杀真菌组合物及其应用 本发明涉及新的杀真菌活性化合物，制备该化合物的方法，能产生所述化合物的微生物，含有所述化合物的组合物，和所述组合物在控制有价值的作物，动物，包括鸟类和哺乳动物中的真菌，及在木材和原木、涂料、化妆品、食物和饲料的防腐方面的应用。
多年来，已知各种不同的微生物可产生具有生物活性的代谢物，其可作为杀生物剂用于对抗疾病和害虫。
尤其已知弯孢属的某些菌种可产生不同的具有生物活性的代谢物，如植物毒素。然而，已知这些代谢物中没有一种是杀真菌剂。发现弯孢(C.lunata(Wakk)Boed)可产生至少两种植物毒素。它们甚至在经高度稀释后仍能在植物叶子上造成枯斑。(F.Macri and A Vianello，physiological Plant Pathology8：325-331，1976)。该毒素系植物毒素并且是非宿主特异性的。已从苍白弯孢(C.pallescensBoedijn)的培养滤液中和从受该菌种侵袭的染病宿主的叶子上分离出宿主特异性毒素(Olufolaji，Cryp-togamie Mycol 7(4)：335-342，1986)。这些毒性物质使玉米植株出现黄化斑。此后它们变得枯萎，类似于由苍白弯孢所引起的病害的体内症状。
弯孢霉素，一种大环代谢物，已被从弯孢菌种中(O.C.Musgrave，J.Chem.Soc.，1956，4301)和从弯孢中(Coombe et al.Aust.J.Chem.21：783，1968)分离出来。该化合物的分子式为C16H20O5(分子量292.3)，如下式1所示：
分离出的粗弯孢霉素为无色或淡黄褐色结晶。
弯孢霉素和弯孢属地粗滤液都没有抗细菌活性(抗枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、和金黄色葡萄球菌)或抗真菌活性(用指状青霉进行的孢子萌发试验)。
以上化合物中没有一种能用于对抗植物病虫害，因为它们是强植物毒素。
虽然在鉴定和开发用于对抗各种发生在具有农艺学重要性的植物和动物中的病虫害的生物学杀虫剂领域中已取得进步，但目前应用的多数杀虫剂仍为合成化合物，它们在自然界难以分解并具有广谱活性。
近十年来，人们对这类杀虫剂对环境和农田周围的生态系统的影响仍日益关注，因而，急需具有更强的特异性活性并且在自然环境中易于降解的杀虫剂。
在1990年3月28日公开的欧洲专利申请No.EP360760(Sandoz AG)中已揭示了许多与本发明所述化合物相关的化合物。据公开这些化合物由壳针孢属真菌制得，其在动物体内具有重要的药理学特性，例如抗真菌活性，抵抗可造成全身病害的酵母和酵母样菌种。该公开只提及一个抵抗假丝酵母属的试验，未提及对82种列举的化合物中的哪些化合物试验了这一活性，但指出了最优选的化合物可由下式表示：
cyclo-[Pec-MeVal-Val-MeAsp-MeIle-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact]
(实施例1，第一种化合物)
如上所述弯孢霉菌属的已知代谢物都具有强植物毒性活性，但现已令人惊奇地发现属于所述属的真菌也能产生具有强的抗真菌活性，并且基本上无植物毒性活性的代谢物。
第一方面，本发明涉及一组新的化合物，包括总组成为I的化合物，及其衍生物，
乳酸(1)，甘氨酸(1)，缬氨酸(4)，
异亮氨酸(1)，六氢吡啶羧酸(1)，
天冬氨酸(1)，酪氨酸(1) (I)其中每个氨基酸残基可分别以L-型或D-型存在，圆括号中的数字表示各基团的存在数。
在这一方面，本发明还涉及组成为C56H89N9O14的化合物及其衍生物。
具体地讲，本发明涉及总组成为II的化合物及其衍生物，
乳酸(1)，甘氨酸(1)，缬氨酸(1)，
N-Me-缬氨酸(3)，N-Me-异亮氨
酸(1)，六氢吡啶羧酸(1)，N-Me-
天冬氨酸(1)，O-Me-酪氨酸(1) (II)其中每个氨基酸残基可分别以L-型或D-型存在，圆括号中的数字表示各基团的存在数。
本发明还涉及式III和式IV的化合物及其衍生物，
(III)cyclo-[Pec-MeAsp-MeVal-Val-MeVal-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact] (III)
(IV)cyclo-[Pec-MeVal-Val- MeAsp-MeVal- MeIle-Gly- MeVal-TyrOMe-D-Lact] (IV)，其中每个氨基酸残基和乳糖残基可分别以L-型或D-型存在。最优选的是所有氨基酸残基均以L-型存在且乳糖残基以D-型存在的化合物。
第二方面，本发明涉及用于生产本发明的新化合物的方法。这些方法包括特定微生物的使用以及全合成或半合成生产所述化合物的化学方法。
