具有抗HIV和抗癌活性的3-位取代的β-咔啉新化合物 本发明涉及3-位取代的β-咔啉新化合物。该类新化合物对HIV-1基因组TAR RNA具有结合作用，能够抑制HIV-1 Tat蛋白与TAR RNA的结合，从而干扰病毒的复制，产生抗病毒活性。抑制HIV-1复制体外实验结果表明，在不显示毒性的剂量下，该类化合物显示了很好的抗病毒活性，这与体外转录的实验结果相吻合。同时该类化合物具有抗肿瘤作用及抗OH*对DNA断裂的抗氧化作用。
HIV-1 TAR RNA是存在于HIV-1病毒mRNA上的一段基因组，当HIV-1 Tat蛋白结合于TAR RNA时，激活了病毒的转录，使转录物延长，病毒得以复制。目前抗HIV-1药物主要针对病毒复制和转录两个阶段的关键酶：蛋白酶和逆转录酶。但这两种酶由于病毒本身的变异和遗传异质性而极易产生耐药性。因此，研究者再次回到HIV-1病毒的基础研究中，发现了TAR RNA和Tat蛋白的结合在病毒生命中的重要作用。由此HIV-TAR RNA成为近年来研究的热点。目前，国外正有一些研究机构从事TAR RAN为靶的抗艾滋病药物研究；国内除本组外尚无人对该靶进行药物设计的研究。因此，如以TAR RNA为研究靶，发现一种新的抗HIV-1的药物，那么就可以达到医治艾滋病患者的目的。
文献中已经描述了大量地β-咔啉化合物。尤其对于其HT2c受体强烈亲合性的报导。日本对β-咔啉化合物进行过抗癌活性研究，德国专利GP19502753，要求保护具有体外对抗细胞增殖作用的β-咔啉化合物。欧洲专利申请EP373986要求保护β-咔啉化合物Fravopereirine，它具有强烈的抗癌活性和抗病毒(包括HIV)活性。
除了本发明化合物是新颖的以外，它们还被证明是有效地抗HIV-1、抗癌及抗OH*对DNA断裂作用的物质。因此它们可用于艾滋病、癌症治疗及医疗食品、疾病治疗中的抗氧化剂。
本发明更确切地涉及(I)化合物。
其中：
R1所代表的基团选自：
COR4，其中R4代表氢原子，直链或支链(C1-C6)烷基、芳基、环烷基、杂环、单-(C1-C6)烷基氨基、单-(C1-C6)烷基胍基、二-(C1-C6)烷基胍基，各基团的烷基部分可以是直链或支链的，
CONHR4其中R4是如上定义的，
R2所代表的基团选自：
氢，
直链或支链(C1-C6)烷基，
COR4其中R4是如上定义的，
R3代表氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基-(C1-C6)烷基，后者的烷基部分可以是直链或支链的，
Ra、Rb、Rc和Rd可以相同或不同，彼此独立地所代表的基团选自氢、卤素、直链或支链(C1-C6)烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基。——其中各烷基部分可以是直链或支链的；——羟基、直链或支链的烷基羰基氧基、直链或支链(C1-C6)酰基、芳氧基和芳基——(C1-C6)烷氧基；——其中烷氧基部分可以是直链或支链的……。
所有化合物及其在药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐，
毫无疑问：
--“芳基”被理解为苯基、萘基、四氢萘基、二氢萘基、茚基或2，3-二氢茚基，各自任选地被一个或多个相同或不同的基团取代，取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基，直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、氨基、直链或支链(C1-C6)烷基氨基；--其中各烷氧基部分可以是直链或支链的--，直链或支链(C1-C6)酰基、直链或支链(C1-C6)烷氧基羰基，直链或支链(C1-C6)烷基氨基羰基和氧代。
--“杂环”被理解为饱和或不饱和的单-或二-环基团，具有芳族和非芳族特征，具有5至12个环原子，含有一个、两个或三个相同或不同的杂原子，杂原子选自氧、氮和硫，杂环被理解为可以任选地被一个或多个相同或不同的取代基取代，取代基选自卤素、羟基、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、硝基、氧代和氨基(任意被一个或两个直链或支链(C1-C6)烷基取代)。
