化合物菠萝酸苷及其用途 【技术领域】
本发明涉及一组新颖的化合物菠萝酸苷及其在医疗方面的用途，具体说是从菠萝叶中分离制备的新颖的化合物菠萝酸苷，以及该化合物在制备治疗体内过氧化物升高、氧化型低密度和高密度脂蛋白升高所引起的多种疾病药物中的应用。
背景技术
菠萝，为凤梨科植物凤梨Ananas comosus(L.)Merr.[Bromelia comosa L.；A.sativusSchult.Et Schult.f.]的果实，又称菠萝。原产美洲，现广植于热带地区，我国福建、广东、海南、广西、云南等地均有种植。本品始载于清.吴其睿《植物名实图考》，以露兜子为名。该书记载：“露兜子产广东，一名波罗，生山野间，实如萝卜，上生叶一簇，尖长深齿，味色香具佳。果熟金黄色，皮坚如鱼鳞状，去皮食肉，香甜无渣，六月熟”。
古时对于菠萝叶无明确记载，现代人们常用菠萝叶纤维为编织和造纸的原料(《中国高等植物图鉴.第5册》科学出版社1976)。近时有记载菠萝叶具有消食和胃，止泻的功效，主治夏日暑泻，消化不良，胃脘胀痛等(《中华本草.第8卷》上海科学技术出版社1999)。
菠萝叶作为药用的记载比较少见，尤其是未见报道菠萝叶或菠萝酸苷及其新化合物菠萝酸苷治疗体内过氧化物过多、脑缺血等疾病的作用。
【发明内容】
本发明的目的是提供一组新的具有药用价值的化合物菠萝酸苷及其在医疗方面的用途。
具体地说是本发明提供的化合物菠萝酸苷其结构通式如(I)所示：
其中：
菠萝酸苷A：R1＝O-β-D-xyl R2＝OH R3＝H2 R4＝OH
菠萝酸苷B：R1＝O-β-D-glu(6→1)glu R2＝H2 R3＝OH R4＝H2
上述新的化合物菠萝酸苷A-B的理化性质及其各种波谱特征如下：
菠萝酸苷A(ananasoside A，3β，11a，15a-trihydroxycycloart-24-en-26-oic acid-3-O-β-D-xylopyra-noside)；
无色无定型固体，mp158-160℃；
[a]25D-150°(c 0.10，MeOH)；
UV(MeOH)nm：203；
IR ν max(KBr)cm-1：3376，2936，1691，1254，1066，991，862；
HRFABMS m/z 638.4277[M+NH4]+(分子式C35H56O9)；
1H NMR，DEPT和13C NMR(pyridine-d5)数据如下。
菠萝酸苷A的核磁共振数据：
No. 1H 13C DEPT
1 1.35(1H，m)，1.66(1H，m) 32.8 CH2
2 1.76(1H，m)，2.39(1H，m) 31.1 CH2
3 3.81(1H，dd，3.5，11Hz) 88.7 CH
4 42.1 C
5 1.44(1H，dd，4.5，11.5Hz) 48.0 CH
6 1.30(1H，m)，1.44(1H，m) 21.7 CH2
7 2.38(2H，d，12.5Hz) 30.2 CH2
8 1.76(1H，m) 42.1 CH
9 20.6 C
10 26.2 C
11 1.44(1H，dd，9.0，12.0Hz)，1.76(1H，m) 26.2 CH2
12 4.12(1H，t，12.0，6.0Hz) 73.7 CH
13 49.9 C
14 53.0 C
15 4.01(1H，d，8.0) 77.2 CH
16 1.95(1H，m)，2.45(1H，m) 40.2 CH2
17 2.79(1H，m) 44.1 CH
18 1.58(3H，s) 18.1 CH3
19 0.43(1H，d，3.5)，0.65(1H，d，3.5) 30.3 CH2
20 1.81(1H，m) 36.8 CH
21 1.36(3H，s) 18.1 CH3
22 1.82(2H，m) 35.6 CH2
23 1.36(2H，m) 26.2 CH2
24 7.25(1H，t，6.5，15Hz) 142.7 CH
