抗病毒试剂.pdf

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摘要
申请专利号:

CN02810209.6

申请日:

2002.04.30

公开号:

CN1527716A

公开日:

2004.09.08

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 31/70公开日:20040908|||实质审查的生效|||公开

IPC分类号:

A61K31/70; C07K14/34

主分类号:

A61K31/70; C07K14/34

申请人:

整合技术有限公司;

发明人:

马瑞娜·N.·巴布什维林

地址:

英国马恩岛

优先权:

2001.05.04 EP 01110873.5

专利代理机构:

北京集佳知识产权代理有限公司

代理人:

王学强

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内容摘要

本发明涉及具有抗单链RNA病毒活性的抗病毒试剂。尤其是,本发明涉及的抗病毒试剂具有一个结构,该结构含有一个来自单链病毒并且能够指导(-)链合成的核苷酸序列、一个编码毒素的可操作地连接到调节子上的基因,其中所述的编码毒素的基因在所述的结构中是反义导向的。本发明也涉及使用所述的抗病毒试剂来制备治疗病毒疾病的药物。

权利要求书

1: 一种对抗单链(+)RNA病毒的抗病毒试剂,它含有下述组分: (A)指导该单链病毒的互补链的合成的核苷序列, (B)含有至少一个可操作地连接到编码毒素的结构基因的调控区域 的核苷序列, 其中编码毒素的核苷序列在反义方向是正向的。
2: 根据权利要求1的抗病毒试剂,其特征在于,所述组分(A)来 自ss(+)RNA病毒的5’-和3’-未翻译区域。
3: 根据权利要求2的抗病毒试剂,其特征在于,所述组分(A)来 自HCV的3’-未翻译区域。
4: 根据前述任意一项权利要求的抗病毒试剂,其特征在于,所述的 调控区域含有一个SD序列或者脊髓灰质炎病毒菌株Sabin 2的遗传RNA 的内部核糖体结合位点。
5: 根据前述任意一项权利要求的抗病毒试剂,其特征在于,所述的 毒素选自:白喉外毒素、白喉外毒素的A亚基、志贺氏杆菌毒素或地森 特芮神经毒素。
6: 根据前述任意一项权利要求的抗病毒试剂,其特征在于,它含有 DNA或RNA载体。
7: 前述任意一项权利要求的抗病毒试剂在制造用于治疗病毒疾病的 药物中的应用。
8: 根据权利要求7的应用,其特征在于,所述的病毒疾病是由下列 病毒中的一种或多种感染造成的:肝炎病毒、登革病毒、未分类的黄病 毒、风疹病毒、黄热病毒、牛滤过腹泻病毒、猪热病毒、脚和口腔疾病 病毒。
9: 根据权利要求7或8的应用,其特征在于,所述的抗病毒试剂被 制成草本制剂形式,包括注射或皮下使用的溶液、鼻输液、口服药剂、 脂质体包封的胶囊、靶向微囊制备物、或病毒基因组的内含物。
10: 根据权利要求7~9中任意一项的应用,其特征在于,所述的抗 病毒试剂制成改进的稳定试剂。

说明书


抗病毒试剂

    【技术领域】

    本发明涉及具有抗单链RNA(+)病毒活性的抗病毒试剂(AVA)。尤其是,本发明涉及的抗病毒试剂具有一个结构,该结构含有一个来自单链病毒并且能够指导(-)链合成的核苷酸序列、一个编码毒素的可操作地连接到调节子上的基因,其中所述的编码毒素的基因在所述的结构中是反义导向的。本发明也涉及使用所述的抗病毒试剂来制备治疗病毒疾病的药物。

    背景技术

    单链RNA(+)病毒是在宿主细胞中扩增但没有DNA阶段的(+)链病毒。这种病毒利用病毒自身编码的酶,通常是指依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp),来复制它们的RNA。在多数情况下,所述的RdRp是所谓的非结构(NS)蛋白地复合物,它不构成病毒体的一部分。

    这种非结构蛋白的酶复合物能识别病毒RNA中的未翻译序列/区域(末端UTR),它们一般位于病毒基因组的5’和/或3’端,并且实现互补链(即单链(+)RNA的(-)链)的合成,参见Ekland et al.,Nature 382(1986),373-376。另外,这种复合物也参与合成病毒RNA的多拷贝以形成双链RNA,即(+)、(-)链RNA的双螺旋结构,参见Bartenschlager etal.,J.Gen.Vir.71(2000),1497-1505。

