壳聚糖血管支架及其制备方法 【技术领域】
本发明属于医用材料领域，具体涉及壳聚糖血管支架及其制备方法。
背景技术
目前临床上所应用的血管支架都是由金属支架构成，植入狭窄血管后再狭窄发生的几率高达20％以上。金属支架本身不带药，也不可重复植入，造成了血管支架治疗的局限性。目前尚无其他生物可降解材料的支架。
但与金属血管支架相比，壳聚糖血管支架记忆性和柔韧性差，如何解决这两个问题成为能否用于临床的关键。因此，壳聚糖血管支架目前只能用于大血管的狭窄。壳聚糖具有许多生物活性，已知的具有抗炎、降血脂及临床上已用于骨科和妇产科手术后的防粘连及手术疤痕形成。我们的实验也证实了壳聚糖具有抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增殖，促进内皮细胞和表皮细胞生长的作用。壳聚糖被誉为二十一世纪的健康保健食品，生命的第六要素。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种可降解的壳聚糖血管支架，该壳聚糖血管支架可自行降解，因此可重复植入患者体内；而且壳聚糖独特的生物活性，具有抗炎、抑制平滑肌细胞增殖和促进内皮细胞生长的作用，促进了病变愈合，缩短了病程。壳聚糖还可制备成纳米微粒，包埋所需的药物，在病变局部发挥更大的效用。
本发明所说的壳聚糖血管支架，是用壳聚糖纤维编织而成。
用于本发明的壳聚糖纤维的丝径为1.6-2.0mm。
上述壳聚糖血管支架的制作方法是：用将壳聚糖聚合物纺丝成纤维，然后编织成支架。制作时可采用常规的Ω编织方法，制得的支架与目前支架导管递送系统兼容。除材料不同外，本发明的壳聚糖血管支架与现有的血管金属支架在形状构造上基本一致，如边缘Zigzag形(锯齿形)(图1)。
壳聚糖血管支架可用于血管的管腔术后防治狭窄，主要使管腔保持畅通。目前壳聚糖血管支架已完成了动物实验，达到了满意的效果。
本发明与现有金属支架相比具有以下优点：目前国内所用金属支架多为进口支架，本发明价格仅为进口的十分之一；壳聚糖血管支架可重复植入；金属支架对人体有损伤所用，而壳聚糖具有明显地抑制平滑肌细胞增殖和促进内皮细胞生长的作用，促进了病变愈合；壳聚糖还可制备成纳米微粒，包埋所需的药物，在病变局部发挥更大的效用。由于壳聚糖血管支架在人体内可自行降解，既环保又对人体无损害，而且具有许多优良的生物特性，是替代金属支架的理想生物可降解材料，因而具有极大的社会效益和经济效益。
【附图说明】
图1是支架形状示意图
【具体实施方式】
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：壳聚糖血管支架的制作
壳聚糖原料由上海其胜生物材料技术研究所提供。采用不同的拉伸比率制成纤维，测定其机械性能、体内外降解速度和动力学过程。检测生物相容性合格后方可使用。其毒理实验见表1。壳聚糖纤维丝径1.8±0.2mm，所能承受的压力和牵张力超过20千帕，10个以上大气压。将壳聚糖纤维编织成长度30±2mm，直径18±2mm的圆柱体支架。
表1.壳聚糖的毒理学检测
实施例2：壳聚糖血管支架的应用
壳聚糖血管支架对兔颈动脉球囊损伤后再狭窄的影响
动脉球囊损伤后再狭窄及其防治是心血管领域重大课题之一。由于其发生机制尚未完全明瞭，因此也缺乏有效的根本防治方法。随着医学科学的发展，对再狭窄病因学的研究有了重大进展，为药物防治提供了可能。动脉平滑肌细胞增殖和动脉内皮细胞损伤是引起再狭窄的关键因素，因此采用抑制动脉平滑肌细胞增殖和和促进动脉内皮细胞生长的药物对RS防治具有重要价值。
我们的体外细胞培养结果表明：壳聚糖具有明显地抑制动脉平滑肌细胞增殖和促进动脉内皮细胞生长的作用。其机制与抑制原癌基因c-myc表达及拮抗单核细胞和内皮细胞粘附密切相关。为此，我们采用家兔髙脂饮食加颈动脉内皮损伤术构建的再狭窄动物模型，观察壳聚糖对家兔再狭窄的影响。
