一种皂苷类成分作为制备抗柯萨奇病毒药物的应用 【技术领域】
本发明涉及一种从中药知母中提取分离的皂苷类有效成分,经药理试验证明可显著抑制柯萨奇B族病毒(Coxsackie Group B Virus)及治疗病毒性心肌炎,更具体指从中药知母中提取分离的有效成分知母皂苷Am,它可在制备抗柯萨奇病毒的药物中应用。
背景技术
柯萨奇病毒可引起多种疾病,如柯萨奇B族病毒主要引起病毒性心肌炎。病毒性心肌炎系以心肌细胞变性坏死、炎性细胞浸润为主要病变的一种临床常见病,在儿童和青少年中高发,严重危害人类健康。
目前,西医临床治疗病毒性心肌炎的主要方法是使用普通抗病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞营养剂等,但疗效并不理想。
近年来,中医药在病毒性心肌炎的临床治疗中显示出极大优势。目前临床上针对病毒性心肌炎的中成药只有个别品种,且均为粗提物制剂(如芪冬颐心口服液),大多为医生自拟的处方汤药,急需开发出有针对性,有效成分和药理作用清楚,剂型先进,服用方便,质量稳定可控的中药制剂。
中药知母清热泻火,生津润燥,主要具有抗菌、解热、降血糖等作用,但未见其治疗病毒性心肌炎的有效部位和有效成分的报道。知母皂苷AIII单体成分的药理作用也未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是克服常规中药存在的不足之处,从中药中寻找一类结构确定,具有抗病毒作用且在制备抗柯萨奇病毒和预防治疗病毒性心肌炎药物中应用。采用化学方法从中药知母中分离出有效成分——知母皂苷AIII,经药理试验,使该化合物在制备抗柯萨奇病毒和治疗病毒性心肌炎的药物中应用。
本发明采用中药知母药材经乙醇回流提取3次,将滤液减压回收,制成知母浸膏,再以少量水溶解,用水饱和正丁醇萃取,正丁醇层用甲醇拌样上硅胶柱,用正丁醇-氯仿(1∶1)洗脱,分离得到纯化合物知母皂苷AIII。结构式如下:
它的分子式为C39H64O13,分子量为740,化学名为萨尔萨皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。
知母皂苷AIII提取工艺参考“中药化学成分提取分离手册”,杨云主编,中国中医药出版社,1998年第一版。
本发明采用上述方法提取得到的知母皂苷AIII首先进行常规的药效试验。
体内试验:
将Balb/c小鼠随机分为3组。
1、正常对照组:不给知母皂苷AIII,不接种病毒,只给等量蒸馏水;
2、病毒对照组:腹腔接种0.1mlCVB3病毒液(TCID50=10-7.5,105倍稀释)。
3、给药组:同上法接种CVB3病毒液,同日灌胃知母皂苷AIII(知母皂苷AIII溶于少量二甲亚砜,再用生理盐水稀释至8.35mg/ml)0.15mmol/kg·d,连续给药7天,观察15天;
观察小鼠的饮食、毛色及活动情况等,并统计死亡率。
实验结果显示,病毒组死亡50%,而本发明药物能将由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率显著降低到7.1%。
本发明采用上述试验的剂量分组,连续给药7天,观察15天,然后将小鼠解剖,在解剖前秤小鼠体重,解剖后再秤取其心脏重量,然后计算出它的心指数。计算方法为:
心指数=心重/体重
当动物被病毒感染后,摄食量减少,体重降低,而心脏却因此膨大,发生纤维化而变重,所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度,心指数越大,心脏病变越严重。
结果显示,本发明药物能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数。
小鼠心脏置福尔马林中固定后,做病理切片。然后在显微镜下观察炎性细胞浸润和心肌细胞坏死情况。每个标本观察5个视野,每个视野病变0-25%记为1,25%-50%记为2,50%-75%记为3,75%-100%记为4,如无病变则记为0。
实验结果表明,本发明药物能有效改善由柯萨奇B3病毒引起地小鼠心脏的病变程度。
体外试验:
取SD大鼠1-3天的乳鼠,做心肌细胞原代培养。24h后加入病毒液孵育1h,弃去病毒液,将本发明药物溶解于生理盐水中,用培养液适当稀释后加入细胞培养板培养。72h后将细胞培养板反复冻融3次,使病毒颗粒充分释放,测定每个孔的病毒滴度。
结果显示,本发明药物可有效降低柯萨奇B3病毒感染细胞的病毒滴度,具有显著的体外抗病毒效果。
