糖链天冬酰胺衍生物的制备方法 【技术领域】
本发明涉及糖链天冬酰胺衍生物的制备方法以及糖链天冬酰胺衍生物。
背景技术
以前，通过糖水解酶将糖链分解制备衍生物的技术一直用于糖链的结构解析等数毫克级的分析研究。但是，由于不能大量得到各种糖链的衍生物，因此克等级的研究技术发展缓慢。因此，难以将糖链的衍生物应用于药品制造等合成研究。
另一方面，已知由卵黄能够得到大量糖肽(BiochimicaetBiophysica Acta 1335(1997)p23～32)。但是，并没有大量得到关于图1所示化合物1以及该化合物1中缺失分支糖链的一个非还原末端的唾液酸或半乳糖等几个糖残基的一系列化合物的芴基甲氧基羰基(Fmoc)化的糖链衍生物。另外，也有从人体血液中的蛋白质等少量分离出几种糖链的实例，但是如果将该糖链用于药品的制造，则存在对人体有害的艾滋病病毒或肝炎病毒等混入该药品中的危险性，因此将该糖链应用于药品的技术成了问题。
可是，也有很多用分支型糖链制备其分支部分具有相同结构的糖链的实例。作为这种现有技术，存在三种方法。第一种是由天然存在的糖蛋白分离纯化结合了天冬酰胺的复合型糖链的方法。作为其代表例，有T.Tamura等，Anal.Biochem.，1994，216，p335-344；V.H.Thomas等，Carbohydr.Res.，1998，306，p387-400；K.G.Rice等，Biochemistry，1993，32，p7264-7270等记载的方法。这些方法地优点在于没有必要合成糖链。但是，也存在一些缺点。例如，来源于上述糖蛋白的糖链作为在非还原末端部分随机缺失几个糖残基的糖链的混合物得到，该混合物中含有的糖链由于其物理和化学性质类似，分离成各种糖链非常困难，因此大量得到单一的糖链实际上是不可能的。另外，为了比较大量地得到糖链，也有由人血中的蛋白质(由血纤维蛋白原(fibrinogen)分离：C.H.Hokke等，Carbohydr.Res.，305(1997)，p463-468；由人血清转铁蛋白(Human SerumTransferrin)分离：M.Mizuno等，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，p284-290)分离糖链的实例。如上所述，在人血中的蛋白质中有可能混入了艾滋病病毒和肝炎病毒，必需慎重操作。因此，难以将得到的糖链、其衍生物用于开发医药品。另外，即使得到大量糖链，其结构也是有限的，实际上并没有得到多种结构的糖链或其衍生物的实例。
在K.G.Rice等，Biochemistry，1993，32，p7264-7270或Rice等，Neoglycoconjugate，Academic Press，1994，ISBN 0-12-440585-1 p286-321中，使用糖水解酶由糖链的非还原末端除去了糖残基，但是由于不能大量得到作为原料的单一结构的糖链，因此只能在分析等级实施。E.Meinjohanns(J.Chem.Soc.Perkin Transl，1998，p549-560)等由牛胎球蛋白(Bovine Fetuin)(来源于牛的糖蛋白)得到图5所示的化合物56后，经由图3所示的化合物33，合成了图1所示的化合物10。为了得到最初的原料化合物56，利用了肼分解反应。该肼毒性高，将得到的糖链衍生物应用于医药品时，有可能混入微量的肼，因此在安全性方面存在问题。另外，只能少量得到未结合唾液酸的化合物56、33和10的糖链衍生物。
第二种方法是化学合成糖链的方法。如J.Seifert等，Angew ChemInt.Ed.2000，39，p531-534的报告例所述，现在已经能够利用化学合成法将单糖组合构建约10个糖。这种方法的优点是理论上能够得到所有糖链衍生物。但是，由于其步骤数量庞大，因此存在难以大量合成的缺点。另外，即使合成数毫克约10个糖残基结合而成的糖链，也需要近1年的时间。迄今为止虽然有一些化学合成糖链的实例，但现状是大多数仅能合成数毫克作为目的物的糖链。
第三种方法是将酶反应和化学反应组合合成糖链的方法。作为其代表例，有例如Carlo Unverzagt，Angew Chem Int.Ed.1996，35，p2350-2353的报道。这种方法是利用化学合成构建某种程度的糖链后，利用酶反应在糖链上加成糖残基，使糖链延长的方法。但是，由于延长糖时使用的酶具有基质特异性，因此能够导入糖链的糖的种类受到限制。另外，由于化学合成的步骤数量庞大，因此难以大量合成，最终只能得到少量目的物。另外，C.H.Lin(Bioorganic & MedicinalChemistry，1995，p1625-1630)等采用M.Koketsu等报道的方法(J.Carbohydrate Chemistry，1995，14(6)，p833-841)，由卵黄得到唾液酸寡糖肽，然后使用糖水解酶、糖转移酶，改变了糖链的非还原末端部分的结构。在该论文的图中，记载了非还原末端部分仅结合了1个天冬酰胺(Asn)残基的糖链，但是按照J.CarbohydrateChemistry，1995，14(6)，p833-841报道的方法，得到糖链的非还原末端除天冬酰胺以外还结合了平均2.5个赖氨酸等几种氨基酸的物质的混合物。因此，不能作为单一化合物得到糖链的衍生物，另外，也没有暗示得到大量有关分支型糖链的分支糖链的糖残基任意缺失的化合物的各种衍生物。在C.H.Lin等的论文中，也没有给出作为单一产物得到糖链肽的根据。Y.Ichikawa在Glycopeptide and RelatedCompounds(Marcel Dekker，Inc.，1997，ISBN 0-8247-9531-8，p79-205)中指出，对3支链型的复合型糖链从末端依次用糖水解酶处理，能够从糖链的非还原末端依次除去糖链，得到各种糖链的衍生物。但是，并没有叙述酶处理后如何分离各种糖链，另外，仅合成了支链均一的物质。因此，认为采用该方法，也不能大量得到有关分支型糖链的分支糖链的糖残基任意缺失的化合物的各种衍生物。
发明公开
本发明的目的在于提供一种糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，与以前相比能够非常容易且大量地得到医药品开发等领域中有用的各种分离的糖链天冬酰胺衍生物。另外，本发明的目的还在于提供一种糖链天冬酰胺的制备方法和糖链的制备方法，其中包括制备糖链天冬酰胺衍生物的步骤，与以前相比能够非常容易且大量地分别得到与糖链天冬酰胺衍生物同样有用的各种分离的糖链天冬酰胺和糖链。而且，本发明的目的还在于提供一种新型的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺和糖链。
也就是说，本发明涉及：
(1)一种来源于糖链天冬酰胺的糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，其中，包括下述步骤：
(a)在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入脂溶性的保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物，以及
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将得到的混合物供于色谱法，分离各种糖链天冬酰胺衍生物。
(2)如上述(1)所述的糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，进一步包括步骤(b’)，即，使用糖水解酶将步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物水解。
(3)如上述(1)或(2)所述的糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或该化合物中缺失1个以上糖残基得到的化合物。
(4)如上述(1)～(3)中任意一项所述的糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，脂溶性的保护基是芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
(5)如上述(1)～(3)中任意一项所述的糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，步骤(a)是在含有1种或2种以上在非还原末端具有唾液酸残基的糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入Fmoc基，并在唾液酸残基上导入苯甲基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的步骤。
(6)一种糖链天冬酰胺的制备方法，其中，包括下述步骤：
(a)在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入脂溶性的保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物，
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将得到的混合物供于色谱法，分离各种糖链天冬酰胺衍生物，以及
(c)除去步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，得到糖链天冬酰胺。
(7)如上述(6)所述的糖链天冬酰胺的制备方法，进一步包括下述步骤：
(b’)使用糖水解酶将步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物水解的步骤，和/或
(c’)使用糖水解酶将步骤(c)得到的糖链天冬酰胺水解的步骤。
(8)如上述(6)或(7)所述的糖链天冬酰胺的制备方法，含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或该化合物中缺失1个以上糖残基得到的化合物。
(9)如上述(6)～(8)中任意一项所述的糖链天冬酰胺的制备方法，脂溶性的保护基是Fmoc基。
(10)如上述(6)～(8)中任意一项所述的糖链天冬酰胺的制备方法，步骤(a)是在含有1种或2种以上在非还原末端具有唾液酸残基的糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入Fmoc基，并在唾液酸残基上导入苯甲基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的步骤。
(11)一种糖链的制备方法，其中，包括下述步骤：
(a)在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入脂溶性的保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物，
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将得到的混合物供于色谱法，分离各种糖链天冬酰胺衍生物，
(c)除去步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，得到糖链天冬酰胺，以及
(d)除去步骤(c)得到的糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基，得到糖链。
(12)如上述(11)所述的糖链的制备方法，进一步包括下述步骤：
(b’)使用糖水解酶将步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物水解的步骤，和/或
(c’)使用糖水解酶将步骤(c)得到的糖链天冬酰胺水解的步骤，和/或
(d’)使用糖水解酶将步骤(d)得到的糖链水解的步骤。
(13)如上述(11)或(12)所述的糖链的制备方法，含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有下述化合物和/或该化合物中缺失1个以上糖残基得到的化合物。
(14)如上述(11)～(13)中任意一项所述的糖链的制备方法，脂溶性的保护基是Fmoc基。
