利用N-膦酰基甲基甘氨酸控制植物病原体的方法
技术领域
本发明涉及用于植物中害物控制的方法和组合物。更具体地说，本发明涉及利用N-膦酰基甲基甘氨酸以及包含N-膦酰基甲基甘氨酸的组合物控制、预防或治疗耐受N-膦酰基甲基甘氨酸的植物中的植物病原体的方法和组合物。
发明背景
耐受除草剂作物的发展允许在作物农业种植期间更多的使用苗后除草剂。苗后除草剂的一个实例是N-膦酰基甲基甘氨酸，还已知草甘膦，一种对广谱植物品种具有活性的公知除草剂。草甘膦是Roundup(Monsanto Co.，St.Louis，MO)的活性成分，是一种在环境中具有所需短半衰期的安全除草剂。当施用于植物表面时，草甘膦内吸性地进入植物。草甘膦通过抑制莽草酸通道中的酶而对植物有毒性，这种酶提供合成芳族氨基酸的前体。植物、真菌和某些细菌含有对草甘膦毒性作用敏感的5-烯醇丙酮酰基(pyruvyl)莽草酸酯-3-磷酸酯合酶(EPSPS)。
农场主典型地根据遗传抗性提供对植物病原体侵染和病害的保护。然而，由于产生的作物中的足够的遗传抗性并非总是可得的，或不期望特性与遗传抗性的遗传位点相连。则农场主必须施用农药来控制病原体的侵染，这大幅增加了作物生长的成本，也影响了环境。
控制真菌病害造成的作物损失是昂贵的。美国农业部估计，使用杀真菌剂防治亚洲大豆锈病，一英亩将单独给大豆种植成本增加25美元，或者说增加大豆种植成本的15％-20％。如果2004年美国所有种植大豆的农田都使用杀真菌剂，将花费掉农场主总共约18.7亿美元。
开发利用有效并且安全的组合物控制耐受草甘膦作物中的病原体与病害的方法和化学混合物将是有利的。这样的方法可以通过减少农场主用于处理作物大田投入数量来降低作物种植成本，同时也为植物病害所带来的损失提供了保护。
发明概述
本发明提供一种控制耐受草甘膦作物中植物病原体病害的方法，该方法包括确认需要病害控制的作物，用有效量的具有草甘膦的组合物接触植物，从而控制由植物病原体导致的作物病害。特别地，植物病原体是真菌，并且具有草甘膦敏感的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶。
本发明还提供一种预防耐受草甘膦作物中病原体所致病害的方法，该方法包括确认处在病原体侵染危险中的作物，用有效量的草甘膦接触至少部分作物来预防该植物受到植物病原体的侵染。特别地，植物病原体是真菌，并且具有草甘膦敏感的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶。
本发明进一步提供了一种治疗植物病害的方法，该方法包括确认受到植物病原体侵染的耐受草甘膦作物，用有效量的含草甘膦的组合物接触该作物。特别地，植物病原体是真菌，并且具有草甘膦敏感的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶。
本发明还提供了一种在耐受草甘膦作物的大田中控制杂草和病原体的方法，该方法包括施用第一种含除草剂成分的组合物，并且施用第二种含有有效量的草甘膦的组合物，其中第二种组合物控制由植物病原体引起的作物病害，所述病原体具有草甘膦敏感的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶。
本发明进一步提供了一种增加耐受草甘膦作物产量的方法，该方法包括种植具有编码多肽的外源核酸分子的作物，其中多肽赋予对草甘膦的耐受性，确认需要病害控制的所述作物，对植物施用含草甘膦的组合物以控制植物病原体，该病原体具有对草甘膦敏感的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶，收获作物的组织或种子，其中产量的增加应归功于病害的控制。
本发明还提供一种草甘膦化合物和害物控制化合物的混合物。优选地，该混合物包括一种草甘膦化合物和一种杀真菌剂化合物，用于耐受草甘膦作物以预防或控制由植物病原体引起的植物病害，特别地，植物病原体是真菌，并且具有草甘膦敏感的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶。该混合物中的杀真菌剂化合物可以是内吸性或接触性杀真菌剂或其各自的混合物。更特别地，该杀真菌剂化合物包含但不限于如下化学品类：甲氧丙烯酸酯类、三唑类、氯腈类、羧酰胺及其混和物。与草甘膦相混合在的害物控制化合物进一步包含杀虫剂化合物，从而减少了对耐受草甘膦植物的农田的化学品施用的次数。
本发明提供一种通过将化合物配制成混和物，并且施用至作物的剂量低于单个化合物通常施用至作物的剂量，以减少草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的作物残留和环境残留的方法，其中保护所处理作物免受由于真菌病害所造成的作物损失，并且降低了草甘膦和杀真菌剂在植物或环境中的残留。
本发明还提供一种通过提供一种草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的混合物，并且处理对真菌病原体敏感的作物，以降低真菌对杀真菌剂抗性的方法，其中化合物有不同的作用模式以预防或减少真菌病害。
本发明还提供一种治疗大豆植株叶锈病的方法，该方法包括确认受到锈菌侵染的大豆植株，并且将具有草甘膦的组合物施用至大豆植株或其部分，从而该组合物导致病害得到控制。另一种方面，治疗是将含有草甘膦和杀真菌剂组合物的组合物施用至大豆植物或其部分，从而该组合物导致病害得到控制。
