毕赤酵母△12－脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列及其应用.pdf

本发明涉及一种从毕赤酵母中分离的编码Δ12－脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列，它是具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的片段、类似物和衍生物。本发明包括编码Δ12－脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列与外源性调节序列连接，进行功能性表达的载体以及含有本发明载体的细胞生物体以及这类生物体的子代。用上述的核苷酸序列或多肽序列或含有本发明载体的细胞生物体以及这类生物体的子代生产不饱和脂肪酸的方法，以及使用SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列作为鉴定相关序列的探针。

1、  一种毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列，其特征在于它是具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，或该核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。

2、  按照权利要求1所的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是选自：
(a)编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；
(b)与核苷酸序列(a)互补的核苷酸序列，或
前述有至少65％相同性的核苷酸序列。

3、  按照权利要求1所的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是具有第64-1230bp的核苷酸序列或具有第1-1314bp的核苷酸序列。

4、  一种多肽，其特征在于它是具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超过30％。

5、  一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。

6、  按照权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于它是pYPPD12。

7、  一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自：
(a)它是用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；
(b)它是用权利要求5所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。

8、  按照权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。

9、  按照权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是酿酒酵母细胞。

10、  权利要求1-9任一项用于生产不饱和脂肪酸的应用。

毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及从一种酵母—毕赤酵母(PichiaPastoris)中克隆Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因，具体讲是毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列及其应用。将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶产生不饱和脂肪酸的方法和应用。
背景技术
Δ¹²-脂肪酸脱氢酶属于一类膜整合酶。到目前为止，由于分离和鉴定膜结合蛋白的难度很大[MaKeon，1981，酶学方法，12141-12147；Wang等，1988，植物生理学生物化学，26：777-792]，因此很难得到包括Δ¹²-脂肪酸脱氢酶在内的各种膜结合蛋白性质脱氢酶的高级结构，而只能通过对酶的核苷酸序列进行初步研究，或者在异源的受体内表达来研究酶的底物特异性。序列比对的结果表明，编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列具有共同的结构特征：存在三个组氨酸保守区His I区HECGH、His II区HXXHH和His III区HVXHH，形成4次跨膜的结构[Kyte et al.，1982，J.Mol.Biol.157：105-132]，这些都是维持脱氢酶活性所必需的[Napier JA，Sayanova O，StobartAK，et al.，1997，Biochem.J.，328：717-720]。包括人在内的哺乳动物体内由于缺少Δ¹²-脂肪酸脱氢酶而只能初步合成饱和的和单不饱和脂肪酸，不能合成含两个和两个以上双键的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，这些多不饱和脂肪酸必须从食物中获取。因此，亚油酸(linoleic acid，LA)和α-亚麻酸(α-linoleic acid，ALA)是人体必需脂肪酸。膳食性摄入亚油酸和α-亚麻酸，经Δ⁶-脂肪酸脱氢酶催化转化成γ-亚麻酸(γ-linoleic acid，GLA)和十八碳四烯酸(Octadecatetraenoic acid，OTA)，它们又在其它相关酶的催化下可进一步转化成其它长链多不饱和脂肪酸(long-chainpolyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs)[Horrobin DF，1992，Prog Lipid Res.，31：163-194]。这些长链多不饱和脂肪酸是机体组织生物膜组成成分，起到维持细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用，同时也是前列腺素、环前列腺素和白介素类等具有强烈生理活性的自身调节物的前体[Napier JA et al.，1999，Curr.Opin.Plant Biol.，2：123-127]，因此包括亚油酸在内的多不饱和脂肪酸在保健和医疗方面有很广阔的应用前景。研究不饱和脂肪酸的合成和它的生理作用成为当前的热点之一。
