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1、(10)申请公布号 CN 102911258 A(43)申请公布日 2013.02.06CN102911258A*CN102911258A*(21)申请号 201210234629.3(22)申请日 2012.07.06C07K 14/00(2006.01)C07K 1/02(2006.01)B82Y 5/00(2011.01)(71)申请人江苏大学地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路301号(72)发明人刘磊 董明东(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司 32200代理人楼高潮(54) 发明名称有机小分子调控多肽组装形成二维多肽纳米薄片的方法(57) 摘要本发明有机小分子调。
2、控多肽组装形成二维多肽纳米薄片的方法，属于生物材料技术领域。按照下述步骤进行：（1）选择一种分子自组装多肽，和选择一种有机小分子调节剂，（2）将所述多肽分子与调节剂分子充分混合，形成混合液；在37条件下，孵育7天。本发明在分子水平上利用引入分子调节剂，调控多肽形成了一种二维自组装薄片结构。本发明利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察到了调节剂分子对类表面活性剂多肽组装结构的调控。在分子水平上提供了调节剂分子与多肽相互作用的位点，可以使人们清楚地了解调节剂分子调控多肽组装的机理。(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书5页 附图5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要。
3、求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页1/1页21.一种制备多肽二维纳米结构的方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）选择一种分子自组装多肽，和选择一种有机小分子调节剂，（2）将所述多肽分子与调节剂分子充分混合，形成混合液；在37条件下，孵育7天。2.根据权利要求1所述的一种制备多肽二维纳米结构的方法，其特征在于其中步骤（1）所述分子自组装多肽为一种类表面活性剂多肽，具体结构为NH2-KKKFAFAFAFAKKK-COOH, NH2-KKKFFFFFFFFKKK-COOH, NH2-AAAAAAAAKKK-COOH, NH2-DDDFFFFFFFFDDD-COOH, NH2-DDDAAAA。
4、AAAAKKK-COOH或NH2-DDDFAFAFAFADDD-COOH。3.根据权利要求1所述的一种制备多肽二维纳米结构的方法，其特征在于其中步骤（2）中所述调节剂为嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯类氮杂环分子及其衍生物。4.根据权利要求1所述的一种制备多肽二维纳米结构的方法，其特征在于其中所述的多肽分子与调节剂分子的摩尔比为1：1 根据权利要求2所述的一种制备多肽二维纳米结构的方法，其特征在于其中步骤（1）所述分子自组装多肽为NH2-KKKFAFAFAFAKKK-COOH。5.根据权利要求3所述的一种制备多肽二维纳米结构的方法，其特征在于其中步骤（2）所述调节剂为44-联吡啶、乙烯吡啶，三吡啶、嘧啶。
5、。6.根据权利要求6所述的一种制备多肽二维纳米结构的方法，其特征在于其中步骤（2）所述调节剂为44-联吡啶。权 利 要 求 书CN 102911258 A1/5页3有机小分子调控多肽组装形成二维多肽纳米薄片的方法技术领域0001 本发明属于生物材料技术领域，具体地说，本发明涉及一种引入调节剂分子调控多肽组装进而形成二维多肽纳米薄片的方法。背景技术0002 众所周知，分子自组装已经成为一种制备纳米结构非常有效的的途径，它可以在无外界干扰的情况下，通过分子间各种特异的相互作用，诱导分子形成高度有序的纳米结构。特别在生物以及和生物相关的领域里，这种技术被广泛应用。一些生物分子或者类生物分子，例如多肽。
