纤维结合蛋白冻干滴剂及其制备方法 本发明涉及一种可用于治疗眼部、耳部、鼻部及宫颈部多处疾病的纤维结合蛋白冻干滴剂及其制备方法。
纤维结合蛋白(Fibronectin，简称Fn)是由 Morrison等人于1948年从低温血浆沉淀中发现的一种B 一球蛋白。1970年，Mosesson和Umflect首先从人血浆 冷沉淀中提纯，之后对其结构进行了鉴定。FN分为血浆 型和组织型，前者为二聚体，A链分子量235K，B链 230K，约工880个氨基酸残基。 A、B二链借C端S-S键相 连。正常人血浆FU平均330ug/ml，男性稍高于女性，以 可溶形式存在于血浆中。组织型为多聚体，以非溶解形 式存在于多种细胞表面及结缔组织申。血浆FN不仅是细 胞与细胞，细胞与基质连结的重要因子，而且对于促进 上皮细胞的移行、修复、维持机体组织细胞的正常结构 和功能起重要作用。此外血浆FN做为一种调理素，有促 进炎症消退，创伤愈合，改善FES宿主细胞的防御功能， 消除衰老细胞，增强伤口的修复及抗感染能力。
在临床应用方面，国內外学者应用亲和层析技术提纯患者自身血浆FN，并制成滴眼液(Nishida et al，JPn J Ophthamol 1982；26：416；郭玉华等，免疫快报1988，8：57)，成功地治愈了各种角膜上皮反复脱落、角膜溃疡和角膜炎症。国内马三科等人应用FN溶液治疗萎缩性鼻炎、化脓性中耳炎、耳膜穿孔和应用FN软膏治疗宫颈糜烂等上皮损伤性疾病也收到了较好的效果(马三科等，FN临床应用资料汇编，丹东市中心血站，1994年)。此外也有人应用FN溶液和FN软膏治疗外伤和做为皮肤保养剂，如JP05,310,592(1993)；WO9212,739(1992)；US4,973,473(1990)；JP63,267,710(1988)；WO8605,690(1985)；JP0106,205(1989)；EP592，380(1994)。但由于FN溶液极不稳定，4℃放置2周约失活40％，FN软膏4℃放置3周，检不出活性。由于剂型不稳定给临床普遍推广带来困难。用患者自身血浆制备FN滴眼液，虽然一周之内可以用完，但提取周期长(约4小时)，费用大(约千元)，同时还存在污染，患者不易接受等问题，也无法大面积推广。
本发明的目的是提供一种使用方便、安全和剂型稳定的人血浆FN(同种异体)冻干粉剂，再配以无菌溶媒，以满足眼用、耳用、鼻用、宫颈用等临床治疗需要。
本发明一种纤维结合蛋白冻干滴剂其特征在于该冻干滴剂由纤维结合蛋白冻干粉剂和溶解液组成，当使用时，现用现溶体积比为纤维结合蛋白冻干粉剂比溶解液＝0.55∶3。
上述纤维结合蛋白冻干滴剂，其特征在于纤维结合蛋白冻干粉剂含有纤维结合蛋白(FN)，磷酸盐，甘氨酸，辛酸钠，白蛋白和氯化钠，其中纤维结合蛋白(FN)占总重量的0.3-0.4，优选0.35-0.37。
上述纤维结合蛋白冻干粉剂含水量小于其重量的1.2-1.8％，优选1.5％。
上述纤维结合蛋白冻干滴剂，其特征在于溶解液含有注射用水，磷酸盐，透明质酸钠，和用来调节渗透压的氯化钠。溶解液中各成分(重量比)如下注射用水 98.1_98.8磷酸盐 0.75_1.0透明质酸钠 0.04_0.055氯化钠 0.70_0.085
本发明的一种纤维结合蛋白冻干滴剂，其中的纤维结合蛋白冻干粉剂，依次按照下述过程制备；(1)冷沉淀制备
取新鲜血液，立即置于冰箱内速冻，保存1-2天，检验合格取出，放在水浴中快速溶化，然后放于已提前予冷至0℃的离心机中分离，取冷沉淀备用。(2)将上述冷沉淀溶于相同体积的氯化钠—柠檬酸钠缓冲液中，控制蛋白质浓度，PH为7.5_8，50_60℃热处理8_15分钟，冷却至15_25℃，离心，分出上清液；(3)向上清液中加入PEG4000，PH5.0_6.0，离心，去上清液，留沉淀物；(4)将上述沉淀物溶于氯化钠_柠檬酸钠缓冲液中，加入甘氨酸，PH6.00_7.50，离心，分出上清液；(5)向上清液中加入氯化钠，PH5.0_7.0，搅拌30-60分钟，4_6℃，离心，将沉淀物溶于氯化钠—柠檬酸钠缓冲液中，控制FN浓度，加入辛酸钠和甘氨酸，在60℃加热10小时，灭活病毒；(6)将上述溶液冷却至常温，超滤去小分子，将浓缩液加至磷酸盐缓冲液中，控制FN浓度在规定值，加入规定量的白蛋白和甘氨酸，用氯化钠调至等渗，超滤，留滤液，罐装，冷冻，干燥，得本发明冻干滴剂之纤维结合蛋白冻干粉剂。上述纤维结合蛋白冻干粉剂罐装每支0.55ml，其FN含量为2mg；上述辛酸钠，甘氨酸以及白蛋白是作为稳定剂。
