一种菌藻联合固定荒漠流沙的方法.pdf

本发明涉及一种菌藻联合固定荒漠流沙的方法。将从干旱、半干旱、或荒漠地表结皮中分离和大规模培养的荒漠藻干粉和土壤芽孢杆菌干粉按2～3∶1的质量比混匀，形成固沙剂，并按2.0～4.0g/m2的接种量接种于荒漠流沙中；同时喷洒液体营养调理剂，并用地膜覆盖。该方法使用的芽孢杆菌与荒漠藻相互作用促进生长，因而，与以往单一由藻类的大规模培养而固沙的技术相比，此种方法能更快速、持久地使荒漠土壤形成结皮，使用此种方法固沙20～40天时，每平方米藻类覆盖率即可达到50～70％，50天时地表可形成微量结

1、  一种菌藻联合固定荒漠流沙的方法，其为将荒漠藻和土壤芽孢杆菌联合使用。

2、  如权利要求1所述的菌藻联合固定荒漠流沙的方法，其特征在于：所述的土壤芽孢杆菌的分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp，于2005年3月9日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1324。

3、  如权利要求1所述的菌藻联合固定荒漠流沙的方法，其特征在于：所述的土壤芽孢杆菌是通过如下的步骤从土壤结皮中分离和培养的：
选择来自干旱、半干旱、或荒漠地表结皮下2～10cm处的土样与无菌水混和，经100℃高温处理后制成土壤稀释液，将此土壤稀释液接种于细菌牛肉膏蛋白胨培养基平板中，倒置培养；培养好的菌种使用芽孢染色法鉴定，分离出经染色后在油镜下观察芽孢呈绿色，菌体呈红色的耐热性的土壤芽孢杆菌；
将上述从土壤结皮中分离的土壤芽孢杆菌在液体培养基I上按常规方法经过大规模连续发酵液体培养后，离心，倾去上清液，下层的菌体沉淀物冷冻干燥后得到冻干粉，于冰箱保存备用；
所述的液体培养基I为按下述比例配制而成：每升水中加入80～100g玉米浆，5g氯化钠，pH7.0～7.5。

4、  如权利要求1所述的菌藻联合固定荒漠流沙的方法，其特征在于：所述的荒漠藻是通过如下的步骤从土壤结皮中分离和培养的：
采集干旱、半干旱、或荒漠土壤表面结皮，除去其中的植物碎片等杂物后，研磨至能过0.5mm的分样筛；将此培养样品于紫外灯下照射后，加无菌蒸馏水振荡，制得均一悬浮液，将之稀释后接种于液体培养基II，置于光照培养箱中培养；将藻种挑出后转接到固体培养基III上，直至获得纯化、无污染的荒漠藻种；
将此纯化的荒漠藻种接入含有液体培养基II的三角瓶中，光照培养并间隙摇动烧瓶，得到的荒漠藻通过离心或过滤收集，收集藻片，粉碎，获得荒漠藻干粉；
所述的液体培养基II是按下述方法配制的：将硝酸钾0.8～2.0g、硫酸镁0.05～1.2g、磷酸二氢钾0.02～0.05g和柠檬酸0.004～0.008g用少量蒸馏水溶解后，补加蒸馏水到980ml；将硝酸钙2～4g用20ml蒸馏水溶解后，加入到上述溶液内；再加入植物生长调节剂0.1～1ppm；
所述的固体培养基III是在上述液体培养基II中加入1％的琼脂，加热溶化后，15磅压力下灭菌30min。

5、  如权利要求1所述的菌藻联合固定荒漠流沙的方法，其特征在于：所述的将荒漠藻和土壤芽孢杆菌联合使用为在野外接种时，将从结皮中分离和培养的荒漠藻干粉和土壤芽孢杆菌干粉按2～3∶1的质量比混匀，形成固沙剂，并按2.0～4.0g/米²的接种量接种于荒漠流沙中；同时喷洒液体营养调理剂，并用地膜覆盖，所述的液体营养调理剂包括液体培养基II和丙烯酸类保水剂0.1～1g/Kg。

