增强了锌结合力的胰岛素衍生物皮下施药胰岛素的药物动力学依赖于其缔合性质。胰岛素在中
性水溶液中形成六聚体。如果胰岛素从组织进入血流而到达作用部
位，它必先经过毛细血管壁。据推测只有单分子的或二聚的胰岛素
才有可能、而六聚的胰岛素或较高分子量的相关物则不可能或可能
性很小(Brange et al.，Diabetes Care：13(1990)，pp 923-954；Kang
et al.，Diabetes Care：14(1991)，pp 942-948)。因此六聚体的解离
是从皮下组织迅速经过进入血流的先决条件。
胰岛素的缔合性质和聚集特性受Zn++的影响，它会导致六聚
体的稳定化并在中性点附近的pH值时导致生成较高分子量的聚集
体直至出现沉淀。Zn++作为添加剂被加入未缓冲的人胰岛素溶液
(pH4)却只是稍微影响作用的形式。尽管这种溶液在注射时在皮下
组织中被迅速中和并形成胰岛素-锌复合体，但是人胰岛素自然的
锌结合力不足以稳定六聚体和更高的聚集体。通过添加Zn++，胰
岛素的释放不被显著延迟而且不会达到强的储存效果。已知胰岛素
六聚体的含锌量是每mol的胰岛素六聚体含大约2mol Zn++(Blun-
dell et al.，Adv.Protein Chem.：26(1972)，pp 323-328)。每个胰
岛素六聚体的2个Zn++离子与胰岛素六聚体牢固结合并且不能被
通常的透析除去。所谓的4-锌胰岛素晶体已被公认地描述，但这
些晶体平均每mol的胰岛素六聚体只含有少于3mol的Zn++(G.D.
Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：81，pp 7093-7097)。
本发明的目的是找出这种胰岛素衍生物：它与人胰岛素相比，具
有增强了的锌结合力，形成含胰岛素六聚体和Zn++的稳定的复合
体，并在皮下注射时出现延迟的作用形式。
式I的胰岛素
![]()
和/或式I的胰岛素的生理上耐受的盐业已被发现，它们基本符合上
述条件并且其中
R1表示苯丙氨酸残基或氢原子，
R3表示基因可编码的氨基酸残基，
Y表示基因可编码的氨基酸残基，
Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有2～35个基因可编码的氨基酸残基的肽，它含1～5个组氨
酸残基，
而残基A2～A20相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的A
链的氨基酸序列，并且残基B2～B29相应于人胰岛素、动物胰岛素
或胰岛素衍生物的B链的氨基酸序列。
这样的式I胰岛素是特别优选的，其中
R1表示苯丙氨酸残基，
R3表示选自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸残基，
Y表示选自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸残基，
Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有4～7个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残
基。
这样的式I胰岛素是更优选的，其中
R1表示苯丙氨酸残基，
R3表示选自Asn、Gly、Ser、Thr、Ala、Asp、Glu和Gln的氨基酸残基，
Y表示选自Ala、Thr、Ser和His的氨基酸残基，
Z表示a)氨基酸残基His或
b)具有2～7个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残
基。
这样的式I胰岛素是特别优选的，其中
Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是特别优选的，其中
R1表示苯丙氨酸残基，
R3表示选自Asn和Gly的氨基酸残基，
Y表示选自Thr和His的氨基酸残基，而
Z表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是更优选的，其中
R1表示苯丙氨酸残基，R3表示甘氨酸残基，Y表示苏氨酸残基而Z
表示具有1～5个氨基酸残基的肽，它含1或2个组氨酸残基。
这样的式I胰岛素是尤为优选的，其中
Z表示具有序列His His、His His Arg、Ala His His、Ala His His Arg、
Ala Ala His His Arg或Ala Ala His His的肽。
肽和蛋白质的氨基酸序列从氨基酸链的N端算起。式I中括
号内的说明例如A1、A6、A7、A11、A20、B1、B7、B19或B30，对应于
胰岛素的A链或B链中氨基酸残基的位置。
“基因可编码的氨基酸残基”这个用词表示氨基酸Gly、Ala、Ser、
Thr、Val、Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Lys、His、Tyr、
Phe、Trp、Pro和硒代半胱氨酸的残基。
动物胰岛素的“残基A2～A20”和“残基B2～B29”这些用词应理
解为例如，得自牛、猪或鸡的胰岛素的氨基酸序列的意思。
胰岛素衍生物的“残基A2～A20”和“B2～B29”表示相应的人胰
岛素的氨基酸序列，这些序列是通过由其它基因可编码的氨基酸置
换其中的氨基酸而形成的。
人胰岛素的A链具有下述序列(序列1)：
Gly，Ile，Val，Glu，Gln，Cys，Cys，Thr，Ser，Ile，Cys，Ser，Leu，
Tyr，Gln，Leu，Glu，Asn，Tyr，Cys，Asn
人胰岛素的B链具有下述序列(序列2)：
Phe，Val，Asn，Gln，His，Leu，Cys，Gly，Ser，His，Leu，Val，Glu，
Ala，Leu，Tyr，Leu，Val，Cys，Gly，Glu，Arg，Gly，Phe，Phe，Tyr，
Thr，Pro，Lys，Thr.
