治疗M2b型急性髓性白血病的靶点 【技术领域】
本发明涉及急性髓性白血病治疗领域，特别是一种治疗M2b型急性髓性白血病的靶点。
背景技术
急性髓性白血病(AML)是一种恶性的造血系统疾病，发病率为1～3/10万人口，近年有逐步增高的趋势。AML治疗困难病死率高，其总的完全缓解率仅为50％～70％，5年生存率为25％～30％。
根据细胞形态学、免疫学、细胞遗传学与分子生物学特点，AML可分为8种类型(M0～M7)，M2b型急性髓性白血病(AML M2b)是M2型急性髓性白血病(AML M2)的一种亚型，发病率占所有AML的10.4％左右。目前AML M2b的治疗仍以化疗为主。化疗药的作用靶点包括DNA(直接破坏DNA)、二氢叶酸还原酶、胸苷酸合成酶、DNA多聚酶、核苷酸还原酶、微管、核糖体等。化疗虽可获得较高的缓解率，但其毒副作用大且易复发并可由于耐药性的产生而导致治疗失败。
因此，揭示引起AML M2b发病的分子异常并将其作为治疗靶点、开发特异针对这种靶点的药物，可提高AML M2b的疗效并减轻治疗伴随地毒副作用，对AML M2b的临床治疗有重要意义。迄今尚未见以C-KIT突变和/或表达增高为AML M2b治疗靶点的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种新的有实际应用价值的AML M2b治疗靶点，以克服上述现有治疗方法的缺陷，为AML M2b病人提供一种新的治疗途径，以进一步提高疗效、改善病人预后。
为实现上述目的，本发明提供一种治疗AML M2b的靶点，该靶点为癌基因C-KIT突变和/或表达增高。
本发明既进一步阐明了AML M2b的发病机制，又为AML M2b的治疗提供新的治疗靶点。这一新靶点的发现对开发AML M2b基于致病基因蛋白产物的靶向疗法具有重要意义，对改善AML M2b病人预后具有潜在的临床应用价值。
【具体实施方式】
发明人对53例AML M2b、5例AML M2a、20例AML M3、12例AML M4、4例AML M5、1例AML M6、5例急性淋巴细胞性白血病(ALL)、6例慢性粒细胞性白血病、4例非霍奇金淋巴瘤病人筛查了III型受体酪氨酸激酶家族成员C-KIT的完整编码序列，并在基因组DNA水平上加以验证。发现在53例AML M2b病人中，25例在两个C-KIT等位基因中有一个等位基因突变，而在其他类型的白血病/淋巴瘤病人中未发现C-KIT突变。
在25例发生C-KIT突变的AML M2b病人中，我们发现了包括7种点突变、1种缺失型突变、3种ITD型突变在内的11种类型的突变形式。3种点突变、3种ITD型突变为首次发现。突变情况见表1。
发明人发现，C-KIT的突变分布于C-KIT蛋白的胞外区、胞内近膜区、激酶1区和激酶2区(TK1、TK2)及激酶间区。迄今我们共发现11种类型的突变，包括7种点突变、一种缺失型突变和3种内串连重复(internal tandem duplication，ITD)型突变，其中3种点突变、3种ITD突变为首次发现。
表1 AML M2b病人中C-KIT突变类型
突变类型 C-KIT蛋白结构上 突变的后果 备注
发生突变的氨基
酸部位
点突变N822K 第822位天门冬 赖氨酸
酰胺
点突变D816Y 第816位天门冬 酪氨酸
氨酸
点突变D816V 第816位天门冬 缬氨酸
氨酸
点突变D816H 第816位天门冬 组胺酸
氨酸
点突变V825I 第825位缬氨酸 异亮氨酸 我们首次发现
点突变L773S 第773位亮氨酸 丝氨酸 我们首次发现
点突变I748T 第773位异亮氨 苏氨酸 我们首次发现
酸
ITD 第773位谷胺酰 插入17个氨基酸 我们首次发现
(Q575+17(EFCELP 胺 (EFCELPYDHKWEFPR
Y NR)
DHKWEFPRNR))
ITD 第571位异亮氨 插入14个氨基酸 我们首次发现
(I571+14(ESVDPT 酸 (ESVDPTQLPYDHKW)
QL
PYDHKW))
ITD 第502～506位氨 AYFNF重复 我们首次发现
(502(AYFNF)506 基酸
repeat)
D419缺失 第419位天门冬 缺失
氨酸
注：大写英文字母为相应氨基酸缩写。
功能上这些突变可分为2型：
(1).调控型(regula tory type)C-KIT突变，即发生在C-KIT蛋白胞外区、胞内近膜区的突变，3种ITD及D419缺失均属此型；
(2).激酶盒袋型(enzymatic pocket type)突变，主要指发生在激酶1区与激酶2区的突变，包括N822K、D816Y、D816V、D816H、V825I等。
发明人发现，AML M2b病人C-KIT mRNA的表达水平较其他类型白血病病人高。在没有C-KIT突变的病人中，其C-KIT mRNA水平亦较高。将这些数据进行以10为底的对数换算后进行统计学分析，发现AML M2b病人C-KIT表达较其他类型白血病为高，差异具有显著性(P＜0.001)；而在AML M2b，C-KIT突变型与野生型病人间C-KIT mRNA的表达没有差异(P＝0.16)(见表2)。
表2白血病病人C-KIT拷贝数
白血病类型 病例 拷贝数，中位数 Log(拷贝数)(均数
数 (范围) ±标准误)
AML M2b伴C-KIT 15 166.13(6.33-11 2.36±0.22*
突变 635.10)
AML M2b不伴C-KIT 13 106.98 1.89±0.24*
突变 (4.52-1548.01)
AML M2a 3 3.7(0.62-11.26) 0.48±0.37
AML M3 12 4.75 0.20±0.41
(0.01-40.26)
AML M4 5 3.26 0.85±0.46
(0.4-151.29)
CML 7 0.39 -0.70±0.51
(0.01-27.78)
其中*表示P＜0.001
发明人比较了伴有与不伴有C-KIT突变的AML M2b病人外周血白细胞计数及其临床预后，发现伴有C-KIT突变者白细胞计数较高而预后较差，差异均具有统计学意义。
发明人分离了AML M2b病人的骨髓单个核细胞，用酪氨酸激酶活性测定试剂盒测定其蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性，发现具有突变型C-KIT的病人其酪氨酸激酶活性比无突变者酪氨酸激酶活性明显增高，而无突变者其PTK活性亦较其他类型白血病为高。
用突变型C-KIT转染鼠32D细胞株，可使其发生转化并去除其对细胞因子IL-3的依赖性。
以上结果说明，癌基因C-KIT异常(发生突变和/或表达增高)与AML M2b的发生密切相关，自然可成为AML M2b新的治疗靶点。根据这种治疗靶点开发若干抗白血病药物。这些治疗靶点开发的抗白血病药物与其他药物联合应用。