对于脂肪酸脱氢酶的生物学功能，许多实验室采用了从各种生物体中克隆相关地基因并转入各种受体中，在受体中观察受体的脂肪酸改变的方法。目前，已从动物、植物、微生物等不同来源中分离到许多Δ¹²-脂肪酸脱氢基因的同源序列，并且证明具有相应的生物学功能。尤其是近几年来随着双功能Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的发现(Edgar B.Cahoon etal，2001，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.，26：2637-2643.)和共轭油酸在医疗保健功能的发掘，人们的注意力又开始转向对Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的研究上。
发明内容
本发明的一个目的是提供从毕赤酵母中分离的编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列或其核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。从一种酵母—毕赤酵母(Pichia pastoris)中克隆Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因，具体讲是毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列及其应用。将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶产生不饱和脂肪酸的方法和应用。
本发明的另一个目的是提供该核苷酸序列所编码的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶多肽、或其片段、类似物或衍生物。
本发明的另一个目的是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能性表达的重组载体。
本发明的另一个目的是提供含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导的宿主细胞及其后代。
本发明的另一个目的是提供一种用含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞或该核苷酸序列所编码的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶多肽制备不饱和脂肪酸的方法。
本发明的第一方面，提供的是具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的片段、类似物和衍生物。
分离的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少65％的同源性：(1)具有编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；(2)与核苷酸序列(1)互补的核苷酸序列。准确地，该核苷酸序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。更准确地，该核苷酸序列是选自下组中的一种：(a)具有SEQ ID NO：1序列中1-1394的序列：和(b)具有SEQ ID NO：1中84-1346的序列。
在本发明的第二方面，提供分离的这个核苷酸序列所编码的多肽，该多肽包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性变异多肽、或其衍生类似物。准确地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超过30％的衍生物。
本发明的第三方面，提供了含有上述核苷酸序列的重组载体，以及被上述核苷酸序列或重组载体转化的宿主细胞及其后代细胞。
本发明的第四方面，提供了一种用含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导宿主细胞及其后代细胞或用该核苷酸序列所编码的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶多肽制备不饱和脂肪酸的方法。
本发明的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列和多肽是没有分离纯化的，但同样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的核苷酸序列”是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化的。
本发明提供了一种新的分离的核苷酸序列——编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列，其基本上是由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的，其特征是：该序列长为1394bp(碱基)，其中85-1347为编码Δ¹²-脂肪酸脱氢酶成熟多肽SEQ ID NO：2的开放阅读框；1bp-84bp为5`非转译区序列，1348bp-1394bp为3`非转译区序列。
本发明提供了分离的核苷酸序列，该核苷酸序列基本由编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列组成。具体地，本发明的核苷酸序列具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
编码SEQ ID NO：2活性多肽的核苷酸序列包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列”是指包括编码毕赤酵母Δ -¹²脂肪酸脱氢酶多肽的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列。
本发明的核苷酸序列可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。
本发明还包括编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。如本发明所用，术语“片段”、“类似物”和“衍生物”是指能编码基本上保持本发明天然的相同的生物学功能或活性的多肽的核苷酸序列。
通过本文的阐述，这样的片段、类似物或衍生物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明核苷酸序列的片段、衍生序列或类似序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分离序列的人工突变体，它还具有所需的酶促功能。还可以是所述的核苷酸序列与脂肪酸生物合成的其它基因的融合序列。
