非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂及其用途.pdf

本发明涉及一类非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂及其用途。该抑制剂为二苯甲基哌嗪类衍生物，其抑制机理在于体积占位及其与3CL蛋白酶之间的疏水相互作用。利用反相高压液相色谱方法和底物pNA标记的酶活性体系进行该抑制剂对SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性影响的测试，证实其对3CL蛋白酶具有抑制作用，细胞实验也证实其对细胞培育的SARS冠状病毒有抑制作用，可用于治疗和预防SARS病毒感染。

1.  式I化合物或其旋光异构体或其水合物或其与酸形成的可药用的盐制备SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂的用途，

                                  式I
其中，R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅、R₂₁、R₂₂、R₂₃、R₂₄、R₂₅独立选自：氢、C₁～C₄直链或支链烷基、C₂～C₅直链或支链烯基、C₃～C₈环烷基、C₅～C₈环烯基、卤素、羟基、C₁～C₄烷氧基、硝基、羟甲基、酰胺基、三氟甲基、苯基、取代苯基，其中的烷基或烯基链上可以无取代，或者带有一个或多个选自下面的取代基团：卤素、苯基、C₃～C₈环烷基、C₅～C₇环烯基、硝基、羟甲基、酰胺基、三氟甲基、三氟甲氧基；
Q为(CH₂)_nQ1，其中：n为1～3的整数；Q1选自：羟基、羟甲氧基、羟乙氧基、C₁～C₄烷氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、C₁～C₄氮烷基、C₁～C₄氮，氮二烷基、1-氮取代-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮基、1-氮取代咪唑基。

2.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式I化合物的R₁₃和/或R₂₃为卤素。

3.  如权利要求2所述的用途，其特征在于，其中所述卤素为氯。

4.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式I化合物的Q1选自：羟乙氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、1-氮取代-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮基。

5.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物选自：2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇、1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮、1-二苯甲基-4-苄基哌嗪、1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪、2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺。

6.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物与酸形成的可药用的盐为盐酸去氯羟嗪，其化学名是2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇二盐酸盐。

7.  式I化合物或其旋光异构体或其水合物或其与酸形成的可药用的盐制备治疗和预防SARS病毒感染的药物的用途。

8.  如权利要求6所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物选自：2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇、1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮、1-二苯甲基-4-苄基哌嗪、1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪、2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺。

9.  如权利要求7所述的用途，其特征在于，其中所述的式I化合物与酸形成的可药用的盐为盐酸去氯羟嗪，其化学名是2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇二盐酸盐。

非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂及其用途
技术领域
本发明涉及一类预防和治疗抗SARS冠状病毒和其他病毒感染的化合物，具体涉及一类非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂二苯甲基哌嗪类衍生物。
背景技术
2003年春天，非典型肺炎(SARS，Severe Acute Respiratory Syndrome)在香港、广州、北京等地区爆发，给人们的身心健康带来了极大的伤害。没有预防或治疗先例的SARS流行病引起了人们的高度重视。对SARS的药物研发一度成为我国科学家研究的焦点。然而，到目前为止仍没有SARS建议用药。
研究表明变种的冠状病毒是导致SARS的主要元凶。冠状病毒的主要蛋白酶或称3CL蛋白酶是病毒复制中的关键蛋白，其主要功能是水解病毒所表达的两个多聚蛋白质。序列分析表明3CL蛋白酶在已测定的SARS基因组中是保守的，有可能成为药物设计的关键靶标之一。
发明内容
本发明的目的是找到非肽类SARS冠状病毒3CL蛋白酶的抑制剂，并用于抗SARS冠状病毒和其他病毒感染。
本发明的技术方案是基于SARS冠状病毒3CL蛋白酶的三维结构进行药物设计，对ACD等药物数据库虚拟筛选，得到可能对SARS冠状病毒3CL蛋白酶有抑制的化合物。我们购买并合成了百余个化合物(其中包括一些临床用药)，并利用反相高压液相色谱方法和底物pNA标记的酶活性体系进行了这些化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性影响的测试，筛选出对SARS冠状病毒3CL蛋白酶有抑制的化合物，然后对细胞培育的SARS病毒进行测试。
经按上述方案进行药物筛选，本发明发现了如下所示(通式为式I)的一类化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶及细胞培育的SARS病毒具有抑制作用：