    这种(+)RNA病毒的最著名的例子是肝炎病毒,现在已经发现了它的多种亚型。最常见的丙肝病毒(HCV)是(+)链壳病毒,它在进化上与黄病毒(flavirirus)和瘟病毒(pestivirus)相关。HCV基因组由一个5’-未翻译区域(5’-UTR)和3’-UTR组成,其中5’-UTR是9030~9099个核苷的长开放阅读框架(ORF)。已知I型株基因组的3’端含有poly(A)结构,但是该发现在II、III、IV型株中没有得到确认。已经报道5’-UTR中的序列对病毒基因的表达显示负翻译控制。

    已经发现HCV的RdRp与3’-UTR的27~45的核苷区域发生作用,后者的功能是作为启动互补链(即(-)链)和整个病毒基因组复制的结构线索(structural clue)。

    丙肝病毒会造成甲肝、乙肝以外的其他许多肝炎。虽然甲肝、乙肝以外的其他肝炎可以由许多不同的病毒造成,但是基本的原因还是HCV。感染可以通过输血、非法的药物皮下注射、肾移植、母婴传递等途径传播。高达20%的零星发作的肝炎是由HCV造成的。

    后转染肝炎(大于95%的病例)的丙肝病毒联合以及感染这种病毒(远超过乙肝病毒)的结果观察表明,与肝细胞癌和肝硬化的发展明显相关,这导致该病毒基因的分子生物学的集中研究。

    迄今为止,现在还没有有效的药物来治疗由ss(+)RNA病毒(比如脚和口腔疾病、登革热)感染引起的病毒疾病。对于HCV引起的肝炎,一种已知的治疗方法是使用含有IFN-α和/或IFN-γ的药物。但是,并未证明单纯使用这些药物会非常有效,而且也没有证明两种药物组合使用会产生理想的效果(Samuel et al.,Viology 130(1983),474-484)。

    所以,迫切需要有效的药物来治疗由ss(+)RNA病毒(比如HCV)引起的病毒疾病。

    经过广泛的研究,本发明的发明人设计了一种新的治疗由ss(+)RNA病毒引起的病毒疾病的产品,它被定义为抗病毒试剂(AVA)。

    【发明内容】

    本发明提供了一种可以对抗单链(+)RNA病毒的抗病毒试剂,它含有下述的组分(A)和(B),其中组分(A)是指导该单链(+)RNA病毒的互补链的合成的核苷序列,组分(B)是含有至少一个可操作地连接到编码毒素的结构基因的调控区域的核苷序列,和相对于(+)链反方向的编码毒素的核苷序列。

    根据本发明的另外一个优选实施例,组分(A)来自ss(+)RNA病毒(比如乙肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、和/或戊肝病毒、登革病毒、未分类的黄病毒(flaviviridae)、风疹病毒、黄热病毒、牛滤过腹泻病毒、猪热病毒、脚和口腔疾病病毒)的5’-或3’-未翻译区域。根据本发明的另外一个优选实施例,所述组分(A)来自HCV的3’-UTR或其一部分。

    根据本发明的另外一个优选实施例,所述的调控区域含有一个SD序列或者脊髓灰质炎病毒菌株Sabin 2的遗传RNA的内部核糖体结合位点(IRBS)。

    所述的毒素可以是任何对脊椎动物呈现出的LD50不超过100ng/kg体重的毒素,它可以用于个体,比如人、动物甚至植物(比较CDC最终条例)。根据本发明的一个优选实施例,所述的毒素选自:白喉外毒素、白喉外毒素的A亚基、志贺氏杆菌毒素或地森特芮(Disenteria)神经毒素。

    根据本发明的抗病毒试剂可以用于生产药物治疗病毒性疾病,这种疾病可以是由下列病毒感染造成:甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、和/或戊肝病毒、登革病毒、未分类的黄病毒(flaviviridae)、风疹病毒、黄热病毒、牛滤过腹泻病毒、猪热病毒、脚和口腔疾病病毒。

    为了把所述的结构导入到宿主细胞中,该结构被制成草本(galenic)制剂形式,然后给病人使用。这种草本制剂包括注射或皮下使用的溶液、鼻输液、口服药剂、脂质体包封的胶囊、靶向微囊制备物、或病毒基因组的内含物。

    为了提高该结构对酶或化学降解的稳定性,所述的核苷可以制成改进的形式,这可以由本领域的技术人员根据其自身的技术来实现。这种稳定手段的例子包括:包封、甲基化、或使用常见的核苷类似物。

    根据本发明构建AVA(抗病毒试剂)的遗传结构的原理可以参考(但不限于)图1。

    【附图说明】

    图1显示了一个AVA的实施例,其中的缩写含义如下:

    CMV启动子*:人CMV启动子,用于在人细胞中表达AVA的基因(ns2,ns3,ns4a,ns4b);