本发明还提供一种预防大豆植株中叶锈病的方法，该方法包括确认正处在锈菌侵染的危险之中的大豆植株，将具有草甘膦的组合物施用至大豆植株或其部分，从而抑制对大豆植株的侵染。本发明的另一方面，将含有草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的组合物施用到大豆植株或其部分，从而抑制对大豆植株的侵染。
本发明还提供一种治疗玉米植株中叶锈病的方法，该方法包括确认受到锈菌侵染的玉米植株，并且将具有草甘膦的组合物施用至玉米植株或其部分，从而该组合物导致病害得到控制。
本发明还提供一种治疗玉米植株中叶锈病的方法，该方法包括确认受到锈菌侵染的玉米植株，并且将具有草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的组合物施用至玉米植株或其部分，从而该组合物导致病害得到控制。
本发明还提供一种预防玉米植株中叶锈病的方法，该方法包括确认正处在锈菌侵染的危险之中的玉米植株，并且将具有草甘膦的组合物施用至玉米植株，从而抑制对玉米植株的侵染。
本发明还提供一种预防玉米中叶锈病的方法，该方法包括确认正处在锈菌侵染的危险之中的玉米植株，并且将具有草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的组合物施用至玉米植株，从而抑制对玉米植株的侵染。
本发明还提供一种治疗棉花植株中真菌性枯萎病的方法，该方法包括确认受到真菌性枯萎病原体侵染的棉花植株，并且将具有草甘膦的组合物施用至棉花植株或其部分，从而该组合物导致病害得到控制。该方法的另一方面，该草甘膦组合物包含植物内吸性杀真菌剂。
本发明还提供一种预防棉花植株中真菌性枯萎病的方法，该方法包括确认正处在真菌性枯萎病原体侵染的危险之中的棉花植株，并且将具有草甘膦的组合物施用至棉花植株，从而抑制对棉花植株的侵染。该方法的另一方面，该草甘膦组合物包含植物内吸性杀真菌剂。
本发明还预期一种能提高吸入到耐受草甘膦作物或该作物的真菌病原体中的含有草甘膦的组合物。在本发明的另一个方面，该草甘膦组合物包含助剂。
一种控制耐受草甘膦作物中真菌病害的方法，其包括用有效剂量的草甘膦组合物处理作物，其中所述作物选自Roundup Ready棉花1445和88913；Roundup Ready玉米GA21、nk603、MON802、MON809；Roundup ReadySugarbeet GTSB77和H7-1；RoundupReadyCanola RT73和GT200；油菜ZSR500，Roundup Ready大豆40-3-2，Roundup ReadyBentgrass ASR368和Roundup Ready马铃薯RBMT22-082。优选地，草甘膦组合物是在含有RoundupWeatherMAX的制剂中，更优选地，该草甘膦组合物含有杀真菌剂。
一种控制耐受草甘膦作物中真菌病害的方法，该方法包括用草甘膦组合物处理作物植株细胞，其中该作物植株细胞和真菌细胞之间发生的化学交换允许草甘膦从作物植株细胞移入真菌细胞中，并且真菌细胞含有草甘膦敏感的EPSPS酶。本方法另一个方面，草甘膦组合物含有植物内吸性杀真菌剂。
本发明还提供了一种包含草甘膦化合物和害物控制化合物的容器。本发明另一个方面，提供一种用于控制作物植株上病原体的试剂盒(kit)，其包括含有草甘膦的组合物，以及用于施用该组合物的说明方法，在第一次施用中用于控制杂草并且第二次施用于作物用于控制植物病原体。特别地，植物病原体是真菌，并且具有草甘膦敏感的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶。
附图的简要说明
图1是描述随着草甘膦处理量的增加锈病感染减少的曲线图。在图1所示的数据中，顶部完全伸展的小麦叶片受到Roundupspray(以0.75lb ae/a的0-1X，IX)的保护，随后在处理后1天(DAT)时将小麦锈菌孢子接种至受到保护的叶片。
图2显示了在用小麦锈菌孢子接种之前(预防性的)或之后(治疗性的)时，在Roundup Ready Wheat中以1/8X到1X的速率施用草甘膦制剂，Roundup WeatherMAX和TouchdownTM IQ控制小麦锈病的对比。
发明详述
本发明涉及用于植物病害的控制、预防或治疗的方法与组合物。在优选的方面，本发明方法涉及控制、预防或治疗耐受草甘膦作物的病害的方法。
通常来说，草甘膦组合物已被用作一种除草剂。出乎意料的是，现已发现了草甘膦组合物还具有杀虫的特性。在优选的方面，当用于耐受草甘膦作物植株时，草甘膦组合物具有杀真菌的活性。本发明另一方面，含有草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的组合物显示特别有效的控制真菌病害作用。低于通常用于控制杂草或真菌病害的各化合物剂量速率显示有效控制真菌病害。
同样，本发明提供利用草甘膦组合物或含有草甘膦和杀真菌剂的混合物来控制、预防或治疗耐受草甘膦作物的植物病原体侵染的方法。该方法用于控制、预防或治疗植物病害，例如大豆、小麦、玉米、水稻、油菜、苜蓿、甜菜、马铃薯、西红柿、棉花或者其它耐受草甘膦的基因修饰作物的真菌病害。