(15)如上述(11)～(13)中任意一项所述的糖链的制备方法，步骤(a)是在含有1种或2种以上在非还原末端具有唾液酸残基的糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入Fmoc基，并在唾液酸残基上导入苯甲基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的步骤。
(16)具有下述通式的糖链天冬酰胺衍生物。
(式中，R1和R2是H或下式表示的基团，可以相同也可以不同。
或
其中，R1和R2均为下式所示基团的场合除外。
(17)具有下述通式的糖链天冬酰胺衍生物。
(式中，RX和RY中一方为下式表示的基团，
另一方为H或下式表示的基团。
或
(18)具有下述通式的糖链天冬酰胺。
(式中，R3和R4是H或下式表示的基团，可以相同也可以不同。
或
其中，R3和R4均为下式所示基团的场合除外。
或
(19)具有下述通式的糖链。
(式中，R5和R6是H或下式表示的基团，可以相同也可以不同。
或
其中，R5和R6均为下式所示基团的场合，
或
或者R5或R6中一方为H，且另一方为下式所示基团的场合除外。
【附图说明】
图1是表示本发明能够得到的一组糖链天冬酰胺衍生物的结构的图。
图2是表示本发明能够得到的一组糖链天冬酰胺衍生物的结构的图。
图3是表示本发明能够得到的一组糖链天冬酰胺的结构的图。
图4是表示本发明能够得到的一组糖链天冬酰胺的结构的图。
图5是表示本发明能够得到的一组糖链的结构的图。
图6是表示本发明能够得到的一组糖链的结构的图。
图7是表示本发明糖链天冬酰胺衍生物的制备方法的步骤的一个实例的图。
图8是表示使用各种糖水解酶改变糖链天冬酰胺衍生物的步骤的一个实例的图。
图9是表示使用各种糖水解酶改变糖链天冬酰胺衍生物的步骤的一个实例的图。
图10是表示使用各种糖水解酶改变糖链天冬酰胺衍生物的步骤的一个实例的图。
图11是表示使用各种糖水解酶改变糖链天冬酰胺衍生物的步骤的一个实例的图。
图12是表示由糖链天冬酰胺衍生物除去保护基(Fmoc基)的步骤以及由糖链天冬酰胺除去天冬酰胺残基的步骤的一个实例的图。
发明的最佳实施方式
本发明糖链天冬酰胺衍生物的制备方法的一大特征在于，在例如来源于天然糖蛋白的糖链天冬酰胺，优选由天冬酰胺结合型糖链得到的糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入(结合)脂溶性保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物的混合物后，将该混合物分离成各种糖链天冬酰胺衍生物。另外，在本说明书中，“糖链天冬酰胺”是指结合了天冬酰胺的状态的糖链。另外，“天冬酰胺结合型糖链”是指在蛋白质的多肽中天冬酰胺(Asn)的酰氨基上，通过N-糖苷键结合了还原末端存在的N-乙酰基葡糖胺，且以Man(β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac为母核的糖链群。“糖链天冬酰胺衍生物”是指天冬酰胺残基上结合了脂溶性保护基的状态的糖链天冬酰胺。另外，化合物的结构式中，“AcHN”表示乙酰氨基。
如上所述，来源于天然糖蛋白的糖链是非还原末端的糖残基随机缺失的糖链混合物。本发明人意外发现通过在来源于天然糖蛋白的糖链，具体而言是糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺中导入脂溶性的保护基，能够采用公知的色谱法容易地将导入了该保护基的糖链天冬酰胺衍生物的混合物分离成各种糖链天冬酰胺衍生物。据此，能够分别大量地制备具有各种结构的糖链天冬酰胺衍生物。例如，能够分离以前难以分离的图1所示化合物2和6或者图2所示化合物3和7这种结构类似的糖链天冬酰胺衍生物，从而能够分别容易且大量地制备这些化合物。另外，以得到的糖链天冬酰胺衍生物为基础，例如使糖水解酶依次作用，除去糖残基，也能够进一步合成各种糖链天冬酰胺衍生物。
如上所述，通过在糖链天冬酰胺中引入脂溶性保护基得到衍生物，能够分离各种糖链天冬酰胺衍生物，认为这是由于通过引入脂溶性的保护基，糖链天冬酰胺衍生物整体的脂溶性增高，例如与适合使用的反相柱的相互作用大幅度提高，结果能够更灵敏地反映糖链结构的差异，分离各种糖链天冬酰胺衍生物。例如，本发明中优选使用的脂溶性保护基Fmoc基的脂溶性非常高。也就是说，Fmoc基的芴基骨架采取中心的五元环上结合2个苯环的脂溶性非常高的结构，与反相柱之一的ODS柱的十八烷基产生非常强的相互作用，能够分离结构类似的糖链天冬酰胺衍生物。
而且，按照本发明，如下所述，通过除去得到的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，能够容易且大量地获得各种糖链天冬酰胺，此外，通过除去得到的糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基，能够容易且大量地获得各种糖链。
本发明的糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，具体包括下述步骤：
(a)在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入脂溶性的保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物，以及
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将得到的混合物供于色谱法，分离各种糖链天冬酰胺衍生物。
作为步骤(a)中使用的含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物，只要是含有1种或2种以上结合有天冬酰胺的糖链的混合物即可，并没有特别的限定。例如，可以是含有1种或2种以上结合了1个或多个天冬酰胺的糖链的混合物。其中，从容易获得的观点来看，优选含有1种或2种以上还原末端结合了天冬酰胺的糖链的混合物。另外，在本说明书中，“糖链”是指2个以上任意的单糖结合得到的物质。
所述糖链天冬酰胺的混合物，可以按照公知的方法得到，优选由天然的原料，例如乳汁、来源于牛的胎球蛋白或者蛋得到糖蛋白和/或糖肽的混合物，在该混合物中添加例如蛋白分解酶，如链霉蛋白酶(和光纯药社制)、肌动蛋白酶-E(Actinase-E，科研制药社制)或一般的羧基肽酶、氨基肽酶等酶，在公知的反应条件下进行反应，切断肽部分，作为该反应后的反应液得到，或者按照公知的方法，例如利用使用凝胶过滤柱、离子交换柱等的各种色谱法或者高效液相色谱法(HPLC)的纯化法，由反应液除去糖链天冬酰胺以外的成分后得到。从容易制得的观点来看，优选使用公知的来源于蛋的糖肽〔Biochimicaet Biophysica Acta 1335(1997)p23～32；粗纯化SGP(含有蛋黄中的蛋白质、无机盐等，且含有糖肽10～80重量％的混合物)〕制备上述混合物。
另外，从有效得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物的观点来看，优选进一步将该混合物中含有的糖链天冬酰胺水解，预先将一部分糖残基切断。另外，该切断的程度只要在至少保持本说明书所说的作为“糖链”的结构的范围内即可，并没有特别的限定。作为这样得到的混合物，可以例举含有图3所示化合物24和/或该化合物中缺失1个以上糖残基得到的化合物的混合物。另外，在这种情况下，对于该缺失了糖残基的化合物，从保持本说明书所说的“糖链”结构的观点来看，糖残基的缺失上限为9。
例如图3所示化合物25和29可以通过如下所述将含有化合物24的糖链天冬酰胺混合物(以下称为化合物24混合物)酸水解，在该混合物中有效获得，进而可以有效获得对应的糖链天冬酰胺衍生物，即图1所示化合物2和6。
例如，在化合物24混合物中适量加入0.1N左右的酸水溶液，在4～100℃下进行反应。这时，利用薄层色谱法(例如，使用硅胶60F254(Merck公司制)，并使用乙酸乙酯∶甲醇∶水＝4∶4∶3作为展开溶剂)追踪水解反应的进行，在得到化合物25和29最多的时刻停止反应。例如，在25℃的条件下可以经5～10小时停止反应，在100℃的条件下可以经数分钟停止反应。优选在70℃下进行反应，反应开始后，经35分钟停止反应，迅速用冰冷却。另外，可以通过中和反应液停止反应。另外，作为上述酸，并没有特别限定，例如可以使用盐酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸等无机酸和有机酸、阳离子交换树脂、不溶性的固体试剂等。
同样，由化合物24也可以在上述混合物中有效得到化合物33。例如，在化合物24混合物中适量加入上述酸水溶液，优选在80℃下进行反应，反应开始后优选经60分钟停止反应。
另外，水解也可以利用酶进行。作为这时可以使用的酶，优选糖水解酶，内切型、外切型任何一种反应方式的酶均可使用。例如，与上述同样，由化合物24得到化合物25和29的场合，可以使用具有由末端切断唾液酸的活性的唾液酸水解酶。作为这种酶，并没有特别的限定，只要具有上述活性，市售的酶、新分离出来的酶、通过基因工程创造出的酶均可。酶反应可以采用公知的条件，这时可以与上述同样利用薄层色谱法追踪反应的进行，在获得化合物25和29最多的时刻适当停止反应。
使用这样得到的含有糖链天冬酰胺的混合物，在其中含有的糖链天冬酰胺中导入脂溶性的保护基。作为该保护基，没有特别的限定，例如可以使用Fmoc基、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基、烯丙基、烯丙氧基碳酸酯基、乙酰基等碳酸酯类或酰胺类的保护基等。从可以将得到的糖链天冬酰胺衍生物直接用于合成所需的糖肽的观点来看，作为该保护基，优选Fmoc基或Boc基等，更优选Fmoc基。在唾液酸等比较酸性的条件下糖链上存在不稳定的糖时，Fmoc基特别有效。另外，保护基的导入可以按照公知的方法(参照例如Protecting groups inOrganic chemistry，John Wiley & Sons INC.，New York 1991，ISBN0-471-62301-6)进行。
例如，使用Fmoc基的场合，在含有糖链天冬酰胺的混合物中适量加入丙酮后，再加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基(succinimidyl)碳酸酯和碳酸氢钠，溶解，在25℃下进行Fmoc基结合到天冬酰胺残基上的反应，可以在该糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基上导入Fmoc基。
通过以上操作，可以得到导入了脂溶性保护基的糖链天冬酰胺衍生物的混合物。
接着，在步骤(b)中，将糖链天冬酰胺衍生物混合物供于公知的色谱法，特别是分离型的色谱法，分离成各种糖链天冬酰胺衍生物。另外，在所述步骤中，可以直接使用上述步骤(a)中得到的糖链天冬酰胺衍生物混合物，从有效得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物的观点来看，也可以使用进一步将该混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，预先切断一部分糖残基得到的糖链天冬酰胺衍生物的混合物。另外，糖残基的切断程度与上述同样。另外，水解与上述同样进行。
例如，得到化合物3和7的场合，与从和化合物2和6的混合物将其分离相比，使用半乳糖水解酶对该混合物进行水解处理，用HPLC能够更容易地从得到的混合物分离化合物3和7，而且能够作为单一化合物大量获得各种化合物。
利用色谱法分离各种糖链天冬酰胺衍生物，可以适当采用单独的公知色谱法进行，或者组合使用多种公知色谱法进行。
例如，用凝胶过滤柱色谱法将得到的糖链天冬酰胺衍生物混合物纯化后，用HPLC纯化。作为HPLC中可以使用的柱，优选反相系的柱，例如可以利用ODS、Phenyl系、腈系或阴离子交换系的柱，具体而言，例如Pharmacia公司制MonoQ柱Iatron公司制Iatrobeads柱等。分离条件等可以适当参照公知的条件进行调整。通过以上操作，可以由糖链天冬酰胺衍生物混合物得到所需的各种糖链天冬酰胺衍生物。图7示意性地表示本发明糖链天冬酰胺衍生物的制备方法的步骤的一个实例。