一种菌藻联合固定荒漠流沙的方法
技术领域
本发明涉及一种菌藻联合固定荒漠流沙的方法，具体地说是涉及一种利用土壤中的芽孢杆菌与结皮中藻类联合作用从而快速形成荒漠地表结皮进行防风固沙的方法。
背景技术
荒漠地表生物结皮是干旱区特殊环境的产物。通过地物光谱和遥感技术，可以观测到沙漠表面约有40～60％的表面被这种特殊“皮肤”覆盖。荒漠地表生物靠自然露水和降水可四季长青，能够适应零下10℃到60℃之间的低营养环境，选择它们作为固沙先锋植物，在大面积流沙中培植，可以补充完善我国目前采用的“乔、灌、草”结合的防风固沙生态体系，尤其适合用于荒漠化地区实施重大工程对地表破坏后的恢复。
“生物结皮”在保持土壤湿度、固定大气中的氮和增加土壤的有机质含量中扮演着重要的角色。结皮的高含水量可以使降雨较多地保留在土壤结皮表面，有利于结皮中低等生物的生长和繁殖并能通过其生活代谢方式影响并改变环境，在防风固沙、防止土壤侵蚀、改变水分分布状况等方面起着重要作用。通过对结皮组成成分的分析，可以得知结皮中的主要成分之一是藻类物质，它们一旦在土壤和沙漠中大量生长，就能向体外分泌以多糖为主的物质，从而粘结土壤颗粒和沙粒形成结皮。然而单由藻种固定流沙形成的结皮在自然条件下生长缓慢，需要很长时间才能形成高覆盖率的结皮植被。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术仅使用藻种固定流沙，形成结皮速度缓慢的缺陷，从而提供一种简单易行、能快速和持久的固沙、且适用于工业化规模生产的菌藻联合固定荒漠流沙的方法。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明提供一种菌藻联合固定荒漠流沙的方法，其为将荒漠藻和土壤芽孢杆菌联合使用，具体包括如下步骤：
1)从土壤结皮中分离和培养芽孢杆菌：
选择来自干旱、半干旱、或荒漠地表结皮下2～10cm处的土样与无菌水混和，经100℃高温处理后制成土壤稀释液，将此土壤稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板中，倒置培养；培养好的菌种使用芽孢染色法鉴定，分离出经染色后在油镜下观察芽孢呈绿色，菌体呈红色的耐热性的土壤芽孢杆菌；
该土壤芽孢杆菌的分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp，于2005年3月9日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1324；
将上述从土壤结皮中分离的土壤芽孢杆菌在液体培养基I上按常规方法经过大规模连续发酵液体培养后，离心，倾去上清液，下层的菌体沉淀物冷冻干燥后得到冻干粉，于冰箱保存备用；所述的液体培养基I为按下述比例配制而成：每升水中加入80～100g玉米浆，5g氯化钠，pH 7.0～7.5；
2)从土壤结皮中分离和培养荒漠藻：
采集干旱、半干旱、或荒漠土壤表面结皮，除去其中的植物碎片等杂物后，研磨至能过0.5mm的分样筛；将此培养样品于紫外灯下照射后，加无菌蒸馏水振荡，制得均一悬浮液，将之稀释后接种于液体培养基II，置于光照培养箱中培养；将藻种挑出后转接到固体培养基III上，直至获得纯化、无污染的荒漠藻种；
将此纯化的荒漠藻种接入含有液体培养基II的三角瓶中，光照培养并间隙摇动烧瓶，得到的荒漠藻通过离心或过滤收集，收集藻片，粉碎，获得荒漠藻干粉；