各节的标题仅在本文用于编制目的，并不以任何方式解释为限制所描述的主题。
I.本发明的方法
本公开内容提供通过将含有N-膦酰基甲基甘氨酸及盐类(在此也称为草甘膦化合物)的组合物施用至需要病害控制、预防或治疗的作物来控制、预防或治疗作物病害的方法。一方面，该方法包括用有效量的含草甘膦的化学组合物接触需要病害控制、预防或治疗的作物来控制、预防或治疗作物的植物病原体侵染。在优选的方面，期望进行病害控制、预防或治疗的作物是耐受草甘膦的。
本文所使用的“病害控制”是指预防或治疗植物中的病原体侵染。它也意指植物避免或最大限度地减少病害或其症状，所述症状是多种植物病原体相互作用的结果。也就是说，是防止病原体导致植物病害或相关的病害症状或两者皆有，或换一种说法，与未处理植物相比，用草甘膦组合物处理使得植物病害或相关的病害症状最小化或减弱。
在优选的方面，通过草甘膦对病原体的活性来预防或控制侵染。虽然本发明不依赖于病害症状严重程度的任何特别地降低，但是与不用草甘膦组合物处理的植物(或者“未处理植物”)相比较，本发明的方法一方面将减少由病原体侵染所引起的病害症状至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。因此，该发明的方法包括，可以用来保护植物免于病害，尤其是植物病原体导致的病害。侵染或病害症状的减少可利用任何可重复的测定方法来测定。一方面，侵染或者病害症状的减少可以通过计算叶片上的病变、脓疱或二者的数量，并与未处理的植物上的病变、脓疱或二者的数量来比较来测定。
本文所使用的“所需植物”是指任何需要病害控制、预防或治疗的植物。特别地，该术语指处在植物病原体侵染的危险中，或受到病原体侵染的植物。植物可以是处于病原体可能侵染植物的环境侵染的危险中，例如在病害最佳的气候条件下，或者大田中其它病害寄主已用除草剂处理过，并且病害从死亡植物向生长植物交叉是可能的。受侵染的植物可以通过观察植株上的病害症状来确认。所表现的病害症状将取决于病害，但一般来说，症状包括病变、脓疱、坏死、超过敏性反应、枯萎、黄叶、诱导防御相关基因(如SAR基因)等。
确定病害侵染或相关症状可以通过任何识别侵染或相关症状的方法来进行。有多种方法可确认受侵染的植株及相关病害的症状。一方面，该方法可以涉及对侵染和/或症状的宏观或微观的拍摄，或者利用微观排列来探测侵染相关的基因(例如系统获得抗性基因、防御素基因等)。用于确定植物中的病原侵染的宏观和微观方法是本领域已知的，并且包括识别由于侵染或者出现病变、坏死、孢子、菌丝、真菌菌丝生长、枯萎、疫病、水果斑点、腐烂、菌瘿和矮化等所导致的对植物组织的损害。这些症状可以与未侵染植物、侵染植物的照片或插图、或者两者结合相比较，以确定存在侵染或识别病原体或二者皆有。病原体侵染症状的照片和插图是在本领域中是广泛可用的，例如从美国植物协会的St.Paul，MN 55121-2097可得。一方面，症状是肉眼或经过特定放大倍率是可见的。在优选的方面，特定放大倍速是2x、3x、4x、5x、10x或50x。
另外一方面，侵染或相关症状可以利用市售的识别植株病原体的测试试剂盒(test kit)来确认。例如，这类试验试剂盒是可以从当地农业机构或合作社获得。另外一方面，确定需要治疗的作物是通过预报有利于病害发展的天气和环境条件来进行的。另外一方面，本领域技术人员在大田观测作物的植物病害来确认需要处理的植物。
另一个方面，可以利用基于聚合酶链反应(PCR)的检定试验来确定侵染或其相关症状。基于PCR的试验描述于例如，利用PCR扩大特定于病原体线粒体基因组的序列，在受到侵染的小麦中检测禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)(GGT，Take-all disease)的存在(Schlesser等，1991；Applied和Environ.Microbiol.57：553-556)，并且随机扩大多形态的DNA(即RAPD)标记以区别松树枯梢病菌(Gremmeniella abietina)的大量品种，所述病菌是在松柏类植物中引起Scleroderris canker的病菌。美国专利号5,585,238描述了源自壳针孢(Septoria)、芥假小尾孢(Pseudocercosporella)和球腔菌(Mycosphaere IIa)菌株的核糖体RNA基因区的ITS序列的引物，以及将其用于识别利用基于PCR技术的这些真菌离析物。此外，美国专利号5,955,274描述了源自镰刀菌(Fusarium)菌株的核糖体RNA基因区的ITS序列的引物，以及将其用于识别利用基于PCR技术的这些真菌离析物。此外，美国专利号5,800,997描述了源自尾孢(Cercospora)、长蠕孢(Helminthosporium)、球梗孢(Kabatiella)和锈菌(Puccinia)菌株的核糖体RNA基因区的ITS序列的引物，以及将其用于识别利用基于PCR技术的这些真菌离析物。具体的鉴定方法取决于病原体。
本文所使用的“接触”指用草甘膦组合物或者直接在作物上，或者在直接相邻近作物上处理作物，其中草甘膦可以被吸入作物的维管系统中。在该方法中，组合物直接接触作物，组合物可以与整个作物植株或仅与植株的一部分相接触。此外，可以通过直接接触植物表面或通过接触植物细胞或组织，将植物病原体与含有草甘膦的草甘膦组合物相接触。在优选的方法，通过过顶喷雾组合物用草甘膦组合物接触植株。