                              式I
式I中，R₁₁～R₁₅、R₂₁～R₂₅独立选自：氢、C₁～C₄直链或支链烷基、C₂～C₅直链或支链烯基、C₃～C₈环烷基、C₅～C₈环烯基、卤素、羟基、C₁～C₄烷氧基、硝基、羟甲基、酰胺基、三氟甲基、苯基、取代苯基，其中的烷基或者烯基链上可以无取代，也可以被选自下面的一个或者多个基团所取代：卤素、苯基、C₃～C₈环烷基、C₅～C₇环烯基、硝基、羟甲基、酰胺基、三氟甲基、三氟甲氧基。
Q为(CH₂)_nQ1，其中：n为1～3的整数；Q1为羟基、羟甲氧基、羟乙氧基、C₁～C₄烷氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、C₁～C₄氮烷基、C₁～C₄氮，氮二烷基、1-氮取代-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮基、1-氮取代咪唑基。
式I化合物中存在有手性中心，因此本发明还包括其各种旋光异构体。
本发明还包括式I化合物的水合物。
式I化合物可以与酸形成各种可药用的盐，如盐酸盐。
将式I化合物与药学上可接受的辅剂结合，可以制备治疗和预防SARS病毒感染的药物。
R₁₃、R₂₃优选基团为卤素，最佳为氯。Q1优选基团为羟乙氧基、苯基、吡啶基、酰胺基、1-氮取代-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮基。
当R为氢，n＝1，Q1为苯基、吡啶基、酰胺基时，是我们合成的新化合物。
当R₁₃为氯，其余R为氢，n＝2，Q1为羟乙氧基时，该化合物的盐酸盐是pkumdl_cvs_1003，即盐酸去氯羟嗪，化学名：2-[2-[4-(4-氯苯基)苯基甲基-1-哌嗪基]乙氧基]-乙醇二盐酸盐，拼音名：YANSUAN QIANGQIN，英文名：HydroxyzineDihydrochloride，CAS No.2192-20-3，分子式：C₂₁H₂₇ClN₂O₂·2HCl，分子量：447.83，作为抗组胺药上市多年。
当R为氢，n＝3，Q1为1-氮取代-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮基时，是镇静性抗组胺药奥沙米特，化学名为1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮。
未见上述化合物抑制3CL蛋白酶的文献报道。
我们选用分子对接程序Dock4.0和Autodock3.05研究了化合物pkumdl_cvs_1003等与SARS-3CL蛋白酶的结合模式。如附图1所示，式I化合物结合到3CL蛋白酶上并且产生生物活性的基本因素是体积占位以及相应的疏水相互作用：式I化合物的哌嗪环位于结合口袋的中心位置，该环上的N与3CL蛋白酶的Glu47的主链氧以及Thr190上的侧链羟基有较强的静电相互作用；与甲基相连的两个芳香环和分别占据了蛋白的S1和S1’的位置。
本发明利用反相高压液相色谱方法和底物pNA标记的酶活性体系对受试化合物进行SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性影响测定。反相高压液相色谱及显色活性测定方法定量、准确度高、重现性好、不易受其他物质干扰，是目前利用天然底物测定RNA病毒(包括导致普通感冒或上呼吸道感染等多种病毒和导致SARS的变种冠状病毒)3CL蛋白酶活性的国际通用方法(John Ziebuhr，Gerhard Heusipp，and Stuart G.Siddell，J.VIROL.1997，71(5)，3992-3997.Chang-kang Huang，Ping Wei，Ke-qiang Fan，Ying Liu，Lu-hua Lai.Biochemistry2004，43(15)，4568-4574.)。
利用细胞单层接种法对细胞培育的SARS病毒进行测试。
本发明经测试发现，化合物pkumdl_cvs_1003，pkumdl_cvs_1006等对SARS冠状病毒3CL蛋白酶及细胞培育的SARS病毒具有较好的抑制作用，提示一些老药可以开发出新的用途。
附图说明
图1是本发明的式I化合物与与SARS-3CL蛋白酶的结合模式图。
具体实施方式：
在以下实施例中，我们所用候选化合物购自ICN试剂公司或用常规试剂合成；所用3CL蛋白酶为经基因克隆、表达、纯化制备的，最后经过凝胶过滤柱达到95％以上纯度；所用的底物是根据3CL蛋白酶在SARS病毒多聚蛋白质上的切点所合成的11肽。
进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤以及底物反应条件等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
实施例1.奥沙米特的合成
[参考文献：刘翔，刘庭辉，刘百里。沈阳药科大学学报，2001，18(5)，327-328。]
一、合成路线：