式I的胰岛素衍生物可借助于基因工程构建物的多重性在微生
物中形成(EP 0489780，EP0347781，EP0368187，EP0453969)。基因
工程构建物在发酵期间在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或链霉菌
(Streptomycetes)的微生物中得以表达。形成的蛋白质被贮存于微
生物内(EP 0489780)或分泌入发酵液。
式I的胰岛素实例有：
Gly(A21)-人胰岛素-His(B31)-His(B32)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH
Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH
式I的胰岛素衍生物主要是按标准方法通过基因工程采用定点
诱变制备的。为此，编码期望的式I的胰岛素衍生物的基因结构被
构建并表达于宿主细胞-优选是如大肠杆菌的细菌内或酵母、尤其
是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)内-而且-如果基因结构编
码融合蛋白-式I的胰岛素衍生物就从融合蛋白中释放；类似的方
法被描述于例如：EP-A-0211299、EP-A-0227938、EP-A-
0229998、EP-A-0286956和DE专利申请P3821159中。
细胞破裂后，融合蛋白部分可以通过化学法利用卤化氰-参见
EP-A-0180920-或者通过酶促法利用溶葡萄球菌素或胰蛋白酶
-参见DE-A-3739347而得以裂解。
然后胰岛素前体用已述方法例如按R.C.Marshall and A.S.In-
glis在“Practical Protein Chemistry-A Handbook”(Editor A.Darbre)
1986，pp 49-53中描述的进行氧化亚硫酸解；接着，例如按G.H.
Dixon and A.C.Wardlow在Nature(1960)，pp 721-724中描述的方
法在硫醇存在下形成恰当的二硫键而被复性。但胰岛素前体还可被
直接折叠(EP-A-0600372；EP-A-0668292)。
通过胰蛋白酶解-例如按Kemmler et al.，J.B.C.(1971)，
pp6786-6791的方法除去C肽以及存在的话除去前序列(式II的
R2)，并利用已知技术例如色谱法-如EP-A-0305760和结晶作用
将式I的胰岛素衍生物纯化。
本发明还涉及含胰岛素六聚体和每mol胰岛素六聚体大约5～
9mol Zn++、优选是每mol胰岛素六聚体5～7mol Zn++的复合体，
该胰岛素六聚体由六个式I的胰岛素分子构成。
锌与胰岛素六聚体结合得如此牢固，以至每mol胰岛素六聚体
的5～9mol Zn++不能用例如pH7.4的10mM Tris/Hcl缓冲水溶液
进行40小时的常规透析而除去。
皮下施药后，存在于基本上不含锌的制剂(pH4)中的式I的胰
岛素，与人胰岛素相比显示很小的作用延迟。加入大约20μg Zn++/
ml制剂后，皮下施药之后，观察到更迟的作用开始。最好是在40μg
Zn++/ml时观察作用的延迟，更高的锌浓度可增强该效果。
本发明还涉及式II的前胰岛素原
R2-R1-B2-B29-Y-Z1-Gly-A2-A2O-R3 (II)
其中R3和Y同权利要求1～6的一或多项中提出的式I中的定义，
和
R1表示苯丙氨酸残基或共价键，和
R2表示a)基因可编码的氨基酸残基或
b)具有2～45个氨基酸残基的肽，且残基A2～A20和B2
～B29相应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素衍生物的A和B链的
氨基酸序列，而且
Z1表示具有2-40个基因可编码的氨基酸残基的肽，它具有1-5
个组氨酸残基。
式II的胰岛素原适于用作制备式I的胰岛素的中间体。
优选的式II的胰岛素原是那些其中
R2表示具有2～25个氨基酸残基的肽。
特别优选的式II的胰岛素原是那些其中
R2表示具有2～15个氨基酸残基的肽，其中一个选自Met、Lys和
Arg的氨基酸残基在羧基端。
本发明的式I的胰岛素衍生物和/或含胰岛素六聚体和5～
9mol Zn++/mol六聚体的复合体和/或其生理上耐受的盐(例如其碱
金属盐或铵盐)，主要是用作治疗多尿症、尤其是糖尿病用的药物制
剂的活性化合物。
该药物制剂最好是注射用的溶液或悬浮液；它包括至少一种本
发明的式I的胰岛素衍生物和/或复合体和/或至少一种其生理上耐
受的盐，该盐为溶解的、无定形的和/或晶态-最好是溶解的形式。
该制剂的pH优选是约为2.5～8.5，特别是约为4.0～8.5，它
含合适的等渗剂、合适的防腐剂且适当时还含合适的缓冲剂，而且最
好还具有一定的锌离子浓度；当然，所有这些溶液均为无菌的水溶
液。除活性化合物之外的全部制剂组分构成药物载体溶液。
含式I的胰岛素溶液的制剂pH为2.5～4.5，特别是3.5～4.5，
优选是4.0。
含式I的胰岛素悬浮液的制剂pH为6.5～8.5，特别是7.0～8.
0，优选是7.4。
合适的等渗剂例如有：甘油、葡萄糖、甘露糖醇、NaCl、钙化合物
或镁化合物如CaCl2或MgCl2。
由于等渗剂和/或防腐剂的选用，在弱酸性的pH值下胰岛素衍
生物或其生理上耐受的盐的溶解性会受影响。
合适的防腐剂例如有：苯酚、间甲酚、苯甲醇和/或对-羟基苯甲
酸酯。
可用的缓冲剂物质、特别是用于调节大约为4.0～8.5间的pH
的缓冲剂物质例如有：乙酸钠、柠檬酸钠或磷酸钠。此外，生理上可