而且，通过将步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物水解，可以有效得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物〔步骤(b’)〕。例如，在分离糖链天冬酰胺衍生物的阶段，限制混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物的种类，将糖链天冬酰胺衍生物大致分离，接着水解，例如使用糖水解酶进行水解，从而能够有效得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。另外，水解可以与上述同样进行。从更有效地得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物的观点来看，特别优选使用糖残基的切断方式明确的糖水解酶进行水解。
例如，化合物2和6通过除去半乳糖残基转变为化合物3和7(图8)，可以通过将化合物2和6溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，按照公知的条件，使用半乳糖水解酶，进行半乳糖残基的切断反应实现。另外，化合物2和6可以是其混合物，也可以是各种分离后的物质。在该反应中使用的半乳糖水解酶优选利用市售的公知外切型酶。另外，只要具有同样的活性，也可以是新分离出的酶、利用基因工程创造出的酶。接着，可以与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供于色谱法，得到各种糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选采用HPLC(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶15)进行。
化合物3和7通过除去N-乙酰基葡糖胺残基转变为化合物4和8(图8)，可以通过将化合物3和7溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，按照公知的条件，使用N-乙酰基葡糖胺水解酶，进行N-乙酰基葡糖胺残基的切断反应实现。另外，也可以使用N-乙酰基氨基己糖苷酶水解酶。另外，化合物3和7可以是其混合物，也可以是各种分离后的物质。在该反应中使用的各种酶优选利用市售的外切型酶。另外，只要具有同样的活性，也可以是新分离出的酶、利用基因工程创造出的酶。接着，可以与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供于色谱法，得到各种糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选采用HPLC(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35或50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶15)进行。
化合物4和8通过除去甘露糖残基转变为化合物5和9(图8)，可以通过将化合物4和8溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，按照公知的条件，使用甘露糖水解酶，进行甘露糖残基的切断反应实现。另外，化合物4和8可以是其混合物，也可以是各种分离后的物质。在该反应中使用的甘露糖水解酶优选利用市售的外切型酶。另外，只要具有同样的活性，也可以是新分离出的酶、利用基因工程创造出的酶。接着，可以与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供于色谱法，得到各种糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选采用HPLC(ODS柱，展开溶剂可以将10-200mM的醋酸铵等缓冲溶液与乙腈、或者乙醇、或者甲醇、或者丁醇或或者丙醇等具有脂溶性的水溶性有机溶剂适当混合后使用。其中在举例的情况下，作为展开溶剂，优选50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
化合物10通过除去半乳糖残基转变为化合物11(图9)，可以通过将化合物10溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，与上述同样，按照公知的条件，使用半乳糖水解酶，进行半乳糖残基的切断反应实现。由反应后的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)分离糖链天冬酰胺衍生物，例如优选采用HPLC(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝85∶15)进行。
另外，进一步使用任意的糖水解酶将化合物11水解，可以转变成各种糖链天冬酰胺衍生物(例如化合物11、12和13等)。
化合物11通过除去N-乙酰基葡糖胺残基转变为化合物12(图9)，可以通过将化合物11溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，与上述同样，按照公知的条件，使用N-乙酰基葡糖胺水解酶，进行N-乙酰基葡糖胺残基的切断反应实现。由反应后的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)分离糖链天冬酰胺衍生物，例如优选采用HPLC(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝85∶18)进行。
化合物12通过除去甘露糖残基转变为化合物13(图9)，可以通过将化合物12溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，与上述同样，按照公知的条件，使用甘露糖水解酶，进行甘露糖残基的切断反应实现。由反应后的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)分离各种糖链天冬酰胺衍生物，例如优选采用高效液相柱色谱法(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
化合物3和7转变为化合物14和19(图10)，可以通过将化合物3和7溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，按照公知的条件，使用唾液酸水解酶，进行唾液酸残基的切断反应实现。另外，化合物3和7可以是其混合物，也可以是各种分离后的物质。在该反应中使用的唾液酸水解酶优选利用市售的外切型酶。另外，只要具有同样的活性，也可以是新分离出的酶、利用基因工程创造出的酶。接着，可以与上述同样，将反应后得到的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)供于色谱法，得到各种糖链天冬酰胺衍生物。例如，分离优选采用高效液相柱色谱法(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝85∶15)进行。
化合物14和19通过除去N-乙酰基葡糖胺残基转变为化合物15和20(图10)，可以通过将化合物14和19溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，与上述同样，按照公知的条件，使用N-乙酰基葡糖胺水解酶，进行N-乙酰基葡糖胺残基的切断反应实现。由反应后的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)分离各种糖链天冬酰胺衍生物，例如优选采用高效液相柱色谱法(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
化合物15和20通过除去甘露糖残基转变为化合物16和21(图10)，可以通过将化合物15和20溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，与上述同样，按照公知的条件，使用甘露糖水解酶，进行甘露糖残基的切断反应实现。由反应后的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)分离各种糖链天冬酰胺衍生物，例如优选采用高效液相柱色谱法(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
化合物16和21通过除去半乳糖残基转变为化合物17和22(图11)，可以通过将化合物16和21溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，与上述同样，按照公知的条件，使用半乳糖水解酶，进行半乳糖残基的切断反应实现。由反应后的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)分离各种糖链天冬酰胺衍生物，例如优选采用高效液相柱色谱法(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝85∶15)进行。
化合物17和22通过除去N-乙酰基葡糖胺残基转变为化合物18和23(图11)，可以通过将化合物17和22溶解于缓冲液(例如磷酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液等)中，与上述同样，按照公知的条件，使用N-乙酰基葡糖胺水解酶，进行N-乙酰基葡糖胺残基的切断反应实现。由反应后的反应液(糖残基切断后的糖链天冬酰胺衍生物的混合物)分离各种糖链天冬酰胺衍生物，例如优选采用高效液相柱色谱法(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝82∶18)进行。
如上所述得到各种糖链天冬酰胺衍生物后，通过进一步使用各种糖水解酶等将该衍生物水解，除去糖链的非还原末端的糖残基，能够分别作为单一化合物得到糖链末端的分支结构不均一的各种糖链天冬酰胺衍生物。另外，通过改变使用各种糖水解酶进行水解的顺序及其种类，可以制备更多种类的糖链天冬酰胺衍生物。
按照以前的方法，即便想以分析等级得到具有有限的糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物，都需要非常长的时间和非常多的成本，但是按照本发明，不需要特别的装置和试剂，使用常用的凝胶过滤柱、HPLC柱以及至少3种糖水解酶(例如半乳糖水解酶、甘露糖水解酶、N-乙酰基葡糖胺水解酶)等，2周左右就能够以1g的程度制备具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物。
通过以上操作，例如保护基为Fmoc基的场合，可以有效得到具有下述通式的糖链天冬酰胺衍生物。
(式中，R1和R2是H或下式表示的基团，可以相同也可以不同。
或
其中，R1和R2均为下式所示基团的场合除外。
作为上述糖链天冬酰胺衍生物，具体可以例举图1和图2所示的各种化合物。其中，化合物1、化合物2～9、11～23、70和71是本发明首次制备的化合物。本发明包括该化合物。
另外，作为本发明糖链天冬酰胺衍生物的制备方法的优选方式，提供一种糖链天冬酰胺衍生物的制备方法，其中，步骤(a)是使用含有1种或2种以上非还原末端具有唾液酸残基的糖链天冬酰胺的混合物，在该混合物中含有的糖链天冬酰胺上导入Fmoc基，并在唾液酸残基上导入苯甲基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的步骤。采用上述制备方法，能够更有效地大量得到各种类型的糖链天冬酰胺衍生物。例如，能够提高图1所示化合物2和6的分离效率，有效进行两种化合物的制备。也就是说，从化合物2和6的混合物直接有效地明确分离两种化合物是不利的，但按照本方式，在两种化合物的唾液酸残基中导入苯甲基，一旦作为以下的化合物76和77的混合物供于上述步骤(b)，则化合物76和77的分离能够比较容易地进行，因此能够分离两种化合物，然后按照后述的方法使苯甲基脱离，即可有效地从化合物2和6的混合物分离两种化合物。
认为化合物2和6的分离有些困难，而在这些化合物的唾液酸残基上导入苯甲基得到的化合物76和77的分离能够容易地进行，是由于在唾液酸残基的羧基上导入脂溶性高的苯甲基，进一步提高了与HPLC(高效液相色谱法)的反相柱的疏水性相互作用。因此，推测与分离步骤(b)中适合使用的反相柱的相互作用大幅度提高，结果能够更敏锐地反映糖链结构的差异，从而分离两种化合物。