一、材料和方法
(一)实验材料和主要仪器：
1.实验动物：2.5Kg左右的雄性新西兰纯种大白兔(第二军医大学实验动物中心)。
2.主要试剂：2％壳聚糖，壳聚糖支架，胆固醇，蛋黄粉，猪油，盐酸氯胺酮注射液，地西泮注射液，普拉固，蒙诺。
(二)实验方法：
1.髙脂饲养：
除正常对照组外，其余兔均饲以髙脂饲料(配方：1％胆固醇、7.5％蛋黄粉、8％猪油、83.5％普通饲料；每日每只家兔需：髙脂饲料100g+普通饲料100g)。
2.家兔颈动脉球囊损伤模型地建立：
髙脂饮食1周后，按Wilentz等方法行家兔颈动脉球囊内皮剥脱术。家兔麻醉后颈动脉走向切开皮肤及皮下组织颈总动脉及颈内、外动脉。将颈外动脉远心端结扎，近心端用线提起，无创血管夹阻断颈总动脉和颈内动脉，剪开颈外动脉，逆行插入4F PTCA球囊导管(导管直径1.2mm，球囊膨胀直径2.0mm，球囊长度20mm)至颈总动脉段40mm处，球囊内充以0.5-0.7ml肝素生理盐水至3个大气压，缓慢会拉导管至近切口处后回抽球囊内液体，使压力降为零，再将导管送入，重复3次后拔出导管，取下无创血管夹。结扎颈外动脉近心端，缝合皮肤。继续髙脂饮食饲养。
3.血清学指标检测：见2。
表2.各组血清学指标检测(n＝8，x±SD)
a.p＜0.01 vs control；b.p＜0.01 vs 5周；c.p＜0.01 vs 10周；d.p＜0.01 vs RS
在各组家兔髙脂饮食饲养前，髙脂饮食饲养后5周、10周分别于耳缘静脉抽血，检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(1DL-C)等血脂指标。
4.病理形态学检查：
麻醉同前。沿颈动脉走向切开皮肤，分离血管，观察颈动脉外形、质地、硬度，剪下颈动脉约40mm，于10％中性福尔马林液中固定，常规酒精脱水，石蜡包埋，制成6μm厚连续切片，光镜下观察形态学变化，并经微机图像分析仪测定管腔面积，内膜厚度，内膜面积和狭窄程度。同时取主动脉、心、肺、肝、肾、脾、脑等组织，置于10％中性福尔马林液中固定。
5.透射电镜观察：
颈动脉标本在4℃下于2％戊二醛固定24小时，经二甲砷酸钠缓冲液漂洗后，用1％鋨酸固定，梯度酒精脱水，3％饱和醋酸鈾块染，包埋于环氧树脂内，超薄切片，透射电镜观察超微结构。
6.颈动脉血管造影：
经股动脉逆行插入造影导管至主动脉弓处，先快速注射3ml安射力(碘佛醇)注射液，见两侧颈总动脉显影良好，对比清晰，再快速注射10ml安射力注射液，并摄片。
(三)实验分组：
将家兔40只随机分成五组：1.正常对照(C)组(普通饲料喂养)；2.动脉粥样硬化(AS)组(髙脂饮食喂养)；3.再狭窄(RS)组(髙脂饮食喂养一周后行颈动脉球囊损伤)；4.普拉固+蒙诺(MP)组(髙脂饮食喂养一周后行颈动脉球囊损伤+普拉固20mg+蒙诺10mg)；5.壳聚糖支架组(髙脂饮食喂养一周后行颈动脉球囊损伤+壳聚糖支架，另喂以壳聚糖粉2g/日)。喂养时限24周，其中对照组和壳聚糖组各死亡1只，RS组、AS组和蒙诺+普拉固组各死亡2只，共存活32只。
二、结果
(一)血清学指标检测：
各组血清脂质浓度见表6。髙脂饮食喂养5周后各组血脂与对照组比较均有显著性差异。髙脂饮食喂养10周后各组血脂与对照组比较同样具有显著性差异；RS组、AS组和壳聚糖组与髙脂饮食喂养5周相比差异显著；蒙诺+普拉固组与其它髙脂饮食组比较有显著性差异，与髙脂饮食喂养5周相比也差异显著，血脂明显降低。髙脂饮食喂养20周后，对照组与前相比无显著性差异；其它各组与对照组和髙脂饮食喂养5周相比差异显著，但RS组、AS组和壳聚糖组与髙脂饮食喂养10周相比无显著性差异；蒙诺+普拉固组与髙脂饮食喂养10周相比差异显著，但血脂仍明显高于正常，说明血脂下降缓慢；虽然壳聚糖组血脂浓度与RS组和AS组无显著性差异，但其内涵发生了变化，即在TC和TG升高的同时HDL-C也升高，而LDL-C则有所下降，表明壳聚糖在稳定动脉粥样斑块及防治再狭窄方面具有重要意义。