术语“有效量”是指，草甘膦化合物的量足以造成任何可观察地测定植物病害控制、预防或治疗。优选地，草甘膦的有效量是导致草甘膦在植物组织中的浓度达到约0.01ppm至约100ppm/鲜重。更优选地，介于0.1ppm至25ppm草甘膦鲜重的组织浓度是在本发明方法中的经处理植物组织中获得的。最优选地，约0.5ppm至约10ppm草甘膦的组织浓度有效控制、预防或治疗所处理植物的病害。
本发明中施用草甘膦化合物的有效比率(rate)受到包括环境的多种因素的影响，因此应当在实际使用条件下进行确定。优选地，以类似于或低于用于杂草控制的量的比率用施用草甘膦获得病害控制、预防或治疗。更优选地，根据本发明的方法，草甘膦化合物的施用比率为约0.1磅酸当量/英亩(有效磅(lb ae)/英亩，本文指磅/英亩)至约5磅/英亩的草甘膦有效控制、预防或治疗病原体。然而更优选的施用比率为约0.37磅/英亩至约2.5磅/英亩。最优选的施用比率为约0.75磅/英亩，本文称作1X草甘膦比率。
在优选的方面，通过将有效量的草甘膦组合物侵染前或侵染后施用至整个植株或植株部分如根、茎、叶、果实、种子、块茎或鳞茎，或施用至待保护植物生长的介质(如土壤、沙或水)中，完成植物病害的控制、预防或治疗。一方面，草甘膦移动穿过植物的维管系统，从而不需要接触整个植株。因此，一方面可以用草甘膦组合物来处理植株部分，并且控制、预防或治疗经处理的部分以及未处理的植株部分如未处理的叶片、茎或根的病害。在一个具体的方面，当用含有草甘膦的组合物处理较低位置的叶片时，降低了耐受草甘膦的小麦植株的未处理叶片的病害侵染。在尤其优选的方面，病害控制、预防或治疗与未处理叶片组织中的草甘膦的浓度相应。另一方面，草甘膦组合物也可以施用于种子以保护种子和秧苗。
本文所使用的“侵染前”就是指植物在没有暴露于植物病原体的条件或受到植物病原体污染的材料。
术语“侵染后”指的植物已经暴露于植物病原物的条件或受到植物病原体污染的材料。该植物会或不会显示侵染的症状。例如，植物可能受到病原体侵染，然而未显示侵染的症状，如超过敏性反应(HR)。
优选地，本发明的方法是通过草甘膦组合物在植物病原体上的直接作用来控制、预防或治疗植物病害。病害控制、预防或治疗还部分地是通过施用草甘膦组合物诱导的系统获得抗性(SAR)的结果。在优选的方面，通过本发明方法所获得的病害控制、预防或治疗是草甘膦直接作用的结果，而不是诱导SAR的结果。
“耐受草甘膦”是指本方法中使用的植物对草甘膦的应用是有抗性的或耐受草甘膦的。在本发明的优选方面，耐受草甘膦植物是提供对草甘膦耐受的外源核酸分子的表达的结果。
因此，本发明提供一种预防植物病害的方法，该方法包括将有效量的草甘膦组合物施用至植物，从而防止植物受到病原体的侵染。在优选的方面，在该方法中使用的植物是耐受草甘膦的。
“预防侵染”意指植物避免病原体侵染或病害症状或二者皆之，或者显示降低或最小化病原体侵染或病害症状或二者皆之，当与不用草甘膦组合物处理植物(或“未处理植物”)相比，这是植物病原体相互作用的自然结果。即，预防或减少导致病害、相关病害症状或二者皆之的病原体。本发明的方法可以用来保护植物免于病害，尤其是由真菌植物病原体引起的的病害。
与未用草甘膦组合物处理的植物相比，通过预防或减少病原体侵染或相关病害症状，侵染或症状或二者优选减少至少约10％。优选地，与未用草甘膦组合物处理的植物的侵染症状一或二者相比，预防或减少至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的侵染或症状或二者皆之。病害侵染可以用任何可重复的测定方法来测定。一方面，通过计数肉眼可见、或在特定放大倍率下可见的病变或脓疱来测定侵染。在优选的方面，特定放大倍率为2x、3x、4x、5x、10x或者50x。
在优选的方面，本发明的方法提供了用草甘膦组合物处理后一段时间的病害预防。优选地，在施用草甘膦组合物后的几个星期内，该草甘膦组合物预防植物的严重病害。更优选的是，在用草甘膦组合物处理之后，预防病害至少约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35天。在一个尤其优选的方面，在用草甘膦组合物处理之后，预防病害至少约40天。可以采用任何可重复的测定方法来测定病害的预防。在优选的方面，通过在用草甘膦组合物处理后的一定时间点来计算病变或脓疱发展来测定病害预防作用。在优选的方面，在草甘膦处理后的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30天计数病变或脓疱。
如下更详细所讨论的，根据用于赋予草甘膦耐受性或抵抗性的方法，施用草甘膦可以在处理后的或短或长时间预防侵染或病害。例如，草甘膦耐受性是通过外源DNA编码的多肽给予植物，该多肽会降解草甘膦(例如草甘膦氧化还原酶或草甘膦乙酰转移酶)，与表达外源多肽所给予的草甘膦耐受性相比较，病害在短期内会得到预防，所述的外源多肽受到草甘膦较小的抑制(例如改性的EPSPS)，这允许草甘膦保存在植物组织中。草甘膦在植物中的耐受性可以通过表达对草甘膦有较低亲和力的改性的I EPSPS来获得，然而，在草甘膦存在下，仍然保留其催化活性(美国专利4,535,060和6,040,497)。
