短肽修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物纳米粒及其制备方法和用途 【技术领域】
本发明属于纳米技术领域。具体涉及短肽修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物纳米粒及其制备方法和在医药中的用途。
发明背景：
1990年Weidner采用内皮细胞表面标记物显示乳腺癌新生血管，发现肿瘤血管密度(MVD)与肿瘤侵袭性、淋巴结转移、病人预后是相关的.此后MVD与肿瘤侵袭转移的关系在许多肿瘤被证实。抗血管形成的干预治疗还处于临床试验阶段。1989年第一个进入临床试验的抗新生血管药物干扰素(αIFNα)，迄今已有13种该药物正在进行II-III期的临床试验。Agniostatin和Endostatin是最强的血管形成抑制剂，分别在1994年和1997年由Falkman实验室报道。1999年美国FDA已批准Endostatin进入I期临床试验。但药物的使用需长期甚至终身服用，这会给患者带来不便和经济负担，探索一劳永逸的方法也是血管形成研究的方向。
近年来国内外对细胞识别和粘附的分子机制研究取得了很大的进展，其中对含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)序列在细胞识别和粘附方面的报道引人注目.RGD是细胞膜整合蛋白十几种受体和细胞外基质如胶原、血管细胞粘附分子等配体识别与结合的氨基酸最小序列.在一定条件下，人工合成的RGD序列的可溶性小分子多肽能够竞争性地与细胞表面的整合蛋白结合，将细胞外信息传入细胞内，引起细胞一系列的生理变化.国际上已有很多学者做过大量的实验，研究RGD序列肽抑制恶性肿瘤的血管新生而抑制其生长与转移，证实RGD序列肽具有直接杀伤肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
有研究者将RDG类多肽直接用于肿瘤的治疗。虽然含有RGD序列多肽可为各种整合蛋白所识别，但是RGD序列肽在体内不稳定，这些多肽在体内迅速被分解与清除，需要多次注射大剂量才能抑制癌细胞转移，这成为该类多肽作为实用性抗肿瘤细胞转移药物的一个不利因素。加大剂量虽可提高血药浓度，但在血中未被磷酸化地药物可迅速尿排，不但不能提高疗效，反而产生肾毒性，而被RGD序列封闭的肿瘤细胞并没有被杀灭，仍能够在体内存活相当长时间，仍可以导致肿瘤的转移。
也有研究者制备了其聚乙二醇、甲壳素的结合物，希望通过延长其体内作用时间来增强其抗癌细胞转移效果。但是这些结合物为线性分子结构，在体内极易降解，一旦RGD序列肽脱落，仍可以导致肿瘤的转移。
脂质体作为一种药物载体得到了比较广泛的研究，包含有PEG类脂衍生物的空间稳定脂质体可以在循环系统中存在足够长的时间并发挥疗效.表面结合了RGD序列肽序列的脂质体可以将药物靶向释放到病变组织中，显著降低对其它组织的毒性并提高了疗效.脂质体最容易制备，却也最难达到质控要求。虽然不少文献上仍用脂质体，但因体内靶向性差，在体内应用，除肿瘤瘤内注射外，其前景仍存在问题。此外，在质控上也有一定困难。
复旦大学医学院肝癌研究所进行了IFNaIb治疗棵植性肝癌等的实验研究，结果令人满意。但是全身系统给药，对肿瘤抑制作用减弱、并有副反应。
研究表明生物活性短肽RGD能有效抑制肿瘤血管的生长，从而抑制肿瘤细胞的转移。目前人们已注意了其临床上治疗肿瘤转移的应用价值。继续寻找抑制粘连作用强、持续时间长、能用于临床的RGD类多肽是今后的研究方向。
发明目的
本发明所要解决的技术问题在于选择合适的载体，使生物活性短肽能有效地抑制肿瘤血管的生长。
本发明提供了一种短肽修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物纳米粒，该纳米粒包括药物和短肽修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物质作载体材料。
本发明另一目的是提供了一种短肽修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物纳米粒的制备方法，该方法为将一定量的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(Arg-Gly-Asp，RGD)修饰的PL-PL高分子材料加到一定体积的二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷(DCM)/丙酮的混合有机溶剂中构成有机相，取适量药物加入有机相中，将其匀化后形成初乳，将初乳加到一定量的乳化剂和一定体积的去离子水所构成的水相中，再次乳化，将所得乳液搅拌蒸发有机溶剂1～5小时，使有机溶剂挥发完全，即得短肽修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物(GD-PL-PL)纳米粒的分散体系，在胶体溶液中加入或不加入适量的支架剂，常规冻干保存。
