《一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102911898 A(43)申请公布日 2013.02.06CN102911898A*CN102911898A*(21)申请号 201210385953.5(22)申请日 2012.10.12CCTCC NO： M 2012243 2012.06.24C12N 1/20(2006.01)B09C 1/10(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(71)申请人台州职业技术学院地址 318000 浙江省台州市椒江区学院路788号(72)发明人于红艳 张昕欣 陈红云(74)专利代理机构浙江杭州金通专利事务所有限公司 33100代理人吴辉辉 徐关寿(54) 发。
2、明名称一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用(57) 摘要本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株降解多环芳烃的根癌农根菌(Agrobacteriumtumefaciens)tzym及其在污染土壤生物修复中的应用。本发明提供的根癌农根菌(Agrobacteriumtumefaciens)，命名为tzym，于2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCCNO：M2012243。地址：中国武汉武汉大学。该菌株可以应用于治理高分子多环芳烃污染土壤。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书4页序列表2页(19)中华人民共。
3、和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 4 页序列表 2 页1/1页21.一株降解高分子多环芳烃的菌株，其特征在于，该菌株为根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens) tzym，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M 2012243，具备降解高分子多环芳烃的能力。2.根据权利要求1所述降解高分子多环芳烃的菌株，其特征在于所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。3.根据权利要求1所述多环芳烃降解菌株，其特征在于所述菌株在多环芳烃污染土壤中具有良好的降解多环芳烃的能力。4.根据权利要求1所述降解高分子多环芳烃的菌株，其特。
4、征在于所述多环芳烃选自芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘、二苯并a，b蒽的一种或多种的混合物。5.根据权利要求1所述降解高分子多环芳烃的菌株在多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用。6.根据权利要求1所述降解高分子多环芳烃的菌株，其特征在于所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO.1所示。7.利用权利要求1所述降解高分子多环芳烃的菌株进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取多环芳烃污染土壤100g，将根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)Tyzm按质量百分比3.5%用量与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在2。
5、0的恒温条件下，振荡培养修复120小时。权 利 要 求 书CN 102911898 A1/4页3一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用技术领域0001 本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株降解多环芳烃的根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens) tzym及其在污染土壤生物修复中的应用。背景技术0002 多环芳烃（PAHs）是一类持久性有机污染物（POPs）。固体废旧金属拆解当地的PAHs污染源主要来自于废旧机器油、电器产品的润滑油和来自废旧金属拆解中的木材、有机高分子化合物、纸张等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而。
6、生成的。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，使得多环芳烃污染土壤的控制和修复迫在眉睫。0003 多环芳烃（PAHs）污染土壤修复是当前环境修复中研究的热点。生物降解是对PAHs污染土壤进行修复的重要途径之一。对于多环芳烃污染，国内外进行了大量多环芳烃降解微生物的筛选工作。到目前为止，已分离出多个具有多环芳烃降解能力的菌株，如假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属等，并没有根瘤菌科用于多环芳烃修复的报道。0004 低分子量（2个或3个苯环）PAHs，如萘、菲、蒽，容易作为微生物生长所需的碳源而快速降解，而高分子量PAHs包含4个或以上的苯环，因其低水溶性和高。
7、稳定性，不易被微生物降解，成为消除PAHs污染的难点。发明内容0005 本发明针对现有技术中高分子多环芳烃降解菌降解能力不足之处，提供一种降解高分子多环芳烃菌株，该菌株可以应用于治理高分子多环芳烃污染土壤。0006 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现的：本发明提供的根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)，命名为tzym，于2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCC NO：M 2012243。地址：中国武汉武汉大学。0007 所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。0008 所述降解多环芳烃的菌株在被多环芳烃污染。
8、的土壤的生物修复中的应用。0009 所述多环芳烃选自芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘、二苯并a，b蒽中的一种或多种的混合物。0010 所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO.1所示。0011 利用所述降解多环芳烃的菌株进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取多环芳烃污染土壤100g，将根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)tyzm按质量百分比3.5%用量与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在20的恒温条件下，振荡培养修复120小时。0012 tzym是从浙江省台州市固体废弃物拆解场某污染土壤中分离并筛选。
9、得到。菌株可在1535，pH值6.08.5培养条件下较好生长；在LB固体平板上生长菌落形态为圆说 明 书CN 102911898 A2/4页4形,乳白色,微隆起,边缘整齐,湿润;细胞杆状,革兰氏染色阴性;无芽孢;有荚膜,有鞭毛。0013 作为优选，本发明所述菌株能以高分子多环芳烃为唯一碳源和能源生长。0014 上述高分子多环芳烃降解菌的筛选方法，可按如下步骤依次实施：（1）从固废拆解场采集距地表下520cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养；所述富集培养基含有：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、 MgSO4；（2）取（1）中所述富集培养液接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，所无机盐选择培养基含有。
10、：柠檬酸钠、（NH4）2SO4、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4；添加多环芳烃（高分子多环芳烃芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘、二苯并a，b蒽的浓度均为150mg/L250mg/L）；（3）取（2）中所述选择培养物稀释涂布于固体无机盐选择培养基上，进行分离进行分离即得到多环芳烃降解菌tzym。0015 上述高分子多环芳烃降解菌tzym可用于高分子多环芳烃土壤污染的生物修复。0016 本发明tzym可在1535，pH值6.08.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为菌株形态特征为杆状,革兰氏染色阴性;无芽孢;有荚膜,有鞭毛；在LB固体平板上生长菌落形态为圆形,乳白色,微隆起,边缘整齐,湿润。