25 128.8 C
26 170.6 C
27 2.09(3H，s) 12.8 CH3
28 1.30(3H，s) 25.8 CH3
29 1.04(3H，s) 15.4 CH3
30 1.33(3H，s) 20.6 CH3
1′ 4.82(1H，d，6.5Hz) 107.4 CH
2′ 4.45(1H，m) 72.9 CH
3′ 4.18(1H，dd，9.0Hz) 74.6 CH
4′ 4.33(1H，m) 69.5 CH
5′ 3.81(2H，d，11.5Hz) 66.7 CH2
菠萝酸苷B(ananasoside B，3β，16β-trihydroxycycloart-24-en-26-oicacid-3-O-β-D-glucopyrano-side(6→1)glu；
无色无定型固体，mp 211-213℃；
[a]25D-93°(c 0.16，MeOH)；
UV(MeOH)nm：215；
IR νmax(KBr)cm-1：3406，2937，1691，1383，1077，1041，892；
HRFABMS m/z 814.4967[M+NH4]+(分子式C42H68O14)；
1H NMR，DEPT和13C NMR(pyridine-d5)数据如下。
菠萝酸苷B的核磁共振数据：
No. 1H 13C DEPT
1 1.56(1H，m)，1.76(1H，m) 33.2 CH2
2 1.08(1H，m)，1.46(1H，m) 32.1 CH2
3 3.47(1H，dd，3.5，11Hz) 88.8 CH
4 41.3 C
5 1.46(1H，dd，12.5，4.5Hz) 47.6 CH
6 1.38(1H，m)，1.56(1H，m) 20.0 CH2
7 1.15(1H，m)，1.90(1H，m) 30.0 CH2
8 1.48(1H，m) 47.0 CH
9 20.3 C
10 25.8 C
11 1.49(1H，m)，2.01(1H，m) 26.8 CH2
12 1.66(2H，m) 32.9 CH2
13 48.0 C
14 47.9 C
15 1.30(1H，m) 48.6 CH2
16 4.28(1H，d，8.0Hz) 78.0 CH
17 1.96(1H，m) 61.6 CH
18 1.10(3H，s) 18.8 CH3
19 0.22(1H，d，3.5Hz)，0.51(1H，d，3.5Hz) 30.0 CH2
20 1.31(1H，m) 35.0 CH
21 0.93(3H，s) 18.6 CH3
22 0.86(1H，m)，1.80(1H，m) 35.1 CH2
23 1.01(1H，m)，1.69(1H，m) 26.2 CH2
24 7.30(1H，t，6.5，15Hz) 143.0 CH
25 128.8 C
26 170.6 C
27 2.13(3H，s) 12.8 CH3
28 1.35(3H，s) 26.8 CH3
29 1.26(3H，s) 15.4 CH3
30 1.35(3H，s) 21.2 CH3
1′；1″4.95(1H，d，8.0Hz)；5.39(1H，d，7.5Hz) 104.9 CH
106.1
2′；2″ 4.20-4.36(m) 83.5 76.0 CH
3′；3″ 4.20-4.36(m) 76.8 77.1 CH
4′；4″ 4.20-4.36(m) 71.5 71.7 CH
5′；5″ 4.20-4.36(m) 78.2 78.3 CH
6′；6″4.60(2H，dd，12Hz)；4.60(2H，dd，12Hz) 62.8 62.8 CH2
本发明提供的化合物菠萝酸苷在制备治疗体内过氧化物升高及其由此引起的疾病的药物中的应用。
本发明提供的化合物菠萝酸苷在制备治疗脑缺血和由此引起地脑神经原受损的药物中的应用。
所述的化合物作为药物使用时，可以是单独应用，也可以是与其它成分混合使用。