第三方面，本发明涉及包括本发明的新化合物与合适的赋形剂，如稀释剂、载体等结合的杀真菌组合物。
本发明还涉及能产生本发明的化合物的微生物作为杀真菌组合物的应用。
将本发明的新化合物与已知的杀生物剂组合制成新的组合物也包括在本发明的范围内。
此外，第四方面，本发明涉及通过将含有本发明化合物的组合物施用于受侵染的部位而对抗植物病害的方法。
第五方面，本发明涉及本发明的新化合物在抵抗或控制植物病害，特别是真菌侵袭方面的应用。
本发明还涉及新化合物作为防腐剂和/或添加剂以控制食物和饲料、原木和木材、涂料、生长培养基、化妆品等中的真菌的应用。
最后，本发明涉及一种分离出的弯孢菌种(CMICCNo.337159)的纯培养物。
为了详细描述本发明，弯孢种真菌菌株(CMICCNo.337159)已保藏于CommonwealthMycological Institute CultureCollection(CMICC)(Ferry Lane，Kew，Surrey TW93AF，England)，保藏日如下。CMICC是布达佩斯条约的国际保藏单位，可按所述条约第9条的规定进行永久保藏。
保藏日 1990年2月6日
保藏者参考号 33177
CMICC保藏号CMICC No.337159
CMICC337159属于半知菌纲(Deuteromycetes)，丝孢亚纲(Hyphomycetidae)，暗色孢科。该真菌是弯孢属的一个新种。
下面参照附图进一步详细描述本发明。
图1是本发明的新化合物的稳定性/活性与温度和PH的关系示意图。
图2，3和4示出了所分离的本发明化合物分别在CDCl3，DMSO-d6和CD3OD中的400MHz 1H-NMR谱。
图5示出了所分离的本发明化合物在CDCl3中的100.6MHz 13C-NMR谱。
图6示出了所分离的本发明化合物在KBr中的红外(IR)光谱。
图7示出了甲基化衍生物在KBr中的IR光谱。
图8，9和10示出了将本发明化合物分别施用于被灰葡萄孢感染的草莓、葡萄和番茄的结果。
如上所示，第一方面，本发明涉及总组成为I的新化合物及其衍生物，
乳酸(1)，甘氨酸(1)，缬氨酸(4)，
异亮氨酸(1)，六氢吡啶羧酸(1)，
天冬氨酸(1)，酪氨酸(1) (I)其中每个氨基酸残基可分别以L-型或D-型存在，圆括号中的数字表示各基团的存在数。
在这一方面，本发明进一步包括还包含一内酯环的化合物及其衍生物。
而且，本发明包括组成为C56H89N9O14的化合物及其衍生物。
在这一方面，以上特别提到的衍生物包括已被烷基化，酰基化、羟基化、糖基化、卤化、还原、氧化、水解或酯化的化合物。
具体地讲，本发明涉及总组成为II的化合物及其衍生物，
乳酸(1)，甘氨酸(1)，缬氨酸(1)，
N-Me-缬氨酸(3)，N-Me-
异亮氨酸(1)，六氢吡啶羧酸(1)，
N-Me-天冬氨酸(1)，
O-Me-酪氨酸(1) (II)其中每个氨基酸残基可分别以L-型或D-型存在，圆括号中的数字表示各基团的存在数。
作为一个具体实例，本发明涉及式III和式IV的化合物及其衍生物，
(III)cyclo-[Pec-MeAsp-MeVal-Val-MeVal-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact] (III)
(IV)cyclo-[Pec-MeVal-Val-MeAsp-MeVal-MeIle-Gly-MeVal-TyrOMe-D-Lact] (IV)，其中每个氨基酸残基和乳酸残基可分别以L-型或D-型存在。最优选的是其中所有氨基酸残基均以L-型存在且乳酸残基以D-型存在的化合物。
式III和式IV的化合物作为代谢物从弯孢属的一个新种，弯孢菌种(CMICC No.337159)中分离出来。
这类有机结构如式III和式IV所示的化合物是新的。最相关的对比文献是上面讨论的EP360760。EP360760的化合物与本发明化合物的主要区别在于它们总是包含两个相邻的异亮氨酸残基。
虽然与本发明的化合物密切相关的化合物公开于EP360760中，但不会考虑将其用于农艺学。这是由于它们的高毒性(约100mg/kg p.o.)和低的抗真菌活性(剂量为25-300mg/kg，每日剂量为300-3000mg)，如在EP360760第47-49页所举例说明的对假丝酵母的活性。
此外，EP360760只指出了相关化合物在药物上的应用。因而根本不能从EP360760推知本发明的化合物在农艺学应用方面的令人惊奇的特异性和活性。
第二方面，本发明涉及组成I的新化合物的生产方法。
