噬菌体多肽的荧光蛋白标记体系的建立方法 技术领域
本发明涉及一种用于噬菌体多肽鉴定的荧光蛋白标记体系的建立方法，尤其是一种噬菌体多肽融合荧光蛋白表达载体的构建方法，属于分子药理学技术领域。
背景技术
噬菌体展示技术中对噬菌体多肽的鉴定通常都是采用免疫学相关方法对噬菌体颗粒进行追踪。但这种方法有其明显的局限性：首先在鉴定过程中依然是采用噬菌体与多肽融合表达的方式，无法排除噬菌体颗粒上蛋白对于多肽的干扰因素，因此很难对多肽的导向性能做出肯定的解释，其次一般的免疫学鉴定方式都是首先将细胞或者组织固定化以后鉴定，这样就不能对多肽在体内的作用过程进行实时观察。另外，目前业内通常采用人工合成多肽，并进行FITC(异硫氰酸荧光素)荧光标记的方法进行鉴定，但是这种方式具有费时较长、合成成本高、难以大量重复等缺点，同时由于FITC的毒性作用，这种方式也难以运用于活体的实时检测。
近年来发展起来的GFP生物标记技术具有很好的应用前景，它可以在生物体内直接发光，且发光稳定，对细胞没有任何毒害作用因此非常适合于对细胞以及组织地活体观察。目前已经广泛的运用于生物学的各个领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种费时较短、成本较低、适合于对细胞以及组织的活体观察的噬菌体多肽荧光蛋白标记体系的建立方法。
本发明采用分子生物学以及基因工程的方法对我们筛选得到的噬菌体多肽与荧光蛋白进行融合表达，以建立噬菌体肽在体内外，与肿瘤结合的特性以及与其他无关器官组织的非特异性结合情况的定性、定量检测方法。为实现本发明的目的本发明首先构建了一个荧光蛋白突变体的新型温度诱导型重组质粒载体，并对其物理、生物化学特性以及荧光蛋白的表达特性进行了研究，在此基础上构建了噬菌体多肽荧光蛋白表达载体，具体而言构建步骤如下：
第一步：对荧光蛋白基因进行改造，使其在氨基端获得新的酶切位点，用限制性内切酶对克隆载体上的荧光蛋白基因进行双酶切，回收目标荧光蛋白基因后，与同样经双酶切处理的表达载体进行连接，再转化到感受态大肠杆菌中，挑选阳性克隆，提取重组原核荧光蛋白表达载体。
本发明所用的荧光蛋白主要是起标记物的作用，所以只要能正确标记噬菌体多肽的荧光蛋白均可采用，本发明优选绿色荧光蛋白GFP。
在第一步中所述的克隆载体优选pBluSKP-GFPS65T载体，与此对应的克隆载体上的荧光蛋白基因为GFPS65T；在选择克隆载体时只要满足能表达荧光蛋白基因GFPS65T的载体均可以在本发明中使用。根据该克隆载体可以选择一系列的限制性内切酶，本发明优选NcoI和SalI限制性内切酶；
在第一步中所述的表达载体优选pBV221；
在第一步中所述的大肠杆菌主要作为宿主细胞，因此所有可以作为宿主细胞的大肠杆菌均可以采用，在本发明中优选DH5α。
因为对荧光蛋白的改造过程仅改变了荧光蛋白首位的一个氨基酸，因此不会对荧光蛋白的荧光产生造成任何影响，同时也为我们对于噬菌体肽荧光蛋白融合表达体系的建立提供了极大的便利。
第二步：根据噬菌体基因设计适用于多种丝状噬菌体的PCR引物，将噬菌体多肽和与其连接的衣壳蛋白部分编码基因共同扩增，再将其连接在经双酶切的重组原核荧光蛋白基因的氨基端，构建成噬菌体多肽融合荧光蛋白表达载体。
在本步骤中进行双酶切的限制性内切酶优选EcoRI和NheI。
由于噬菌体肽所固有的分子量小，结构不稳定的特点，我们考虑在融合表达时最大限度的保持噬菌体肽外环境的稳定。因此在PCR提取噬菌体肽的同时我们将噬菌体衣壳蛋白上与多肽连接的DomainI同时拉出来。在保证以后工作更加便利的基础之上，很好地保持了噬菌体多肽的结构稳定，也最好地保持筛选后多肽导向性。与此同时拉出的噬菌体基因总共仅约300bp(100个Aa)，因此这样的设计也不会给以后的导向治疗带来不便。同时我们研究了常用于构建噬菌体肽库的丝状噬菌体M13、f1等，设计了通用于这两种噬菌体的PCR引物，大大增加了此项技术的适用范围。
本发明与已有技术相比较而言具有显著的有益效果。本发明提供的噬菌体肽融合荧光蛋白表达载体采用的GFP荧光标记技术大大降低了实验的成本和实验时间，整个构建过程仅需要2-3天就可完成，而且我们可以同时进行多个克隆的构建。另外大量的实验证明GFP对于活体组织没有任何毒性，因此我们可以对噬菌体粘附肽进行活体的实时观测。最后，在已构建的GFP荧光标记体系的平台上我们可以非常容易的对噬菌体特异性粘附肽进行毒素分子的偶联，为以后的导向治疗研究打下了良好的研究基础。而且不仅适合体外检测，也适合于活体体内检测。
具体实施方式
实验材料与试剂
1.实验材料：绿色荧光蛋白基因GFPS65T(构建于载体pGlow-TOPO，商品号K4830-01)，大肠杆菌DH5α(商品号11319-019)均购自Invitrogen公司。
2.试剂
(1)酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Proteous Peptone购自英国OXOID公司
(2)DNA快速纯化/回收试剂盒、Tris饱和酚购自北京鼎国生物技术有限公司
(3)琼脂糖购自西班牙BIOWEST生物公司
(4)RNA酶、氨苄青霉素、蛋白Marker购自华美生物工程公司
(5)SalI、NcoI、NheI、EcoRI等连接酶、T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司