接受的稀酸(以HCl为典型)或碱(以NaOH为典型)也适于调节
pH。
如果制剂中存在含Zn++量，一个含量为1μg～2mg的Zn++/
ml，尤以5μg～200μg的Zn++/ml为优选的。
为改变本发明的制剂的作用形式，还可掺合未修饰的胰岛素，优
选是牛的、猪的或人的胰岛素，最好是人胰岛素；或者掺合修饰的胰
岛素例如单一的胰岛素、快速作用(rapid-acting)胰岛素或Gly
(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰岛素。
优选的活性化合物浓度是大约1～1500，更优选大约为5～1000
且最优选大约为40～400国际单位/ml。
实施例1：Gly(A21)-人胰岛素-His(B31)-His(B32)-OH的制
备
该表达系统的制备基本按US5,358,857中描述的进行。其中
还描述了载体pINT 90d和pINT 91d(参见实施例17)和PCR引物
TIR和Insu11。将这4种组分特别用作下述载体构建物的起始原
料。
首先，将Gly(A21)的密码子插入编码小胰岛素原(miniproin-
sulin)的序列中。为此，以pINT 91d为模板并用引物TIR和Insu31
进行PCR反应。
Insu31(序列10)：
5′TTT TTT GTC GAC CTA TTA GCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3′
PCR循环的进行如下：第1分钟94℃，第2分钟55℃，第3分钟
72℃。该循环被重复25次然后将该混合物在72℃下培养7分钟，
接着在4℃下过夜。
使所得PCR片段在乙醇中沉淀以纯化它，干燥，然后按制造商
的说明利用限制酶Nc01和Sal1在限制缓冲液中消化，接着用凝胶
电泳将反应混合物分离而Nc01-前胰岛素原-Sal1片段被分离出。
同样利用Nc01和Sal1使质粒pINT90d的DNA裂解，且猴胰岛素
原(the monkey proinsulin)片段以这种方式从pINT残余质粒中被释
放出来。两种片段通过凝胶电泳被分离，而残余质粒DNA被分离
出。该DNA在连接酶反应中与Nc01-Sal1 PCR片段反应，由此得
到质粒pINT 150d，它被大肠杆菌转化后被复制然后再次分离出来。
将质粒pINT 150d的DNA用作质粒pINT302的起始原料，利
用后者可制备所需的胰岛素变体。
为了构建该质粒，可采用US5,358,857(参见实施例6)中描述
的路线。为此进行彼此独立的两个PCR反应，质粒pINT 150d的
DNA被用作模板。其中一个反应的进行用到引物对TIR和
pINTB5(序列11)：
5′GAT GCC GCG GTG GTG GGT CTT GGG TGT GTAG 3′
而另一个反应用到引物对Insu11和pINTB6(序列12)：
5′A CCC AAG ACC CAC CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′
所得PCR片段是部分互补的，所以在第3个PCR反应中它们
导致生成一个片段，它编码被位置B31和B32增长的Gly(A21)小胰
岛素原。用Nc01和Sal1使该片段裂解，然后在连接酶反应中使之
与所述pINT 90d残余质粒的DNA反应而得质粒pINT302。
将用该质粒转化过的大肠杆菌K12 W3110发酵，再按US5,
227,293的实施例4中的方法操作。作为中间体(在胰蛋白酶裂解
前)而得到的前胰岛素原衍生物具有下述氨基酸序列：
前胰岛素原1(序列3)：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
前胰岛素原1符合式II，此时
R2表示具有11个氨基酸残基的肽，
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示His His Arg(B31～B33)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～20)，
而B2～B29表示人胰岛素的B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
29)。
按US5,227,293中的实施例4用胰蛋白酶将前胰岛素原裂解，
然后按实施例11将所得产物与羧肽酶B反应而得胰岛素1。胰岛
素1符合式I，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示His His(B31～B32)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
20)，而B2～B29表示人胰岛素的B链的氨基酸序列(氨基酸残基2
～29)。
胰岛素1具有下述氨基酸序列：
胰岛素1(序列4)：
B链 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
His His
A链 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
形成如式I所述的二硫键。
实施例2：Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)
-Arg(B34)-OH的制备
按实施例1构建表达载体。
将质粒pINT150d作为模板用于两个彼此独立的PCR反应，利
用引物对TIR和pINT B7(序列13)：
5′GAT GCC GCG