式III或式IV的化合物可在合适的营养培养基上，在下述条件下对属于弯孢属的真菌菌株，特别是弯孢菌种(CMICC337159)的真菌菌株进行需氧培养，然后从生物量和发酵培养基中回收活性组分而制得的。
此后，天然代谢物可用化学方法修饰以获得其各种不同的衍生物。为了改善代谢物的某些特性，例如其在含水培养基中的溶解性、其疏水性、亲水性、稳定性、特异性等，可生产不同的衍生物。
可用易得到的起始物，通过众所周知的化学合成方法制备本发明的化合物。
相关化合物的衍生物及生产这类衍生物的方法在EP360760中已公开，在此作为参考。
特定类型的式III和式IV化合物的衍生物是其中内酯环已打开的化合物。
一组衍生物是组成I，II，III或IV的化合物，其中一个或几个羟基和/或氨基已被一个或多个糖基糖基化。
另一组包括组成I，II，III或IV的化合物，其中一个或几个羟基和/或氨基已被有机酸酰化为酯/酰胺基。
再一组衍生物是组成I，II，III或IV的化合物，其中一个或几个羟基和/或氨基已被烷基化为烷基醚/胺。
再一组衍生物是组成I，II，III或IV的化合物，其中一个或几个基团已被卤素所取代，成为其中一个或多个基团为卤素的化合物。
再一组衍生物是组成I，II，III或IV的化合物，其中一个或几个基团已通过一个或多个基团的还原而在所得化合物中被改变。
再一组衍生物是组成I，II，III或IV的化合物，其中一个或几个基团已通过一个或多个基团的氧化而在所得化合物中被改变。
再一组衍生物是组成I，II，III或IV的化合物，其中一个或几个基团已通过一个或多个基团的水解而在所得化合物中被改变。
虽然下面讨论的本发明主要涉及特定的菌种CMICC337159，但本领域的技术人员都知道微生物的特性可被自然地和人为地改变。因此所有属于弯孢属的菌株，包括变异体、重组体和突变体，无论是经自然选择而得到，还是通过突变剂的作用如电离辐射或紫外线照射或是通过化学诱变剂如亚硝基胍的作用而产生，都包括在本发明中。
众所周知，真菌能产生具有相同或相似活性，但化学结构上略有差别的密切相关的代谢物(参见EP360760，其中三种相关的化合物是由CMICC337159产生的)。因此本发明也意欲包括这类由CMICC337159产生的密切相关的化合物。
依据诸如欲对抗其中的真菌的作物，环境条件或其它因素等情况，本发明的组合物除含有所述的本发明的杀真菌活性化合物之外还可含有其他活性成分，例如其他杀生物剂，如杀真菌剂、杀虫剂、除莠剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、杀螨剂，或植物营养素，植物生长调节剂或肥料。
可与本发明的活性化合物组合的其他杀真菌剂的实例特别包括麦角甾醇生物合成抑制剂(“EBIs”)。这些EBIs一般为咪唑或三唑衍生物，其实例包括通用名称如下的化合物：prochloraz，triadimefon，propiconazole，diclobutrazol，triadiminol，flusilazole，flutriafol，myclobutanil，penconazole，quinconazole，imazalil和diniconazole。非吡咯EBIs的实例包括nuarimol，fenarimol，fenpropimorph，tridemorph)和fenpropidine。可与本发明的酶制剂组合的其它杀真菌剂包括酰替苯胺，例如萎锈灵，metalaxyl，furalaxyl，ofurace，benalaxyl，mepronil，flutolanil，pency-curon和oxadixyl；苯并咪唑，例如苯菌灵和多菌灵；氨基甲酸酯，例如，代森锰，代森锰锌和propamo-carb；二甲酰亚胺，例如iprodione，vin-clozolin和procymidone；亚磷衍生物，例如定菌灵，tolclofos-methyl和fosetylaluminum；和混杂化合物，包括二硫代氨基甲酸酯，双二硫代氨基甲酸酯，咪唑，三唑，邻苯二甲腈，多卤烷基硫代化合物，iminoctadine，双胍盐，氯硝胺，百菌清，pyrifexox，乙菌定，cymoxanil，苯基吡咯，thiocyofenes，嘧啶类内吸杀菌剂，和敌菌灵。
为了对抗动物包括人体内的真菌，本发明的组合物通常应包括所述的本发明的活性化合物以及生理上相容的载体或稀释剂，但它也可与其他活性成分如抗菌素组合。
以本发明的杀真菌活性化合物作为其活性成分的本发明杀真菌组合物，可通过下述方法配制以用于农艺和/或园艺领域：将活性成分与合适的惰性相容载体或稀释剂混合，得到在农药组合物中通常使用类型的组合物，例如可润湿的粉末，可乳化浓缩物，浓缩的乳液，颗粒制剂，水溶性粉末，藻酸盐，黄原胶和/或气溶胶。作为固体载体，可提到的有膨润土，硅藻土，磷灰石，石膏，滑石，叶蜡石，蛭石，地壳和粘土。为了制备均匀而稳定的制剂还可加入表面活性剂。