所述的液体培养基II是按下述方法配制的：将硝酸钾0.8～2.0g、硫酸镁0.05～1.2g、磷酸二氢钾0.02～0.05g和柠檬酸0.004～0.008g用少量蒸馏水溶解后，补加蒸馏水到980ml；将硝酸钙2～4g用20ml蒸馏水溶解后，加入到上述溶液内；再加入植物生长调节剂0.1～1ppm；
所述的固体培养基III是在上述液体培养基II中加入1％的琼脂，加热溶化后，15磅压力下灭菌30min；
3)野外接种：
将步骤1)和2)从结皮中分离和培养的荒漠藻干粉和土壤芽孢杆菌干粉按2～3∶1的质量比混匀，形成固沙剂，并按2.0～4.0g/米²的接种量接种于荒漠流沙中；同时喷洒液体营养调理剂，并用地膜覆盖，所述的液体营养调理剂包括液体培养基II和丙烯酸类保水剂0.1～1g/Kg。
本发明在于将干旱半干旱地区土壤结皮中广泛存在的芽孢杆菌与荒漠藻联合使用，土壤芽孢杆菌具有粘性荚膜，胶质鞘或厚的果胶质外壁，在生长中能分泌大量的粘液，这些具有粘性附属物的菌体和粘性质液通过与藻类物质的交连结合从而构成了结皮的基础。使用此种方法固沙20～40天时，每平方米藻类覆盖率可达到50～70％，50天时地表可形成微量结皮。
本发明与现有技术相比，其优益之处在于：
1、该方法简单易行、操作方便、设备简单。
2、本发明提供的方法是将微生物和藻类联合使用，两者相互作用促进生长，因而，与以往单一由藻类的大规模培养而固沙的技术相比，此种方法能更快速、持久的使荒漠土壤形成结皮。
3、该方法无需对所分离的菌种和藻种进行严格的种类纯化鉴定，省略了以往繁琐而不必要的操作步骤。
4、利用本发明提供的方法固沙后所形成的土壤，为沙漠提供了丰富的碳源和氮源，更利于它种微生物和一些低等的微管束植物生长，由此而更加坚固流沙。
5、本发明提供的方法能适用于工业化规模生产。
具体实施方式
实施例1、
选择来自我国新疆准噶尔盆地地区土壤地表结皮下2cm地土样10g与无菌水混和，放入盛有90ml的并带有玻璃珠的三角瓶中振荡20min后将三角瓶放在沸水中加热10min后制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-54种稀释度的土壤悬液，每一稀释度的土壤悬液中各吸取0.2ml接种于装有细菌牛肉膏蛋白胨培养基的平板中，将培养基平板倒置在37℃的温箱中培养2天。使用芽孢染色法鉴定培养好的菌种，将培养好的菌体涂片干燥固定，经染液染色干燥后置油镜下观察，分离出经染色后在油镜下观察芽孢呈绿色，菌体呈红色的耐热性的土壤芽孢杆菌；该土壤芽孢杆菌的分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp，于2005年3月9日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1324。
将上述从土壤结皮中分离的土壤芽孢杆菌使用优化的廉价液体培养基I-1进行大规模发酵，该液体培养基I-1的组成为每升水中含玉米浆80g，氯化钠5g，pH 7.0，在此条件下，将上述分离的土壤芽孢杆菌大规模连续液体发酵培养3天，离心发酵液，倾去上清液，下层的菌体沉淀物冷冻干燥，得到芽孢杆菌冻干粉，其收率为90g/每升发酵液，于冰箱保存备用。
