三.发明内容
本发明的目的在于2种灵芝注射剂及其HPLC供试品的制备方法，建立从
灵芝原料、原料药到其2种注射剂所含三萜类化合物的高效液相指纹图谱
(FP-HPLC)，以确保该注射剂的质量稳定与可控。本发明所提及的灵芝抗肿瘤
组分三萜类化合物，具有以下一些特征：
1.外观为淡黄色固体物质，味微苦，易溶于甲醇、氯仿、乙醇、碳酸氢钠溶
液等，不溶或难溶于水。
2.光谱特征：其甲醇、氯仿、乙醇、饱和碳酸氢钠溶液的紫外可见光谱中，
在250～260nm处均有一个最大吸收峰；其溴化钾压片的红外光谱中，在
3400cm-1，1025cm-1有羟基吸收峰，1710cm-1出现六元环酮，2955cm-1
出现CH3-C-基团，2922cm-1和2851cm-1出现-C-CH2-C-强的伸
缩振动峰。
3.薄层色谱特征：固定相选择GF-254硅胶板，流动相选择展开剂系统，即
V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5，并滴加
1-2滴冰乙酸抑制拖尾现象。在波长254nm下可检测到6个斑点，Rf值
分别为0.54、0.41、0.36、0.33、0.21、0.12。
4.化学结构：有5种不同的母核结构，见说明书附图1。
5.药理活性：具有较强的抗肿瘤活性，对肝肿瘤的抑制作用尤为明显。体外
实验发现，该终产物对人肝癌细胞BEL 7402和人子宫癌细胞HeLa的IC50
值分别为12.4μg·mL-1和129.2μg·mL-1。动物实验显示，20mg/kg/d组
的肿瘤抑制率为43.9％，而5mg/kg/d组的肿瘤抑制率高达74.9％，且毒
副作用较小。因此，该终产物有可能作为新的抗肿瘤药物的原料。
该灵芝抗肿瘤注射剂粉针制剂制备方法的实施方案如下：
用9％碳酸氢钠溶液溶解灵芝三萜类化合物，注射用水稀释，使其最终质量
浓度为10mg·mL-1，调pH值至7.2～7.4，进行无菌过滤(所用微孔滤膜孔径为
0.22μm)和无菌分装，得到注射剂水针制剂，在温度范围-40℃～-80℃内
进行真空冷冻干燥后，得到注射剂粉针制剂。
该灵芝抗肿瘤注射剂水针制剂制备方法的实施方案如下：
用9％碳酸氢钠溶液溶解灵芝三萜类化合物，使其最终质量浓度为100
mg·mL-1，用注射用水稀释10倍，调pH值至7.2～7.4。进行无菌过滤，所用微
孔滤膜孔径为0.22μm，最后进行无菌分装。
该灵芝抗肿瘤注射剂粉针制剂HPLC供试品制备的实施方案如下：
第一步溶剂溶解：精确称取烘干至恒重后的粉针固体粉末，9％碳酸氢钠溶
液充分溶解，使最大质量百分浓度为100mg·mL-1。
第二步酸化：用1～6mol·L-1盐酸酸化，使最终pH值为3.0～5.0。
第三步萃取：萃取液为氯仿，体积与溶液体积相等，萃取1～2次。
第四步减压蒸干：温度控制在40℃～60℃，得到淡黄色固体。
第五步再溶解：精确称取上述结晶，用甲醇充分溶解，进样浓度为0.2～1
mg·mL-1，进样前用0.22μm微孔滤膜过滤。
该灵芝抗肿瘤注射剂水针制剂供试品制备的实施方案如下：
取质量百分浓度为10mg·mL-1的水针制剂，按照粉针制剂供试品制备步骤
第二步～第五步进行。
该灵芝原料、原料药以及注射剂2种剂型所含三萜类化合物高效液相色谱
指纹图谱(FP-HPLC)具有以下特征：
1.根据灵芝原料、原料药以及注射剂2种剂型所含三萜类化合物的仪器精
密度试验和重现性试验结果，要求各供试品峰面积占总峰面积5％以上
的主要色谱峰，其相对保留时间和峰面积比值的相对标准偏差
RSD＜3％。
2.建立各供试品的相对保留值指纹图谱，确定共有指纹峰为13个。相对
保留时间α值分别为：0.51、0.62、0.69、0.78、0.88、0.92、1.00、1.07、