如SEQ ID NO：1所示的衍生物或功能性衍生物表示的等位变异体，它在衍生的氨基酸水平具有至少75％的同源性，优选至少80％的同源性，特别优选85％的同源性，非常特别的优选是90％的同源性。所述同源性是基于完整氨基酸片段计算的。由所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，同源性表示同一性，就是说氨基酸序列至少70％相同。所述的新核苷酸序列在核酸水平上至少具有65％的同源性，优选至少70％的同源性，特别优选75％的同源性，非常特别的优选是80％的同源性。
衍生物还表示SEQ ID NO：1所示序列的同系物，如真核同系物、截短的序列，但仍具有所需功能，就是说具有这种蛋白的酶促活性，因此，功能性等同物包括上述序列的的天然变体和人工核苷酸序列。
非编码的衍生物还表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反义DNA。所述的反义DNA属于本发明的无功能衍生物。如不具备酶促活性的衍生物。可用本领域的技术人员熟知生产无功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和内含子的使用。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核苷酸序列(两个序列之间具有至少50％的同源性，优选至少70％的同源性)，并且，可杂交的核苷酸序列编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，优选是至少20-30个核苷酸，特别优选是至少50-60个核苷酸，非常特别的优选是至少100个核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码的核苷酸序列。
本发明中的多肽和核苷酸序列优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于：(1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的核苷酸序列；和(2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序列片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：(1)从基因组DNA分离双链DNA序列；(2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是DNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，用试剂盒也可从商业途径获得。而构建cDNA文库也是通常的方法。当结合聚合酶链式反应技术(PCR)时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因，这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或消失；(3)测定的转录本的水平；(4)通过免疫学技术测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。在第(1)中方法中，杂交所用的探针是与本发明的核苷酸序列的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，优选是至少30个核苷酸，特别优选是至少50个核苷酸，非常特别的优选是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内。此处所用得探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki et al.，1985，Science，230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的核苷酸序列信息适当的选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明还提供了一种新的多肽序列—毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列，其基本上是由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中产生。
本发明的多肽包括的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“类似物”和“衍生物”是指基本上保持本发明天然的相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代、倒位、插入或缺失；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。
本发明也涉及含有编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列和外源性调节序列元件结合进行功能性表达的重组表达载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。能够影响基因表达产物的序列元件包括有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等[Sambroook，et al.，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989]。所述的编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的P_L启动子：真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录。如腺病毒增强子。
本发明还涉及用含有本发明编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列的重组载体或直接用编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列经基因工程产生的宿主细胞。本发明中，编码毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。宿主细胞的代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域是众所周知的。也可用MgCl₂，电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。