用洗净消毒的采样器采集我国新疆准噶尔盆地地区0.5cm厚的土壤地表结皮。把采集的样品放在洗净灭菌的培养皿和磨口试剂瓶中，取瓶中的样品，仔细拣去残留的植物碎片等杂物，放在研钵中轻轻敲碎，直至全部能通过0.5mm的分样筛。称取此培养样品20g于60W的高效紫外灯下照射2min左右，然后放在250ml三角瓶中加无菌蒸馏水180ml，振荡20min，制得均一悬浮液，然后按比例稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个等级并将之接种于液体培养基II-1。
培养条件是在4只40瓦的日光灯管的光照培养箱中，光周期：光/暗＝16h/8h，温度25℃左右下培养，培养天数为10天左右。将平板培养基中生长的藻种用无菌玻璃棒或小镊子挑出，在无菌载玻片上用液体培养基II-1清洗，再将之接种到新的装有固体培养基III-1的平板上，获得无污染藻种后转接到斜面保存。将斜面中生长的无污染藻种进行大批量液体培养，接种量是把藻液光密度控制在0.1A左右，光照周期同上，培养周期为6天，计测培养后的细胞数，结果70,000细胞/ml。培养后得到的荒漠藻通过离心或过滤收集，涂抹于丝绢上，收集到藻片后，用粉碎机粉碎，获得荒漠藻干粉。培养全部在无菌条件下进行。
所述的液体培养基II-1是按下述方法配制的：将硝酸钾1g、硫酸镁0.8g、磷酸二氢钾0.03g和柠檬酸0.005g用少量蒸馏水溶解后，补加蒸馏水到980ml；将硝酸钙2.5g用20ml蒸馏水溶解后，加入到上述溶液内；再加入植物生长调节剂三十烷醇0.1ppm。
所述的固体培养基III-1是在上述液体培养基II-1中加入1％的琼脂，加热溶化后，15磅压力下灭菌30min。
将上述从结皮中分离和培养的荒漠藻干粉和土壤芽孢杆菌干粉以2∶1的质量比混合后，按2.0g/米²的量接种于荒漠流沙中；同时按0.5-1千克/米²使用移动式喷溉装置喷溉液体营养调理剂，并用地膜覆盖，地膜上扎有空洞便于空气流通，该液体营养调理剂中含有上述液体培养基II-1，同时还含有聚丙烯酸钠-聚丙烯酰胺保水剂0.1g/Kg。
在此种培养条件下地膜内5～7天后出现藻类生长迹象，40天左右时藻类覆盖率达到50％，50天左右时形成微量结皮后揭去地膜，任其自由生长。
实施例2、
选择来自我国新疆准噶尔盆地地区土壤地表结皮下6cm的土样10g与无菌水混和，放入盛有90ml的并带有玻璃珠的三角瓶中振荡20min后将三角瓶放在沸水中加热10min后制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-54种稀释度的土壤悬液，每一稀释度的土壤悬液中各吸取0.2ml接种于装有细菌牛肉膏蛋白胨培养基的平板中，将培养基平板倒置在37℃的温箱中培养3天。使用芽孢染色法鉴定培养好的菌种，将培养好的菌体涂片干燥固定，经染液染色干燥后置油镜下观察，分离出经染色后在油镜下观察芽孢呈绿色，菌体呈红色的耐热性的土壤芽孢杆菌。
将上述从土壤结皮中分离的土壤芽孢杆菌使用优化的廉价液体培养基I-2进行大规模发酵，该液体培养基I-2的组成为每升水中含玉米浆90g，氯化钠5g，pH 7.5，在此条件下，将上述分离的土壤芽孢杆菌大规模连续液体发酵培养3天，离心发酵液，倾去上清液，下层的菌体沉淀物冷冻干燥，得到芽孢杆菌冻干粉，其收率为120g/每升发酵液，于冰箱保存备用。
在基本操作同实施例1的情况下，荒漠藻液体培养基II-2的组成为：硝酸钾1.5g、硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾0.04g、柠檬酸0.006g、硝酸钙3g、植物生长调节剂三十烷醇0.5ppm。所述的固体培养基III-2是在上述液体培养基II-2中加入1％的琼脂，加热溶化后，15磅压力下灭菌30min。在此条件下发酵后计测培养后的藻细胞数，结果是300,000细胞/ml。