(6)λDNA/HindIII+EcoRI Marker、100bpDNA ladder购自北京鼎国生物技术有限公司
3.试剂的配制
培养基：
(1)LB培养基：酵母浸出粉5g；胰蛋白胨10g；NaCl 5g，加水定容至1000ml，调pH到7.0~7.2(固体培养基加2％琼脂)
(2)SOB培养基：酵母浸出粉5g；胰蛋白胨20g；NaCl 0.5g；0.25MKCl 10ml；2M MgCl2 5ml，加水定容至1000ml，调pH到7.0~7.2。
(3)SOC培养基：每1000ml SOB培养基，降温至60℃，加入20ml除过菌的1M葡萄糖，调pH到7.0~7.2。
(4)Tris-乙酸(TAE)：每升中含有0.04mol/L Tris-乙酸；0.001mol/LEDTA
(5)胰RNA酶：将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/l Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/l NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
(6)30％丙烯酰胺溶液：将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌，检测该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。
(7)1mol/L CaCl2溶液：在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成每管10ml贮存于-20℃。
(8)溴化乙锭(10mg/ml溶液)：在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。
(9)β-巯基乙醇(BME)溶液：一般得到的是14.4mol/L溶液，棕色瓶中保存于4℃。
(10)酚/氯仿溶液：把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/LTris·HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液层，保存于4℃。
(11)磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液：在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1000ml，在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min。保存于室温。
(12)10％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液：在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1000ml，分装备用。
(13)1mol/L Tris溶液：在800ml水中溶解121.91g Tris碱，加入浓HCl调节pH值至所需值。
pH HCl
7.4 70ml
7.6 60ml
8.0 42ml
应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1000ml，分装后高压灭菌。
(14)Tris-硼酸(TBE，0.5×)：0.045mol/L Tris-硼酸；0.001mol/LEDTA
(15)2×SDS凝胶加样缓冲液：100mmol/L Tris·HCl(6.8)；200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；4％SDS(电泳级)；0.2％溴酚蓝；20％甘油
(16)0.5M EDTA pH8：800ml H2O中加186.1g EDTA·Na2 2H2O，用NaOH调pH至8.0，定溶至1000ml。
(17)100×TE：800ml H2O中加121.1g Tris，37.2 EDTA Na2 2H2O，用HCl调pH至8.0，定溶至1000ml，高温灭菌。
(18)3M NaAc pH5.2：600ml H2O中加入408.24gNaAc·3H2O，溶解后，用冰醋酸调pH至5.2，然后定溶1000ml，灭菌。
(19)20％SDS：在2000ml热水中缓慢加400g SDS，边加边搅拌，溶解后放置热地方保存。
(20)溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液I可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。
(21)溶液II：0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％SDS。
(22)溶液III：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Ac-5mol/L。
(23)STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。
(24)TBE缓冲液(5×)：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。