GTG
GTG
CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3′
或Insu11和pINTB8(序列14)：
5′ACCC AAG ACC
GCG
CAC
CAC CGC GGC ATC GTG GAG 3′
两个反应中生成的PCR片段是部分互补的，且在第3个PCR
反应中产生完整的序列，它编码所需的胰岛素变体。用酶Nc01和
Sal1处理该反应的片段，然后将其连接到pINT90d DNA的Nc01/
Sal1-开放式残余质粒(opened residual plasmid)中。生成的质粒
pINT303用大肠杆菌K12 W3110转化后被用作表达所需的前小胰
岛素原(pre-miniproinsulin)的基础。按实施例1进行发酵和操作，
省去羧肽酶B反应。
所得前胰岛素原衍生物具有下述氨基酸序列：
前胰岛素原2(序列5)：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
前胰岛素原2符合式II，此时
R1表示Phe(B1)，
R2表示具有11个氨基酸残基的肽，
Y表示Thr(B30)，
Z1表示Ala His His Arg(B31～B34)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
29)。
然后将前胰岛素原2与胰蛋白酶反应而得胰岛素2。胰岛素2
符合式II，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala His His Arg(B31～B34)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
29)。
胰岛素2具有下述氨基酸序列：
胰岛素2(序列6)：
B链 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His Arg
A链
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
形成如式I所述的二硫健。
实施例3：Gly(A21)-人胰岛素-Ala(B31)-Ala(B32)-His(B33)
-His(B34)-OH的制备
按实施例1构建表达载体。
将质粒pINT150d作为模板用于两个彼此独立的PCR反应，利
用引物对TIR和pINT 316a(序列15)：
5′GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3′
或Insu11和pINT316b(序列16)：
5′A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3′
两个反应中生成的PCR片段是部分互补的，且在第3个PCR
反应中产生完整的序列，它编码所需的胰岛素变体。用酶Nc01和
Sal1处理该反应的片段，然后将其连接到pINT90d DNA的Nc01/
Sal1-开放式残余质粒中。生成的质粒pINT316用大肠杆菌K12
W3110转化后被用作表达所需的前小胰岛素原的基础。按实施例1
进行发酵和操作，省去羧肽酶B反应。
所得前胰岛素原3具有下述氨基酸序列：
前胰岛素原3(序列7)：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
前胰岛素原3符合式II，此时
R1表示Phe(B1)，
R2表示具有11个氨基酸残基的肽，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala Ala His His Arg(B31～B35)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
29)。
然后将前胰岛素原3与胰蛋白酶和实施例11的羧肽酶B反应
而得胰岛素3。胰岛素3符合式I，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala Ala His His(B31～B34)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
20)，而B2～B29表示人胰岛素B链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
29)。
胰岛素3具有下述氨基酸序列：
胰岛素3(序列8)：
B链 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala Ala His His
A链 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
形成如式I所述的二硫键。
实施例4：
将按实施例2制备的胰岛素2与实施例11的羧肽酶B反应而
得胰岛素4。
胰岛素4符合式I，此时
R1表示Phe(B1)，
Y表示Thr(B30)，
Z表示Ala His His(B31～B33)，
R3表示Gly(A21)和
A2～A20表示人胰岛素的A链的氨基酸序列(氨基酸残基2～
20)，而B2～B29表示人胰岛素的B链的氨基酸序列(氨基酸残基2
～29)。
胰岛素4具有下述氨基酸序列：
胰岛素4(序列9)：
B链 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His
A链
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