11、。0017 tzym在LB（胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5g%，氯化钠1.0%）固体培养基培养24小时菌落特征为圆形，菌落直径23mm，白色，表面光滑，边缘整齐。0018 tzym的生理生化特征，见表1。0019 表1Tzym的生理生化特征鉴定项目鉴定结果吲哚产生-MR实验+VP实验-明胶水解+尿酶实验-酪素水解+苯丙氨酸脱羧酶-精氨酸双水解酶-卵磷脂酶-（NH4）2SO4+KNO3+NH4Cl +丙二酸盐利用-柠檬酸盐利用+淀粉水解+纤维素水解-葡萄糖产酸产气-乳糖产酸产气-过氧化氢酶+葡萄糖利用+麦芽糖利用-阿拉伯糖利用+木糖利用-甘露醇利用+甘油利用+说 明 书CN 10291189。
12、8 A3/4页5蔗糖利用-tzym的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成，得到了长度为1385bp的16SrDNA全序列。选择同源性大于97%的基因序列进行系统发育分析，表明菌株与Agrobacterium tumefaciens（BLN4）同源性最高，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于根癌农根菌（Agrobacterium tumefaciens）。0020 本发明的tzym既可以在营养培养基，如：普通牛肉膏蛋白胨、普通LB、营养琼脂中生长，又可在以多环芳烃为唯一碳源、能源的无机盐基础培养基中生长。0021 综上所述，本发明具有以下优点：本发明提供的tz。
13、ym对污染土壤中的高分子多环芳烃有快速降解能力，且降解底物范围广，降解率高。0022 分类命名：根癌农根菌 tzym拉丁文名：Agrobacterium tumefaciens tzym保藏单位：中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉武汉大学保藏日期：2012年6月24日保藏编号：CCTCC NO：M 2012243。具体实施方式0023 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。0024 实施例1本发明提供的tzym的分离筛选方法。0025 从固废拆解场采集距地表下520cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养，将葡萄糖2g，胰蛋白胨4g，牛肉。
14、膏4g，MgSO40.8g加入到400mL的蒸馏水中，配制好的培养液在121的温度条件下灭菌处理20min，在此培养基上培养三天，再配制无机盐基础培养基，加入芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘、二苯并a，b蒽的多环芳烃化合物，配制成溶液后再加入蒸馏水定容至500mL，上述加入芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘、二苯并a，b蒽的量要使配制好的培养液中芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘、二苯并a，b蒽的最终浓度均为200mg/mL，然后将配制好的培养液在121的温度条件下灭菌处理20min，即得所需的培养液。在此培养基上培养三天，稀释涂布分离出一株菌命名为tzym，该菌于2012年6月24日保藏于。
15、“中国典型培养物保藏中心”其保藏号CCTCC NO： M 2012243。0026 tzym的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成。根据测序结果构建系统发育树。系统发育表明菌株与Agrobacterium tumefaciens的进化距离最近，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)。0027 实施例2根癌农根菌降解高分子多环芳烃。0028 选取芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘浓度各为200mg/Kg多环芳烃污染的污染土壤100g，接种tzym，加入量为土壤干重的3.5%，加少量水使土壤含水率保持在1。
16、5%左右，放入振荡器中，控制培养温度在20的恒温条件下，振荡培养修复120小时，提取纯说 明 书CN 102911898 A4/4页6化处理后进行液相色谱分析，芘、苯并a蒽、苯并b荧蒽、苯并a芘的降解率均为90%以上。0029 本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说 明 书CN 102911898 A1/2页7SEQUENCE L。
17、ISTING台州职业技术学院一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用1 PatentIn version 3.311385DNAAgrobacterium tumefaciens1cttggcgcag gcttaccatg cagtcgacgc cccgcaaggg gagtggcaga cgggtgagta 60acgcgtggga acataccctt tcctgcggaa tagctccggg aaactggaat taataccgca 120tacgccctac gggggaaaga tttatcgggg aaggattggc ccgcgttgga ttagctagt。
18、t 180ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccatagctgg tctgagagga tgatcagcca 240cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 300atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg aaggccttag ggttgtaaag 360ctctttcacc ggagaagata atgacggtat ccggagaaga agccccggct aacttcgtgc 420cagcagccgc ggtaatac。
19、ga agggggctag cgttgttcgg aattactggg cgtaaagcgc 480acgtaggcgg atatttaagt caggggtgaa atcccagagc tcaactctgg aactgccttt 540gatactgggt atcttgagta tggaagaggt aagtggaatt ccgagtgtag aggtgaaatt 600序 列 表CN 102911898 A2/2页8cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctta ctggtccatt actgacgctg 660aggtgcgaaa gcgtgggg。
20、ag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 720atgaatgtta gccgtcgggc agtatactgt tcggtggcgc agctaacgca ttaaacattc 780cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagct cttgacattc 900ggggtatggg cattggagac gatgtccttc agttaggctg。
21、 gccccagaac aggtgctgca 960tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020cgcccttagt tgccagcatt tagttgggca ctctaagggg actgccggtg ataagccgag 1080aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct 1140acaatggtgg tgacagtggg cagcgagaca gcgatgtcga gctaatctcc aaaagccatc 1200tcagttcgga ttgcactctg caactcgagt gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcag 1260atcagcatgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1320gagttggttt tacccgaagg tagtgcgcta accgcaagga ggcagctaat cacgttagac 1380aaggt 1385序 列 表CN 102911898 A。