    T7 pr.*:T7噬菌体RNA聚合酶的启动子,用于体外转录AVA序列(在真核细胞中无活性);

    5’-UTR是HCV基因组RNA的5’-未翻译末端区域;

    ns2,ns3,ns4a,ns4b是编码非结构的HCV蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B的基因;

    Δns5**是编码依赖于HCV的RNA的RNA聚合酶的损伤基因;

    3’-UTR是HCV基因组RNA的3’-未翻译末端区域;

    IRES***是脊髓灰质炎病毒的调控序列,它用于在人细胞中翻译白喉外毒素A亚单位****;

    DTA基因是白喉外毒素A亚单位的编码基因;

    Ter是用于调控白喉外毒素A亚单位基因表达的终止密码子;

    Xho I,EcoR I,Xba I,Hind III,Sal I,Not I是克隆结束的限制性位点;

    水平箭头表明基因转录的方向。

    注:

    *:pCI-新质粒序列(Promega公司);

    **:该基因(它导致正常RdRp酶的缺失合成)的损伤可以阻碍健康细胞的互补RNA链的合成;

    ***:该序列只在互补RNA链中工作;

    ****:白喉外毒素A亚单位在破坏细胞时必需。

    【具体实施方式】

    所有(+)RNA病毒的基因组以相似的途径构建。尤其是HCV的基因组由4条接连的链组成:5’-UTR,一个编码结构蛋白(C,E1,E2,p7)的区域,一个非结构蛋白编码区域(NS2-NS5)和3’-UTR。影响ns-区域和UTR的显著缺失会阻碍病毒RNA的复制。结构蛋白基因的缺失或替代都不会影响病毒的复制。但是,如果RdRp编码基因损伤而UTRs保留下来,则只有当细胞感染了相同的全功能(full-fledged)协助病毒时,该病毒会确保病毒特异性RdRp的流入(influx),从而有缺陷的(+)RNA的复制成为可能。有缺陷的(+)RNA也就能够形成病毒颗粒。

    可以插入其他基因(比如反义方向的白喉外毒素A-亚单位基因)来代替缺失的编码结构蛋白的基因序列。所述的毒素可以是任何对脊椎动物呈现出的LD50不超过100ng/kg体重的毒素,它可以用于个体,比如人、动物甚至植物(比较CDC最终条例)。根据本发明的一个优选实施例,所述的毒素选自:白喉外毒素、白喉外毒素的A亚基、志贺氏杆菌毒素或地森特芮(Disenteria)神经毒素。

    在该基因的5’-端,所述的IRES序列应该作为正义方向的第一个起始密码子AUG,而在3’-端,则应该有一个带有翻译终止密码子的序列。这样的RNA应该具有图1所示的AVA结构。该AVA结构确保了白喉外毒素A-亚单位基因只能够在感染了相同病毒(它导致细胞必然死亡)的细胞中表达。    

    图1表示了一个AVA,其主干可以是质粒pCI-新(Promega)。该AVA由三部分组成:第一部分含有5’-UTR,第二部分是白喉外毒素A亚单位基因,dta,第三部分由编码蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B的基因(ns2,ns3,ns4a,ns4b)、和编码蛋白NS5的一部分的基因(Δns5)以及3’-UTR序列组成。

    HCV基因组片断的序列可以借助于在PCR扩增后进行反转录反应(RT)来制备。根据现有的技术,可以很容易的从感染了HCV的个体的血浆中分离出HCV RNA。向用于扩增AC 5’-UTR的引物的5’-端,可以分别在插入区段的5’-和3’-端添加限制性位点,比如Xho I和EcoR I。用于扩增3’-UTR的两个引物可以含有Not I的限制位点。与该结构互补的cDNA片断分别含有350和7500个核苷。

    dta基因的开放阅读框架(ORF)是在IRES脊髓灰质炎病毒(疫苗株Sabin 2)的调控区域的控制下。该序列可以根据生产厂商的方法进行PCR扩增。Hind III和Xba I的限制位点已经添加到dta基因的引物的5’-端,Hind III和Sal I,对于脊髓灰质炎IRES序列。一个Ter终止密码子已经添加到dta基因的引物的3’-端。dta的ORF可以随着处理dta Ter和IRES扩增器混合由次序连接的Hind III限制酶产生。

    ns-基因序列可以在中间载体pGEM5Z(f+)(Promega)中克隆,然后在Aat2限制位点的帮助下,可以在ns5基因中发生缺失。该结构的所有三个部分可以再连续的构建到载体聚合链中,分别使用不同的酶和T4噬菌体连接酶来连接限制位点(Xho I,EcoR I,xba I,Sal I,Not I)。在反义方向也发现了dta基因ORF。