在临床应用时，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物。如散剂，丸剂，胶囊剂，片剂，微囊剂，软胶囊剂，膜剂，栓剂，注射剂，膏剂，酊剂，散剂，冲剂，气雾剂，各种外用制剂等。
在多年的研究中，本发明人从菠萝叶中分离制备出的化合物---菠萝酸苷A和菠萝酸苷B。药理实验表明，菠萝酸苷具有抗氧化，增强脑血流的作用，可以用来治疗体内过氧化物升高以及脑缺血所引起病症，如中风，脂代谢紊等。实验结果表明，菠萝酸苷具有明显的升高脑血流的作用，有效终浓度为2.5-10mg/kg。体外实验表明，菠萝酸苷有较强地抑制缺糖缺氧脑组织MDA生成的作用，最低有效浓度为1×10-6g/ml。
【附图说明】
图1为本发明提供的化合物菠萝酸苷的化学结构式。
【具体实施方式】
先将药材重量的5～10倍的醇溶剂在50℃～90℃下进行加热提取，得到提取液；将提取液在50～90℃温度下减压浓缩后，用药材重量的2～5倍水溶解，离心或静止过滤，弃去沉淀，取上清液；将上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用浓度大于70％的乙醇洗脱，将洗脱液在温度50～90℃下减压浓缩，然后减压干燥或冷冻干燥，得到菠萝叶提取物；将菠萝叶提取物用乙醇溶剂溶解，再用硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，用氯仿∶甲醇或石油醚∶丙酮或氯仿∶丙酮梯度洗脱，先后用反相硅胶和葡聚糖凝胶纯化，可先后得到该化合物-菠萝酸苷A和菠萝酸苷B。
菠萝酸苷分离制备的来源植物，可以是菠萝叶，也包括其它任何一种植物。
下述药物实验资料使本发明所说的菠萝酸苷的制备及其用途得以证实，同时又不应将下列实施例看作是对本发明的限制。
实施例1
菠萝酸苷A的分离制备及其理化和波谱数据：
在制备具有上述新化合物时，首先用药材重量的5倍浓度在50％的醇将菠萝叶在60℃加热提取3次，每次为1小时，得到提取液；然后提取液在减压(压力98Kpa)，温度在50℃浓缩后，用药材重量的2倍水溶解，离心，弃去沉淀，上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用80％乙醇洗脱，洗脱液在温度为50℃(压力98Kpa)减压浓缩，浓缩物减压(压力98Kpa)干燥，得到菠萝叶提取物。菠萝叶提取物用70％乙醇溶解，再用硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，用氯仿∶甲醇梯度洗脱，先用反相硅胶分离，继用葡聚糖凝胶纯化，得到菠萝酸苷A。
菠萝酸苷A(ananasoside A，3β，11a，15a-trihydroxycycloart-24-en-26-oic acid-3-O-β-D-xylopyra-noside)；
无色无定型固体，mp158-160℃；
[a]25D-150°(c 0.10，MeOH)；
UV(MeOH)nm：203；
IR ν max(KBr)cm-1：3376，2936，1691，1254，1066，991，862；
HRFABMS m/z 638.4277[M+NH4]+(分子式C35H56O9)；
1H NMR，DEPT和13C NMR(pyridine-d5)数据看下表1。
表1 菠萝酸苷A的核磁共振数据
No. 1H 13C DEPT
1 1.35(1H，m)，1.66(1H，m) 32.8 CH2
2 1.76(1H，m)，2.39(1H，m) 31.1 CH2
3 3.81(1H，dd，3.5，11Hz) 88.7 CH
4 42.1 C
5 1.44(1H，dd，4.5，11.5Hz) 48.0 CH
6 1.30(1H，m)，1.44(1H，m) 21.7 CH2
7 2.38(2H，d，12.5Hz) 30.2 CH2