本发明的一种纤维结合蛋白冻干粉剂，其中的溶解液依次按照下述过程制备；
取无水磷酸盐溶于注射用水中，加入透明质酸钠，搅拌，使其溶解，用氯化钠调渗透压与0.75％氯化钠溶液相当，除菌，超滤，罐装，得本发明冻干滴剂之溶解液。
本发明的纤维结合蛋白冻干滴剂，其特征在于制备溶解液过程中使用的无水磷酸盐优选无水磷酸二氢钠或无水磷酸氢钠。
上述的透明质酸钠是作为增粘剂；
用本发明的纤维结合蛋白冻干滴剂主要治疗如眼部感染，角膜术后，角膜溃疡，干眼病等眼部疾病。化脓性中耳炎及耳膜穿孔等耳部疾病，以及萎缩性鼻炎，宫颈糜烂等上皮损伤性疾病。
上述新鲜血浆可是健康人地或是动物的；
下面结合实施例详细说明本发明；
实施例1
制取冷沉淀
取40L(200袋)新鲜健康人血浆，立即置于-80℃冰箱内，在于-30℃冰箱内保存48小时，经全项检验并二次复核合格后取出，放在4_5℃水浴中快速融化(2小时内)，然后放于已提前预冷至0℃的离心机中离心15分钟(4500rpm)，分出冷沉淀，备用。实施例2制备纤维结合蛋白冻干粉剂
将20ml冷沉淀(AHF，丹东市中心血站产品)溶于20ml0.06M的氯化钠—柠檬酸钠缓中液中(PH7.0)，55℃热处理2小时，冷却至20℃，离心(2000rpm)15分钟，分出上清液，向上清液中加入PGE—4000，使含量达10％(W/L)，PH5-6，离心，将沉淀物溶于0.06M氯化钠—柠檬酸钠缓冲液20ml中，加入甘氨酸，使其浓度达2.3M，PH6.5-7.0，离心，分出上清液，并向其中加入等量的3M氯化钠—柠檬酸钠缓冲液10ml中，控制FN浓度为4mg/ml以下，加入辛酸钠和甘氨酸，使其浓度分别达0.03M和0.5M，60℃加热10小时，冷却至20℃，用Amico TCT-10超滤装置(PM-30膜)除去小于20,000道尔顿小分子，然后将上述浓缩液加至0.05M磷酸盐缓冲液中(PH7.2)，FN浓度为4mg/ml，按每毫升溶液加0.01g人白蛋白(上海生物制品研究所产品)和0.01g甘氨酸，经0，22um除菌器，过滤，无菌分装，冷冻干燥，并控制最终产品含水量1.5％以下。实施例3制备溶解液
取无水磷酸二氢钠和磷酸氢钠各3.2g和5，55g，溶于1000ml注射用水中，加入0.5g透明质酸钠(Pharmacia产品，纯度95％)，搅拌，使其溶解，用氯化钠调渗透压与0.75％氯化钠溶液相当，经0.22um除菌器除菌，过滤，无菌罐装。
按照本发明制备的纤维结合蛋白冻干滴剂有效期为一年(溶解)，应在4_6℃保存，溶解后15天内用完。治疗眼病每日4_6次，每次2_3滴。
本发明纤维结合蛋白冻干滴剂中所含的FN是人或动物蛋白，无任何刺激及毒副作用。
下边列出使用本发明纤维结合蛋白冻干滴剂的临床效果；
下述是丹东市第一医院眼科用FN滴眼液治疗角膜损伤临床观察良告；
1992年10月8日1994年l0月15日应用FN滴眼液治疗角膜上皮损伤和角膜炎等，疗效满意。
一、治疗病种及例数
各种角膜炎症 50例
角膜溃疡 15例
各种角膜损伤 25例
二、治疗方法：
FN滴眼液(2mg/3ml)，每天滴4次每次数1-2滴，
3周为一疗程。
三、疗效判定标准：
角膜上皮溃疡，片状或点状上皮缺损治愈，染色阴转或仅偶见几个上皮状染色，自觉症状好转为显效；经治疗上皮缺损明显减少或缩小，自觉症状好转为有效。如连续给予FN滴眼液，症状毫无改善，或加重恶化者为无效。
四、观察方法
初诊时记录病情，以后每1天检查一次，记录上皮缺损变化及自觉证状，每3周一个疗程。
五、临床结果病 种 例数 显效 有效 无效 总有效率各种角膜炎症 50 22 14 14 71.80％角 膜 溃 疡 15 8 5 2 87.5％各种角膜损伤 25 12 8 5 80.2％六、副作用：全例患者均未发现副作用。
由上述报告知道本发明纤维结合蛋白冻干滴剂具有促进炎症消退，创伤愈合，改善细胞功能和改善FES宿主细胞的防御功能，增强吞噬细胞的活性，增强伤口的修复和抗感染能力，疗效显著，其不足之处是其水溶液的稳定性差。