本发明组合物中的稀释剂或载体可以是固体或液体，根据需要，可与表面活性剂，例如分散剂、乳化剂或润湿剂结合。合适的表面活性剂包括阴离子化合物，如羧酸盐，例如长链脂肪酸的金属羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物形成的单酯或二酯或这种酯的盐；脂肪醇硫酸盐如十二烷基硫酸钠，十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐如烷基-苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐；例如丁基-萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合物的盐；或多配磺酸盐如酰胺磺酸盐，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物或二烷基磺基琥珀酸盐，例如二辛基琥珀酸的磺酸钠。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酰胺或脂肪烷基取代的苯酚或脂肪烯基取代的苯酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇酯，例如脱水山梨醇脂肪酸酯，这样的酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔属二醇如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或乙氧基化炔属二醇。
阳离子表面活性剂的实例包括，例如，脂族单胺、二胺或多胺的乙酸盐，环烷酸盐或油酸盐；含氧胺如氧化胺或聚氧乙烯烷基胺；通过羧酸与二胺或多胺的缩合所制得的酰胺连接的胺；或季铵盐。
本发明的组合物可采取本领域已知的适于农药配制的任何形式，例如溶液、分散液、含水乳液，撒粉，拌种剂、可分散粉末，可乳化浓缩物或颗粒。而且，它可为适于直接应用的形式或为浓缩物或初级组合物，应用前需用适量的水或其他稀释剂稀释。
可乳化的浓缩物包括溶于可与水混溶的溶剂的活性成分，在乳化剂存在下用水将其制成乳液。
撒粉包括与固体粉末稀释剂，例如，高岭土充分混合和被磨细的活性成分。
颗粒状固体包括与稀释剂混合的活性成分，所用稀释剂与在撒粉中所用者相似，但该混合物用已知方法制粒。另外，它包括吸附于成粒状稀释剂例如漂白土，硅镁土或石灰渣上的活性成分。
可润湿粉末，颗粒通常包括与合适的活性剂和惰性粉末稀释剂如陶土混合的活性成分。
另一种合适的浓缩物是可流动悬浮浓缩物，它是通过将活性成分与水或其它液体、润湿剂和悬浮剂一起研磨后形成的。
为了控制植物中的真菌，预计本发明的活性化合物可按约0.001μg/ml-750mg/ml、优选1μg/ml-10mg/ml的浓度施用。
为了抵抗动物(包括哺乳动物)中的真菌，可通过将本发明的化合物与现有技术中已知的用于常规配方中的或用作可应用的内吸杀虫剂的合适的惰性和相容性载体混合而配制出本发明的活性化合物。
根据配方的类型以及应用的领域，这里所述的本发明组合物中本发明活性化合物的浓度可在很宽的范围内变化。
为了控制动物中的真菌，预计本发明的活性化合物可按约0.001μg/ml-10mg/ml、优选0.1μg/ml-1mg/ml的浓度施用。
本发明所涉及的第四个方面是抵抗植物或动物(包括哺乳动物)中真菌的方法，其中杀真菌有效量的本发明活性化合物被施用于欲处理的区域。
对于这一方面，可将用于农艺或园艺的本发明组合物施用于欲处理的区域，它既可以作为苗前处理而直接施用于土壤，以对种子表面进行敷裹，也可以作为苗后处理而施用于植物的叶片或果实。根据作物和环境的不同，该处理可一直延续至需要控制其中真菌的植物出现种子或果实为止。
可在植物上出现真菌时或作为一种保护性措施在植物上出现真菌前，通过喷雾或撒粉而将本发明的活性制剂或组合物直接施用于植物。在这两种情况下，优选的施用方式是叶面喷雾。一般来说，在植物生长的早期获得良好的真菌控制效果非常重要，因为这是植物可能遭受最严重损害的时期。如果认为需要的话，喷雾剂或粉剂通常可含有苗前或苗后除草剂、其它杀虫剂的混合物、植物生长调节剂或肥料。
有时，可在种植之前或种植过程中通过将根浸入合适的液体或固体组合物中而处理植物的根。当将本发明的活性制剂直接施用于植物时，适宜的施用率为0.001-50kg/公顷，优选0.05-5kg/公顷。
在本发明的方法中，单独或与常规杀生物剂结合的本发明活性制剂也可被施用于种子或植物的产地。因此，可在钻孔之前、同时或之后将该制剂直接施用于土壤，以便土壤中存在的活性成分能够控制可能侵袭种子的真菌的生长。