(二)颈动脉形态学观察：
1.肉眼观察：
正常对照组家兔颈动脉管壁呈红色，有光泽，弹性好，搏动明显；AS组和RS组管壁为白色或黄色，搏动不明显或无搏动，管俓明显增粗，部分血管壁红白相间呈花纹状，横切面呈新月形，可见黄色脂样物及机化血栓，动脉内面有脂质条纹及纤维斑块，管腔狭窄或完全闭塞，管壁明显增厚；壳聚糖支架组和普拉固+蒙诺组病变较AS组和RS组明显减轻。
2.光镜下观察：
正常对照组家兔颈动脉管腔呈圆形，内膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由单层内皮细胞覆盖，内弹力膜完整，中膜层较厚，有8-12层环形排列的SMC。而AS组和RS组管腔不规则，呈同心形或偏心形，内膜向心性增厚，新生内膜可见大量梭形SMC，排列紊乱，管壁局限性隆起，管腔明显狭窄，部分管腔几乎完全闭塞，内膜SMC大量增生，并有泡沫细胞，SMC排列紊乱，严重者可见斑块破裂。壳聚糖支架组和普拉固+蒙诺组病变较AS组和RS组明显减轻。
3.透射电镜观察：
电镜下可见AS组和RS组动脉内皮细胞坏死脱落，有泡沫细胞，内膜SMC大量增生，以合成型为主，平滑肌细胞胞质内高尔基体发达，粗免内质网和线粒体增多。而壳聚糖支架组和普拉固+蒙诺组内皮损伤较AS组和RS组轻，罕有泡沫细胞。正常组内皮完整，无泡沫细胞，内膜无明显增生的平滑肌细胞。
4.颈动脉血管造影：
髙脂饮食结束后行兔颈动脉造影发现：对照组与正常兔颈动脉相比无明显改变，其管腔稍增粗，管壁仍光滑，血流通畅。AS组兔颈动脉与对照组相比明显增粗，管腔狭窄，管壁不光滑，血流不畅；而RS组甚至有管腔闭塞，血流中断见图。蒙诺+普拉固组虽有血管增粗，但管腔面积较RS组明显扩大，血流通畅。壳聚糖组在植入支架后的最初12周内，血管增粗，血流尚通畅，24周后支架溶解，管腔明显缩小，表明壳聚糖支架具有抗动脉球囊损伤后再狭窄的作用。
5.图像分析：见表3。
表3.壳聚聚糖对兔颈动脉球囊损伤后再狭窄的影响(n＝8，x±SD)
a.p＜0.01 vs control；b.p＜0.01 vs RS
(三)各脏器形态学和光镜下观察：
1.脑：各组均呈正常组织形态，其脑组织色泽正常，未见水肿及胶质细胞增生，锥细胞正常、分布均匀。
2.心：心肌结构大致正常，未见细胞变性，其肌束排列正常。
3.肝：对照组肝脏呈紫红色，色泽均匀一致，肝小叶结构及肝索排列正常，肝细胞形态无异形及变性，汇管区周围肝细胞未见病理性变化；而实验组肝脏呈黑灰色，肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，细胞形态改变，尤以AS组和RS组改变明显。
4.脾：正常组脾脏的白髓及红髓分布正常，脾窦无扩、淤血；而实验组脾脏的白髓和红髓分布异常，可见脾窦扩张、淤血。
5.肾：对照组肾脏呈紫红色，色泽均匀，肾小球结构正常，肾毛细血管球及间质小动脉未见淤血及内皮细胞损伤，肾小管上皮未见浊肿变性，近曲小管上皮刷状缘排列整齐；而实验组肾脏呈白色肿胀，肾小球结构变性，肾毛细血管球及间质小动脉可见淤血及肾小管上皮浊肿变性，尤以AS组和RS组改变明显。
三、结论
加用壳聚糖后病变较RS组和AS组明显减轻(虽然壳聚糖对血脂影响很小)，表明壳聚糖具有抗家兔颈动脉球囊损伤后再狭窄的作用。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。