EPSPS酶，例如II EPSPS已经从对草甘膦有天然抗性的细菌中分离出来，并且当该酶表达为植物中转基因的基因产物时提供对植物的草甘膦耐受性(美国专利5,633,435和5,094,945)。本发明意欲使用任何改良或天然存在的EPSPS酶，例如从微生物源分离出来的耐受草甘膦的EPSPS酶，其不是I或II类酶以及改性的I EPSPs(WO04/07443)，所述酶在转基因植物中用作转基因而对草甘膦具有抗性。对于研究草甘膦耐受植物的本领域技术人员来说，这类酶是已知的。
另外一方面，施用草甘膦组合物有效预防在施用草甘膦组合物点的远距离处的植物位点处的病害或相关症状。一方面，草甘膦组合物的叶片施用有效预防寄居于相对远和植物的难以接近的区域例如根和分生组织的病原体。另一方面，通过接触植物生长的介质获得对植物叶片的病害预防。由于草甘膦化合物在植物维管系统中迁移，这使得在活植物中长距离迁移所述化合物，从而产生该远程作用。此外，通过施用诱导系统获得抗性(SAR)的草甘膦制剂来提高病害的预防作用。响应于尤其是引起坏死的病原体侵染，或通过某些化合物的诱导在植物中出现SAR，并且其提供对相同或甚至无关的病原体的随后侵袭的增强的抗性。SAR提供对整个植物(系统的)抗广谱的无关病原体的长期(数周至数月)的保护作用。在植物细胞中诱导的防御响应的实例包括合成植物细胞结构组分如角质软木脂、愈创葡聚糖和木质素，化学防御化合物例如过氧化氢，以及抗细菌或抗真菌化合物例如丹宁酸类和植物抗毒素。在优选的方面，植物中病害的预防首先通过草甘膦的直接作用，而不是通过诱导SAR。
因此，本发明提供预防植物病害的方法仅是将植物的一部分与草甘膦组合物相接触，然而未经处理的植物部分也免受病害。一方面，仅有约5％、10％、20％、30％、50％、75％或90％的植物与草甘膦组合物相接触。草甘膦组合物所接触的植物的百分比可以通过任何可重复的测定方法来测定。
本发明一方面提供一种在大豆、玉米、水稻、棉花、苜蓿、甜菜或小麦植物中预防侵染的方法。该方法通常包括将有效量的草甘膦组合物施用至大豆、玉米、水稻、棉花、苜蓿、甜菜或小麦植株或其部分，以预防侵染植物。在优选的一方面，大豆、玉米、水稻、棉花、苜蓿、甜菜或小麦植物是耐受草甘膦的。特别优选的方面是提供预防大豆、玉米、棉花或小麦植物受到真菌病原体侵染的方法。在优选的方面，提供预防玉米、小麦和大豆受到叶锈病侵染的方法。另一优选的方面，提供预防侵染棉花和真菌性枯萎病的方法。
在另一方面，本发明的方法通过将草甘膦组合物施用至需要病害控制、预防或治疗的大豆植株，来提供对大豆植株中锈病(Phakopsorapachyrhizi)的控制、预防或治疗。在优选的方面，大豆是耐受草甘膦的。
还提供了治疗植物病害的方法，该方法通过识别被植物病原体侵染(即侵染后)的植物，并且用有效量的草甘膦组合物接触受侵染的植物，以此来治疗侵染。在优选的方面，受到侵染的植物是耐受草甘膦的。侵染可用任何可重复的测定方法来测定。一方面，通过计数肉眼可见、或在特定放大倍率下可见的病变数目来测定侵染。在优选的方面，特定放大倍率为2x、3x、4x、5x、10x或50x。
“治疗”植物病害是指由植物病原体导致的症状减轻或者不向严重程度发展。严重程度的减轻是指与治疗时的症状相比，在治疗之后某个时间，所治疗植物叶片表面区域显示出较少侵染或者减轻症状(例如叶表面的百分比)。一方面，与未采用草甘膦组合物治疗的受到侵染的植物相比，侵染减少5％、10％、25％、50％或75％。
在另一方面，预防病变在尺寸上增大或者发展到下一级的侵染或症状。在优选的方面，病变通过发展为脓疱而减少。一方面，预防10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的病变在叶片表面变成脓疱。病变的发展可用任何可重复的测定方法来测定。一方面，病变发展可以通过将用草甘膦组合物治疗后的植物表面可见的脓疱数与用草甘膦组合物治疗时的植物表面可见的病变数相比较来测得。
本发明一方面提供一种在大豆、玉米、水稻、棉花、苜蓿、甜菜或小麦植物中预防侵染的方法。该方法通常包括将有效量的草甘膦组合物施用至大豆、玉米、水稻、棉花、苜蓿、甜菜或小麦植株或其部分，以预防侵染植物。在优选的一方面，大豆、玉米、水稻、棉花、苜蓿、甜菜或小麦植物是耐受草甘膦的。特别优选的方面是提供预防大豆、玉米、棉花或小麦植物受到真菌病原体侵染的方法。在优选的方面，提供预防玉米、小麦和大豆受到叶锈病侵染的方法。另一优选的方面，提供预防侵染棉花和真菌性枯萎病的方法。
在另一方面，本发明的方法通过将草甘膦组合物施用至需要病害控制、预防或治疗的大豆植株，来提供对大豆植株中锈病(Phakopsorapachyrhizi)的控制、预防或治疗。在优选的方面，大豆是耐受草甘膦的。
还提供了治疗植物病害的方法，该方法通过识别被植物病原体侵染(即侵染后)的植物，并且用有效量的草甘膦组合物接触受侵染的植物，以此来治疗侵染。在优选的方面，受到侵染的植物是耐受草甘膦的。侵染可用任何可重复的测定方法来测定。一方面，通过计数肉眼可见、或在特定放大倍率下可见的病变数目来测定侵染。在优选的方面，特定放大倍率为2x、3x、4x、5x、10x或50x。