可按相应于约1g-100kg杀真菌活性化合物/公顷的量施用组合物。
当直接处理土壤时，可将活性制剂(单独或与常规杀生物剂混合)按使其与土壤均匀混合的任何方式施用，例如喷雾、播撒固体状颗粒或将活性成分在钻孔时与种子插入同一孔中而进行施用。合适的施用率为0.01-5kg/公顷，更优选的是0.05-5kg/公顷。
单独或与常规杀真菌剂结合后施用于植物时，本发明组合物中杀真菌活性化合物的浓度在0.001-30％(重量)的范围内较好，在0.01-3.0％(重量)范围内更好。初级组合物中活性化合物的量可在很宽的范围内变化，例如，可为组合物重量的约5-95％。
当与本发明的组合物混合应用于植物时，其它杀真菌活性成分的浓度在0.001-50％(重量)范围内较好，在0.01-10％(重量)范围内更好。在初级组合物中，其它活性成分的量可在很宽的范围内变化，例如可为组合物重量的5-80％。
尽管针对控制植物和动物真菌对本发明进行了详细叙述，但仍然可以预想到，通过将本发明的杀真菌活性化合物加到木材防腐和/或浸渍组合物中而可将其用于木材防腐。另外，也可将本发明的活性化合物用作涂料中的杀真菌剂和防腐剂--既可防止真菌在涂料保存期间的生长也可防止真菌在所涂物体如涂过的墙壁上生长。
由于其低毒性，本发明的杀真菌活性化合物还可用于化妆品、食品和饲料以及化合物可在任何热炼加工后加入的其它物品的防腐。
另外，也可将本发明的杀真菌活性化合物作为杀真菌添加剂应用到各种微生物(如大肠杆菌、铜绿假单孢菌、Serpulalacrymans和枝孢菌种)的生长培养基中。
对菌株的描述
菌落：灰色，棉花状，有时成带。
分生孢子梗：单个至聚集，简单，从直至弯曲，膝状弯曲向上。
分生孢子：顶侧生，成熟时有2-4个隔膜，光滑，但在大的中心细胞上多疣，大部分弯曲，单色或中心细胞比其它细胞具有更多色素沉着，大部分长20-39μm，且最宽部分厚11-14μm。
象C.verruciformis一样，CMICC337159为4分隔，但与其不同的是分生孢子的大小。C.verruciformis分生孢子的大小为16-26μm×8-12μm。CMICC337159为弯孢属中的新种。它属于半知菌纲，丝孢亚纲，暗色孢科。
菌株的培养
可在含有以下成分(克/升)的琼脂斜面上培养真菌：
醇母浸膏 4.0
磷酸二氢钾 1.0
七水合硫酸镁 0.1
葡萄糖 15
Bacto(Difco
Laboratories，
Detroit，USA)琼脂 20
将这一基质于121℃高压灭菌20-40分钟，该培养基以下称作YPG琼脂。斜面含有12ml YPG琼脂，将其接种后于20-25℃培养7天或更长时间。
杀真菌剂的生产
利用软化水和以下成分(g/l)可配制用于摇瓶培养的基质：
酵母浸膏 4.0
磷酸二氢钾 1.0
七水合硫酸镁 0.1
葡萄糖 15
Pluronic L61
(BASF，Federal
Republic of
Germany) 0.1
于121℃灭菌20分钟。将来源于前面所述接种了CMICC337159的YPG琼脂斜面的106孢子接种装有100ml基质的500ml锥瓶。该锥瓶于25℃以230rpm振荡3-7天，然后离心发酵肉汤。从菌丝体中分离出含有杀真菌剂的上清液。分析菌丝体和上清液二者的杀真菌活性。
也可按照熟知的方法在表面培养物中生产杀真菌剂。
也可在含有其它可被微生物同化的碳源和氮源以及通常低水平的无机盐的培养基中进行发酵。另外，尽管当使用复合碳源和氮源时它们通常以复合物形式存在，培养基中仍可补充微量金属。
化合物的提取
用High Flow Supercel对培养液进行圆筒过滤以作为预涂布。向滤液中加入20g/l XAD-8，并将混合物于5℃搅拌16小时。
然后过滤掉树脂XAD-8，用10个柱床体积的25％v/v乙醇漂洗并搅拌30分钟。首先用2×3体积的60％乙醇(于10mM磷酸盐中，pH7.0)洗脱活性，并搅拌60分钟。其余活性用2×3体积80％v/v乙醇(于10mM磷酸盐中，pH7.0)洗脱并搅拌60分钟。合并洗脱液，并于低于40℃的温度下通过真空蒸发浓缩至1/5体积。
将3.6升浓缩过的洗脱液进一步浓缩至750ml。然后离心浓缩物，并弃去沉淀。上清液用765ml乙酸乙酯萃取两次。然后冷冻合并后的乙酸乙酯相以除去水。
通过真空蒸发浓缩无水提取物至20ml，然后加至120ml乙腈。通过真空蒸发进一步浓缩至25ml后，加至70ml去离子水和70ml乙醇中，并真空蒸发至轻微混浊。然后将该溶液置于冰箱中结晶。4天后，用去离子水洗涤晶体并冻干。
从而得到1克晶体。
为简便起见，式IV化合物以下命名为BK202。