形成如式I所述的二硫键。
实施例5：胰岛素衍生物的锌结合
在15℃下将胰岛素的制剂(0.243mM人胰岛素，0.13M NaCl，
0.1％苯酚，80μg/ml(1.22mM)的Zn++，10mMTris/Hcl，pH.7.4)用
10mM Tris/HCl pH7.4透析共40小时(16小时和24小时后更换缓
冲液)。然后酸化透析液，用HPLC测定胰岛素的浓度并用原子吸
收光谱测定锌。用不含胰岛素的对照组的锌含量校正锌值，表1给
出了结果：
表1：
对照胰岛素
mol Zn/mol
胰岛素六聚体
|
人胰岛素(HI)
1.98
Gly(A21)Des(B30)-HI
1.8
Gly(A21)Arg(B31)-Arg(B32)-HI
2.1
按本发明的式I的胰岛素：
式I的胰岛素
mol Zn/mol
胰岛素六聚体
|
Gly(A21)His(B31)His(B32)-HI
6.53
Gly(A21)His(B31)His(B32)Arg(B33)-HI
5.29
Gly(A21)Ala(B31)His(B32)His(B33)-HI
6.73
Gly(A21)Ala(B31)His(B32)His(B33)Arg(B34)-HI
5.01
实施例6：人胰岛素对狗的作用形式的锌依赖性
施药法：皮下
剂量：0.3IU/kg，制剂的pH为4.0
每组实验的狗数目(n)为6只
表2显示以起始值的％表示的血液萄萄糖
表2
时间(小时)
不含锌
80μg Zn/ml
160μg Zn/ml
0
100
100
100
0.5
88.66
94.06
101.48
1
59.73
72.31
76.87
1.5
50.61
58.6
67.44
2
54.32
54.05
61.49
3
61.94
58.84
62.8
4
85.59
70.03
71.32
5
100.46
78.97
81.65
6
105.33
94.63
96.19
7
106
102.46
100.27
8
108.39
106.12
104.34
10
102.72
105.11
105.1
12
105.03
107.14
103.02
实施例7：Gly(A21)Ala(B31)His(B32)，His(B33)，Arg(B34)人胰岛素对狗的
作用形式(胰岛素2)
按实施例2制备的胰岛素2被用于下述配方：
甘油20mg/ml；间甲酚2.7mg/ml，胰岛素2 40IU/ml
IU表示国际单位且相当于大约6nmol的胰岛素，例如人胰岛素或式I
的胰岛素。用NaOH或HCl调节pH。
施药法：皮下；剂量：0.3IU/kg；
受试验的狗数为6，制剂的pH为4.0
表3显示以起始值的％表示的血液葡萄糖
表3
时间(小时)
不含锌
20μg Zn/ml
40μg Zn/ml
80μg Zn/ml
0
100
100
100
100
1
74.38
95.24
95.6
102.06
2
48.27
90.11
78.74
97.44
3
57.67
89.96
84.81
90.44
4
74.2
81.35
74.66
88.69
5
91.68
74.43
75.71
79.7
6
100.79
71.61
67.37
65.26
7
98.5
67.73
66.05
62.17
8
100.54
68.92
64.97
47.71
实施例8：Gly(A21)Ala(B31)His(B32)，His(B33)人胰岛素对狗的作
用形式(胰岛素4)
将按实施例4制备的胰岛素4如实施例7中那样配方和应用。
施药法：皮下；剂量：0.3IU/kg；
n＝6；制剂的pH为4.0
表4显示以起始值的％表示的血液葡萄糖
表4
时间(小时)
不含锌
20μg Zn/ml
40μg Zn/ml
80μg Zn/ml
0
100
100
100
100
1
61.51
70
96.52
101.77
2
49.82
52.55
89.28
90.01
3
55.66
60.13
80.23
70.79
4
78.09
78.46
73.03
68.48
5
94.27
97.7
70.3
74.94
6
103.69
105.27
61.86
74.1
7
105.51
106.48
62.28
76.42
8
108.05
104.51
81.68
88
实施例9：Gly(A21)His(B31)，His(B32)人胰岛素对狗的作用形式
(胰岛素1)
将按实施例1制备的胰岛素1如实施例7那样配方和应用。
施药法：皮下；剂量：0.3IU/kg；
n＝6；制剂的pH为4.0
表5显示了以起始值的％表示的血液葡萄糖
表5
时间(小时)
不含锌
20μg Zn/ml
40μg Zn/ml
80μg Zn/ml
0
100
100
100
100
1
60.71
73.16
100.25
102.86
2
52.29
55.43
94.86
100.19
3
61.74
61.6
89.37
89.12
4
79.93
81.53
81.55
79.19
5
96.17
96.84
73.06
70.67
6
103.2
102.43
74.58
75.75
7
110.86
104.75
77.68
79.36
8
113.42
108.14
84.87
78.74
实施例10：Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)His(B33)His(B34)人胰岛素
对狗的作用形式(胰岛素3)
将按实施例3制备的胰岛素3如实施例7那样配方和应用。