“治疗”植物病害是指由植物病原体导致的症状减轻或者不向严重程度发展。严重程度的减轻是指与治疗时的症状相比，在治疗之后某个时间，所治疗植物叶片表面区域显示出较少侵染或者减轻症状(例如叶表面的百分比)。一方面，与未采用草甘膦组合物治疗的受到侵染的植物相比，侵染减少5％、10％、25％、50％或75％。
在另一方面，预防病变在尺寸上增大或者发展到下一级的侵染或症状。在优选的方面，病变通过发展为脓疱而减少。一方面，预防10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的病变在叶片表面变成脓疱。病变的发展可用任何可重复的测定方法来测定。一方面，病变发展可以通过将用草甘膦组合物治疗后的植物表面可见的脓疱数与用草甘膦组合物治疗时的植物表面可见的病变数相比较来测得。
此外，提供了治疗由植物病原体侵染植物的方法，其中将植物的非侵染部分用草甘膦治疗。该方法包括确定该植物受到植物病原体的侵染，随后将含有草甘膦的组合物施用至未受到植物病原体侵染的植物部分。将草甘膦组合物施用至植物的非侵染区域导致治疗植物上的另一部位的侵染。
本发明还提供了在耐受草甘膦作物的大田中控制有害杂草，以及控制、预防或治疗病原体的方法，其中该方法利用施用草甘膦组合物。该方法包含将草甘膦组合物一次或多次施用至对草甘膦耐受或有抗性的作物大田中，优选两次或多次施用。优选地，该施用或施用们应选择时间以有效地控制所处理植物中的杂草并且有效控制、预防或治疗病害。例如，非限制性地，当在植物大田中施用来控制杂草的同时进行草甘膦的第一次施用。例如，非限制地，在作物处于植物病原体侵染的危险中或已被侵染时进行第二次施用。一方面，施用草甘膦组合物导致植物组织中草甘膦的浓度为约0.01ppm至约100ppm/鲜重。更优选地，介于0.1ppm至25ppm草甘膦鲜重的组织浓度是在本发明方法中的经处理植物组织中获得的。最优选地，约0.5ppm至约10ppm的草甘膦的浓度有效控制、预防或治疗所处理植物中的病害。
本发明中施用草甘膦组合物的有效比率可以受到包括环境的多种因素的影响，因此应当在实际使用条件下进行确定。优选地，根据本发明的方法，草甘膦组合物的施用比率为约0.1磅/英亩至约5磅/英亩的草甘膦有效控制、预防或治疗病原体。然而更优选的施用比率为约0.37磅/英亩至约2.5磅/英亩。最优选的施用比率为约0.75磅/英亩。
一方面，控制大田作物中的杂草和病原体的方法包括如下步骤：(a)在大田种植农作物，(b)施用除草组合物基本上消除大田的非作物植株，并且(c)随后施用草甘膦组合物控制、预防或治疗病害。在该方法中，应当理解的是种植和基本上消除的步骤可以进行互换。
从而，在在大田中种植作物之前，可以基本上消除大田中的非作物植株。一方面，施用除草剂组合物与施用草甘膦组合物控制病害要隔开1天、隔开2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21天。另一方面，施用除草剂和杀虫剂的时间间隔要大于5、10、20、25、30、35、40、45或50天。
一方面，在生长季节期间施用草甘膦组合物一次或者多次。另一方面，对于需要病害控制、预防或治疗的植物，在其生长季节期间施用草甘膦组合物2、3、4、5、6、7、8、9、10次。
本发明还提供一种增加植物产量的方法，该方法包括种植具有编码多肽的外源核酸分子的植物，其中该多肽赋予对草甘膦的耐受性，确定受到植物病原体侵染或处于侵染危险中的植物，将包含(包含指“包括但不限于”)草甘膦的组合物施用至植物以控制、预防或治疗植物病原体，并且从植物中收获一种组织。在优选的方面，该方法提高植物组织包括但不限于：种子、果实、核仁、圆荚、块茎、根和叶的产率。在本发明的一个方面，与未用草甘膦组合物处理以控制、预防或治疗病害的植物相比较，产率增加了5％、10％、15％、20％、25％、30％、50％。在优选的方面，产量的增加可以通过相对于种子的干重或交叉收集种子的干重的平均增加来测得。在本发明的优选方面，种子的收集是单个植株上的所有种子或其一定百分比例如25％、50％或75％，由大田或种植区域获得的有代表性的种子数量也属于本发明的方法，或在对照的情形下不属于本发明的方法。在优选的方面，所选择的有代表性的种子数量足以用于统计分析。
本发明还提供用于控制、预防或治疗植物病害的试剂盒，根据本发明的方法，该试剂盒包含具有草甘膦组合物的容器和将草甘膦组合物施用以控制、预防或治疗植物病原体侵染的说明材料(instructionalmaterial)。本领域技术人员将理解在本发明方法中用于施用草甘膦组合物的说明可以是以任何形式的说明方法(instruction means)。这类指示包括但不限于书面说明材料(例如标签、图册、小册子)，或口头说明材料(例如音频磁带或CD)或视频说明(如录影带或DVD)。
II.草甘膦组合物