作为含有1种或2种以上在非还原末端具有唾液酸残基的糖链天冬酰胺的混合物，只要是含有1种或2种以上具有所述结构的糖链天冬酰胺的混合物即可，并没有特别的限定。从容易获得的观点来看，优选含有1种或2种以上在非还原末端具有唾液酸残基且在还原末端结合了天冬酰胺的糖链的混合物。作为该混合物，优选含有上述图3所示化合物24和/或该化合物中缺失1个以上糖残基得到的化合物的混合物。
另外，从更有效得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物的观点来看，优选实施上述步骤(b’)。
另外，在本方式中，分别得到导入了苯甲基和Fmoc基的糖链天冬酰胺衍生物，以及仅导入了Fmoc基的糖链天冬酰胺衍生物。
在糖链天冬酰胺的唾液酸残基上导入苯甲基可以按照公知方法(例如参照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley& Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)进行。
通过以上操作，例如可以有效得到具有下述通式的导入了苯甲基和Fmoc基的糖链天冬酰胺衍生物。
(式中，RX和RY中一方为下式表示的基团，
另一方为H或下式表示的基团。
或
作为所述糖链天冬酰胺衍生物，具体可以例举上述化合物76和77及以下的化合物78。
按照本方式得到的糖链天冬酰胺衍生物可以直接用于糖肽的固相合成。由于该糖链天冬酰胺衍生物的唾液酸残基上存在的羧基被苯甲基保护，因此具有下述优点，即，与未导入苯甲基的糖链天冬酰胺衍生物相比，在糖肽的固相合成中，不会发生与该羧基有关的副反应，能够有效得到所需的糖肽。
另外，本发明还提供能够大量得到各种分离的糖链天冬酰胺的糖链天冬酰胺制备方法。该方法在按照上述糖链天冬酰胺衍生物的制备方法的糖链天冬酰胺衍生物的制备步骤之后，还包括由得到的糖链天冬酰胺衍生物除去保护基的步骤。
也就是说，本发明的糖链天冬酰胺的制备方法包括下述步骤：
(a)在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入脂溶性的保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物，
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将得到的混合物供于色谱法，分离各种糖链天冬酰胺衍生物，以及
(c)除去步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，得到糖链天冬酰胺。
步骤(a)和(b)与上述糖链天冬酰胺衍生物的制备方法的场合同样，使用的含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物以及脂溶性的保护基也与上述同样。
步骤(c)中由糖链天冬酰胺衍生物除去保护基，可以按照公知的方法进行(例如，参照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley & Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。例如，保护基为Fmoc基的场合，如图12示意性所示，通过在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，向糖链天冬酰胺衍生物中加入吗啉进行反应，可以除去Fmoc基。另外，Boc基可以通过使弱酸反应除去。除去保护基后，可以根据需要，适当采用公知的方法，例如通过使用凝胶过滤柱、离子交换柱等的各种色谱法或HPLC进行分离的方法，进行纯化，得到糖链天冬酰胺。
另外，与上述糖链天冬酰胺衍生物的制备方法同样，作为本发明糖链天冬酰胺的制备方法的优选方式，提供一种糖链天冬酰胺的制备方法，其中，步骤(a)是使用含有1种或2种以上非还原末端具有唾液酸残基的糖链天冬酰胺的混合物，在该混合物中含有的糖链天冬酰胺上导入Fmoc基，并在唾液酸残基上导入苯甲基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的步骤。在所述方式中，步骤(c)中，除了除去Fmoc基以外，还要除去苯甲基。苯甲基的除去可以按照公知的方法进行(例如，参照Protecting groups in Organic chemistry，John Wiley& Sons INC.，New York 1991，ISBN 0-471-62301-6)。
而且，与上述同样，从有效得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺的观点来看，优选将步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物水解和/或将步骤(c)得到的糖链天冬酰胺水解。另外，水解可以与上述同样进行。从更有效地得到具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺的观点来看，更优选使用糖水解酶进行水解〔步骤(b’)和/或步骤(c’)〕。
通过以上操作，例如可以有效得到具有下述通式的糖链天冬酰胺。
(式中，R3和R4是H或下式表示的基团，可以相同也可以不同。
或
其中，R3和R4均为下式所示基团的场合除外。
或
作为所述糖链天冬酰胺，具体可以例举图3和图4所示的各种化合物。其中，化合物25～32、34～46、72和73是本发明首次制备的化合物。本发明包括该化合物。
而且，本发明还提供能够大量得到各种分离的糖链的糖链制备方法。该方法在按照上述糖链天冬酰胺的制备方法的糖链天冬酰胺的制备步骤之后，还包括由得到的糖链天冬酰胺除去天冬酰胺残基的步骤。
也就是说，本发明的糖链的制备方法包括下述步骤：
(a)在含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物中含有的该糖链天冬酰胺上，导入脂溶性的保护基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物，
(b)将该糖链天冬酰胺衍生物混合物或该糖链天冬酰胺衍生物混合物中含有的糖链天冬酰胺衍生物水解，将得到的混合物供于色谱法，分离各种糖链天冬酰胺衍生物，
(c)除去步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物的保护基，得到糖链天冬酰胺，以及
(d)除去步骤(c)得到的糖链天冬酰胺的天冬酰胺残基，得到糖链。
步骤(a)～(c)与上述糖链天冬酰胺的制备方法的场合同样，使用的含有1种或2种以上糖链天冬酰胺的混合物以及脂溶性的保护基也与上述同样。
另外，在本发明的糖链的制备方法中，作为其优选方式，提供一种糖链天冬酰胺的制备方法，其中，步骤(a)是使用含有1种或2种以上非还原末端具有唾液酸残基的糖链天冬酰胺的混合物，在该混合物中含有的糖链天冬酰胺上导入Fmoc基，并在唾液酸残基上导入苯甲基，得到糖链天冬酰胺衍生物混合物的步骤。在所述方式中，步骤(c)中，除了除去Fmoc基以外，还要除去苯甲基。苯甲基的除去可以按照上述方法进行。
步骤(d)中由糖链天冬酰胺除去天冬酰胺残基，可以按照公知的方法进行。例如，如图12示意性所示，通过使糖链天冬酰胺与无水肼反应后，进行乙酰化，可以除去天冬酰胺残基，得到糖链。另外，通过用碱性水溶液将糖链天冬酰胺加热回流后，进行乙酰化，也可以除去天冬酰胺残基，得到糖链。除去天冬酰胺残基后，可以根据需要，适当采用公知的方法，例如通过使用凝胶过滤柱、离子交换柱等的各种色谱法或HPLC进行分离的方法，进行纯化。
而且，与上述同样，从有效得到具有所需糖链结构的糖链的观点来看，优选将步骤(b)分离的糖链天冬酰胺衍生物水解和/或将步骤(c)得到的糖链天冬酰胺水解和/或将步骤(d)得到的糖链水解。另外，水解可以与上述同样进行。从更有效地得到具有所需糖链结构的糖链的观点来看，更优选使用糖水解酶进行水解〔步骤(b’)和/或步骤(c’)和/或步骤(d’)〕。
通过以上操作，例如可以有效得到具有下述通式的糖链。
(式中，R5和R6是H或下式表示的基团，可以相同也可以不同。
或
其中，R5和R6均为下式所示基团的场合，
或者R5或R6中一方为H，且另一方为下式所示基团的场合除外。
作为所述糖链，具体可以例举图5和图6所示的各种化合物。其中，化合物48～55、57～69、74和75是本发明首次制备的化合物。本发明包括该化合物。
如上所述，按照本发明，可以廉价且有效地大量制备具有所需糖链结构的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺和糖链(以下，有时将这3种总称为糖链类)。
所述糖链类在医药品开发等领域非常有用。例如，作为医药品开发中的应用例，可以例举癌症疫苗的合成。已知如果细胞发生癌变，则会出现体内所没有的糖链。另外，还已知如果化学合成该糖链，作为疫苗向个体给药，则可以抑制癌的增殖。因此，如果按照本发明能够制备所需的糖链类，则能够合成对于癌症的治疗有效的疫苗。另外，将化学反应和利用糖转移酶的反应等组合，进一步使本发明得到的糖链类结合新的糖残基，制备衍生物，能够合成新型的疫苗。
另外，例如作为糖蛋白的红细胞生成素(EPO)由于其红细胞增殖能力一直作为贫血的治疗药使用，但是判断出该EPO如果不与糖链结合，则没有活性。如上所述，有时蛋白质通过结合糖链才能表达生理活性，因此例如通过不能结合糖链的大肠杆菌表达体系仅制备大量蛋白质，接着导入具有所需糖链结构的按照本发明制备的糖链，使之能够表达生理活性，或者在任意的蛋白质上导入具有各种糖链结构的按照本发明制备的糖链，也能够合成具有新的生理活性的新型糖蛋白。
另外，通过使天然糖蛋白中存在的糖链与本发明制备的糖链进行置换，也能够赋予其新的生理活性。作为使糖蛋白具有的糖链与本发明得到的糖链进行置换的技术，可以例举P.Seas and C.H.Wong，Science，2001，vol 291，p2344～2350记载的方法。亦即，可以例举用β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶(Endo-H)处理糖蛋白，成为蛋白质表面的天冬酰胺残基上仅结合1个N-乙酰基葡糖胺残基的状态。接着，使用β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶(Endo-M)，使本发明得到的糖链天冬酰胺(例如，图3和图4的各种化合物)中的所需糖链结合在上述N-乙酰基葡糖胺残基上的方法。另外，也可以在tRNA上结合N-乙酰基葡糖胺后，利用大肠杆菌等的表达体系，合成具有N-乙酰基葡糖胺残基的糖蛋白后，使用Endo-M导入本发明得到的糖链天冬酰胺中所需的糖链。
另外，关于目前利用糖蛋白作为治疗药时存在的问题，可以例举给药后糖蛋白的代谢速度快。这是由于糖蛋白的糖链末端存在的唾液酸在生物体内被除去后，该糖蛋白立即由肝脏代谢。因此，必需给予某种程度的量的糖蛋白。因而，如果按照本发明制备糖链末端新连接了难以除去的唾液酸的糖链，利用Endo-M将该糖链导入对象蛋白质中，则能够控制糖蛋白在生物体内的代谢速度，也能够降低给予的糖蛋白的量。
以下，结合实施例更具体地说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定。各化合物的结构式和序号如图1～图6所示。另外，关于1H-NMR数据，实施例1～7是在30℃下以HOD为4.8ppm进行测定得到的值，实施例8～45是在30℃下以作为内标准的丙酮的甲基的信号为2.225ppm，以HOD为4.718ppm进行测定得到的值。另外，对于除去了Fmoc基的化合物，使测定溶剂中共存50mM碳酸氢铵进行测定。
实施例1 化合物24的合成
将来源于蛋的粗纯化SGP(唾液酸糖肽)2.6g溶解于Tris-盐酸·氯化钙缓冲液(TRIZMA BASE 0.05mol/l、氯化钙0.01mol/l、pH7.5)100ml中。向其中加入叠氮化钠58mg(772μmol)和肌动蛋白酶-E(科研制药社制)526mg，37℃下静置。65小时后，再加入肌动蛋白酶-E 263mg，再在37℃下静置24小时。将该溶液冷冻干燥后，用凝胶过滤柱色谱法(Sephadex G-25，2.5φ×1m，展开溶剂为水，流速为1.0ml/min)将残留物精制2次，得到所需的图3所示化合物24 1.3g(555μmol)。SGP中含有的糖链的结构如下所示。
另外，得到的化合物24的物理数据如下所述。
1H-HMR(D2O、30℃)