施药法：皮下；剂量：0.3IU/kg；
n＝6；制剂的pH为4.0
表6显示以起始值的％表示的血液萄萄糖
表6
时间(小时)
不含锌
20μg Zn/ml
40μg Zn/ml
80μg Zn/ml
0
100
100
100
100
1
75
99
101
99
2
57
77
96
91
3
58
64
84
80
4
82
65
73
79
5
94
70
68
77
6
100
74
72
76
7
96
81
80
69
8
100
90
88
75
9
100
96
94
83
10
95
98
92
87
12
98
99
95
94
14
95
100
94
93
实施例11：由前胰岛素原1制备胰岛素
将200mg按实施例1制备的、其中一个Arg在B链的羧基端的
胰岛素溶于95ml 10mM HCl中。加入5ml pH为8的1M Tris(三
(羟甲基)氨基甲烷)/HCl后，用HCl或NaOH调节pH至8。
加入0.1mg羧肽酶B，90分钟后，精氨酸裂解基本。加入HCl
调节混合物的pH至3.5，泵入反相柱(PLRP-SRP300 10μ，2.5×
30cm，Polymer Laboratories Amherst，MA，USA)。流动相A为含
0.1％三氟乙酸的水，相B由含0.09％三氟乙酸的乙腈构成。在
5ml/min的流速下操作柱子。加样后，用150ml A洗柱子，用22.5～
40％B的线性梯度在400分钟内进行分级洗脱，采用分析用反相
HPLC分析各级分，合并足够纯的含Des-Arg-胰岛素的级分。用
NaOH将pH调至3.5，通过旋转式蒸发器除去乙腈。然后将pH定
到6.5使Des-Arg-胰岛素沉淀。离心出沉淀物，用50ml水洗涤
二次，最后冻干。胰岛素1的产率为60～80％。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)名称：Hoechst Aktiengesellschaft
(B)街：—
(C)城市：Frankfurt am Main
(D)州：—
(E)县：Bundesrepublik Deutschland
(F)邮政编码：65926
(G)电话：069-305-6047
(H)传真：069-35-7175
(I)电报：041234-700 hod
(ii)发明名称：增强了锌结合力的胰岛素衍生物
(iii)序列数：16
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)
(2)序列1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..21
(xi)：序列1描述：
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
20
(2)序列2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..30
(xi)序列2描述：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
(2)序列3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：65个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..65
(xi)序列3描述：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His
1 5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly Ile Val Glu
35 40 45
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55 60
Gly
65
(2)序列4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：53个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..53
(xi)序列4描述：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His
20 25 30
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
35 40 45
Glu Asn Tyr Cys Gly
50
(2)序列5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：66个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..66
(xi)序列5描述：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His
1 5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly Ile Val
35 40 45
Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
50 55 60
Cys Gly
65
(2)序列6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：55个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..55