在杂环中，可以象征性而不加任何限制地提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃-4-酮、吡嗪基、嘧啶基、异恶唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基……。
在药学上可接受的酸中，可以不加任何限制地提到盐酸、氰溴酸、硫酸、膦酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、甲磺酸、樟脑酸等。
在药学上可接受的碱中，可以不加任何限制地提到氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺、叔丁胺等。
按照一种有利的变例，优选的本发明化合物是，其中，R1是COR4其中R4是如式(I)定义的。按照一种有利的变例，优选的取代基R1是CONR4aR4b其中当R4b代表氢原子时，R4a代表单链(C1-C6)烷基氨基、单链(C1-C6)烷基胍基；R4a和R4b相连时，代表哌嗪。
按照本发明，优选的取代基R2和R3是氢原子和单一直链(C1-C6)烷基。尤其有利的是R2和R3代表氢原子和甲基。
按照本发明，优选的化合物是：
3-乙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
3-己氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
9-甲基-3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
1-甲基-3-乙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
1-甲基-3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
1-甲基-3-哌嗪基-β-咔啉-3-甲酰胺
1-甲基-3-己氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
1，9-二甲基-3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
3-(2-胍基)-乙基-β-咔啉-3-甲酰胺
3-(3-胍基)-丙基-β-咔啉-3-甲酰胺
3-(6-胍基)-己基-β-咔啉-3-甲酰胺
3-(12-胍基)-十二烷基-β-咔啉-3-甲酰胺
1-甲基-3-(2-胍基)-乙基-β-咔啉-3-甲酰胺
1-甲基-3-(3-胍基)-丙基-β-咔啉-3-甲酰胺
1-甲基-3-(6-胍基)-己基-β-咔啉-3-甲酰胺
优选化合物以及它们与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐构成本发明的完整内容的一部分。
本发明还涉及式(I)化合物的制备方法，其特征在于使用(II)化合物作为原料：
其中Ra、Rb、Rc、Rd和R3是如上定义的。
按照有机合成中常规成酯条件，与甲醇得到式(III)化合物。
其中Ra、Rb、Rc、Rd和R3是如上定义的。
按照有机合成中的Pictet-Spengler反应条件，使该式(III)化合物与(IV)化合物反应：
R2CHO (IV)
其中，R2是如式(I)定义的。
得到式(V)化合物：
其中Ra、Rb、Rc、Rd、R2和R3是如上定义的。
受到有机合成中常用的氧化剂的作用，得到式(VI)化合物
其中Ra、Rb、Rc、Rd、R2和R3是如上定义的。
按照常规的酰胺化条件，用式(VII)化合物处理：
R4aNHR4b (VII)
其中R4a和R4b是如上定义的。
得到式(I/a)化合物，即式(I)化合物的一个特定例子：
其中Ra、Rb、Rc、Rd、R2、R3、R4a和R4b是如上定义的。
将该式化合物置于式(VIII)化合物的作用下：
[H2N-C(-SCH3)＝NH]2·H2SO4 (VIII)
得到式(I/b)化合物，即式(I)化合物的一个特定例子：
其中Ra、Rb、Rc、Rd、R2、R3和R4a是如上定义的。
化合物(I/a)和(I/b)构成本化合物的整体。如果必要的话，这些化合物按照常规的纯化工艺进行纯化，如果需要的话，可以任选地用药学上可接受的酸或碱转化为加成盐。
式(II)、(IV)、(VII)、(VIII)化合物是商业上可得到的化合物，或者是按照有机合成的已知方法得到的化合物。