二、实验步骤：
A、1-异丙烯基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(2)的制备
在装有分水器的反应瓶中，加入邻苯二胺54g(0.5mol)、二甲苯220ml，加热搅拌回流后，缓慢滴加乙酰乙酸乙酯71.5g(0.55mol)和二甲苯20ml混合液，滴毕，搅拌回流，共沸脱水至无水珠出现为止，继续搅拌回流2h。反应毕，冷却，析出结晶，过滤，干燥，得白色粒状结晶(3)56.2g(产率64.6％)，mp121-122℃
B、1-(3-氯丙基)-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(3)的制备
在反应瓶中，加入(2)5.042g(0.029mol)、1，3-氯溴丙烷6.5ml、苯37ml和氯化苄基三乙胺(TEBA)0.502g，搅拌溶解后，缓慢滴加60％氢氧化钠溶液22ml，加毕，于60搅拌7h，反应毕，冷却，加入冷水，分出有机层，水层用苯提取，合并有机层，水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，固体抽滤，洗涤，干燥后加入一反应瓶中，加乙醇40ml和盐酸5ml，室温搅拌4h，将反应液倒入冰水300ml中，析出白色固体，抽滤，干燥，得粗品(3)4.304g(产率70.6％)。用乙醇-水重结晶得白色晶体，mp114-115℃。
C、二苯甲基溴甲烷(4)的制备
在反应瓶中，加入二苯甲醇12g(0.065mol)、氢溴酸9.25g，升温至100℃左右，缓慢滴加浓硫酸11ml，加毕，于115℃搅拌5h。冷却，用苯提取，合并有机层，依次用碳酸氢钠溶液、水洗涤，无水氯化钙干燥，减压旋掉溶剂，柱层析提纯，得无色液体(4)14.505g(产率90.3％)。
D、二苯甲基哌嗪(5)的制备
在反应瓶中，加入六水哌嗪18.1g(0.093mol)、甲苯20ml，搅拌回流共沸脱水至无水珠出现为止。脱水毕，冷却至40℃，滴加(4)2.47g(0.01mol)和甲苯3ml的溶液，加毕，加热搅拌回流8h。反应毕，冷却，加水20ml，搅拌后，分出水层(可回收六水哌嗪)，有机层用水洗涤后，加入7mol/L盐酸搅拌，用甲苯萃取。盐酸层用10％氢氧化钠溶液调至pH为12，析出晶体，过滤，干燥，得白色固体(5)1.713g(产率：68.0％)，mp88-89℃(文献89-91℃)。
E、1-[3-[4-(二苯甲基)-1-哌嗪基]丙基]-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮(奥沙米特，pkumdl_cvs_1005)(1)的合成
在反应瓶中，加入(4)1.052g(0.005mol)，二苯基哌嗪1.25g(0.005mol)、DMF4.5ml，三乙胺1ml(0.0022mol)，碘化钾0.132g，于70-80℃搅拌反应14小时，冷却，将反应液倒入20ml蒸馏水中，氯仿萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析提纯，氯仿∶甲醇(体积比100∶5)淋洗，固体用异丙醇-异丙醚重结晶，得无色晶体1.2g(56.3％)，mp：152-154℃
¹HNMR(CDCl₃)δ：1.95(s，2H，CH₂C)，2.43(s，10H，哌嗪环上的和与哌嗪氮相连的CH₂上的氢)，3.93(s，2H，CH₂NCO)，4.21(s，1H，ArCH)，7.03(s，4H，Ar-H)，7.17-7.42(m，10H，苯环上的氢)，9.67(s，1H，ArNHCO)。
实施例2.1-二苯甲基-4-苄基哌嗪(pkumdl_cvs_1006)的合成
按照实施例3中E步骤操作条件，把(4)换成苄基氯，制得1-二苯甲基4-苄基哌嗪，丙酮重结晶得无色晶体，产率81.2％。
¹HNMR(CDCl₃)δ：2.46(s，8H，哌嗪环上的氢)，3.51(s，2H，CH₂Ph)，4.23(s，1H，ArCH)，7.14-7.42(m，15H，苯环上的氢)
实施例3.1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪(pkumdl_cvs_1007)的合成
按照实施例3中E步骤操作条件，把(4)换成3-氯甲基吡啶盐酸盐，制得1-二苯甲基-4-[(吡啶-3-基)甲基]哌嗪，丙酮重结晶得无色晶体，产率61.8％。