6、和蛋白质，它们可以利用分子间氢键相互作用，疏水相互作用等自组装形成一维或者零维纳米结构，例如一维纳米纤维，纳米管；零维纳米球。人们可以将这些纳米结构广泛的应用在各个领域。例如，一维纳米纤维形成的脚手架结构可以在组织工程中得到应用，零维纳米球结构可以被应用到药物传输的领域中。然而，目前为止，几乎没有研究报道，利用多肽的组装形成二维有序的纳米结构。二维结构同样是一种非常重要的几何结构，它可以具备独特的表面性质，独特的电学性质，并可以在器件的加工制备等诸多方面得到广泛应用。在2010-2011年间，美国洛伦兹伯克利国家实验室的Zuckermann教授利用一种特意序列的类多肽聚合物，自组装制备得到了大。
7、量的超薄二维纳米晶体，这一研究可以帮助人们通过一种非天然的聚合物体系的组装过程来理解多肽和蛋白质组装的机理，并为人们进一步设计制备二维蛋白质纳米结构奠定了坚实的基础（可参考M.Reches,E.Gazit,Science 2003,300,625;E.Gazit,G.Rosenman,Journal of the American Chemical Society 2010,132,15632;R.N.Zuckermann,et al,Nature Materials 2010,9,454;R.N.Zuckermann,Journal of the American Chemical Soci。
8、ety 2011,133,20808.）。发明内容0003 基于上述的研究可知，制备一种二维蛋白质纳米结构有着非常重要的理论意义与实际意义。本发明发展了一种利用有机小分子末端调控多肽组装进而形成二维多肽薄片结构的新方法。0004 本发明的目的在于，提供一种制备多肽二维纳米结构的方法,按照下述步骤进行：0005 （1）选择一种分子自组装多肽，和选择一种有机小分子调节剂，0006 （2）将所述多肽分子与调节剂分子充分混合，形成混合液；在37条件下，孵育7天。0007 其中所述步骤（1）中用于制备二维薄片结构的多肽为一种类表面活性剂多肽，具体结构为NH2-KKKFAFAFAFAKKK-COOH,NH。
9、2-KKKFFFFFFFFKKK-COOH,NH2-AAAAAAAAKKK-COOH,NH2-DDDFFFFFFFFDDD-COOH,NH2-DDDAAAAAAAAKKK-COOH,NH2-DDDFAFAFAFADDD-COOH等，优选地类表面活性剂多肽分子为NH2-KKKFAFAFAFAKKK-COOH。0008 其中所述步骤（2）中所述调节剂分子为嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯类氮杂环分子及其说 明 书CN 102911258 A2/5页4衍生物，例如44-联吡啶、乙烯吡啶，三吡啶、嘧啶等，优选所述标记分子为4,4-联吡啶。0009 其中所述的多肽分子与调节剂分子的摩尔比为1：10010 综上所述。
10、，本发明的目的在于发展一种制备二维多肽纳米结构的新方法，通过加入调节剂在分子水平上调控多肽的组装结构，促使多肽形成二维的组装基元，最终形成完整的多肽二维组装薄片结构。0011 本发明至少具有以下有益效果：0012 本发明在分子水平上利用引入分子调节剂，调控多肽形成了一种二维自组装薄片结构。本发明利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察到了调节剂分子对类表面活性剂多肽组装结构的调控。在分子水平上提供了调节剂分子与多肽相互作用的位点，可以使人们清楚地了解调节剂分子调控多肽组装的机理。0013 本发明利用原子力显微技术和透射电子显微技术揭示了多肽与调节剂分子组装形成了二维薄片结构。进一步证明了分子水平上。
11、调控的有效性。0014 本发明利用定量纳米力学成像技术研究了由多肽与调节剂分子形成的二维组装薄片结构的杨氏模量，进一步探测了此二维结构的力学性质。为发展一种新型的生物纳米材料提供了一条新思路。附图说明0015 图1是类表面活性剂多肽和调节分子的分子结构示意图以及多肽与调节剂分子以不同方式结合时的结合能量；其中a为类表面活性剂多肽的分子和调节剂分子4,4-联吡啶分子的结构示意图和卡通示意图，b,为多肽分子与调节剂分子以两种不同方式结合时，简化结合能计算值。0016 图2是多肽分子与调节剂分子形成共组装结构的扫描隧道显微镜图像，其中，a为多肽分子与调节剂分子4，4-联吡啶形成的组装体的扫描隧道显微。