本发明还涉及药物组合物，包含至少一种式(I)化合物或与药学上可接受的酸或碱所形成的加成盐作为活性成分，单独或结合一种或几种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体。
在按照本发明的药物组合中，可以特别提到适用于口服、胃肠外(静脉内、肌肉或皮下)，经皮或透皮、经鼻、直肠、经舌、经眼或呼吸给药的那些，尤其是片剂或糖衣丸、舌下片、扁囊剂、胶囊剂、锭剂、栓剂、霜剂、软膏剂、皮肤凝胶、可注射成可饮用制剂、气雾剂、滴眼剂或滴鼻剂等。
本发明化合物具有抗HIV-1活性、抗癌活性及抗OH*断裂DNA的抗氧化活性。含有一至少一种式(I)化合物的药物组合因此可以用于HIV-1的治疗，癌症治疗及疾病、食品、医药品中的抗氧化剂。
作为药物，有用剂量因患者年龄与体重、给药途径、疾病性质与严重性和所接受的任何其它治疗而异。
下列实施例阐述而绝非限制本发明：
所用原料和/或试剂是已知的产品，或者是按照已知操作制备的产品。
实施例和合成步骤中所述化合物的结构是按照常规的光谱技术(红外，NMR、TOF-质谱……)测定的。
实施例1 3-乙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
步骤A：盐酸色氨酸甲酯
1.0ml氯化亚砜在-4℃下滴入1.0g L-色氨酸与20ml无水甲醇的混悬液中，加毕，撤去冰水浴，室温搅拌6小时后，70℃-80℃回流6小时，减压蒸去溶剂，得到预期产物。
步骤B：1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酸甲酯
将1.25g步骤A中得到的产物溶于75ml甲醇中，加入37％甲醛0.95ml，蒸汽浴回流2小时后，减压蒸去溶剂，用14％浓氨水调PH8至9，加入40ml氯仿萃取，再用3×20ml氯仿洗水层，合并氯仿层，无水硫酸钠干燥过夜，滤除硫酸钠，滤液减压蒸干，得到预期产物。
步骤C：β-咔啉-3-甲酸甲酯
将0.5g步骤B中得到的产物溶于10ml冰醋酸中，冷水浴中，快速搅拌下加入四醋酸铅2.25g，加毕，搅拌20分钟，加入2.5g草酸，搅拌1小时，过滤，沉淀混悬于25ml水和50ml氯仿的混合溶液中，用碳酸氢钠调pH至中性，过滤分两层，收集氯仿层，用饱和食盐水洗氯仿层，分出氯仿层，无水硫酸钠干燥过夜，过滤除去硫酸钠，滤液减压蒸干，得到预期产物。
步骤D：3-乙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
将0.1g步骤C中得到的产物溶于4ml氯仿和5滴甲醇中，将该溶液于3小时内滴入加热至80℃-85℃的1ml 1，2-乙二胺中，加毕，加热回流6小时后，减压浓缩，残渣中加入5ml氯仿和3ml水的混合液，充分搅拌后静置过夜。次日析出固体，过滤，用少量水和甲醇分别洗固体，收集固体于真空干燥，得到预期产物。
熔点：234-237℃
EI-MS：255
1H-NMR：12.26，9.08，8.92，8.87，8.45，7.69，7.61，3.63，3.03
实施例2：3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例1，在步骤D中使用1，3-丙二胺作为反应物。
熔点：218-222℃
EI-MS：269
1H-NMR：8.917，8.889，8.835，8.395，7.673，7.591，7.297，3.420，
2.614，1.638
实施例3：3-己氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例1，在步骤D中使用1，6-己二胺作为反应物
熔点：189-193℃
EI-MS：311
1H-NMR：8.93，8.84，8.37，7.67，7.58，7.25，3.42，3.28，2.78，1.82
实施例4：9-甲基-3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例2，在步骤A中用1-甲基-L-色氨酸作为反应物。
熔点：116-118℃
EI-MS：282
实施例5：1-甲基-3-乙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
步骤E：1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酸甲酯