5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，dd，Asn-βCH)，3.00(1H，dd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)
实施例2 化合物1、2、6和10的合成
将实施例1得到的化合物24(609mg，261μmol)溶解于水20.7ml中，再加入0.1N盐酸13.8ml。在70℃下将该溶液加热35分钟后，迅速用冰冷却，加入饱和碳酸氢钠水溶液，达到pH7。将其冷冻干燥后，用凝胶过滤柱色谱法(Sephadex G-25，2.5φ×1m，展开溶剂为水，流速为1.0ml/min)精制残留物，得到图3所示的化合物24、化合物25和29、化合物33的混合物534mg。这4种成分无需一一分离，进入以下步骤。
另外，得到的糖链混合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
5.13(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H1)，5.01(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.47(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax，NeuAc7’-H3ax)
将得到的糖链混合物429mg溶解于丙酮16.3ml和水11.2ml中。向其中加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(155.7mg，461.7μmol)和碳酸氢钠(80.4mg，957μmol)，在室温下搅拌2小时。将该溶液供于蒸发器，除去丙酮，用凝胶过滤柱色谱法(SephadexG-25，2.5φ×1m，展开溶剂为水，流速为1.0ml/min)精制残留的溶液，得到图1所示化合物1、化合物2和6、化合物10的混合物309mg。使用HPLC(ODS柱，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35，2.0φ×25cm，流速为3ml/min)精制该混合物，51分钟后洗脱出化合物1，67分钟后洗脱出化合物2和6的混合物，93分钟后洗脱出化合物10。分别收集这些化合物，冷冻干燥后，用凝胶过滤柱色谱法(SephadexG-25，2.5φ×30cm，展开溶剂为水，流速为1.0ml/min)脱盐，得到目的化合物2和6的混合物150mg。
另外，得到的化合物1的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.15(18H，s×6，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS按C103H154N8NaO66[M+Na+]计算：2581.8838，测定：2581.8821.
另外，得到的化合物2和6的混合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
7.99(d，Fmoc)，7.79(d，Fmoc)，7.55(m，Fmoc)，5.14(s，Man4-H1)，5.12(s，Man4-H)，5.00(d，GlcNAc1-H1)，4.94(s，Man4’-H1)，4.93(s，Man4’-H1)，4.82(s，Man3-H1)，4.60(d，GlcNAc2-H1)，4.58(d，GlcNAc5，5’-H1)，4.46(dd，Gal6，6’-H1)，4.44(d，Gal6，6’-H1)，4.24(d，Man3-H2)，4.19(d，Man4’-H2)，4.11(d，Man4-H2)，2.97(bdd，Asn-βCH)，2.72(dd，NeuAc7-H3eq，NeuAc7-H3eq)，2.64(bdd，Asn-βCH)，2.15(s×5，-Ac)，1.79(dd，NeuAc7-H3ax.NeuAc7’-H3ax)
另外，得到的化合物10的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.12(1H，s，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.93(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，3.03(1H，bdd，Asn-βCH)，3.00(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)；HRMS按C81H120N6NaO50[M+Na+]计算：1999.6930.测定：1999.6939.
实施例3 化合物3和7的合成
将实施例2得到的化合物2和6的混合物(224mg，97μmol)和牛血清白蛋白24mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH6.0)22ml中，再加入来源于肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)的β-半乳糖苷酶(1.35U)。在37℃下将该溶液静置15小时后，进行冷冻干燥。用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝85∶15，流速为3ml/min)精制残留物，129分钟后洗脱出图2所示的化合物3，134分钟后洗脱出化合物7。分别收集这些化合物，进行冷冻干燥。接着，使用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展开溶剂采取梯度方式，在最初的15分钟为水，16分钟后至30分钟后为水∶乙腈(体积比)＝10∶0至85∶15，31分钟后至45分钟后为水∶乙腈＝85∶15至80∶20，流速为3.0ml/min)进行脱盐处理，得到目的化合物381mg，化合物775mg。
另外，得到的化合物3的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS按C86H127N7NaO53[M+Na+]计算：2128.7356，测定：2128.7363.
另外，得到的化合物7的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5.5’-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，4.19(1H，d，Man4-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.60(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(15H，s×5，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7-H3ax)；HRMS按C86H125N7Na3O53[M+Na+]计算：2172.6995，测定：2172.7084.
实施例4 化合物4和8的合成
不对实施例3得到的化合物3和7的混合物(90mg，47.3μmol)一一进行分离，与牛血清白蛋白8mg一起溶解于HEPES缓冲溶液50mM，pH6.0)8.1ml中，再加入来源于牛肾(Bovine kidney)的β-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于牛肾)2.88U。在37℃下将该溶液静置18小时后，进行冷冻干燥，用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶甲醇＝65∶35，流速为3ml/min)精制残留物，117分钟后洗脱出图2所示的化合物4，127分钟后洗脱出化合物8。分别收集这些化合物，进行冷冻干燥。接着，使用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展开溶剂采取梯度方式，在最初的15分钟为水，16分钟后至30分钟后为水∶乙腈＝10∶0至85∶15，31分钟后至45分钟后为水∶乙腈＝85∶15至80∶20，流速为3.0ml/min)进行脱盐处理，得到目的化合物4 40mg，化合物8 37mg。
另外，得到的化合物4的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.22(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.94(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.55(1H，d，Gal6-H1)，4.33(1H，dd，Man3-H2)，4.20(1H，dd，Man4-H2)，4.15(1H，dd，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(2H，dd，NeuAc7，7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS按C78H114N6NaO48[M+Na+]计算：1925.6562，测定：1925.6539.
另外，得到的化合物8的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
7.99(2H，d，Fmoc)，7.79(2H，d，Fmoc)，7.55(4H，m，Fmoc)，5.15(1H，S，Man4-H1)，5.06(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.82(1H，s，Man3-H1)，4.69(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.67(2H，d，GlcNAc5，5’-H1)，4.53(2H，d，Gal6，6’-H1)，4.34(1H，d，Man3-H2)，4.27(1H，d，Man4’-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.61(1H，bdd，Asn-βCH2)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(1H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS按C78H114N6NaO48[M+Na+]计算：1925.6562，测定：1925.6533.
实施例5 化合物5的合成
将实施例4得到的化合物4(30mg，473μmol)和牛血清白蛋白3mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH6.0)6ml中，再加入来源于刀豆(JackBeans)的α-甘露糖苷酶10U。在37℃下将该溶液静置21小时后，进行冷冻干燥，接着用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展开溶剂采取梯度方式，在最初的15分钟为水，16分钟后至30分钟后为水∶乙腈＝10∶0至85∶15，31分钟后至45分钟后为水∶乙腈＝85∶15至80∶20，流速为3.0ml/min)进行精制，得到所需的图1所示化合物5 20mg。
另外，得到的化合物5的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.00(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.95(1H，s，Man4’-H1)，4.84(1H，s，Man3-H1)，4.67(1H，d，GlcNAc2-H1)，4.56(1H，d，GlcNAc5-H1)，4.44(1H，d，Gal6-H1)，4.11(1H，dd，Man4’-H2)，4.07(1H，dd，Man3-H2)，2.97(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7’-H3eq)，2.62(1H，bdd，Asn-βCH)，2.15(12H，s×4，-Ac)，1.79(2H，dd，NeuAc7’-H3ax)；HRMS按C72H104N6NaO43[M+Na+]计算：1763.6034，测定：1763.6074.