(xi)序列6描述：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His
20 25 30
His Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
35 40 45
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55
(2)序列7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：67个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..67
(xi)序列7描述：
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His
1 5 10 15
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly Ile
35 40 45
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
50 55 60
Tyr Cys Gly
65
(2)序列8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：55个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..55
(xi)序列8描述：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala
20 25 30
His His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
35 40 45
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55
(2)序列9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：54个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)来源：
(A)生物：大肠杆菌
(ix)特征：
(A)名称/键：蛋白质
(B)位置：1..54
(xi)序列9描述：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His
20 25 30
His Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
35 40 45
Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50
(2)序列10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：39个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1..39
(xi)序列10描述：
TTTTTTGTCG ACCTATTAGC CGCAGTAGTT CTCCAGCTG 39
(2)序列11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1..31
(xi)序列11描述：
GATGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGTA G 31
(2)序列12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1..31
(xi)序列12描述：
ACCCAAGACC CACCACCGCG GCATCGTGGA G 31
(2)序列13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1..34
(xi)序列13描述：
GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TCTTGGGTGT GTAG 34
(2)序列14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1..34
(xi)序列14描述：
ACCCAAGACC GCGCACCACC GCGGCATCGT GGAG 34
(2)序列15的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：37个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1..37
(xi)序列15描述：
GATGCCGCGA TGATGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG 37
(2)序列16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：37个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组的)
(ix)特征：
(A)名称/键：外显子
(B)位置：1..37
(xi)序列16描述：
ACCCAAGACC GCGGCGCATC ATCGCGGCAT CGTGGAG 37