¹HNMR(CDCl₃)δ：2.41(s，8H，哌嗪环上的氢)，3.49(s，2H，CH₂-)，4.27(s，1H，CH-)，7.12-7.42，7.65-7.69，8.43-8.45(m，d，d，14H，苯环与吡啶环上的氢)。
实施例4.2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺(pkumdl_cvs_1008)的合成
按照实施例3中E步骤操作条件，把(4)换成氯乙酰胺，制得2-[4-(二苯甲基)哌嗪-1-基]乙酰胺，丙酮重结晶得无色晶体，产率88.2％。
¹HNMR(CDCl₃)δ：2.42，2.57(d，8H，哌嗪环上的氢)，3.01(s，2H，CH₂-)，4.24(s，1H，CH-)，5.50(宽单峰，1H，NH-)，7.03(宽单峰，1H，NH-)，7.14-7.42(m，10H，苯环上的氢)。
实施例5.SARS冠状病毒3CL蛋白酶的制备
一、实验缓冲液体系
1.破壁缓冲液：40mM Tris-HCl
              100mM NaCl
              10mM咪唑
              7.5mM β-巯基乙醇
2.Ni-NTA柱：
(1)洗柱缓冲液：40mM Tris-HCl
               100mM NaCl
               10mM咪唑
               7.5mM β-巯基乙醇
(2)洗脱缓冲液：40mM Tris-HCl
               100mM NaCl
               250mM咪唑
               7.5mM β-巯基乙醇
(3)凝胶过滤柱：40mM Tris-HCl
               100mM NaCl
               7.5mM β-巯基乙醇
二、操作步骤及方法
1.载体构建：
从3CL蛋白酶的克隆载体中用引物扩增，通过Nhe I和Xho I的DNA限制性内切酶切口连接入表达载体pET21a(Novagen公司)，得到3CL蛋白酶的表达载体pET21a-3CLP-21x。该载体表达的3CL蛋白酶的氨基酸链碳端带有6个组氨酸。
2.表达纯化：
表达载体pET21a-3CLP-21x转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)。在转化平板上挑取一个转化子单菌落，50毫升LB培养基37℃，220转/分钟培养12小时后，按1％的接种量转接入1升LB培养基中37℃，220转/分钟继续培养至OD₆₀₀＝0.8，加入终浓度为0.5mM/L的IPTG，30℃，240转/分钟诱导表达3小时。5000g离心收集菌体，超声破壁，24000g离心收集上清液。上清液过Ni-NTA柱(Qiagen公司)纯化，过完Ni柱后得到的产品经过超滤浓缩，再经过Sephacryl S-200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia公司)纯化，最终得到95％以上纯度的3CL蛋白酶产品，产量约每升培养液15毫克纯蛋白。
实施例6.底物合成
根据3CL蛋白酶在病毒多聚蛋白质上的切点，设计了一个11肽：NH₂-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH₂，作为3CL蛋白酶酶促反应的分解底物，酶促反应的分解产物分别为NH2-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-COOH和NH₂-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-CONH₂。利用标准的芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基(tBu)保护策略多肽固相合成方法合成此底物11肽。多肽固相合成在Rink树脂(Advanced ChemTech公司，美国)上进行。
实验方法：
1.称量0.667g Rink树脂(取代值0.6mmol/g)，在反应器中以5mL二氯甲烷溶胀3小时；
2.抽干二氯甲烷，再加入40％六氢吡啶DMF溶液5mL，脱除Fmoc保护基，反应40分钟；