本发明还涉及用上述转基因宿主细胞生产，根据宿主细胞，用本领域技术人员所共知的方法生长或培养。比如微生物细胞通常是在0-100℃，优选10-60℃，同时还要氧气。培养基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有机氮的形式，如酵母提取物、氨基酸，或盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、镁盐，如果需要的话还有维生素。在此期间培养基的pH可以保持固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以分批培养、半不连续培养或连续培养形式进行。在培养之后，收集细胞，捣碎或直接使用，通过本领域技术人员熟知的方法从细胞中提取脂肪酸。
本发明还涉及一种制备不饱和脂肪酸的方法，该方法是这样实现的，将具有饱和或不饱和脂肪酸甘油三酯与SEQ ID NO：2一起培养。该方法优选是在由能够摄取或释放还原性等同物的化合物存在条件下进行的。然后，可以从甘油三酯中释放脂肪酸。上述方法优选可以合成具有12位双键的脂肪酸。
本发明还涉及用上述方法制备不饱和脂肪酸，以及将其应用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品用途。
附图说明
图1、显示所推测的毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的疏水图，两条实线表示推测的两个疏水域。
图2、显示本发明的毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶和克氏酵母(Saccharomyceskluyveri)Δ¹²-脂肪酸脱氢酶(AB115968.1)的氨基酸序列同源性比较图。
图3、显示所构建的酿酒酵母表达载体pYPPD12。
图4A、显示亚油酸甲基酯标准物的气相色谱图。
图4B、含pYES2.0空载体的转基因酵母的气相色谱图。
图4C、含重组质粒pYPPD12的转基因酵母的气相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。
实施例1  从毕赤酵母中分离Δ¹²-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列
根据刘晓勇等(刘小勇等，1997，提取植物和微生物DNA的SDS-CTAB改进法，北京林业大学学报，100-103。)提供的方法从培养48小时的毕赤酵母菌丝体中提取总的DNA，取5μg为模板进行聚合酶链式反应。根据所发表的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶同源序列的组氨酸保守区I和III区氨基酸序列设计兼并引物(引物1和引物2)，以上述提取的DNA为模板在T-Gradient PCR仪(Biometra公司)上进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：引物1：5-CA(TC)GA(AG)TG(TC)GG(I)CA(TC)CA(CAG)-3`
                引物2：5`-(AG)TG(AG)TGIGCIAC(GA)TGIGT-3`
反应组分              加入量       终浓度
模板DNA               5μl
缓冲液(10×)
(含20mmol/L MgCl<sub>2</sub>)   5μl         1×
dNTP(2.5mmol/L)       4μl         0.4mmol/L
引物1(10μmol/L)      1μl         0.2μmol/L
引物2(10μmol/L)      1μl         0.2μmol/L
Taqase(5u/μl)        0.5μl        2.5u/反应
H<sub>2</sub>O                  33.5μl
———————————————————————
总体积                50μl
扩增条件：94℃变性3min，再用94℃ 1min；55℃ 1min→72℃ 1min进行30个循环，最后72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增得到大小约750bp的片段，用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEM-T(Promega公司产品)中；连接产物转化到用CaCl<sub>2</sub>法处理的大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory，New York，p19-21]提取质粒，经NcoI和SacI双酶切和PCR扩增鉴定正确，测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。测序结果显示所扩增得到的片段大小为681bp，通过其编码的氨基酸序列在Genbank数据库中用Blast程序(Basic local Alignment seatchtool)[Altschul SF et al，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402]进行同源检索，检索结果表明与该片段最相似的同源片段为Δ<sup>12</sup>脂肪酸脱氢酶，但并不完全相同，证明所扩增片段为新的潜在脱氢酶基因的片段。
根据所获得的部分序列设计基因特异性引物(引物3和引物4)，利用cDNA末端扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)获得包含上述片段的基因的3`和5`末端序列。先提取细胞总RNA，用SMRT<sup>TM</sup>ACER cDNA Amplification Kit(Clontech公司产品)反转录合成第一条cDNA，用基因特异性引物和试剂盒提供的接头引物，按PCR扩增试剂盒(Clontech公司产品)分别进行3`和5`末端序列的PCR。
引物3(3`RACE)：5-TGACCTGGGTATCTTGGCAC-3，(SEQ ID NO：3)
引物4(5`RACE)：5`-AACTTCTCCTTTGTGGCAGG-3`(SEQ ID NO：4)
模板cDNA 2.5μl、缓冲液(10×)5μl、dNTP(50×)1μl、引物3(10μmol/L)1μl、引物4(10μmol/L)1μl、Advantage2 Polymeerase Mix 1μl、H2O 34.5μl  扩增条件：先95℃变性2min，进入95℃ 30sec 68℃ 3min，共进行30个循环。PCR扩增产物采用上述相同的方法鉴定、测序。序列分析结果显示3`RACE扩增获得从引物3序列到polyA前共531bp的序列信息，而5`RACE获得从引物4序列到末端接头序列之间共641bp的序列信息。用序列分析软件(DNAMAN Version4.0，Lynnon BioSoft)将三个片段进行拼接并进行分析，得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其中85bp-1347bp(ATG----TAG)为潜在的开放阅读框，编码420个氨基酸。两侧分别为5`非转译区(84bp)和3`非转译区(47bp)。根据两个末端序列，设计基因特异性引物(引物5和引物6)按3`和5`RACE条件PCR扩增、测序，所的结果和拼接结果一致。