1.12、1.27、1.48、1.61、1.72，这13个色谱峰为三萜类化合物组分的
基本组成成分，可作为鉴别灵芝样品所含三萜类化合物的必要条件之
一。峰面积占总峰面积5％以上的色谱峰集中在0.69～1.61区域，均出现
8个相同的主峰，相对保留时间α分别为0.69、0.78、0.88、1.00、1.12、
1.27、1.48、1.61。要求8个主要色谱峰的面积百分数在70％以上。
3.根据各供试品的试验数据，要求共有指纹峰的重叠率在90％以上。
与其它相关技术相比，本发明的主要优点如下：
1.本发明所述的灵芝中抗肿瘤注射剂的制备方法，特别是涉及所含三萜类
化合物的水针制剂和粉针制剂的制备方法，为一种具有工业化前景的生产方法，
所涉及的灵芝抗肿瘤注射剂新药将主要用于治疗当前国内外高发的几种癌症如
肝、肺、乳腺癌等。
2.本发明所述的灵芝抗肿瘤注射剂的高效液相色谱指纹图谱，是利用反相
高效液相色谱技术得到的灵芝原料、原料药及其注射剂三者相关性的特征图谱。
根据本发明的制备方法所建立的灵芝三萜类化合物注射剂FP-HPLC，其专属性
强，具有稳定、重现的特点。
五.具体实施方式
实施例1
1.1材料与供试品制备
1.1.1设备与条件
惠普-1100高效液相色谱仪系列，包括四元泵，二级管阵列与多波长检测器，
真空脱气机，柱温箱，自动进样器等。RP-C18：5μm填料，250mm×4.6m
m。软件处理：Agilent化学工作站。
色谱条件：检测波长252nm，参比波长360nm，样品浓度1mg·mL-1，进
样量10μL，流速0.8mL·min-1，柱温40℃；流动相：5％醋酸-甲醇(60∶40)。
1.1.2供试品制备
1.1.2.1灵芝原料及其高效液相指纹图谱供试品制备方法
灵芝原料的制备参见文献：黄书铭，杨新林，王帮武等.灵芝三萜类化合物的制
备工艺与检测方法研究.中国中药杂志，2003，28(4)：332-334。
高效液相指纹图谱供试品制备如下：精确称取100g椴木灵芝子实体精粉，
按1∶15(g∶mL)加入无水乙醇，恒速搅拌，浸泡24h，用自制的过滤装置抽
滤，除去残渣，浸提液在45℃，-0.08～-0.1MPa，67～68r.m-1，减压旋转蒸
馏，完全蒸干后得到黑色浸膏。将上述灵芝浸膏用等级为色谱纯的甲醇溶解，
进样浓度为1mg·mL-1，进样前用0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC进样量10μL。
1.1.2.2灵芝原料药及其高效液相指纹图谱供试品制备方法
灵芝原料药的制备参见文献：黄书铭，杨新林，王帮武等.灵芝三萜类化合物的
制备工艺与检测方法研究.中国中药杂志，2003，28(4)：332-334。
高效液相指纹图谱供试品制备如下：将灵芝浸膏用氯仿溶解后，倾入球形
分液漏斗中，加入饱和NaHCO3溶液萃取。充分振荡、静置，收集上清液，下
层氯仿部分复加入饱和NaHCO3溶液，分2次萃取，收集、合并三次上清液，
冷却至0℃，准备酸化。用6mol·L-1冷盐酸将碱提液酸化至pH3.0，酸化后的
碱提液用氯仿按1∶1(V/V)萃取3次，收集氯仿溶部分，减压蒸干得到淡黄
色固体三萜类化合物结晶。将上述三萜类化合物用等级为色谱纯的甲醇溶解，
进样浓度为1mg·mL-1，进样前用0.22μm微孔滤膜过滤，HPLC进样量10μL。
1.1.2.3灵芝注射剂的制备方法
精确称取烘干并恒重后的灵芝三萜类化合物固体粉末，用9％碳酸氢钠溶
解，使溶解后的三萜类化合物最大质量百分浓度为100mg·mL-1，用注射用水稀
释10倍，使最终的质量百分浓度为10mg·mL-1。用1mol·L-1的盐酸浓度调最
终pH值为7.2。用孔径为0.22μm的细菌滤器进行无菌过滤。将上述滤液进行