温度和pH稳定性
步骤：在图1所示pH下，将化合物BK202溶于缓冲液，然后于25-55℃放置16小时。在pH2.5-7时所用的缓冲液为磷酸盐-柠檬酸盐(T.C.McIlvaine，J.Biol.Chem.49，183(1982))，在pH7-9.5时，所用缓冲液为TRIS0.05M。16小时后，于0.45μm膜过滤器上过滤样品，然后通过HPLC法进行分析。
图1显示了在各种温度下残余活性与pH值之间的关系。从中可以看出，本发明式IV化合物在pH7时显示出最佳稳定性，该稳定性似乎不受温度影响，而当pH值在8以上时稳定性迅速下降。除25℃外，当pH值低于7时稳定性缓慢下降，而在25℃外，当pH值低于7时稳稳性缓慢下降，而在25℃时稳定性似乎迅速下降。但是，这可能是由于实验误差造成的。
分析--HPLC法
柱：Spherisorb Hexyl 5μm，140mm×4.6mm
流速：1.5ml/分钟
检测：220nm和210nm
洗脱液：55％乙腈+0.1％三氟乙酸
样品：10μl
保留时间：约6.3分钟
物理和化学性质
通过前面所述的分离步骤从乙醇水溶液中结晶物质后得到具有以下理化性质的白色晶体(于80℃干燥2小时并于无水硅石上的真空干燥器中过夜保存)。
1.物理性质
性状：无色晶体
MP：194-195℃
[α]D21(C＝0.4，MeOH)：205°
元素分析(C56H89N9O14·H2O)
实测值 C：59.44
H：8.14
N：10.89
计算值 C：59.50
H：8.11
N：11.15
从甲醇中结晶物质后得到具有以下理化性质的无水白色晶体(于80℃干燥2小时，并在无水硅石上的真空干燥器中过夜保存)。
1.物理性质
性状：无色晶体
MP：210-212℃
[α]D21(C＝0.4，MeOH)：-227°
元素分析(C56H89N9O14)
实测值 C：60.11
H：8.00
N：11.28
计算值 C：60.48
H：8.06
N：11.33
质谱(FAB) MH+1112.6
2.化学性质
总酸水解(6NHCl，18-24小时，110℃)产生下列α-氨基酸和羟基酸(通过三氟乙基-正丁基酯衍生物的气相色谱/质谱分析测得，括号中的数字表示每种氨基酸出现的数目)。
乳酸(1) C3H4O2
甘氨酸(1) C2H3NO
缬氨酸(1) C5H9NO
N-Me-缬氨酸(3) C6H11NO
N-Me-异亮氨酸(1) C7H13NO
六氢吡啶羧酸(1) C6H9NO
N-Me-天冬氨酸(1) C5H7NO3
O-Me-酪氨酸(1) C10H11NO2
C56H89N9O14
本发明化合物BK202对水合茚三酮试验呈阴性，不含可被乙酰化的XH官能团(乙酸酐/吡啶，24小时，室温)而具有一个游离羧基，通过用重氮甲烷处理后它能被酯化为相应的一甲基酯BK202-Me(Cf-PDMS，MH+1126.5)。
本发明化合物BK202含有内酯键(IR1736cm-1)。通过温和的碱水解(0.1N NaOH；0.5小时，室温)，该内酯键可被打开，产生开环衍生物BK202-OH。用重氮甲烷处理后BK202-OH可变为相应的二甲基酯BK202Me2(Cf-PDMS，MH+1158.4)
光谱数据
BK202
1H-NMR：由于多种构象体的共存而导致的光谱的复杂性，目前只完成了表1所示的部分排布。
表1
1H-NMR光谱的部分排布(图2)
与TMS相关的主要构象物的化学位移值(多重性(d＝双峰，t＝三峰，dd＝双双峰，q＝四峰，m＝多重峰，br＝宽峰)，J-Hz值)残基 NH α-H β-H γ-H 其他O-MeTyr 7.50 5.20 3.25 ---- 7.00(2H，d，8)
(d，10) (m) (2H，m) 6.70(2H，d，8)Val 7.00 4.55 2.10 0.80，0.89 ----
(d，10) (t，10) (m) (2Me，d，7)Gly 7.08 4.02 ---- ---- ----
(br) (dd，6/18)NMe-Val ---- 5.19 2.37 0.88，0.98 ----
(d，11) (m) (2Me，d，7)NMe-Val ---- 4.31 2.43 0.89，1.06 ----
(d，10) (m) (2Me，d，7)NMe-Val ---- 4.74 2.13 0.68，？ ----
(d，10) (m) (Me，d，7)Lac ---- 5.47 1.40 ---- ----
(q，7) (Me，d，7)
1H-NMR是作为原光谱示于图2-4中。(图2、3和4：分别于CDCl3、DMSO-d6和CD3OD中的400MHz谱)。 13C-NMR：100.6MHz(于CDCl3中)(图5)