本发明的方法中所使用的组合物包括具有作为其有效成分的N-膦酰基甲基甘氨酸的组合物，本文也称为草甘膦。因此，本发明方法所使用的组合物包括任何含有草甘膦化合物的组合物。特别是，包含草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的组合物对于易侵染的真菌病原体的活性是加合或增效的。草甘膦是一种有效的广谱除草剂。例如在美国专利号3,927,080；3,956,370；3,969,398；4,147,719和4,654,429所示公开了多种已知的制备草甘膦的方法。本文所使用的“草甘膦”指N-膦酰基甲基甘氨酸，其盐或酯，或在植物组织中转化为草甘膦的化合物或另外提供草甘膦离子的化合物。这包括草甘膦的TMS盐(以商品名TouchdownTM市售)，以及草硫膦及其盐类。一方面，用于本发明的方法中的草甘膦、草甘膦盐类或两者公开于美国专利3,799,758中。另一方面，许多N-膦酰基甲基甘氨酸的衍生物显示出广谱杀虫活性，因而任何这种杀虫衍生物将在本发明中定义为草甘膦。另一方面，草甘膦的任何制剂都在本发明范围内。在优选的方面，草甘膦组合物包含草甘膦的阳离子和阴离子形式的盐，更优选是草甘膦的阴离子形式的盐。
优选地，将所选择的草甘膦组合物以与其它载体、表面活性剂、助剂或其它常规用于制剂工艺中的促进施用的化学品的组合物形式施用于待保护或处理的植物。适宜的载体、表面活性剂和助剂可以是固态或者液态，并且是制剂工艺中通常使用的物质，例如天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、增稠剂、粘合剂或肥料。
施用草甘膦组合物的优选方法是施用至土壤表面上的植物部分，尤其是叶片(叶片施用)。施用频率和施用比率取决于病原体的生物学的和气候上的存活条件。然而，如果植物生长地方充满了液体制剂(例如在稻田培育中)，或者如果组合物以固体形式引入土壤，例如以颗粒的形式(土壤施用)时，该组合物也可以经由土壤或经由水(内吸作用)经根渗透进植物。为了处理种子，通过用组合物的液体制剂浸渍块茎或谷粒，或用已经组合的湿润或干燥制剂进行涂覆，组合物也可以施用于种子(涂覆)。此外，在特定情况下，施用于植物的其它方法也是可行的，例如直接处理芽或果实组织。
本发明的方法中所使用的草甘膦组合物也可以与一种或多种其它杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学不孕剂、semiochemicals、驱虫剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂或其它的生物活性化合物相混合，以形成具有更广谱的农业保护作用的多组分的农药。
可以与本发明化合物配制的这种农业保护剂的例子是：杀虫剂例如阿维菌素、乙酰甲胺磷、保棉磷、氯氰菊酯、扑虱灵、克百威、氟唑虫腈、毒死蜱、甲基毒死蜱、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、除虫脲、乐果、高氰戊菊酯、苯氧威、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、fonophos、吡虫啉、异柳磷、马拉硫磷、四聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多威、烯虫酯、甲氧滴滴涕、7-氯-2，5-二氢-2-[N-(甲氧羰基基)-N-[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基]羰基]茚并[1，2-e][1，3，4]二嗪-4a(3H)-甲酸甲酯(DPX-JW062)、久效磷、杀线威、对硫磷、甲基对硫磷、氯菊酯、甲拌磷、杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、鱼藤酮、硫丙磷、虫酰肼、七氟菊酯、特丁硫磷、杀虫威、硫双威、四溴菊酯、敌百虫和杀铃脲；最优选的是，草甘膦化合物与杀真菌剂化合物或杀真菌剂组合物相配制，例如嘧菌酯、苯菌灵、灭瘟素、碱式硫酸铜混合物(三元硫酸铜)、糠菌唑、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、王铜、铜盐、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺(CGA 219417)、哒菌酮、氯硝胺、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、烯唑醇、烯唑醇-M、多果定、克瘟散、氧唑菌(BAS 480F)、唑菌酮、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、氟啶胺、喹唑菌酮、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、藻菌磷、呋霜灵、己唑醇、环戊唑醇、异稻瘟净、异菌脲、稻瘟灵、春雷霉素、嗜球果伞素、代森锰锌、代森锰、灭锈胺、甲霜灵、叶菌唑、7-苯并噻唑硫代甲酸(carbothioate)S-甲酯(CGA 245704)、腈菌唑、甲胂铁铵(甲基胂酸铁)、霜灵、戊菌唑、戊菌隆、噻菌灵、咪鲜安、丙环唑、啶斑肟、咯喹酮、喹氧灵、螺茂胺(KWG4168)、硫磺、戊唑醇、四氟醚唑、噻菌灵、甲基托布津、福美双、三唑酮、三唑醇、三环唑、肟菌脂、灭菌唑、有效霉素和烯菌酮；杀真菌剂的组合物通常为例如环唑醇和嘧菌酯、苯醚甲环唑和精甲霜灵，咯菌腈和精甲霜灵，代森锰锌和精甲霜灵，氢氧化铜和精甲霜灵，嘧菌环胺和咯菌腈，环唑醇和丙环唑；用于控制亚洲大豆叶锈病的市售杀真菌制剂包括但不限于Quadris(Syngenta公司)、Bravo(Syngenta公司)、Echo720(Sipcam Agro