实施例6 化合物9的合成
将实施例4得到的化合物8(40mg，630μmol)和牛血清白蛋白5mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH6.0)7.8ml中，加入来源于刀豆(JackBeans)的α-甘露糖苷酶38U。在37℃下将该溶液静置63小时后，进行冷冻干燥，接着用HPLC(ODS柱，2.0φ×25cm，展开溶剂采取梯度方式，在最初的15分钟为水，16分钟后至30分钟后为水∶乙腈＝10∶0至85∶15，31分钟后至45分钟后为85∶15至80∶20，流速为3.0ml/min)进行精制，得到目的化合物9 30mg。
另外，得到的化合物9的物理数据如下所述。
1H-NMR(D2O、30℃)
8.01(2H，d，Fmoc)，7.80(2H，d，Fmoc)，7.56(4H，m，Fmoc)，5.23(1H，s，Man4-H1)，5.08(1H，d，GlcNAc1-H1)，4.53(1H，d，Gal6-H1)，4.32(1H，dd，Man3-H2)，4.28(1H，dd，Man4-H2)，2.81(1H，bdd，Asn-βCH)，2.76(1H，dd，NeuAc7-H3eq)，2.59(1H，bdd，Asn-βCH)，2.13(12H，s×4，-Ac)，1.80(1H，dd，NeuAc7H3ax)；HRMS按C72H104N6NaO43[M+Na+]计算：1763.6034，测定：1763.6041.
实施例7 Fmoc基的脱保护(化合物33的合成)
将实施例2得到的化合物10(10.5mg，5.27μmol)溶解于50％吗啉/N，N-二甲基甲酰胺溶液1.4ml中，在室温、氩气环境下，使之反应2小时。向该溶液中加入甲苯3ml，在35℃下供于蒸发器。重复该操作3次，除去反应溶剂。用凝胶过滤柱色谱法(Sephadex G-25，2.5φ×30cm，展开溶剂为水，流速为1.0ml/min)精制残留物，得到所需的图3所示化合物33 7mg(收率为76％)。另外，由于1H-NMR波谱与由实施例2得到的化合物33一致，从而确认了所得化合物的结构。
化合物33的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.8Hz，GlcNAc5，5’-H-1)，4.47(d，2H，J＝7.9Hz，Gal6，6’-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4’-H-2)，4.12(bdd，1H，J＝3.2Hz，1.4Hz，Man4-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.93(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.08(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)
实施例8 化合物14的合成
将化合物3(28mg，21.3μmol)和牛血清白蛋白1.0mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，454μl)中，加入神经氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于霍乱弧菌(Viblio Cholerae)，198mU)。在37℃下将该溶液静置20小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物14(17mg，收率为70％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，4.11(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.0Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.7Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS按C75H110N6NaO45[M+Na+]计算：1837.6402，测定：1837.6471
实施例9 化合物19的合成
将化合物7(20mg，9.4μmol)和牛血清白蛋白1.6mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，323μl)中，加入神经氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于霍乱弧菌(Viblio Cholerae)，141mU)。在37℃下将该溶液静置18小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物19(13mg，收率为76％)。由于1H-NMR与标准品一致，从而确认了所得化合物的结构。
实施例10 化合物15的合成
将化合物4(45mg，24μmol)和牛血清白蛋白1.7mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，820μL)中，加入神经氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于霍乱弧菌(Viblio Cholerae，134mU)。在37℃下将该溶液静置14小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物15(28mg，收率为74％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)4.58(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6’-H-1)，4.35(t，1H，Fmoc)，4.24(bd，1H，J＝1.9Hz，Man3-H-2)，4.11(bs，1H，Man4’-H-2)，4.07(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.7Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS按C67H97N5NaO40[M+Na+]计算：1634.5608，测定：1634.5564
实施例11 化合物70的合成
将化合物15(11mg，6.8μmol)和牛血清白蛋白1.5mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，269μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业社制，来源于刀豆(Jack Beans)，11μL，275mU)。在37℃下将该溶液静置14小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物70(6.3mg，收率为64％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.32(t，1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，4.06(bs，1H，J＝1.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝14.0Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.5Hz，14.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]计算：1450.5，测定：1450.4
实施例12 化合物20的合成
将化合物8(47mg，25μmol)和牛血清白蛋白1.9mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，840μl)中，加入神经氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于霍乱弧菌(Viblio Cholerae，369mU)。在37℃下将该溶液静置37小时后，通过HPLC分析确认反应结束。将反应溶液冷冻干燥，接着用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120AODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物20(26mg，收率为65％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(bd，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.5Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，3H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man4’-H-2)，4.19(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；HRMS按C67H97N5NaO40[M+Na+]计算：1634.5608，测定：1634.5644
实施例13 化合物71的合成
将化合物20(12mg，7.4μmol)和牛血清白蛋白1.0mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，330μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业社制，来源于刀豆(Jack Beans)，12μL，297mU)。在37℃下将该溶液静置46小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMCPacked Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物71(6.6mg，收率为61％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.90(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc2，5-H-1)，4.31(b，1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.8Hz，3.3Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd.1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，1.88(each s，each3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]计算：1450.5，测定：1450.3
实施例14 化合物16的合成
将化合物5(32mg，18.4μmol)和牛血清白蛋白2.5mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，713μL)中，加入神经氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于霍乱弧菌(Viblio Cholerae，134mU)。在37℃下将该溶液静置17小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物16(13mg，收率为52％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.44(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.00(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，2H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.10(bd，1H，Man3-H-2)，4.07(bs，1H，Man4’-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.2Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]计算：1450.5，测定：1450.3.
实施例15 化合物17的合成
将化合物16(9mg，6.2μmol)和牛血清白蛋白1.6mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，613μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业社制，来源于刀豆(Jack Beans)，186mU)。在37℃下将该溶液静置32小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物17(5.4mg，收率为68％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.89(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.68(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.49(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.42(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.09，4.07(s，1H，Man4’-H-2，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz Asn-βCH)，2.56(bdd，1H，J＝8.1Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C55H77N5NaO30[M+Na+]计算：1310.5，测定：1310.2
实施例16 化合物18的合成
将化合物17(3.4mg，2.6μmol)和牛血清白蛋白1.1mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，257μL)中，加入N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich，来源于刀豆(Jack Beans)，144mU)。在37℃下将该溶液静置24小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物18(2.1mg，收率为75％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，7.5Hz，Fmoc)，5.00(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(d，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.07(d，1H，J＝2.7Hz，Man4’-H-2)，3.97(dd，1H.J＝1.6Hz，3.7Hz，Man3-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝3.2Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.1Hz，Asn-βCH)，2.07，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C47H65N4O25[M+Na+]计算：1085.4，测定：1085.3
实施例17 化合物21的合成
将化合物9(28mg，16μmol)和牛血清白蛋白1.7mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，624μL)中，加入神经氨酸苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于霍乱弧菌(Viblio Cholerae，117mU)。在37℃下将该溶液静置17小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物21(14.6mg，收率为68％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，2H，J＝7.2Hz，GlcNAc2-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.34(t，1H Fmoc)，4.22(bd，1H，J＝2.7Hz，Man3-H-2)，4.19(b，1H，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝9.8Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C61H88N5O35[M+H+]计算：1450.5，测定：1450.3
实施例18 化合物22的合成
将化合物21(10mg，6.9μmol)和牛血清白蛋白1.6mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，672μL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业社制，来源于刀豆(Jack Beans)，205mU)。在37℃下将该溶液静置20小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物22(5.6mg，收率为64％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.87(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.67(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.48(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.41(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.26(t，1H，Fmoc)，4.22(d，1H，J＝2.2Hz，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.54(bdd，1H，J＝9.5Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C55H78N5O30[M+H+]计算：1288.5，测定：1288.3
实施例19 化合物23的合成
将化合物22(3.6mg，2.8μmol)和牛血清白蛋白1.2mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，227μL)中，加入N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich，来源于刀豆(Jack Beans)，195mU)。在37℃下将该溶液静置24小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物23(2.3mg，收率为77％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.57(d，1H，J＝6.5Hz，GlcNAc-H-1)，4.33(t，1H，Fmoc)，4.22(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.07(bdd，1H，J＝2.1Hz，Man4-H-2)，2.72(bdd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.9Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C47H65N4O25[M+H+]计算：1085.4.测定：1085.3
实施例20 化合物11的合成
将化合物10(123mg，62μmol)和牛血清白蛋白(1.1mg)溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，2.5mL)中，加入β-半乳糖苷酶(生化学工业社制，来源于刀豆(Jack Beans)，24μL，612mU)。在37℃下将该溶液静置61小时后，通过HPLC分析确认反应结束。冷冻干燥反应溶液，接着，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120AODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为3.5mL/min)精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物11(71mg，收率为70％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.11(s，1H，Man4-H-1)，4.99(1H，d，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.55(d，2H，J＝8.6Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.34(t，1H，Fmoc)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4-H-2)，4.10(s，1H，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.51(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.06(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，1.88(s，3H，Ac)；HRMS按C69H100N6NaO40[M+Na+]计算：1675.5873，测定：1675.5841
实施例21 化合物12的合成