8 1.76(1H，m) 42.1 CH
9 20.6 C
10 26.2 C
11 1.44(1H，dd，9.0，12.0Hz)，1.76(1H，m) 26.2 CH2
12 4.12(1H，t，12.0，6.0Hz) 73.7 CH
13 49.9 C
14 53.0 C
15 4.01(1H，d，8.0) 77.2 CH
16 1.95(1H，m)，2.45(1H，m) 40.2 CH2
17 2.79(1H，m) 44.1 CH
18 1.58(3H，s) 18.1 CH3
19 0.43(1H，d，3.5)，0.65(1H，d，3.5) 30.3 CH2
20 1.81(1H，m) 36.8 CH
21 1.36(3H，s) 18.1 CH3
22 1.82(2H，m) 35.6 CH2
23 1.36(2H，m) 26.2 CH2
24 7.25(1H，t，6.5，15Hz) 142.7 CH
25 128.8 C
26 170.6 C
27 2.09(3H，s) 12.8 CH3
28 1.30(3H，s) 25.8 CH3
29 1.04(3H，s) 15.4 CH3
30 1.33(3H，s) 20.6 CH3
1′ 4.82(1H，d，6.5Hz) 107.4 CH
2′ 4.45(1H，m) 72.9 CH
3′ 4.18(1H，dd，9.0Hz) 74.6 CH
4′ 4.33(1H，m) 69.5 CH
5′ 3.81(2H，d，11.5Hz) 66.7 CH2
实施例2
菠萝酸苷B的分离制备及其理化和波谱数据：
在制备具有上述新化合物时，然后提取液在减压(压力98Kpa)，温度在70℃浓缩后，用药材重量的2倍水溶解，离心，弃去沉淀，上清液通过大孔吸附树脂，先用水洗脱，洗脱液废弃，再用80％乙醇洗脱，洗脱液在温度为70℃(压力98Kpa)减压浓缩，浓缩物减压(压力98Kpa)干燥，得到菠萝叶提取物。菠萝叶提取物用50％乙醇溶解，再用硅胶拌样，用硅胶柱色谱分离，用氯仿∶丙酮梯度洗脱，先用反相硅胶分离，继用葡聚糖凝胶纯化，继菠萝酸苷A后得到菠萝酸苷B。
菠萝酸苷B(ananasoside B，3β，16β-trihydroxycycloart-24-en-26-oicacid-3-O-β-D-glucopyrano-side(6→1)glu；
无色无定型固体，mp 211-213℃；
[a]25D-93°(c 0.16，MeOH)；
UV(MeOH)nm：215；
IR ν max(KBr)cm-1：3406，2937，1691，1383，1077，1041，892；
HRFABMS m/z 814.4967[M+NH4]+(分子式C42H68O14)；
1H NMR，DEPT和13C NMR(pyridine-d5)数据看下表2。
表2菠萝酸苷B的核磁共振数据
No. 1H 13C DEPT
1 1.56(1H，m)，1.76(1H，m) 33.2 CH2
2 1.08(1H，m)，1.46(1H，m) 32.1 CH2
3 3.47(1H，dd，3.5，11Hz) 88.8 CH
4 41.3 C
5 1.46(1H，dd，12.5，4.5Hz) 47.6 CH
6 1.38(1H，m)，1.56(1H，m) 20.0 CH2
7 1.15(1H，m)，1.90(1H，m) 30.0 CH2
8 1.48(1H，m) 47.0 CH
9 20.3 C
10 25.8 C
11 1.49(1H，m)，2.01(1H，m) 26.8 CH2
12 1.66(2H，m) 32.9 CH2
13 48.0 C
14 47.9 C
15 1.30(1H，m) 48.6 CH2
16 4.28(1H，d，8.0Hz) 78.0 CH
17 1.96(1H，m) 61.6 CH
18 1.10(3H，s) 18.8 CH3
19 0.22(1H，d，3.5Hz)，0.51(1H，d，3.5Hz) 30.0 CH2