引物5：5`-AGGAGATTACTGTTAATAAAAGTAGGGTAC-3  (SEQ ID NO：5)；
引物6：5`-AAAATTTAAACATAACTTAATCTAC-3  (SEQ ID NO：6)；
实施例2：所分离核苷酸序列的同源性搜索
将推测Δ<sup>12</sup>-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列在Genbank上进行同源性搜索，所得同源序列大部分为编码Δ<sup>12</sup>-脂肪酸脱氢酶的序列，少数编码Δ<sup>15</sup>-脂肪酸脱氢酶以及其它脱氢酶和其它酶的序列，其中与来克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)同源性最高：相同性64％，(附图2，附图2显示本发明的毕赤酵母Δ<sup>12</sup>-脂肪酸脱氢酶和克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)Δ<sup>12</sup>-脂肪酸脱氢酶(AB115968.1)的氨基酸序列同源性比较图，PPD12：本发明的毕赤酵母Δ<sup>12</sup>-脂肪酸脱氢酶，SKD12：来克氏酵母Δ<sup>12</sup>-脂肪酸脱氢酶。(相同的氨基酸在两个序列之间用单字符氨基酸表示)。这说明本发明的新的核苷酸序列所编码的酶具有潜在Δ<sup>12</sup>-脂肪酸脱氢酶的功能。
实施例3：酿酒酵母重组表达载体的构建
根据SEQ ID NO：1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物(引物7和引物8)分离其潜在开放阅读框序列：
引物7：5-CCGGACCATGTCTGCCGTCACAGTTACAG G-3`(SEQ ID NO：7)；
引物8：5`-GGCTTCTAGACTATTTCTCACCGGTTC-3`(SEQ ID NO：8)；
此两个引物的5`端黑体分别含有BamHI和XbaI酶切位点。所用的扩增条件和反应组分和3`和5`RACE相同，扩增产物的测序结果显示和SEQ ID NO：1所示84bp-1374bp的序列一致。然后取50μl PCR产物和1μl pYES2.0分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在4度冰箱中过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见附图3，所构建的含有Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因的酵母表达命名为pYPPD12。该质粒是由pYES2.0(Invitrogen公司)和引物7和引物8的PCR产物构建而成。质粒和分别经BamHI和XbaI双酶切后，电泳回收纯化，经T4DNA Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选鉴定出重组质粒，命名为pYPPD12。
实施例4：重组表达载体转化酿酒酵母细胞
挑取酿酒酵母菌株INVSc1单菌落于10ml YEPD液体培养基中、30℃摇床过夜培养，检测菌液的OD₆₀₀值，取适量菌液稀释于50ml，使OD₆₀₀为0.4；继续培养2到4h后，2500rpm离心沉淀细胞，以40ml 1×TE重悬菌体，2500rpm离心沉淀细胞，以2ml1×LiAc/0.5×TE悬浮细胞，并在室温下放置10min，此细胞即为感受态细胞；取100μl制备好的酵母感受态细胞，加入1μg重组质粒pYPPD12和100μg变性鲑精DNA，混匀，加入700μl 1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE并混匀，于30℃温育30min；然后，加入88μl DMSO混匀，于42℃水浴中热激7min；离心10s沉淀细胞，加入1ml 1×TE悬浮细胞并再次离心沉淀细胞，最后加入100μl重悬细胞，全铺于SC-Ura(无尿嘧啶)选择培养基平板，置30℃培养48-72h。
实施例5：酵母工程菌的诱导表达
挑取SC-Ura(无尿嘧啶)选择培养基平板上出现的阳性转化，接种于15ml SC-Ura选择培养基(含2％的葡萄糖)，28℃摇菌过夜培养，以5％的接种量加入含有2％半乳糖的100ml SC-Ura培养基，28℃继续培养72h；2500rpm收集菌体，用去离子水洗涤三次，50℃烘干，研碎，取100mg加入5ml 5％的KOH-CH₃OH溶液，70℃反应2-3h；反应结束，冷却到室温，用6mol/L的盐酸调节溶液的pH值到2.0，加入4ml 14％BF₃-CH₃OH，70℃反应1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入饱和的NaCl溶液10ml，剧烈震荡混匀，并转移到分液漏斗中，用8ml 1∶4的氯仿∶己烷抽提两次，合并提取液；加入适量无水Na₂SO₄干燥提取液，静置1h，去掉Na₂SO₄，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮气吹干，用200μL的正己烷回溶样品，后用0.45mm的微孔滤膜过滤。
实施例6：脂肪酸气相色谱分析
按如下条件进行：
仪器为岛津GC-7A，柱子：弹性石英毛细管柱，0.32×30m，固相支持物：聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)镀膜物：聚酰亚胺。载气：N₂，线速：10cm/s。分流比：100∶1，气化室温度：250℃，柱温：180℃，尾吹：50ml/min，检测器：氢火焰离子化检测器。以Sigma公司生产的LA甲酯为标准品，把上述方法制备的脂肪酸甲酯化的样品，进行GC分析，上样量为1μl；分析软件：Anstar，分析之星色谱工作站。
色谱分析结果见附图4，附图4显示亚油酸甲基酯标准物(4A)、含pYES2.0空载体的转基因酵母(4B)和含重组质粒pYPPD12的转基因酵母(4C)的气相色谱图。通过与已知的脂肪酸甲基酯标准物的保留时间进行比较鉴别出各个峰。图4C中保留时间为14.09min对应的峰即为毕赤酵母Δ¹²-脂肪酸脱氢酶催化油酸产生的亚油酸。
序列列表
                    SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120>毕赤酵母Δ12-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列及其应用