取0.5g L-色氨酸，加入1N硫酸2.5ml和8ml水的混合液，搅拌下加入40％乙醛3.6ml，40℃水浴加热30分钟，室温搅拌2小时，于蒸汽浴上加热回流1.5小时，冷至室温，用浓氨火调pH至8，过滤，用冷水洗涤沉淀，收集沉淀，室温晾干，将得到的沉淀按步骤B进行酯化，得到预期产物。
步骤F：1-甲基-β-咔啉-3-甲酸甲酯
取1.5g步骤E得到的产物，加入4.2g硫，100ml干二甲苯，回流4.5小时，将反应液冷至5℃过夜，次日过滤，用40ml冷二甲苯和低沸点的石油醚依次洗涤沉淀，收集沉淀，真空干燥，得到预期目标化合物。
将步骤F得到的化合物按步骤D反应，得到预期的化合物。
熔点：黄油状
EI-MS：268
1H-NMR：11.15，8.72，8.34，7.64，7.58，6.8，3.1-3,67，2.83
实施例6：1-甲基-3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例5，在步骤D中用1，3-丙二胺作为反应物。
熔点：175-177℃
EI-MS：292
1H-NMR：12.03，8.77，8.35，7.67，7.59，7.30，3.56，3.33，2.83，1.9
实施例7：1-甲基-3-己氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例5，在步骤D中用1，6-己二胺作为反应物
熔点：243℃(碳化)
EI-MS：324
实施例8：1-甲基-3-哌嗪基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例5，在步骤D中用哌嗪作为反应物。
熔点：192-194℃
EI-MS：294
实施例9：1，9-二甲基-3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例5，在步骤E中用1-甲基-L-色氨酸作为反应物，在步骤D中用1，3丙二胺作为反应物。
熔点：149-151℃
EI-MS：296
实施例10：3-(2-胍基)-乙基-β-咔啉-3-甲酰胺
步骤G：称取S-甲异硫脲硫酸盐0.021g，加0.03ml水和0.03ml 2M氢氧化钠，快速搅拌下滴加实施例1中得到的化合物0.1g混悬于2ml H2O的混合液，加毕，室温搅拌两天，4℃放置过夜，过滤，沉淀分别用少量的水和甲醇洗涤，收集沉淀，真空干燥，得到预期化合物。
熔点：312-313℃
TOF-MS：297.0486
实施例11 3-(3-胍基)-丙基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例10，在步骤G中使用实施例2得到的化合物作为反应物。
熔点：199-201℃
TOF-MS：311.0407
1H-NMR：8.92，8.81，8.37，7.64，7.58，7.27，3.41，3.11，1.75
13C-NMR：165.08，157.12，141.10，139.61，137.23，132.47，128.38，
128.00，122.07，120.96，119.75，113.73，112.30，38.39，36.23，28.84
实施例13 3-(12-胍基)-十二烷基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例10，在步骤D中用，1，12-二氨基-十二烷作为反应物，此产物在步骤G中作为反应物。
熔点：199-201℃
TOF-MS：437.1623
实施例14：1-甲基-3-(2-胍基)-乙基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例10在步骤G中使用实施例5得到的化合物作为反应物。
熔点：242-245℃
TOF-MS：297.0486
实施例15 1-甲基-3-(3-胍基)-丙基-β-咔啉-3-甲酰胺
操作同实施例10，在步骤G中使用实施例6得到的化合物作为反应物。
熔点：270-272℃
TOF-MS：325.0608
1H-NMR：12.03，8.66，8.28，7.64，7.53，7.23，3.36，3.12，2.82，1.69
13C-NMR：165.12，157.13，140.94，140.84，138.99，135.85，128.13，
127.31，122.03，121.42，119.77，112.27，111.99，36.30，29.06，20.41(2C)
实施例16 1-甲基-3-(6-胍基)己基-β-咔啉-3-甲酰胺。