将化合物11(50mg，30μmol)和牛血清白蛋白2.0mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，920μL)中，加入N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于刀豆(Jack Beans)，2.1U)。在37℃下将该溶液静置48小时后，通过HPLC分析确认反应结束。用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)精制反应溶液，冷冻干燥。用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)对该残留物进行脱盐，得到目的化合物12(25mg，收率为66％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.70(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.50(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，5.10(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(bd，1H，J＝1.6Hz，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.58～4.52(b，1H，GlcNAc2-H-1)，4.33(t，1H，Fmoc)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(dd，1H，J＝1.6Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，3.97(dd，1H，J＝1.6Hz，3.5Hz，Man4’-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.53(bdd，1H，J＝9.0Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.88(each s，each 3H，Ac)
实施例22 化合物13的合成
将化合物12(10mg，11μmol)和牛血清白蛋白0.9mg溶解于HEPES缓冲溶液(50mM，pH5.0，440μL)中，加入α-甘露糖苷酶(Sigma-Aldrich公司制，来源于刀豆(Jack Beans)，30μL，3.2U)。在37℃下将该溶液静置21小时后，通过HPLC分析确认反应结束。接着，用HPLC(YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝80∶20，流速为4mL/min)进行精制。再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物13(3mg，收率为43％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.51(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.43(dd，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.57(1H，GlcNAc2-H-1)，4.06(d，1H，J＝3.2Hz，Man3-H-2)，2.72(bd，1H，J＝15.5Hz，Asn-βCH)，2.52(bdd，1H，J＝8.3Hz，15.5Hz，Asn-βCH)，2.05，1.89(each s，each3H，Ac)
(糖链天冬酰胺衍生物的Fmoc基的脱保护)
以下，对所有糖链天冬酰胺衍生物，按照下述顺序进行Fmoc基的脱保护。首先，向每1μmol糖链天冬酰胺Fmoc体中加入240μL的N，N-二甲基甲酰胺、160μL的吗啉，在室温、氩气环境下使之反应。通过TLC(使用1M醋酸铵∶异丙醇＝8∶5作为展开溶剂)确认反应结束后，用冰水冷却。向其中加入反应溶液的10倍量的乙醚，搅拌15分钟后，过滤析出的沉淀物。将得到的残渣溶解于水中，在35℃下进行蒸发。再加入甲苯3mL，进行蒸发，这种操作重复3次。用反相柱色谱法(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，展开溶剂为水)对残留物进行精制。
实施例23 化合物33的合成
按照上述操作使化合物10(10.5mg，5.3μmol)反应7小时后，得到目的化合物33(7mg，收率76％)。由于1H-NMR与标准品一致，从而确认了得到的化合物。
实施例24 化合物26的合成
按照上述操作使化合物3(8.0mg，3.8μmol)反应21小时后，得到目的化合物26(6.3mg，收率88％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.56(d，1H，J＝8.1Hz，GlcNAc5-H-1)，4.52(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.12(bs，1H，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝6.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.07，2.06，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)按C71H118N7O51[M+H+]计算：1884.7，测定：1884.5
实施例25 化合物27的合成
按照上述操作使化合物4(11.0mg，5.8μmol)反应23小时后，得到目的化合物27(8.5mg，收率88％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.08(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.95(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，2H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.45(d，1H，J＝7.6Hz，Gal6’-H-1)，4.26(bd，1H，Man3-H-2)，4.12(bd，1H，Man4’-H-2)，4.08(bdd，1H，J＝1.6Hz，3.3Hz，Man4-H-2)，2.94(dd，1H，J＝4.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.2Hz，17.2Hz，Asn-CH)，2.68(dd，1H，J＝4.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.09，2.07，2.04，2.02(each s，each 3H，Ac)，1.72(dd，1H，J＝12.1Hz，12.1Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)按C63H104N6NaO46[M+Na+]计算：1703.6，测定：1703.1
实施例26 化合物28的合成
按照上述操作使化合物5(7.0mg，4.0μmol)反应21小时后，得到目的化合物28(5.3mg，收率87％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.94(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.10，4.07(each 1H，Man4’，3-H-2)，2.93(dd，1H，J＝4.6Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.85(dd，1H，J＝7.0Hz，17.5Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3eq)，2.08，2.06，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(2H，dd，J＝12.2Hz，12.2Hz，NeuAc7’-H-3ax)；MS(Fab)按C57H94N6NaO41[M+Na+]计算：1541.5，测定：1541.3
实施例27 化合物30的合成
按照上述操作使化合物7(13.9mg，6.6μmol)反应7小时后，得到目的化合物30(8.0mg，收率64％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.13(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.60(each d，each 1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2，5-H-1)，4.55(d，1H，J＝8.4Hz，GlcNAc5’-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，3.2Hz，Man4’-H-2)，4.10(bdd，1H，J＝1.4Hz，3.2Hz，Man4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.5Hz，16.7Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.07，2.06，2.05，2.02，2.01(each s，each 3H，Ac)，1.71(dd， 1H，J＝12.4Hz，12.4Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C71H117N7NaO51[M+Na+]计算：1906.7，测定：1906.1
实施例28 化合物31的合成
按照上述操作使化合物8(8.0mg，4.2μmol)反应12小时后，得到目的化合物31(6.0mg，收率86％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.59(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.43(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.24(bd，1H，Man3-H-2)，4.18(bdd，1H，Man4’-H-2)，2.91(bd，1H，J＝17.0Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.5Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.66(dd，1H，J＝4.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06，2.06，2.02，2.00(each s，each 3H，Ac)，1.70(dd，1H，J＝12.6Hz，12.6Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C63H104N6NaO46[M+Na+]计算：1703.6，测定：1703.0
实施例29 化合物32的合成
按照上述操作使化合物9(7.7mg，4.4μmol)反应23小时后，得到目的化合物32(5.2mg，收率78％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.14(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4,60(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.44(d，1H，J＝8.0Hz，Gal6-H-1)，4.23(d，1H，J＝3.0Hz，Man3-H-2)，4.19(bdd，1H，J＝1.3Hz，2.9Hz，Man4-H-2)，2.92(dd，1H，J＝4.1Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.5Hz，12.7Hz，Asn-βCH)，2.67(dd，1H，J＝4.6Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.06(s，6H，Ac×2)，2.03，2.01(each s，each3H，Ac)1.71(dd，1H，J＝12.7Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C57H94N6NaO41[M+Na+]计算：1541.5，测定：1541.2
实施例30 化合物37的合成
按照上述操作使化合物14(9.1mg，5.0μmol)反应13小时后，得到目的化合物37(6.5mg，收率77％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57，4.55(each d，each1H，J＝7.5Hz，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.3Hz，Gal6’-H-1)，4.23(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.87(dd，1H，J＝4.8Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝7.2Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C60H100N6NaO43[M+Na+]计算：1615.6，测定：1615.0
实施例31 化合物42的合成
按照上述操作使化合物19(9.8mg，5.4μmol)反应13小时后，得到目的化合物42(8.0mg，收率88％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.57，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8 z，Gal6-H-1)，4.28(s，1H，Man3-H-2)，4.18(s，1H，Man4’-H-2)，4.10(s，1H，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.0Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.5Hz，16.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.04(s，6H，Ac×2)，2.00(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C60H101N6O43[M+H+]计算：1593.6，测定：1593.8
实施例32 化合物38的合成
按照上述操作使化合物15(5.1mg，3.2μmol)反应11小时后，得到目的化合物38(4.0mg，收率91％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.4Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’·H-1)，4.24(d，1H，J＝2.3Hz，Man3-H-2)；4.10，4.06(each bd，each 1H，Man4’，4-H-2)，2.90(dd，1H，J＝4.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝7.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C52H88N5O38[M+H+]计算：1390.5，测定：1390.1
实施例33 化合物72的合成
按照上述操作使化合物70(4.0mg，2.8μmol)反应13小时后，得到目的化合物72(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.09(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.10，4.06(each bs，each 1H，Man4，4’-H-2)，2.87(dd，1H，J＝17.2Hz，Asn-βCH)，2.76(dd，1H，J＝6.5Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H78N5O33[M+H+]计算：1228.5，测定：1228.3
实施例34 化合物43的合成
按照上述操作使化合物20(5.4mg，3.3μmol)反应11小时后，得到目的化合物43(4.1mg，收率87％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，Gal6-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4-H-2)2.90(dd，1H，J＝4.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C52H88N5O38[M+H+]计算：1390.5，测定：1390.2
实施例35 化合物73的合成
按照上述操作使化合物71(4.0mg，2.8μmol)反应13小时后，得到目的化合物73(2.9mg，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.60，4.54(each d，each 1H，J＝7.9Hz，GlcNAc2.5-H-1)，4.24(s，1H，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，3.96(1H，dd，J＝1.6Hz，1.6Hz，Man4-H-2)，2.88(dd，1H，J＝4.3Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.77(dd，1H，J＝7.2Hz，16.8Hz，Asn-βCH)，2.06，2.04，2.00(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H78N5O33[M+H+]计算：1228.5，测定：1228.3
实施例36 化合物39的合成
按照上述操作使化合物16(2.2mg，1.5μmol)反应7小时后，得到目的化合物39(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.75(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.58(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.09，4.08(each s，each 1H，Man3，4’-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.81(dd，1H，J＝6.8Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.08，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H77N5NaO33[M+Na+]计算：1250.4，测定：1250.3
实施例37 化合物40的合成
按照上述操作使化合物17(1.5mg，1.2μmol)反应14小时后，得到目的化合物40(1.1mg，收率89％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62，4.55(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.10，4.07(each s，each 1H，Man4’，3-H-2)，2.89(dd，1H，J＝3.7Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.79(dd，1H，J＝7.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C40H67N5NaO28[M+Na+]计算：1088.4，测定：1088.2
实施例38 化合物41的合成
按照上述操作使化合物18(1.3mg，1.2μmol)反应14小时后，得到目的化合物41(0.8mg，收率80％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.07(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.62(d，1H，J＝7.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.08(d，1H，J＝2.9Hz，Man3-H-2)，2.92(dd，1H，J＝3.9Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.83(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C32H55N4O27[M+H+]计算：863.3，测定：863.2
实施例39 化合物44的合成
按照上述操作使化合物21(2.3mg，1.6μmol)反应7小时后，得到目的化合物44(1.6mg，收率84％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.57(each d，each 1H，GlcNAc2，5-H-1)，4.46(d，1H，J＝7.8Hz，Gal-H-1)，4.22，4.18(each bs，each 1H，Man3，4-H-2)，2.91(dd，1H，J＝4.1Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.82(dd，1H，J＝7.0Hz，17.3Hz，Asn-βCH)，2.05，2.04，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C46H78N5O33[M+H+]计算：1228.5，测定：1228.3
实施例40 化合物45的合成
按照上述操作使化合物22(1.6mg，1.3μmol)反应14小时后，得到目的化合物45(1.1mg，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.12(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61，4.54(each d，each 1H， GlcNAc2，5-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.5Hz，Man3-H-2)，4.18(dd，1H，J＝1.4Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)，2.89(dd，1H，J＝4.3Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.78(dd，1H，J＝7.5Hz，16.9Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C40H67N5NaO28[M+Na+]计算：1088.4，测定：1088.3.