无菌分装，即得到灵芝注射剂水针制剂。将上述分装好的无菌滤液在-40℃温
度下真空冷冻干燥，即得到灵芝注射剂粉针制剂。
1.1.2.4灵芝注射剂的高效液相指纹图谱(FP-HPLC)供试品制备方法
精确称取烘干并恒重后的灵芝三萜类化合物固体粉末，用9％碳酸氢钠溶
解，使溶解后的最大质量百分浓度为100mg·mL-1，即为灵芝注射剂水针制剂。
用6mol·L-1的冷盐酸酸化使最终pH值为3.01。以氯仿等量体积萃取2次，萃
取液合并后40℃减压浓缩干燥，得到淡黄色三萜类化合物固体结晶。精确称
取上述固体结晶，用等级为色谱纯的甲醇溶解，进样浓度为1mg·mL-1。灵芝
粉针制剂和水针制剂FP-HPLC供试品在进样前分别用0.22μm微孔滤膜过滤，
HPLC进样量10μL。
1.2试验方法
1.2.1相对保留时间值α和相对峰面积值RA
相对保留时间值α的计算 选择一个保留时间较居中且在各样品中均存在
有效组分的色谱峰作为参照物，指定它的α值为1，然后分别求出各样品中各组
分的相对保留时间值α(α＝tRi/tRα，其中tRi为各组分的出峰时间，tRα为参
照峰的出峰时间)。灵芝原料1号样品、灵芝原料药5号样品、灵芝注射剂粉针
及水针制剂3号样品色谱峰总面积较大，峰数较多且具有代表性，故将其指定
为标准，以保留时间24.2min峰为参照峰，计算各待测峰的相对保留时间值α
和相对峰面积值RA。
α值窗口的设定 因保留时间受各种实验因素的影响，每一次实验的数据
不可能完全一致，故对每个峰位的α值根据统计学的处理设定窗口≤5％，即通
过实验数据算出每个峰的α值可信度限制在±5％的范围内。
相对保留值指纹图谱的建立 取某一样品的色谱峰总面积为分母，各样品
每个色谱峰面积为分子，求得该色谱峰的相对面积值(RA)，将它标在其α值项
下，最后将各样品的α值按小到大的次序排列成行，得到样品的相对保留值指
纹谱，其中无相应的相对面积RA时表示该样品不具有该α值的色谱峰。
1.2.2共有指纹峰的标定
在用色谱指纹图谱研究的样品中，具有相同相对保留时间值α的峰，即为
色谱指纹图谱共有峰。根据四种灵芝供试品的检测结果，标定灵芝抗肿瘤组分
三萜类化合物的共有指纹峰。提供2小时的记录图，以考察1小时以后的色谱
峰情况。
1.2.3指纹图谱中色谱峰的重叠率
重叠率的计算是以参照物(四种供试样品分别以灵芝原料1号样品、灵芝
原料药5号样品、灵芝注射剂粉针及水针3号样品为参照物)的指纹谱为基准，
将它的出峰数目和欲对比样品的出峰数之和为分母，两者具有相同α值的峰数
之和为分子，以此分别求出样品的重叠率。
1.2.4仪器精密度试验
主要考察仪器的精密度。分别取同一供试品，按照供试品制备方法，连续
进样5次，考察主要色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。
相对标准偏差是试验可信度的一种考察标准，根据检测数据，计算四种供
试品仪器精密度试验的相对标准偏差RSD。
RSD = nΣ x 2 - ( Σx ) 2 n ( n - 1 ) X ‾ ]]>
1.2.5重现性试验
分别取同一批号的供试品5份，按照供试品制备方法，考察主要色谱峰的
相对保留时间、峰面积比值的一致性。根据检测数据，计算四种供试品重现性
试验的相对标准偏差RSD。
1.3结果与讨论
1.3.1共有指纹峰
在FP-HPLC中，具有相同α值的峰，即为共有指纹峰。结果显示，灵芝原
料药10批次供试品的色谱指纹图谱相对保留值α：0.51、0.62、0.69、0.78、0.88、
0.92、1.00、1.07、1.12、1.27、1.48、1.61、1.72为各样品所含三萜类化合物的