注:试验方法参考《现代药理实验方法》(下册,P1425,张均田主编,北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998年版)。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述,但不对其有任何限制。
实施例1:本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响试验(体内)
取Balb/c小鼠34只,随机分为3组。
正常对照组:6只,不给本发明药物,也不接种病毒,只给等量蒸馏水。
病毒对照组:14只,每只腹腔接种0.1mlCVB3病毒液(TCID50=10-7.5,105倍稀释)。
给药组:14只,同上法接种CVB3病毒液,同日按0.15mmol/kg·d灌胃给予本发明药物,连续给药7天,观察至第15天。
观察记录给药(饲养)期间动物的精神状态、饮食、毛色及死亡等情况。
结果:本发明药物能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率,见表1。
表1 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响组别动物数(只)死亡例数死亡率正常对照组病毒对照组给药组61414071050%7.1%**
注:采用卡方检验,给药组与病毒组比较,**P<0.01
实施例2:本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响试验(体内)
Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例1。连续给药7天,观察到第15天,将所有小鼠全部解剖。在解剖前秤小鼠的体重,解剖后再秤取其心脏重量。
心指数=心重/体重
当动物被病毒感染后,摄食量减少,体重降低,而心脏却因此膨大、发生纤维化而变重,所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度,心指数越大,心脏病变越严重。
结果:本发明药物能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数,见表2。
表2本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响
组别 心指数(×10-3)
正常对照组 5.80±0.60
病毒对照组 8.23±1.33
给药组 6.20±0.57*
注:给药组与病毒组比较:*p<0.05,**p<0.01
实施例3:本发明药物对病毒性心肌炎小鼠病理切片的影响试验(体内)
Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例1。给药7天,观察到第15天,解剖后将小鼠心脏置福尔马林中固定,做病理切片。在显微镜下观察心肌炎性细胞浸润和心肌纤维坏死情况。每个标本观察5个视野,每个视野病变0-25%记为1,25%-50%记为2,50%-75%记为3,75%-100%记为4,如无病变则记为0。
实验结果表明,本发明药物能有效改善由柯萨奇B3病毒引起的小鼠心脏的病变程度。
表2本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心脏病理切片的影响组别0++++++++++均值病毒组给药组14251001332.21.46*
注:采用非参数统计检验,给药组与病毒组比较,*P<0.05
实施例4:本发明药物对病毒感染细胞病毒滴度的影响(体外)
取SD大鼠新生1-3天的乳鼠,做心肌细胞原代培养,用24孔培养板在CO2培养箱中培养。24h后弃去培养液,加入1∶60稀释的病毒液孵育1h,弃去病毒液,将本发明药物溶于生理盐水中(10mg/ml),再用培养液将药物溶液1∶200稀释,加入细胞培养板培养。72h后,病变发展到适当程度,将细胞培养板反复冻融3次,使病毒颗粒充分释放,用hep-2细胞测定病毒滴度。
所得结果以负对数表示,称为中和指数,可以表征病毒毒力。中和指数越大,表示病毒毒力越强。根据国家药监局发布的《新药药效学研究指导原则》中“抗病毒性心肌炎药物”一章中所述,对于抗病毒药物,病毒毒力降低1个指数,即中和指数降低1,就算有效。
结果显示,本发明药物可有效降低柯萨奇B3病毒感染细胞的病毒滴度,具有显著的体外抗病毒效果。
表3本发明药物对病毒感染细胞病毒滴度的影响组别中和指数病毒对照组药物培养组4.752.13*
注:根据《新药药效学研究指导原则》,*为有统计意义。