其药物可接受的盐的剂量单位可以方便地用以满足日剂量的要求。用药量和剂量单位可以超过上述的范围。
下面的试验实施例和实施例以举例说明本发明的某些方面为目的，对本发明的范围不构成任何限制。试验实施例1抗病毒活性试验
用Sells，M.A.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.,84,1005-1009(1987)中描述的常规方法评价本发明化合物对HBV DNA复制的抑制活性。
用六个独立的培养物、以四个浓度测定下面列出的化合物的抗HBV活性：
1、2-(1，3-二硫环丁2-基亚基)丙二酸二异丙酯；
2、2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
3、2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基)-2-[N-(1，3，4-噻二唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
4、2-(1，3-二硫环丁-2基亚基)-2-[N-(2-吡啶基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
5、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
6、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(2-吡啶基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
7、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-羧基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
8、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸乙酯；
9、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(2-噻唑基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；和
10、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-(N-苄基氨基甲酰基)乙酸异丙酯。
将每个试验化合物溶解在DMSO中，浓度为7、20、67、或200μM得到试验溶液。在室温下将测定量的试验溶液加入得到装有培养基的24孔平底组织培养皿中，然后，向其中加入2.2.15细胞系。然后不间断地以日剂量用试验化合物处理所得的培养物8天。第9天处理后24小时，通过Southern印迹杂交试验分析法(Korva and Gerin，AntiviralResearch，19，55-70(1992))分析胞外HBV DNA的量。此测量结果示于表I。
在未处理的培养物(对照)中的HBV病毒DNA量为81±9pg/ml培养基。在此分析中，1.0pg胞外HBV DNA/ml培养基对应于约3×105病毒粒子/ml培养基。
表I 试验化合物 各个浓度下的HBV DNA量(pg/ml培养基) 200μM 67μM 20μM 7μM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3±1 9±1 3±1 5±1 5±1 7±2 6±1 6±2 2±1 3±1 14±2 20±1 20±3 36±3 18±3 48±5 44±3 31±1 13±2 66±3 47±5 45±4 55±6 102±15 55±3 85±13 89±11 62±2 49±4 73±15 99±14 84±5 101±9 108±19 111±10 108±10 94±16 87±13 79±6 99±9
一般认为，与对照物相比，当处理过的培养基的胞外HBV DNA量降低3倍或更多倍时，在统计学上是明显的(p＜0.05)。
如表1所示，本发明的每个化合物均表现出优异的抗HBV活性。试验实施例2毒性试验
用广泛用于评价细胞在各种病毒宿主体系，包括HSV(单纯性疱疹病毒)和HIV(人免疫缺损病毒)的生存性的常规中性红色染料吸收分析法进行本发明化合物的胞毒性试验(参见，Finter，N.B.，“Dye uptake method for assessing viral cytopathogenicity and theirapplication to interferon assays”，J.Gen Viral，5，419-427(1969))。
用六个独立的培养物、以四种试验浓度进行本化合物的毒性分析：
1、2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基)丙二酸二异丙酯；
2、2-(1，3-二硫环丁-2-基亚基)-2-[N-(1，3，4-噻二唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
3、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
4、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(2-吡啶基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯；
5、2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-(N-苄基氨基甲酰基)乙酸异丙酯。
培养用于毒性分析的细胞，用试验化合物以相同于抗病毒活性试验所用的方法(参见试验实施例1)处理这些细胞。
用分光光度计定性测定内化染料在510nm(A510)的吸收率。试验化合物的中性红色染料吸收值(％)表示为：平均A510值(±标准误差，n＝6)相对于未经处理的对照物的平均A510值(n＝9)的百分数，并用作表示相对毒性的指数。结果示于表II。
表II试验化合物 各种化合物浓度下的中性红色染料吸收率(％) 200μM 67μM 20μM 7μM 1 2 3 4 5 96±1 64±3 99±2 77±2 101±3 99±2 79±2 96±1 100±2 102±1 103±3 98±1 99±2 100±2 99±1 99±2 100±2 100±2 99±1 99±1
如表II所示，本发明化合物的毒性没有显示出随浓度的提高。这些结果表明本发明化合物的胞毒性非常低，特别在有效剂量范围内是安全的。实施例1片剂的配制
用表III列出的成分制备片剂形式的本发明药物组合物。
用聚乙烯基吡咯烷酮溶液将2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯(活性成分)，乳糖，预凝胶淀粉，十二烷基硫酸钠，交联吡咯烷酮和胶体二氧化硅的混合物制成颗粒状，通过20目的筛。所得的颗粒与硬脂酸镁混合，将混合物制成片。
表III 成分 量(mg) 活性成分 乳糖(USP) 预凝胶淀粉(USP) 聚乙烯基吡咯烷酮(USP) 交联吡咯烷酮(USP) 十二烷基硫酸钠(USP) 胶体二氧化硅(USP) 硬脂酸镁(USP) 100 80.5 50 7.5 7.5 0.75 1.25 2.5 总计 250实施例2片剂的制备
重复实施例的操作方法，除了用微晶纤维素代替预凝胶淀粉。
表IV 成分 量(mg) 活性成分 乳糖(USP) 微晶纤维素(USP) 聚乙烯基吡咯烷酮(USP) 交联吡咯烷酮(USP) 十二烷基硫酸钠(USP) 胶体二氧化硅(USP) 硬脂酸镁(USP) 100 80.5 50 7.5 7.5 0.75 1.25 2.5 总计 250实施例3胶囊的配制
用表V所列的成分制备胶囊形式的本发明药物组合物。
2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯(活性成分)，乳糖，微晶纤维素，十二烷基硫酸钠，交联吡咯烷酮和胶体二氧化硅通过20目的筛然后混合。混合物与硬脂酸镁混合并被填充在明胶硬胶囊中。
表V 成分 量(mg) 活性成分 乳糖(USP) 微晶纤维素(USP) 十二烷基硫酸钠(USP) 交联吡咯烷酮(USP) 胶体二氧化硅(USP) 硬脂酸镁(USP) 100 47.2 40 0.8 8 2 2 总计 200
实施例4胶囊的配制
重复实施例3的方法，除了用8g淀粉-甘醇酸钠代替交联吡咯烷酮。实施例5颗粒剂的配制
用表VI所列的成分制备颗粒形式的本发明药物组合物。
将聚乙烯基吡咯烷酮溶液加入到2-(1，3-二硫环戊烯-2-基亚基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]乙酸异丙酯(活性成分)，乳糖，交联吡咯烷酮，微晶纤维素，和胶体二氧化硅的混合物中然后混合。用挤压机将所得的混合物造粒，然后干燥得到颗粒。
表VI 成分 量(mg) 活性成分 乳糖(USP) 微晶纤维素(USP) 聚乙烯基吡咯烷酮(USP) 交联吡咯烷酮(USP) 胶体二氧化硅(USP) 400 335 200 30 8 5 总计 800
虽然本发明是以具体的实施方案描述的，但应认识到本发明领域的技术人员可以作出的各种改进和变化也落入由所附权利要求定义的本发明范围中。