<130>20041210
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1394
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia Pastoris)
<400>1
aggagattac tgttaataaa agtagggtac tcttttgtgt gatactactt agagagctgt     60
gcatttcaac ccaccaattc cacaatgtct gccgtcacag ttacaggtaa taatggtgat    120
gcttcaagaa gtaacaccac caccaccaca aaacgtacag gcaatgtttc ctccttcagc    180
caatccaaag gtttgactgc catagacacc tggggtaacg tcttcaaagt ccctgatttt    240
acaatcaagc aaatcttgga tgctattcca aagcactgct atgaacgcag gctaaccacg    300
tcgttctact acgtgttcag ggacatattc ctcattggtt gtaccatgtt catggggtcg    360
ttcattccca tgattgagaa tgttttcctt agaggcgctg cttacgccgc tttggttttt    420
ctcttatctg ttgagtacac tggtttgtgg gttttggccc acgagtgcgg tcatcaagct    480
ttctccgatt atggttgggt caacgacacc gtgggatgga ttttgcattc ttacctgtta    540
gtcccatatt tttcttggaa atacagtcat ggtaaacatc acaaggctac tggccacttg    600
actagagaca tggtgtttgt acctgccaca aaggagaagt tcttggaaaa gagaaacgcc     660
agcaaacttg gcgaactggg agaagatgct cccattttca cattatatca gttggtagcc     720
caacaattgg gaggctggat tttgtatttg ttcaccaacg ttactggtca accctacccc     780
aacaccccta aatggatgca gaaccacttt gttccctcat ctccaatttt cgaaaaaaag     840
gactactggt ttatcattct gagtgacctg ggtatcttgg cacagttgat ggttttgtat     900
gtgtggagac aacaaatggg aaactggaac ttatttattt actggttcct gccttatgtt     960
ctcaccaacc attggctggt gttcatcaca ttcctgcaac actctgatcc aacgatgcct    1020
cactacgagg ctgaacaatg gacgtttgcc agaggagctg ccgcaaccat cgaccgtgaa    1080
tttggattca ttggaccttt cttctttcac gatatcatcg aaactcacgt cttgcatcac    1140
tatgtgagta gaattccttt ctacaacgcc cgagaggcca gtgaaggtat taagaaagtt    1200
atgggggagc attatcgcta cagtggtgaa aacatgtggg tctctctttg gaagagtgga    1260
cgttcatgtc agtttgttga tggagaaaac ggggtgaaaa tgtaccgtaa catcaataac    1320
tggggtattg gaaccggtga gaaataggat tcatctgaaa tagagtagag tagattaagt    1380
tatgtttaaa tttt                                                      1394
<210>2
<211>420
<212>PRT
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>2
Met Ser Ala Val Thr Val Thr Gly Asn Asn Gly Asp Ala Ser Arg Ser
1               5                   10                  15
Asn Thr Thr Thr Thr Thr Lys Arg Thr Gly Asn Val Ser Ser Phe Ser
            20                  25                  30
Gln Ser Lys Gly Leu Thr Ala Ile Asp Thr Trp Gly Asn Val Phe Lys
        35                  40                  45
Val Pro Asp Phe Thr Ile Lys Gln Ile Leu Asp Ala Ile Pro Lys His
    50                  55                  60
Cys Tyr Glu Arg Arg Leu Thr Thr Ser Phe Tyr Tyr Val Phe Arg Asp
65                  70                  75                  80
Ile Phe Leu Ile Gly Cys Thr Met Phe Met Gly Ser Phe Ile Pro Met
                85                  90                  95
Ile Glu Asn Val Phe Leu Arg Gly Ala Ala Tyr Ala Ala Leu Val Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ser Val Glu Tyr Thr Gly Leu Trp Val Leu Ala His Glu Cys
        115                 120                 125