将上述从结皮中分离和培养的荒漠藻干粉和土壤芽孢杆菌干粉以3∶1的质量比混合后，按3.0g/米²的量接种于荒漠流沙中；同时按0.5-1千克/米²使用移动式喷溉装置喷溉液体营养调理剂，并用地膜覆盖，地膜上扎有空洞便于空气流通，该液体营养调理剂中含有上述液体培养基II-2，同时还含有聚丙烯酸钠—聚丙烯酰胺保水剂0.5g/Kg。
在此种培养条件下地膜内3～5天后出现藻类生长迹象，30天左右时藻类覆盖率达到70％，50天左右时形成微量结皮后揭去地膜，任其自由生长。
实施例3、
选择来自我国新疆准噶尔盆地地区土壤地表结皮下10cm的土样10g与无菌水混和，放入盛有90ml的并带有玻璃珠的三角瓶中振荡20min后将三角瓶放在沸水中加热10min后制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-54种稀释度的土壤悬液，每一稀释度的土壤悬液中各吸取0.2ml接种于装有细菌牛肉膏蛋白胨培养基的平板中，将培养基平板倒置在37℃的温箱中培养3天。使用芽孢染色法鉴定培养好的菌种，将培养好的菌体涂片干燥固定，经染液染色干燥后置油镜下观察，分离出经染色后在油镜下观察芽孢呈绿色，菌体呈红色的耐热性的土壤芽孢杆菌。
将上述从土壤结皮中分离的土壤芽孢杆菌使用优化的廉价液体培养基I-3进行大规模发酵，该液体培养基I-3的组成为每升水中含玉米浆100g，氯化钠5g，pH 7.5，在此条件下，将上述分离的土壤芽孢杆菌大规模连续液体发酵培养3天，离心发酵液，倾去上清液，下层的菌体沉淀物冷冻干燥，得到芽孢杆菌冻干粉，其收率为80g/每升发酵液，于冰箱保存备用。
在基本操作同实施例1的情况下，荒漠藻液体培养基II-3的组成为：硝酸钾2.0g、硫酸镁1.2g、磷酸二氢钾0.05g、柠檬酸0.008g、硝酸钙4g、植物生长调节剂三十烷醇1ppm。所述的固体培养基III-3是在上述液体培养基II-3中加入1％的琼脂，加热溶化后，15磅压力下灭菌30min。在此条件下发酵后计测培养后的细胞数，结果10,000细胞/ml，这是因为高浓度的植物生长调节剂抑制藻类物质的生长。
将上述从结皮中分离和培养的荒漠藻干粉和土壤芽孢杆菌干粉以3∶1的质量比混合后，按4.0g/米²的量接种于荒漠流沙中；同时按0.5-1千克/米²使用移动式喷溉装置喷溉液体营养调理剂，并用地膜覆盖，地膜上扎有空洞便于空气流通，该液体营养调理剂中含有上述液体培养基II-3，同时还含有聚丙烯酸钠-聚丙烯酰胺保水剂1fg/Kg。
在此种培养条件下地膜内3～5天后出现藻类生长迹象，35天左右时藻类覆盖率达到60％，50天左右时形成微量结皮后揭去地膜，任其自由生长。
由上述实施例可以看出，本发明将干旱半干旱地区土壤结皮中广泛存在的芽孢杆菌与荒漠藻联合使用，两者相互作用促进生长，因而，与以往单一由藻类的大规模培养而固沙的技术相比，此种方法能更快速、持久的使荒漠土壤形成结皮，使用此种方法固沙20～40天时，每平方米藻类覆盖率即可达到70～90％，50天时地表可形成微量结皮。而且，利用本发明提供的方法固沙后所形成的土壤，为沙漠提供了丰富的碳源和氮源，更利于它种微生物和一些低等的微管束植物生长，由此而更加坚固流沙。