(25)SDS蛋白电泳凝胶配方：
储存液 分离胶12％ 浓缩胶5％1.5M Tris-HCl pH8.8 2.5ml /1.0M Tris-HCl pH6.8 / 0.25ml30％Acr-0.8％Bis 4.0ml 0.33ml10％SDS 0.1ml 0.02ml1％APS 0.1ml 0.02mlddH2O 3.3ml 1.4mlTEMED 0.004ml 0.002ml
具体实验过程：
首先构建重组原核荧光蛋白表达载体。
1、PCR定点突变，采用50ul反应体系。模板的制备：采用大量制备质粒的方法抽提大肠杆菌DH5α(pBV221-GFPS65T)，获得质粒pBV221-GFPS65T的浓度为0.02ug/ul。
P1：TAACCATGGCTAGCAAGGGCGAGGAG(其中斜体为NcoI、下划线为NheI)
P2：CCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAG
10×Buffer 5ul
dNTP(10mM) 1ul
P1(50pmol/ul) 5ul
P2(50pmol/ul) 5ul
ddH2O 26ul
模板 5ul
RedTaq(1unit/ul) 3ul
反应条件：
首轮循环：94℃ 3分钟； 50℃ 1分钟； 72℃ 1分钟
后续循环：94℃ 1分钟； 50℃ 1分钟； 72℃ 1分钟(35轮)
末轮循环：94℃ 1分钟； 50℃ 1分钟； 72℃ 10分钟
2、进行酶切，按下表依次加样，37℃水浴酶切反应1小时，电泳检查酶切结果。
ddH2O 20μl DNA 1μl 10×TE Buffer 3μl 0.1％BSA 2μl NcoI 1μl SalI 1μl
3、酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，再用DNA纯化试剂盒分别提纯pBV221中的约3.6kbp片段和pBluSKP-GFPS65T中的约0.7k片段；
4、纯化后的DNA按2∶1比例(pBV221∶pBluSKP-GFPS65T)依照下表依次加样，16℃反应过夜；
ddH2O 25μl10×T4 Ligase Buffer 2.5μl突变后的GFP片段 5μlpBV221载体片断 5μlT4 Ligase 1μl
5、用CaCl2转化法将连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，37℃倒置培养24小时，抗性选用氨苄青霉素；紫外投射仪照射，挑选有绿色荧光的克隆，接种培养；提取阳性克隆质粒，用SalI和NcoI双酶切鉴定。
其次构建噬菌体多肽融合荧光蛋白表达载体。
1、PCR扩增噬菌体基因，采用50ul反应体系。
模板制备：无菌牙签点取蓝色噬菌斑，加入无菌水1ml后煮沸裂解。
P3：GGAATTCATGGTACCTTTCTATTCTCACTC(斜体部分为EcoRI)
P4：CTAGCTAGCGTACTCAGGAGGTTTAG (斜体部分为NheI)
10×Buffer 5ul
dNTP(10mM) 1ul
P3(50pmol/ul) 5ul
P4(50pmol/ul) 5ul
ddH2O 26ul噬菌体模板(106/ml) 5ul
RedTaq(1unit/ul) 3ul
反应条件：
首轮循环：94℃ 3分钟； 50℃ 1分钟； 72℃ 1分钟
后续循环：94℃ 1分钟； 50℃ 1分钟； 72℃ 0.5分钟(35轮)
末轮循环：94℃ 1分钟； 50℃ 1分钟； 72℃ 10分钟
2、按下表依次加样，37℃水浴酶切反应1小时，电泳检查酶切结果。
ddH2O 20μlDNA 1μl10×TE Buffer 3μl0.1％BSA 2μlEcoRI 1μlNheI 1μl
3、酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，再用DNA纯化试剂盒分别提纯噬菌体肽片段和重组原核荧光蛋白片段。
4、纯化后的DNA片段按2∶1比例(噬菌体肽片段和重组原核荧光蛋白片段)依照下表依次加样，16℃反应过夜；
ddH2O25μl10×T4 Ligase Buffer2.5μl噬菌体肽片段5μl重组原核荧光蛋白片段5μlT4 Ligase1μl
连接得到噬菌体多肽融合荧光蛋白表达载体。
本发明还对多肽导向性进行了鉴定。将与GFP融合表达后的B3多肽，与培养的肝癌细胞BEL-7402共同孵育，PBS缓冲液洗脱未结合的B3多肽-GFP后，载玻片滴片在荧光显微镜下观察，发现与对照组(未加GFP融合多肽)相比，细胞膜周围明显可见GFP特有的绿色荧光，证明了噬菌体多肽在脱离噬菌体结构后依然保持了其结合作用。
通过我们的工作，我们首先建立了可以在原核系统中稳定表达的GFP表达体系。在此基础之上我们对GFP基因进行了人工的改造，使其更加适合于与噬菌体插入肽基因的融合表达。最终我们获得稳定表达在大肠杆菌DH5α中的新型GFP基因GFPS65T/NheI(构建于原核表达载体pBV221)，改造过的GFP不但保持了其原有稳定、高效、荧光强度高等特性，还为我们在其氨基端融合噬菌体肽基因提供了便利。最后我们通过PCR扩增，酶切连接等分子生物学常用手段获得了与肝癌组织特异性结合肽B3相融合表达的荧光蛋白，并进行了一系列的多肽结合性鉴定，取得了优良的效果。