Gly His Gln Ala Phe Ser Asp Tyr Gly Trp Val Asn Asp Thr Val Gly
    130                 135                 140
Trp Ile Leu His Ser Tyr Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr
145                 150                 155                 160
Ser His Gly Lys His His Lys Ala Thr Gly His Leu Thr Arg Asp Met
                165                 170                 175
Val Phe Val Pro Ala Thr Lys Glu Lys Phe Leu Glu Lys Arg Asn Ala
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Gly Glu Leu Gly Glu Asp Ala Pro Ile Phe Thr Leu Tyr
        195                 200                 205
Gln Leu Val Ala Gln Gln Leu Gly Gly Trp Ile Leu Tyr Leu Phe Thr
    210                 215                 220
Asn Val Thr Gly Gln Pro Tyr Pro Asn Thr Pro Lys Trp Met Gln Asn
225                 230                 235                 240
His Phe Val Pro Ser Ser Pro Ile Phe Glu Lys Lys Asp Trp Trp Phe
                245                 250                 255
Ile Ile Leu Ser Asp Leu Gly Ile Leu Ala Gln Leu Met Val Leu Tyr
            260                 265                 270
Val Trp Arg Gln Gln Met Gly Asn Trp Asn Leu Phe Ile Tyr Trp Phe
        275                 280                 285
Leu Pro Tyr Val Leu Thr Asn His Trp Leu Val Phe Ile Thr Phe Leu
    290                 295                 300
Gln His Ser Asp Pro Thr Met Pro His Tyr Glu Ala Glu Gln Trp Thr
305                 310                 315                 320
Phe Ala Arg Gly Ala Ala Ala Thr Ile Asp Arg Glu Phe Gly Phe Ile
                325                 330                 335
Gly Pro Phe Phe Phe His Asp Ile Ile Glu Thr His Val Leu His His
            340                 345                 350
Tyr Val Ser Arg Ile Pro Phe Tyr Asn Ala Arg Glu Ala Ser Glu Gly
        355                 360                 365
Ile Lys Lys Val Met Gly Glu His Tyr Arg Tyr Ser Gly Glu Asn Met
    370                 375                 380
Trp Val Ser Leu Trp Lys Ser Gly Arg Ser Cys Gln Phe Val Asp Gly
385                 390                 395                 400
Glu Asn Gly Val Lys Met Tyr Arg Asn Ile Asn Asn Trp Gly Ile Gly
                405                 410                 415
Thr Gly Glu Lys
            420
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia Pastoris)
<400>3
tgacctgggt atcttggcac                                                    20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>4
aacttctcct ttgtggcagg                                                    20
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>5
aggagattac tgttaataaa agtagggtac                                         30
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>6
aaaatttaaa cataacttaa tctac                                              25
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>7
ccggaccatg tctgccgtca cagttacagg                                         30
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400>8
ggcttctaga ctatttctca ccggttc                                            27