20 1.31(1H，m) 35.0 CH
21 0.93(3H，s) 18.6 CH3
22 0.86(1H，m)，1.80(1H，m) 35.1 CH2
23 1.01(1H，m)，1.69(1H，m) 26.2 CH2
24 7.30(1H，t，6.5，15Hz) 143.0 CH
25 128.8 C
26 170.6 C
27 2.13(3H，s) 12.8 CH3
28 1.35(3H，s) 26.8 CH3
29 1.26(3 H，s) 15.4 CH3
30 1.35(3H，s) 21.2 CH3
1′；1″4.95(1H，d，8.0Hz)；5.39(1H，d，7.5Hz) 104.9 CH
106.1
2′；2″ 4.20-4.36(m) 83.5 76.0 CH
3′；3″ 4.20-4.36(m) 76.8 77.1 CH
4′；4″ 4.20-4.36(m) 71.5 71.7 CH
5′；5″4.20-4.36(m) 78.2 78.3 CH
6′；6″4.60(2H，dd，12Hz)；4.60(2H，dd，12Hz) 62.8 62.8 CH2
实施例3：对小鼠脑膜血流量的作用
观察本发明菠萝酸苷A，B对小鼠脑膜血流量的作用。菠萝酸苷A，B。用时以生理盐水配制成所需浓度。试验动物为雄性ICR种小鼠，非近交系封闭群，体重18-22g，由北京维通利华实验动物中心提供。实验室室温20-22℃，相对湿度40％～60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼5只，每三日清扫笼舍一次。
取小鼠乌拉坦(1.0g/kg)麻醉后，固定头部，切开皮肤，于大脑皮质运动区(AP-1，L2)安置激光探头(JI-200激光微循环仪，天津南开大学生产)，待稳定5-10分钟后开始测试脑血流，记录给药前后脑膜血流量的变化。
本试验观察指标及指标表达：所测结果直接经JI-200软件处理，脑膜血流量以KHz(千赫兹)表示，脑膜血流量增加百分值[＝(给药后血流量-给药前血流量)/给药前血流量]。
本试验所用菠萝酸苷A和菠萝酸苷B的给药剂量分别为2.5mg/kg，10mg/kg；给药途径为尾静脉给药；给药体积为0.1ml/10g小鼠。
本试验空白对照为等体积生理盐水，阳性药对照为肾上腺素注射液，10mg/ml。上海天丰制药厂生产，批号：020601，小鼠用量为0.01mg/kg。
本试验数据均以Excel软件处理。
表3：菠萝酸苷A，B对正常小鼠脑血流量的作用(x±s)
药物 剂量 脑血流量(KHz)
(mg/kg) 0 1 3 5 10 15(分
钟)
对照组 11.67 11.51 11.29 11.72 11.77 11.78
±4.02 ±4.31 ±3.76 ±4.17 ±3.92 ±3.96
肾上腺素 0.01 12.13 11.04 13.06 13.09 13.57 13.0
±1.77 ±1.72 ±1.32 ±1.41 ±1.43 ±1.36
菠萝酸苷 2.5 9.0± 9.09 9.16 9.39 9.55 9.42
A 1.76 ±1.63 ±1.73 ±1.89 ±1.78 ±2.03
菠萝酸苷 10 10.07 11.03 10.94 11.16 11.31 11.51
A ±1.94 ±1.69 ±2.12 ±2.33 ±2.32 ±2.32
菠萝酸苷 2.5 12.87 13.26 13.49 13.69 13.76 13.85
B ±3.63 ±3.68 ±3.75 ±3.51 ±3.74 ±3.64
菠萝酸苷 10 10.07 11.03 10.94 11.16 11.31 11.51
B ±1.94 ±1.69 ±2.12 ±2.33 ±2.32 ±2.32
与同时间对照组相比，P＞0.05。n＝5
表4：菠萝酸苷A，B对正常小鼠脑血流量增加百分比值(x±s)