实施例41 化合物46的合成
按照上述操作使化合物23(1.6mg，1.5μmol)反应14小时后，得到目的化合物46(1.1mg，6.4μmol，收率85％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.06(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝7.3Hz，GlcNAc2-H-1)，4.22(d，1H，J＝2.4Hz，Man3-H-2)，4.07(dd，1H，J＝1.6Hz，3.0Hz，Man4’-H-2)2.90(dd，1H，J＝4.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.80(dd，1H，J＝7.0Hz，17.2Hz，Asn-βCH)，2.05，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C32H55N4O23[M+H+]计算：863.3，测定：863.3
实施例42 化合物34的合成
按照上述操作使化合物11(12.4mg，7.5μmol)反应11小时后，得到目的化合物34(9.2mg，收率86％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.11(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝10.0Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.77(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝6.8Hz，GlcNAc2-H-1)，4.55(d，2H，GlcNAc5，5’-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.18(bs，1H，Man4’-H-2)，4.10(bs，1H，Man4-H-2)，2.80(dd，1H，J＝3.8Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.63(dd，1H，J＝8.2Hz，15.6Hz，Asn-βCH)，2.07(s，3H，Ac)，2.05(s，6H，Ac×2)，2.01(s，3H，Ac)；MS(Fab)按C54H90N6NaO38[M+Na+]计算：1453.5，测定：1453.2
实施例43 化合物35的合成
按照上述操作使化合物12(12.0mg，8.4μmol)反应11小时后，得到目的化合物35(7.0mg，收率81％)。得到的化合物的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
δ5.10(s，1H，Man4-H-1)，5.07(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H-1)，4.91(s，1H，Man4’-H-1)，4.78(s，1H，Man3-H-1)，4.61(d，1H，J＝8.0Hz，GlcNAc2-H-1)，4.25(bs，1H，Man3-H-2)，4.06(bs，1H，Man4’-H-2)，3.97(bs，1H，Man4-H-2)，2.79(dd，1H，J＝5.0Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.61(dd，1H，J＝7.3Hz，17.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.01(each s，each 3H，Ac)；MS(Fab)按C38H65N4O28[M+H+]计算：1025.4，测定：1025.2
实施例44 化合物76、77的合成与分离
将化合物2、6(5.0mg，2.2μmol)溶解于220μL的水中，加入22mM的碳酸铯水溶液100μL，达到pH7.0。将该溶液冷冻干燥。向干燥后的固体物质中加入N，N-二甲基甲酰胺430μL，再加入6.6μmol的苯甲基溴/N，N-二甲基甲酰胺溶液20μL。在氩气环境下搅拌该溶液。48小时后，通过TLC(展开溶剂使用1M NH4OAc∶异丙醇＝2∶1)确认原料消失后，加入4.4mL的乙醚，使化合物沉淀。过滤沉淀的糖链，使残留的糖链溶解于水，冷冻干燥。用分离HPLC(YMC PackedColumn D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178，20×250mm，展开溶剂为50mM醋酸铵水溶液∶乙腈＝78∶22，流速为4.0mL/min)精制冷冻干燥后的残留物，88分钟后洗脱出化合物77，91分钟后洗脱出化合物76。分别收集这些化合物，再用ODS柱(Cosmosil 75C18-OPN，15×100mm，最初流过H2O 50mL，接着流过25％乙腈进行洗脱)脱盐，得到目的化合物76 1.6mg，化合物77 1.8mg。得到的化合物的物理数据如下所述。
化合物76的数据
1H-NMR(30℃)
δ7.92(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.53-7.40(m，9H，Fmoc，-CH2-Ph)，5.38(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.31(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.5Hz，GlcNAc1-H-1)，4.92(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(m，3H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.47(d，1H，J＝7.9Hz，Gal6’-H-1)，4.33(d，1H，J＝7.9Hz，Gal6-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.11(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.6Hz，12.7Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.52(dd，1H，J＝8.7Hz，15.0Hz，Asn-βCH)，2.07，2.04，2.03，2.02，1.89(each s，each 3H，Ac)1.84(dd，1H，J＝12.7Hz，12.7Hz，NeuAc7-H3ax)；MS(Fab)按C99H143N17NaO58[M+H+]计算：2380.8，测定：2380.0.
化合物77的数据
1H-NMR(30℃)
δ7.91(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.71(d，2H，J＝7.5Hz，Fmoc)，7.53-7.41(m，9H，Fmoc，-CH2-Ph)，5.37(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.31(d，1H，J＝12.1Hz，-CH2-Ph)，5.12(s，1H，Man4-H-1)，4.99(d，1H，J＝9.8Hz，GlcNAc1-H-1)，4.93(s，1H，Man4’-H-1)，4.76(s，1H，Man3-H-1)，4.58(m，3H，GlcNAc2，5，5’-H-1)，4.46(1H，d，J＝7.8Hz，Gal6-H-1)，4.33(d，1H，J＝7.8Hz，Gal6’-H-1)，4.24(bs，1H，Man3-H-2)，4.19(bs，1H，Man4’-H-2)，4.11(bs，1H，Man4-H-2)，2.72(bd，1H，Asn-βCH)，2.68(dd，1H，J＝4.8Hz，13.0Hz，NeuAc7-H-3eq)，2.52(bdd，1H，J＝9.7Hz，14.1Hz，Asn-βCH)，2.06，2.05，2.04，2.02，1.89(each s，each 3H，Ac)，1.84(dd，1H，J＝13.0Hz，13.0Hz，NeuAc7-H-3ax)；MS(Fab)按C99H143N7NaO58[M+H+]计算：2380.8，测定：2380.5
实施例45 化合物78的合成
使化合物1(20mg)的冷水溶液流入冷却至4℃的Dowex-50W×8(H+)的柱(φ0.5cm×5cm)，将洗脱出的水溶液冷冻干燥。将得到的冷冻干燥物溶解于4℃的冷水中，向其中加入Cs2CO3水溶液(2.5mg/1ml)，调节水溶液的pH为5～6，然后将该水溶液冷冻干燥。将冷冻干燥后的Fmoc-二唾液酸糖链样品溶解于DryDMF(1.3ml)中，加入苯甲基溴(5.1μL)，在氩气流下，室温下搅拌45小时。通过TLC确认反应结束后，将反应溶液冷却至0℃，加入乙醚10ml，使目的物析出。用滤纸将其过滤。在残留的目的物中加入蒸馏水，作为滤液进行洗脱，接着将其减压浓缩。用ODS柱(φ1.6cm×14cm，洗脱液：水溶液)精制得到的残渣，得到化合物78(18.2mg，收率85％)。得到的化合物78的物理数据如下所述。
1H-NMR(30℃)
7.90(d，2H，Fmoc)，7.70(d，2H，Fmoc)，7.53-7.40(m，9H，Bn，Fmoc)，5.36(d，2H，J＝11.6Hz，CH2)，5.30(d，2H，J＝11.6Hz，CH2)，5.12(s，1H，Man4-H1)，4.99(d，1H，J＝9.7Hz，GlcNAc1-H1)，4.93(s，1H，Man4’-H1)，4.75(s，1H，Man3-H1)，4.57(m，3H，GlcNAc2-H1，GlcNAc5，5’-H1)，4.32(d，2H，Gal6，6’-H1)，4.24(d，1H，Man3-H2)，4.18(d，1H，Man4’-H2)4.10(1H，d，Man4-H2)，2.72(bd，1H，Asn-βCH)，2.67(dd，2H，NeuAc7，7’-H3eq)，2.51(bdd，1H，Asn-βCH)，2.06(s，3H，Ac)，2.03，2.01(each s，each 6H，Ac×2)，1.89(s，3H，Ac)，1.83(2H，dd，J＝12.2，12.2Hz，NeuAc7，7’-H3ax)；HRMS按C117H165N8Na2O66[M+Na+]计算：2783.9597，测定：2783.9501
工业实用性
按照本发明，可以非常容易且大量地得到具有所需糖链结构的各种糖链类。因此，期待用于癌、炎症、流感等的治疗药。特别是按照本发明可以得到的糖链天冬酰胺衍生物、糖链天冬酰胺，在制备过程中不存在混入毒性成分等的危险性，安全性优良。