12、镜图像，b为多肽分子与调节剂分子形成的组装体的结构示意图；0017 图3是多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的原子力显微镜图像；0018 图4是多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的透射电子显微镜图像；0019 图5是多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的原子力显微镜图像以及杨氏模量测量图像；a为多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的高度图像，b为多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的杨氏模量测量图像，c为多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的统计高度测量值，d为多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的统计杨氏模量值。0020 图6是多肽分子与调节剂分子共组装后形成。
13、的聚集体力学性质的研究,a为多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的形貌，b为经2nN的力剪切后，多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的形貌，c和d为剪切前后，多肽分子与调节剂分子共组装后形成的聚集体的高分辨形貌。具体实施方式0021 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。0022 实施例1基于扫描探针显微镜和透射电子显微镜分别来观察类表面活性剂多肽说 明 书CN 102911258 A3/5页5与调节分子共组装形成的二维纳米薄片结构，以及利用定量纳米力学成像系统研究多肽纳米薄片的力学性质。0023 1、所使用物质的化学结构0024 多肽分子（NH2-KKKFAFAFAFA。
14、KKK-COOH），4，4-联吡啶类分子（4Bpy）的化学结构，如下所示：0025 0026 类表面活性剂多肽0027 0028 44-联吡啶(44-bipyridyl，4Bpy）0029 2、具体方法0030 1）设计一种含有8个疏水基团的类表面活性剂多肽，其中8个氨基酸分别为FAFAFAFA,4个苯丙氨酸（F）和4个丙氨酸（A），为了调节多肽的水溶性，分别在多肽的两个末端设计3个赖氨酸（K），最终的多肽结构为NH2-KKKFAFAFAFAKKK-COOH,此多肽结构中的疏水氨基酸将在多肽组装过程中起到重要作用，促使多肽形成条陇结构。为了形成二维组装结构，我们引入一种末端调节剂分子4,4-联。
15、吡啶分子（4Bpy），连接于各多肽末端，促使多肽形成二维连接的片层结构。将多肽结构和4Bpy分子进行优化，利用分子模拟计算，具体采用密度泛函理论，分别计算得出4Bpy分子与多肽末端-COO基团和-NH2基团的作用结合能量。得到调节剂分子与多肽结合的理论支持（如图1所示）；0031 图1是类表面活性剂多肽和调节分子的分子结构示意图以及多肽与调节剂分子以不同方式结合时的结合能量；其中a为类表面活性剂多肽的分子和调节剂分子4,4-联吡啶分子的结构示意图和卡通示意图，b,为多肽分子与调节剂分子以两种不同方式结合时，简化结合能计算值。0032 2）先将多肽分子和吡啶分子混合于水溶液中，超声1分钟，充分混。
16、合之后，在37oC温度下孵育7天，此后，取出15微升溶液，滴到新解理的石墨表面，静置10分钟，使混合分子体系在石墨上形成组装体并沉积在表面上之后，再用高纯氮气吹干。0033 利用商品化的多模式扫描探针显微镜（SPM，Nanoscope IIIa型，Veeco公司，美国），实验条件为大气下恒电流模式，对多肽和44-联吡啶体系进行扫描，得到高分辨STM图像（如图2所示）；0034 图2（a）是多肽分子与调节剂分子在HOPG表面组装结构的STM图像。我们发现，多肽/4Bpy的组装体形成片层结构，多肽以条陇结构存在，而4Bpy分子伴随在多肽的陇间，与多肽相互作用。调节剂分子作为粘合剂将多肽分子在二维尺。