100％共有指纹峰，这13个色谱峰为三萜类化合物组分的基本组成成分，可作
为鉴别灵芝样品所含三萜类化合物的必要条件之一。峰面积占总峰面积5％以上
的色谱峰集中在0.69～1.61区域，均出现8个相同的主峰，相对保留时间α分别
为0.69、0.78、0.88、1.00、1.12、1.27、1.48、1.61。各供试品8个主峰面积百
分数均在70％以上；各供试品色谱峰的重叠率均在90％以上，说明四种灵芝供
试品均含有相同的组分。
1.3.2实验方法学考察结果：
分别取四种不同的供试品，对于同一供试样品，连续进样5次(仪器精度
试验)，以及同一批号的供试品5份(重现性试验)。结果显示，四种不同的灵
芝供试品FP-HPLC中的主要色谱峰，其相对保留时间α和峰面积比值的相对标
准偏差(RSD)均小于3％。说明检测的仪器精度较高，试验方法的重现性较好。
1.4结论
结果表明，灵芝原料、灵芝原料药及其注射剂2种剂型之间所含三萜类化
合物存在着良好的相关性，8种主要成分均在各供试品中有相应的色谱峰，且它
们的色谱指纹图谱极其相似，这说明在制备抗肿瘤注射剂的过程中，灵芝中的
有效组分并未改变，均含有相同的主要成分。
实施例2
按所述相同步骤重复进行实施例1，但在灵芝注射剂的制备方法中，调最终
pH值为7.3。无菌滤液在-60℃温度下真空冷冻干燥，即得到灵芝注射剂粉针
制剂。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂粉针制
剂用2mol·L-1盐酸调pH值为3.0，氯仿萃取1次。减压蒸干温度控制50℃。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂水针制
剂用2mol·L-1的冷盐酸酸化使最终pH值为4.05，进样浓度为0.2mg·mL-1。
实施例3
按所述相同步骤重复进行实施例1，但在灵芝注射剂的制备方法中，调最终
pH值为7.4。无菌滤液在-80℃温度下真空冷冻干燥，即得到灵芝注射剂粉针
制剂。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂粉针制
剂用4mol·L-1盐酸调pH值为4.0，氯仿萃取2次。减压蒸干温度控制55℃。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂水针制
剂用4mol·L-1的冷盐酸酸化使最终pH值为5.0，进样浓度为0.5mg·mL-1。
实施例4
按所述相同步骤重复进行实施例1，但在灵芝注射剂的制备方法中，调最终
pH值为7.3。无菌滤液在-75℃温度下真空冷冻干燥，即得到灵芝注射剂粉针
制剂。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂粉针制
剂用6mol·L-1盐酸调pH值为4.5，氯仿萃取1次。减压蒸干温度控制60℃。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂水针制
剂用6mol·L-1的冷盐酸酸化使最终pH值为4.8，进样浓度为0.6mg·mL-1。
实施例5
按所述相同步骤重复进行实施例1，但在灵芝注射剂的制备方法中，调最终
pH值为7.25。无菌滤液在-53℃温度下真空冷冻干燥，即得到灵芝注射剂粉
针制剂。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂粉针制
剂用2mol·L-1盐酸调pH值为4.8，氯仿萃取2次。减压蒸干温度控制45℃。
在灵芝注射剂的高效液相指纹图谱供试品制备方法中，灵芝注射剂水针制
剂用2mol·L-1的冷盐酸酸化使最终pH值为4.0，进样浓度为1.0mg·mL-1。