本发明纳米粒载体材料用一系列不同分子量和不同L-lactic Acid与-L-lysine比例以及不同RGD含量的材料，其分子量为4.0×103～6.0×104；L-lacticAcid与-L-lysine比例为100∶1-50∶50；RGD含量为0～50％。其有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷和丙酮(AC)的混合液，DCM和AC的体积比为60～100/0～40。
本发明水分散介质为右旋糖苷40或右旋糖苷70或普朗尼克F68，其浓度为0.1～5％。其匀化方式包括超声乳化，高压乳匀方式。支架剂包括葡萄糖、乳糖或甘露糖等，其含量为0.1～5％。
本发明又一目的是提供了短肽修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物在制备纳米级药物中的应用。
本发明提供的短肽(RGD)修饰的聚赖氨酸-聚乳酸共聚物(Poly(L-lacticAcid-co-L-lysine)。该高分子材料是优良的药物载体，利用这种材料包裹药物，在机械搅拌或高压乳匀机作用下制备缓释纳米粒，粒径在10～1000nm以下可控，表面光滑，均匀度好，颗粒规则无粘连，再分散性好，载药量和包封率高，可用于制备静脉或肌肉注射或口服给药的缓释纳米粒，作为癌细胞靶向给药。
本发明所述的药物为有机药物、水溶性药物或水不溶性药物抗癌药，如抗叶酸类(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤类(如巯嘌呤)、抗嘧啶类(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸还原酶抑制药(如羟基脲)、脱氧核糖核苷酸多聚酶抑制药(如环胞苷)、直接影响和破坏DNA结构及其功能的药物(如氮芥、环磷酰胺、氮甲、顺铂、丝裂霉素、喜树碱)、抑制蛋白质合成的药(如阿霉素、L-门冬酰胺酶、柔红霉素、光辉霉素)、影响微管蛋白质组装和纺锤丝形成的药物(长春碱、依托泊苷)。
附图说明：
图1RGD-PL-PL缓释纳米粒粒径分布图。
图2RGD-PL-PL缓释纳米粒透射电镜(JEM-100SX透射电子显微镜，日本电子公司)图。
具体实施方式：
下面再以实施例对本发明加以进一步的说明，但是不能限制本发明的内容。
实施例1
精确称取RGD-PL-PL 500mg，加到丙酮中构成有机相。将氟尿嘧啶或米托蒽醌(DHAQ)25mg溶于双蒸水中形成水相。将氟尿嘧啶或DHAQ溶液加入有机相中其匀化后形成初乳。称取普朗尼克F68加入双蒸水中使其充分溶解，调节使其浓度为3％，构成外水相。内水相与外水相的体积比为1∶4～1∶8。将初乳加到外水相中，高压乳匀机乳化，将所得乳液磁力搅拌蒸发有机溶剂4～5小时，使丙酮挥发完全，即得RGD-PL-PL纳米粒的分散体系。加入3％的甘露糖作为支架剂，常规冻干保存。
实施例2
精确称取RGD-PL-PL50mg，加到二氯甲烷(DCM)和丙酮的混合有机溶剂中(DCM和AC的体积比为60～100/1～40)构成有机相。将氟尿嘧啶或米托蒽醌(DHAQ)2mg溶于双蒸水中形成水相。将氟尿嘧啶或DHAQ溶液加入有机相中其匀化后形成初乳。称取右旋糖苷70加入双蒸水中使其充分溶解，调节使其浓度为1％，构成外水相。将初乳加到外水相中，超声乳化30s，将所得乳液放入烧杯中，磁力搅拌蒸发有机溶剂3小时，使二氯甲烷和丙酮挥发完全，即得RGD-PL-PL纳米粒的分散体系。加入3％的甘露糖作为支架剂，常规冻干保存。
实施例3
精确称取RGD-PL-PL100mg，加到丙酮中构成有机相。将米托蒽醌(DHAQ)5mg溶于双蒸水中形成水相。将DHAQ溶液加入有机相中其匀化后形成初乳。称取右旋糖苷40加入双蒸水中使其充分溶解，调节使其浓度为1％，构成外水相。将初乳加到外水相中，高压乳匀机乳化，将所得乳液磁力搅拌蒸发有机溶剂1～5小时，使丙酮挥发完全，即得RGD-PL-PL纳米粒的分散体系。加入3％的乳糖作为支架剂，常规冻干保存。