IR：KBr(图6)
BK202的衍生物
BK202-Me
IR：KBr(图7)
生物检测
将10个灰葡萄孢的孢子加到包括以下成分的50ml稀盐中：
磷酸氢铵 66mg
磷酸二氢钾 68mg
磷酸氢二钾 87mg
二水氯化钙 7.4mg
六水氯化镁 10mg
接种前，用蒸馏水将盐溶液加到1升并于121℃灭菌20分钟。
在琼脂保持液体状态而对孢子无任何损害的30℃-45℃范围内有利于葡萄孢属孢子存活的温度下，将该盐溶液与50mlYPG琼脂混合。将12ml该混合液倒入9cm陪氏平皿中让其固化。在琼脂中打出1-5个直径4mm的孔，并向每孔中倒入15μl培养肉汤。
将陪氏平皿于20-25℃培养2天。孔周围明显的非生长区的出现说明有杀真菌剂的存在--该区越大，杀真菌作用越强。在前述条件下的CMICC337159的上清液产生一个相当扩散的区，直径为40mm。在立体显微镜下，可以看出真菌的存在，但其正常生长被阻止。在光学显微镜下，菌丝体以大的泡囊出现，揭示了一种特定的作用方式。
哺乳动物致病性
当将含有杀真菌剂、活孢子和菌丝体的培养肉汤按每千克体重20ml的量对小鼠进行腹膜注射时，未显示出任何作用。该肉汤含有约4.5×107活孢子数/ml。
毒理学
在以下的试验中，利用晶体形式的式IV化合物，对BK202的毒性进行了研究。
--小鼠中的急性口服和静脉注射毒性，和
--Ames斑点试验和皮肤刺激(Skintex)的体外测式。
当活性成分是以悬浮液形式对动物给药时，其剂量不超过1600mg/kg；当以溶液形式在尾部进行静脉给药时，其剂量不超过13mg/kg。
根据以上试验值测出BK202的IC50值为：
ATP＞10μg/ml；
化学发光＞10μg/ml。
最后的结论是，BK202在所进行的试验中未显示出毒性，而且，在Skintex试验中BK202可能造成的刺激最低。
杀真菌活性
进行实验以测定式IV化合物对各种真菌的效力。将活性成分溶于60％乙醇中并加到冷却的马铃薯葡糖琼脂中，分别得到25、5、1、0.2、0.04和0.0016μg活性成分/ml的终浓度。对照平皿中不含活性成分。
将10ml琼脂培养基倒入9cm陪氏平皿中，并用用于试验的真菌分离物的有效成长的菌丝体接种每种浓度的培养基。在分离物的最佳生长温度下培养平皿3-6天，然后按毫米测定生长并与对照进行比较。
试验分离物包括了卵菌纲、子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲和接合菌纲在内的各种真菌。
结果发现，BK202对属于子囊菌和半知菌种的真菌的杀菌活性最强。对以下真菌尤其有效：
子囊菌纲：黑星菌属，如苹果黑星菌
核盘菌属，如核盘菌
链核盘菌属，如果生链核盘菌
曲霉属，如烟曲霉
青霉属，如指状青霉
半知菌纲：葡萄孢属，如灰葡萄孢
壳二孢属，如豌豆壳二孢
核腔菌属，如圆核腔菌
尾孢属，如菾菜生尾孢(弱)
茎点霉属，如P.sorghing(弱)
链格孢属，如链格孢(弱)
镰孢属，如F.lycopersici(弱)
除发现对菾菜生尾孢、P.sorghina、链格孢和F.lycopersici的抑制作用较弱外，在浓度低达0.0016μg/ml时对以上真菌的抑制作用也极强。
对接合菌纲的真菌种只发现有较弱的抑制作用，对卵菌纲和担子菌纲的真菌种实际上未发现有抑制活性。
对植物的生物活性
在以下实施例中所用的浓度下未发现植物毒性。
实施例1
对西红柿植株上灰葡萄孢的抗性
用每毫升含有0.035毫克活性成分的液体悬浮液处理西红柿植株(“First in Field”品种，3周龄)。将该植株于温室中干燥24小时，然后用含有105灰葡萄孢孢子/ml的孢子悬浮液(于25％葡萄汁中)接种。于透明聚乙烯袋中培养该植株6天(于15℃-20℃光照16小时(1000lux)和暗置8小时)以将相对湿度提高至95-100％。未观察到真菌的破坏作用。对照植物按同样方式处理，只是施用的是不含活性成分的悬浮液，结果发现其上长满灰葡萄孢。
实施例2
对苹果(Golden Delicious)上灰葡萄孢的抗性
将含有9.8μg活性成分/ml的悬浮液喷洒于人工损伤的苹果上。第二天用含有1×105/ml真菌的孢子悬液接种被处理过的苹果，并于高空气湿度和18-20℃下保温1周。评估时，计数被感染的损伤部位，并由此测定试验物质的杀真菌效果。活性化合物完全防止了真菌的生长。未处理的苹果则百分之百地被灰葡萄孢感染。
实施例3
对草霉(Senga-Sengana)上灰葡萄孢的抗性
按照EPPO指南在丹麦的Funen完成了田间试验(Guideline for the BiologicalEvaluation of Fungicides.Botrytis cinerea onstrawberries)。