操作同实施例10，在步骤G中使用实施例7得到的化合物作为反应物。
熔点：196-198℃
TOF-MS：367.0860
本发明化合物的药理研究。
实施例17抗癌筛选试验，分别用KB、Hela、HL-60、BGC及BEL-7402肿瘤细胞进行试验，用MTT法或SRB法。
MTT法：分别将生长状态良好的、处于对数生长期的HL-60、Bel-7402、KB及Hela细胞以1×104个/mL浓度接种于96孔板，37℃5％CO2培养箱中培养24小时。弃旧液，换新培养液，加入灭菌处理的化合物，继续培养48小时后，弃去培养液，每孔加20mL含5mg/mL MTT的RPMI 1640(含10％小牛血清)培养液，继续培养4小时。离心，2500rpm，20min，吸出上清，室温晾干。加入一定量的二甲基亚砜溶解紫色残留物，于570nm处酶标仪上测定吸收值。
SRB法：同MTT法一样。
分别将生长状态良好的、处于对数生长期的HL-60、Bel-7402、KB及Hela细胞以1×104个/mL浓度接种于96孔板，37℃5％CO2培养箱中培养24小时。弃旧液，换新培养液，加入灭菌处理的化合物，继续培养48小时后，取上清，每个小孔中加入100μl 10％TCA(三氯醋酸)，静置5分钟后，于4℃放置1小时固定。然后倒掉固定液，每个小孔用水洗5遍。室温干燥后，每孔加入0.4％SRB100μl，室温放置10分钟后，用1％HOAc(醋酸)洗5遍，空气干燥，加入10mMTris 200μl/每孔，振荡溶解，于540nm单波长处测定OD值
实施例18：急毒试验
将药物制备成盐酸盐，用生理盐水溶解备用。首先进行预试验，找出0％及100％估计致死量；然后根据该结果，设定五个剂量组，剂量间距为1∶0.8。昆明种小鼠(体重20±2g)随机分为五组，每组10只，雌雄各半，给药后连续观察14天内动物毒性反应情况和死亡情况。累计14天内死亡动物数，输入计算机，用Bliss法统计程序计算其LD50值和95％平均可信限。根据上述方法测得化合物3-丙氨基-β-咔啉-3-甲酰胺对小鼠经腹腔给药的半数致死量(LD50)为170mg/Kg。
实施例19：转录水平拮抗HIV-1 Tat/TAR RNA的结合
我们成功构建了两个质粒。一个是Tat基因表达质粒(plasmid I)，另一个是以HIV-1 LTR片段为启动子，含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的质粒(plasmid II)。转化大肠杆菌后，经酶切鉴定得到阳性克隆。利用磷酸钙介导这两种质粒共转染293细胞，24小时后加入3种样品，浓度均为30μmol/L。收集48小时培养上清液，用CAT ELISA试剂盒在405/490nm波长下检测细胞上清液中CAT活性。考察样品对Tat-TAR相互作用的影响。
以未加样品的plasmid I、II共转染体系的CAT活性为100％，用相对活性表示加样共转染体系的CAT活性。
实施例20：抑制HIV-1复制体外试验。
采用MT4细胞与HIV IIIB株进行试验，使用的病毒量分为100TCID50和1000TCID50(tissue cultured infection dose)。MT4细胞和HIV IIIB株与不同剂量下的药物培养5天后，在显微镜下观察CPE(细胞病变——空泡、肿胀、融合等)。设立五组实验：
对照： 药物+MT4细胞
空白对照：MT4细胞+HIV IIIB
阴性对照：水+MT4细胞+HIV IIIB
阳性对照：AZT+MT4细胞+HIV IIIB
实验组： 药物+MT4细胞+HIV IIIB
实施例21：抗OH*对DNA断裂的抗氧化活性，采用质粒pBR322进行试验，用Fenton反应诱导OH*的产生。
本试验被广泛用于评价药物对抗OH*对DNA断裂的保护能力。
步骤A：
将化合物(5/0.5mM)2μl与四乙酸二钠(3mm)，磷酸二氢钾缓冲液(50mm，pH7.4)，双氧水(3mm)，硫酸亚铁(1.6mm)和pBR322质粒DNA各2ul，混合于1.5ml Eppendorf管中，保证硫酸亚铁/四乙酸二钠的比值为0.53，总体积为12ul(不足的用水补充)，37℃孵育30分钟后，每管加入2ul溴汾蓝，琼脂糖凝胶电泳(0.8％琼脂粉，1XTAE，pH7.4，600mv，约1小时)紫外透射仪下观察结果。
空白对照：质粒DNA
阴性对照：不加任何抗氧化活性物质
阳性对照：VE(5mM)