药物 剂量 脑血流量增加百分比值(％)
(mg/kg 0 1 3 5 10 15(分钟)
)
对照组 0 -2.0± -3.01± 0.13± 1.18± 1.17±
5.46 4.37 3.25 3.31 4.07
肾上腺素 0.01 0 -8.7± 9.08± 9.58± 12.52± 7.87±
2.97 16.33* 17.98 6.46* 8.07
菠萝酸苷 2.5 0 1.33± 1.85± 4.16± 6.32± 4.3±
A 1.94 2.53 2.87* 3.65* 5.65
菠萝酸苷 10 0 10.48± 8.81± 10.77± 12.31± 14.64±
A 10.42* 9.45* 9.11* 8.79* 12.45*
菠萝酸苷 2.5 0 3.59± 5.04± 7.18± 7.22± 8.19±
B 8.79 4.26* 7.69 6.79 8.32
菠萝酸苷 10 0 10.47± 8.81± 10.77± 12.31± 14.64±
B 10.42* 9.45* 9.11* 8.79* 12.45*
与同时间对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝5
实验结果显示，菠萝酸苷A-B对小鼠脑膜血流量有明显增加的作用。一般在给药后1分钟即有脑血流升高，5-15分钟脑血流升高明显；表明菠萝酸苷A-B对脑血管有直接地扩张作用，提示对于脑缺血及其血管性痉挛所引起的疾病有较好的作用。
实施例4：对脑MDA生成的影响
观察本发明菠萝酸苷对小鼠脑MDA生成的抑制作用。本发明所用菠萝酸苷A和菠萝酸苷B。用时以生理盐水配制成所需浓度。实验所用动物为雄性ICR小鼠，非近交系封闭群，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2002-0003，体重18-22g。实验室室温20-22℃，相对湿度40％～60％，换气扇通气，自然光源12h/日，笼养，每笼10只，每三日清扫笼舍一次。
取正常小鼠，处死后取脑，加入生理盐水做匀浆液(与脑比例为5∶1)。4℃冰箱静置5分钟，取上部均匀混浊液。每管加入脑组织液150uL，加入不同浓度药液50ul，37℃水浴孵育30分。依次加入10％SDS 0.1ml，50％冰醋酸硫代巴比妥酸液0.5ml和1％盐酸液2ml。沸水浴15分钟，取出后冷水置10分钟，1500转离心15分钟，取上清于532nm处测吸光度A值。每组做三复管。计算抑制率＝[(对照组A-给药组A)/对照组A×100％]。
所得数据经EXCEL软件处理。组间t检验。
本试验菠萝酸苷A和菠萝酸苷B给药终浓度分别为1×10-4g/ml，1×10-5g/ml，1×10-6g/ml。
本试验为体外实验。本试验空白对照为等体积生理盐水.阳性药对照为维生素E，购自Sigma公司。实验终浓度为1×10-5g/ml。本试验数据均以Excel软件处理。
表5菠萝酸苷A，B体外对脑MDA生成的抑制作用(x±s)
分组 药物终浓度 Umol/g
(g/ml)
生理盐水 104.43±9.95
维生素C 1×10-3 42.38±1.66**
菠萝酸苷A 1×10-4 48.72±2.64**
菠萝酸苷A 1×10-5 57.0±6.17**
菠萝酸苷A 1×10-6 68.6±3.88**
菠萝酸苷B 1×10-4 50.72±3.08**
菠萝酸苷B 1×10-5 60.3±7.53**
菠萝酸苷B 1×10-6 68.31±1.15**
与生理盐水组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。n＝3
本实验结果显示，菠萝酸苷A和菠萝酸苷B体外有较强地抑制缺糖缺氧脑组织MDA生成的作用，最低有效浓度为1×10-6g/ml。提示菠萝酸苷A，B具有一定的抗氧化的作用。