试验田的大小为20m2，并重复三份。所用活性化合物为含有约10％活性成分(a.i.)的试验配方。使用三种浓度的活性化合物：100，300和900g a.i./ha.喷洒体积为1200l/ha。
在以下生长期喷洒草霉：T1，开始开花；T2，10％开花；T3，50％开花；T4，80％开花。
用市售杀真菌剂ROVRAL作为标准对照。
通过分别对健康的和被感染的草霉计数和称重而完成评定。
结果如图8所示，每次试验的感染程度均被标出。从图8可以看出，BK202显示出比ROVRAL更优越的杀真菌效果。
实施例4
对葡萄(Ugni Blane)上灰葡萄孢的抗性
按照CEB Method No.37在法国的Bordeaux进行了田间试验。
试验田由一行15株葡萄组成，总共六行。所用活性化合物为含有约10％活性成分的试验配方。应用三种浓度的活性化合物：100，300和900g a.i./ha.水体积为300l/ha。
在以下生长期对葡萄进行喷雾：T1，葡萄串的形成结束；T2，葡萄开始成熟；T3，收获前3-4周。
使用市售杀真菌剂RONILAN和BASULTRA作为标准对照。
在出现病害后通过估测灰葡萄孢损害的强度和频率而完成评定。
其结果如图9所示，其中标出了每次试验的感染强度(定义为100串葡萄中发病的百分数)。从图9可以看出，BK202显示出比RONILAN和BASULTRA更强的杀真菌效果。
实施例5
对西红柿(Matador)上灰葡萄孢的抗性
在丹麦的Lyngby完成了温室试验。
试验田由7株植株组成(约12周龄，1m高)，并重复三组。将这些植株置于塑料“帐蓬”中以维持湿度。喷洒植株前对每植株的20片叶子进行机械损伤以利灰葡萄孢的侵袭。所用的活性化合物为约含有10％活性成分的试验配方。应用三种浓度的活性化合物：0.01％，0.03％和0.09％。水体积为770ml/试验田。
损伤叶子后立即喷洒西红柿。杀真菌剂处理24小时后，通过喷洒悬浮于30％橙汁中的灰葡萄孢于植株而完成人工接种。
利用市售杀真菌剂RONILAN作为标准对照。
通过对叶子、枝条、果实和花蕾上的侵袭数进行计数而完成评定。
结果示于图10，其中表示了每次试验中感染的程度。从图10可以看出，在所有浓度下BK202均显示出比RONILAN更优越的杀真菌效果。
实施例6
对抗杀真菌剂的灰葡萄孢分离物的抗性
将一个抗BENLATE的分离物(分离物A)、一个抗BENLATE、ROVRAL和SUMISCLEX的分离物(分离物B)从已喷洒了上述杀虫剂的植物中分离出来。在体外检测中测定BK202对这些分离物的作用效果，并与三种市售杀虫剂进行比较。将杀真菌剂加到琼脂中并按不同浓度分散到陪氏平皿中，然后用敏感菌株(正常(分离物C))和两种抗性菌株接种。25℃培养3天后测定生长(mm)。
其结果示于下面的表II。
表II杀虫剂 浓度 分离物 分离物 分离物
ppm A B CBK202 10 0 0 0
2 0 0 0
0.125 0 0 0ROVRAL 10 0 13 0
2 0 46 0BENLATE 10 50 50 0
2 65 62 0SUMISCLEX 10 0 35 0
2 0 46 0对照 - 76 80 74
实施例7
对苹果(Golden Delicious)上果生链核盘菌的抗性
将苹果进行表面灭菌，每个苹果用直径2.1mm的钉子钻孔5次，然后浸入含有0、0.5、5、50和500mg a.i./ml的悬浮液中。活性成分为：(i)BK202，(ii)苯菌灵(BENLATE)，(iii)iprodione(ROVRAL)。将4个苹果钻孔并用每种浓度的三种杀虫剂处理，使每种浓度共产生20个损伤。将苹果置于成排的塑料容器中，损伤朝上。24小时后，用含有1×105孢子/ml的果生链核盘菌悬浮液喷洒损伤部位。然后用聚乙烯袋覆盖容器，并保持于室温(约22℃)下。
5天后，通过计数被感染的损伤数而评定效果(每次处理的最大感染损伤为20)。
结果如表III所示。
表III
浓度 BK202 BENLATE ROVRAL
0mg ai/l 20 20 20
0.5mg ai/l 18 18 20
5.0mg ai/l 14 19 19
50mg ai/l 7 12 15
500mg ai/l 1 3 4
从表III可以看出，BK202对果生链核盘菌的活性优于两种被试验的市售杀真菌剂。
据信可被保护以抗真菌侵袭的其它作物的例子是：梨、李树、桃树、樱桃、木莓、蚕豆、豌豆、黄豆、油培养物(如油菜、芥子、橄榄、向日葵等)、谷物、黄瓜、甜瓜、柑桔属水果(如橙子、柠檬、中国柑桔等)、菠菜、莴苣、土豆、胡椒、鳄梨、茄子、香蕉、菊科植物(如非洲菊)以及其它观赏植物等。