3.抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂；
4.称量1.6mmol保护氨基酸，加入等摩尔量的1-羟基苯并三氮唑及2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-四甲基脲六氟磷酸盐的N-甲基吡咯烷酮溶液2mL溶解，反应成活泼酯，再加入等摩尔量二异丙基乙基胺；
5.将此溶液加入反应器，于摇床震荡反应3-5小时；
6.反应完成后，抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂；
7.取少量树脂，加入干净小试管，分别加入(1)水合茚三酮/无水乙醇溶液、(2)苯酚/无水乙醇溶液、(3)KCN/吡啶溶液各两滴，于沸水浴中加热2～3分钟，观察树脂颜色。若树脂无色，则反应完全，可继续进行后续反应步骤8；若树脂变蓝色，则反应不完全，应自步骤4重新进行这一步偶联反应；
8.加入40％六氢吡啶DMF溶液5mL，脱除Fmoc保护基，反应40分钟；
9.抽干反应液，以DMF、二氯甲烷、异丙醇、DMF顺次洗涤树脂。按步骤4偶联下一氨基酸；
10.待所有氨基酸残基偶联完成并脱Fmoc保护后，将树脂仔细洗涤干净，真空干燥至恒重；
11.每25mg肽树脂加入1mL K试剂(5％水，5％苯酚，5％苯甲硫醚，2.5％二巯基乙烷，82.5％三氟乙酸)于室温反应不超过3小时；
12.反应完成后，加入大量冰乙醚中，冰冻过夜。过滤并用冰乙醚洗净；
13.用适当浓度的乙腈/水溶液溶解，过滤除去树脂，洗净。滤液真空冻干，即得产物。
14.产物经高压液相色谱分离纯化，以基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱鉴定分子量。
所用保护氨基酸分别为：Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gln-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(But)-OH，，Fmoc-Thr(But)-OH，Fmoc-Val-OH。
实施例7.反相高压液相色谱测试抑制剂pkumdl_cvs_1003
一、实验试剂
储备液：
Tris-HCl缓冲溶液储备液：200mM，pH＝8.0；
二硫代苏糖醇储备液：100mg/mL溶于水；
3CL蛋白酶储备液：6mg/mL溶于Tris-HCl缓冲溶液，分子量为35kDa；
底物11肽：冻干粉，分子量为1192Da。
实验溶液：
Tris-HCl缓冲溶液：40mM，pH＝8.0。
3CL蛋白酶溶液：取10μL3CL蛋白酶储备液，加二硫代苏糖醇储备液10μL，Tris-HCl缓冲溶液360μL。
底物11肽：称量一定质量冻干粉，用Tris-HCl缓冲溶液溶解至浓度为4mM。
终止液：0.1％三氟乙酸水溶液
抑制剂：pkumdl_cvs_1003(Hydroxyzine Dihydrochloride)为ICN公司产品，CAS Number：2192-20-3。将其溶于DMSO，制备成浓度为1mM的溶液。
二、操作步骤及方法
取5μL Tris-HCl缓冲溶液，加5μL抑制剂DMSO溶液，20μL底物11肽溶液。加入20μL 3CL蛋白酶溶液后开始计时，20分钟后加入50μL终止液。
反应时底物11肽浓度为1.6mM，3CL蛋白酶浓度为1.8μM，二硫代苏糖醇浓度为6.8mM，抑制剂浓度为0.1mM。
高压液相色谱分析：
Zorbax C18分析型反相色谱柱(Agilent公司，美国)，Lab-Prep高压液相色谱系统(Gilson公司，法国)，Unipoint高压液相色谱控制软件(Gilson公司，法国)，紫外检测波长为220纳米。流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，洗脱梯度为0至50％流动相B，洗脱时间为15min，流速1mL/min，进样量80μL。
利用Unipoint高压液相色谱控制软件包含的峰面积积分方法计算底物11肽被3CL蛋白酶分解所得到的两产物的峰面积。将此峰面积与空白样品(为用不含抑制剂的DMSO配制的分析样品)相应峰面积对比，则可以确定生成产物减少的比例，可以据此计算抑制率。