17、度上连接在一起。多肽与说 明 书CN 102911258 A4/5页64Bpy分子相互作用的模型示意图如图2（b）下方所示。通过得到的STM试验结果，我们可以得知，多肽羧基端的COOH基团与4Bpy分子中N原子形成的分子间氢键驱动了多肽/4Bpy组装体的形成。试验中，我们测量得到的多肽长度为4.5nm，考虑到端基的羧基和胺基尺寸，此多肽测量的长度基本与理论长度相吻合。0035 3）将孵育7天后的多肽分子和吡啶分子混合溶液，取出15微升，滴到新解理的云母表面，静置10分钟，使混合分子体系的聚集体充分吸附在在云母表面，再用高纯氮气吹干。0036 利用商品化的多模式扫描探针显微镜（SPM，Nanos。
18、cope V型，Bruker公司，美国），实验条件为大气下轻敲模式，对多肽与4Bpy形成的聚集体体系进行扫描，得到AFM图像（如图3所示）；0037 图3为多肽分子与4Bpy分子自组装形成的二维纳米薄片形貌。0038 4）将孵育7天后的多肽分子和吡啶分子混合溶液，取出2微升，滴到带有碳支持膜的铜网上，静置2分钟，使混合分子体系的聚集体充分吸附在铜网上，然后除掉剩余溶液。0039 利用Philips CM20 LaB6透射电子显微镜观察多肽与4Bpy分子形成的聚集体形貌。（如图4所示）；0040 图4是多肽分子与调节剂分子4Bpy共组装形成的聚集体的透射电子显微镜图像。0041 5）将孵育7天后。
19、的多肽分子和吡啶分子混合溶液，取出15微升，滴到新解理的云母表面，静置10分钟，使混合分子体系的聚集体充分吸附在在云母表面，再用高纯氮气吹干。0042 利用商品化的多模式扫描探针显微镜（SPM，Nanoscope V型，Bruker公司，美国），实验条件为大气下定量纳米力学成像模式，测量多肽与4Bpy分子形成的二维纳米薄片的力学性质。具体如图5和6所示；0043 图5（a）是多肽分子与调节剂分子4Bpy共组装形成的二维纳米薄片的高度图像，其高度分布为4nm，具体如图5（c）所示，基底的高度为0nm，多肽组装形成的二维薄片的高度明显不同于基底高度。图5（b）是多肽分子与调节剂分子4Bpy共组装形。
20、成的二维纳米薄片的杨氏模量图像。通过测量，我们得到二维纳米薄片的杨氏模量为200MPa，如图5（d）所示，此结果显示多肽与调节剂分子形成一种生物纳米软材料。通过对其表面的杨氏模量测量得知，表面的杨氏模量为230MPa，如图5（d）所示，这与云母的杨氏模量不相符，此结果证明，云母表面吸附了一层多肽与4Bp形成的组装体结构，此结构影响了云母的杨氏模量的测量。0044 本发明利用扫描隧道显微技术和原子力显微技术和透射电子显微技术分别观察，引入调节剂分子调控淀粉样多肽的组装结构，并利用定量纳米力学成像系统，研究了多肽组装薄片的力学性质，具体包括如下步骤：0045 1）制备多肽分子溶液，超声30秒钟；0。
21、046 2）在多肽分子的溶液中，加入调节剂分子，使其充分混合，孵育7天；0047 3）孵育7天后，将多肽溶液和多肽与调节剂分子共混的溶液，各取15微升分别滴在解理的高定向石墨表面和解理的云母表面，静置5分钟；0048 4）将多肽溶液和多肽与调节剂分子共混的溶液，取2微升滴在带有碳支持膜的铜网上，静置2分钟；说 明 书CN 102911258 A5/5页70049 5）用高纯氮气把残留在表面的溶液吹走；0050 6）用扫描隧道显微镜来进行观测，观察多肽和调节剂分子的共组装结构。0051 7）用原子力显微镜来观察上述多肽与调节剂分子形成的聚集体结构。0052 8）用透射电子显微镜观察上述多肽与调节。
22、剂分子形成的聚集体结构。0053 9）用定量纳米力学成像系统研究多肽与调节剂分子形成的聚集体结构的杨氏模量，以及此结构的其它力学性质。0054 图6（a）为原子力探针剪切前，多肽分子与4Bpy分子形成的二维薄片结构的形貌图像，A-D标记了形成的薄片结构，选择D为研究对象，其它三个薄片作为标记物，证明原位的研究。当使用2nN的力操纵纳米薄片时，结果发现，扫描操作后，纳米薄片被剪切成两段，如图6（b）所示。此结果证明多肽与4Bpy形成的纳米薄片结构是一种软结构，容易被剪切。图6（c和d）为剪切前后的纳米薄片的高分辨形貌图像。图像明显显示，剪切后，薄片结构缩小，证明在操作过程中，此种软结构极其容易变形，更加容易被修剪。0055 通过上述五个步骤，我们制备并表征了一种通过多肽与调节剂分子共组装得到的二维纳米薄片结构，此研究为制备新型功能化的生物纳米材料提供一个新方法。说 明 书CN 102911258 A1/5页8图1说 明 书 附 图CN 102911258 A2/5页9图2说 明 书 附 图CN 102911258 A3/5页10图3说 明 书 附 图CN 102911258 A10。