    为了把所述的结构导入到宿主细胞中,该结构被制成草本(galenic)制剂形式,然后给病人使用。这种草本制剂包括注射或皮下使用的溶液、鼻输液、口服药剂、脂质体包封的胶囊、靶向微囊制备物、或病毒基因组的内含物。

    为了提高该结构对酶或化学降解的稳定性,所述的核苷可以制成改进的形式,这可以由本领域的技术人员根据其自身的技术来实现。这种稳定手段的例子包括:包封、甲基化、或使用常见的核苷类似物。

    如上所述,当该结构进入要治疗的个体体内的细胞时,启动子下游的核苷序列会在细胞酶的作用下转录成RNA分子,它会在反义方向产生毒素,然而,由于所述的RNA分子容易发生细胞内通常的降解过程,它会随着时间而消失。但是,如果在所述的细胞中有要治疗的病毒,该病毒会产生能够影响合成该结构(+)链的互补链(-)链的RdRp-复合物,或者任何含有所述组分的RNA分子。

    这样,在后一种情况下就会形成一种RNA分子,它含有在正确阅读方向编码毒素的核苷序列,然后在细胞中就会合成该毒素,最终杀死细胞。

    结果,本发明提供了一种选择性杀死感染了病毒(要治疗的)的细胞,因为只有在这些细胞中,“反义毒素”才会在正义方向翻译成多肽。在无毒素的细胞中,不会形成含有在正义方向编码毒素的基因的(-)链,所以不会破坏未感染的细胞。

    为了不被任何理论所限制,现在已经确信在死亡的过程中,感染的细胞的部件会成为病毒颗粒的部件,这包括整合一个或多个拷贝的复制结构到病毒颗粒中以及它转移到其他将要感染的细胞中。这样,本发明的结构不仅会选择性的杀死感染病毒的细胞,而且还提供了向其他感染细胞的转移。

    所以,本发明具有以下优点:(1)选择性杀死感染了ss(+)RNA病毒的细胞;(2)该结构可以插入到细胞中作为DNA,当它是载体质粒的部件时;或作为RNA,当它在转录以后导入时;也可以是早期复制的结果;(3)在没有病毒酶系统的情况下,该结构不会产生毒素,这保证了系统的安全;(4)该结构能够在宿主细胞中进行复制,所以只要给个体使用较少剂量。

    下面的实施例将对本发明作进一步的解释,但是本发明并不仅仅局限于这些实施例。

    实施例1

    使用Transfectin转化方法(频率2550-1200克隆/105细胞)将DNA质粒(pCI-新/AVA)导入HepG2系细胞中。转化细胞在含有10%小牛血清和遗传霉素(0.5mg/ml)的RPMI 1640培养基中进行选择。遗传霉素抗性的克隆(G418R)用于确定HCV-特异性抗原,RNAAVA。

    转化24~72小时以后,开始在G418R细胞确定HCV-特异性抗原和RNA以及白喉毒素。结果表明,在72小时或者更长的时间(最多14天)以后,没有白喉毒素导致G418R细胞死亡的形态学特征。在14天中,在G418R细胞培养基中发现了含有SRNAHCV的HCV-类似颗粒。研究表明表达非结构蛋白(HepG2NS系)的人肝癌细胞HepG2对G418R细胞生长过的培养基高度敏感,溶解到高达1∶1600的滴度。

    实施例2

    AVA用作抗病毒RNA。通过使用热聚合酶Pwo II和质粒pCI-新/AVAPCR来扩增。使用T7噬菌体RNA聚合酶来完成扩增子的转录。通过电穿孔技术吧得到的RNA插入到HepG2NS系的细胞中。电穿孔24小时后,细胞中可以检测到白喉毒素。最初的白喉毒素是在电穿孔48~52小时后检测到,持续120小时都可以检测到。

    在6小时中,在细胞中可以检测到HCV特异性的抗原和SRNAHCV,以及白喉毒素。ELISA也可以检测到毒素。电穿孔28小时后检测到明显的细胞破坏的迹象。在14天内,在HepG2NS系的穿孔细胞培养基中检测到含有SRNAHCV的HCV类似颗粒。而无序列(non-tracted)的HepG2NS系对穿孔细胞生长过的培养基高度敏感,溶解到高达1∶100的滴度。

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本发明涉及具有抗单链RNA病毒活性的抗病毒试剂。尤其是,本发明涉及的抗病毒试剂具有一个结构,该结构含有一个来自单链病毒并且能够指导()链合成的核苷酸序列、一个编码毒素的可操作地连接到调节子上的基因,其中所述的编码毒素的基因在所述的结构中是反义导向的。本发明也涉及使用所述的抗病毒试剂来制备治疗病毒疾病的药物。 。

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