三、实验结果：
在该实验条件下测得pkumdl_cvs_1003的抑制率为45.3％。
实施例8. 底物pNA标记的酶活性体系测试抑制剂pkumdl_cvs_1006
一、仪器
酶标仪    Molecular Device，SpectraMax GeminiXS
移液器    Gilson
Tip头     Axygen
酶标板    Costar，96孔细胞培养板
离心管    Axygen
pH计    Cole Parmer
EIMS    Micromass GCT mass spectrometer，Manchester，England
二、试剂
pNA底物(Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-pNA)    上海吉尔生化
其余所用试剂均为市售分析纯级
三、溶液配制
pNA储液      2mM pNA dd-H₂O溶液
Buffer 1     Tris-HCl  20mM      NaCl     100mM
             EDTA        5mM        DTT       1mM
             pH          7.4
Buffer 2     Tris-HCl  75mM      NaOAc    25mM
             Bis-Tris    25mM       Glycine   25mM
             EDTA        5mM        DTT       1mM
我们设计并购买得到了C-端对硝基苯胺(pNA)标记的多肽底物，其序列为Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-pNA，其中Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln为酶自切位点的P1-P6序列，将自切位点的P1’位的Ser用显色基团pNA代替，酶催化水解Gln-pNA键，释放出显色化合物pNA，通过监测pNA的生成速度确定底物的水解速度。所有实验都在37℃下完成，根据底物水解前后差谱，确定体系最佳检测波长为390nm。
实验结果：
在25μM下测得pkumdl_cvs_1006的抑制率为38.3％。
实施例9.测试对Vero细胞培育的SARS病毒的抑制作用
实验材料：
1.受试物：pkumdl_cvs_1003
2.样品来源：北京大学化学与分子工程学院
3.细胞：Vero 150代
4.病毒：协和株7代
5.溶液：DMEM
实验方法：细胞单层接种法
实验步骤：
一.pkumdl_cvs_1003对Vero细胞毒性测定：
1.Vero细胞1：2传代，40万/mL接种于96孔培养板，37℃、5％CO₂培养24小时。
2.药物：pkumdl_cvs_1003先用100μL二甲基亚砜(DMSO)稀释，然后用培养液配制成200μg/ml，二倍稀释至1.5625μg/mL，分别加入细胞培养板中，每孔200μL。
3.每天观察细胞CPE，三天后记录结果，对细胞没有损伤的药物浓度为药物的安全浓度。
4.结果：