Inc)、Headline2.09EC(BASF公司)、Tilt3.6EC(Syngenta公司)、PropiMaxTM 3.6EC(Dow AgroSciences)、Bumper41.8EC(MakhteshimAgan)、Folicur3.6F(Bayer CropScience)、Laredo25EC(Dow AgroSciences)、Laredo25EW(DowAgroSciences)、Stratego2.08F(Bayer公司)、DomarkTM 125SL(Sipcam Agro USA)和Pristine38％WDG(BASF公司)，它们可以与本发明所述的草甘膦组合物相组合以提供对大豆锈病增强的保护；杀线虫剂如砜灭威和苯线磷等；杀细菌剂如链霉素等；杀螨剂如杀虫脒、灭螨猛、杀螨酯、三环锡、三氯杀螨醇、遍地克、乙螨唑、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨灵和吡螨胺；以及生物试剂，例如苏云金杆菌、苏云金杆菌三角内毒素、杆状病毒、病原细菌、病毒和真菌。
三唑类和嗜球果伞素类是特别有效并且环境安全的杀真菌剂。七十年代中期引入含有三唑杀真菌剂的杀真菌剂组DMI或脱甲基化抑制剂。自此以后，三唑杀真菌剂是谷物病害控制的主要产品。其中首先出现的是三唑酮(Bayleton)，随后定期又有新的三唑类化合物出现，例如popinconazole、戊唑醇、腈菌唑和氟环唑。三唑类化合物对大范围的叶类病害具有活性，其单独使用或与非内吸性杀真菌性混和使用，也可以和内吸性吗啉类杀真菌剂混和使用。由于其抗性的发展并且不再对控制真菌病害提供任何好处或优势，从引进三唑酮25年之后，部分三唑类化合物从市场上消失了。因此，本发明预期三唑类杀真菌剂单独或与一种或多种具有不同作用方式的杀真菌剂的组合物与草甘膦相混合。草甘膦作用方式是抑制EPSPS酶，通过提供具有不同作用方式的化合物，草甘膦和三唑的混合物可以提供一种防止或降低对杀真菌剂抗性发展的方法，从而延长杀真菌剂用于作物保护的应用。当同时或先后施用时，草甘膦和三唑均提供系统的真菌病害控制作用。本发明提供一种通过结合草甘膦化合物和三唑杀真菌剂化合物的混合物来降低真菌对三唑杀真菌剂的抗性，并且用该混合物处理耐受草甘膦植物的方法。
在1997年随着嘧菌酯(Amistar)引进了一类新的杀真菌剂STAR或嗜球果伞素类杀真菌剂。以及随后的甲基醚菌酯/氟环唑(Allegro)和肟菌脂(Twist)和唑酮菌/氟硅唑(Charisma)，它们是非嗜球果伞素但具有嗜球果伞素类作用。嗜球果伞素类杀真菌剂是基于天然抗真菌化合物的，其中部分森林木材腐烂蘑菇的分泌物以抑制竞争真菌。相对于其它杀真菌产品来说，它们具有新的作用方式。从环境的角度来看，它们也非常安全。不同的制剂和杀真菌剂混合物是市售的，Acanto(Syngenta Corp)以纯的嗜球果伞素(啶氧菌酯)可得，Modem是另一种纯的嗜球果伞素(唑菌胺酯)。Quadris嘧菌酯、Headline啶氧菌酯和唑菌胺酯加上boscalid都是市售的杀真菌制剂。在所有的情形下，纯的嗜球果伞素需要非嗜球果伞素配体。Opera(BASF公司)是预先配制的唑菌胺酯和氟环唑的混合物，Stratego(BayerCropScience)杀真菌剂是肟菌酯和丙环唑的混合物，而Covershield(BASF公司)是唑菌胺酯、氟环唑和甲基醚菌酯的三元混合物。草甘膦的作用方式是系统地抑制EPSPS酶，草甘膦和内吸性嗜球果伞素类杀真菌剂或含有所述嗜球果伞素的杀真菌剂混合物的混合物可以提供一种预防或减少真菌病害，并且发展对杀真菌剂的真菌抗性的方法，从而延长杀真菌剂在作物生产中的应用。因此，本发明预期嗜球果伞素类杀真菌剂单独或与一种或多种具有不同作用方式的杀真菌剂的组合物与草甘膦相混合。本发明提供一种通过结合草甘膦化合物和嗜球果伞素杀真菌剂化合物的混合物来降低真菌对嗜球果伞素杀真菌剂的抗性，并且用该混合物处理耐受草甘膦植物的方法。
氯腈类的杀真菌剂，例如百菌清和chloronil是接触性杀真菌剂，可以有效预防孢子生长和减少菌丝的生长。预期当施用于耐受草甘膦植物时，草甘膦与氯腈杀真菌剂的混合物将有效预防严重的真菌侵染和病害症状。羧酰胺类杀真菌剂例如啶酰菌胺也是接触性杀真菌剂，预期当施用于耐受草甘膦植物时，草甘膦与羧酰胺杀真菌剂的混合物将有效预防严重的真菌侵染和病害症状。接触性杀真菌剂对植物表面提供保护作用，以抑制孢子萌芽或菌丝生长，所加入的草甘膦提供另外的系统保护作用以抑制植物组织中的菌丝生长。
对特定植物病原体有效的施用比率的选择是本领域的普通农业科学家的常识。本领域技术人员同样认识到个体植物的条件，天气和生长条件，以及具体的病原体和所选自的草甘膦组合物将影响本发明实践中所获得的生物效力的程度。所使用的草甘膦组合物的有用施用量取决于所有上述条件。优选地，其施用量将导致植物组织中草甘膦的浓度为约0.01ppm至约100ppm/鲜重。更优选地，介于0.1ppm至25ppm的草甘膦鲜重的组织浓度是在用本发明方法处理的植物组织中获得的。最优选地，约0.1ppm至约10ppm或0.5ppm至约10ppm草甘膦的浓度有效控制、预防或治疗所处理植物中的病害。表1显示当施用草甘膦时，在不同施用剂量比率、不同处理次数(Trt)和不同的植物发育阶段下，在不同耐受草甘膦作物(RR，RoundReady，Monsanto公司的注册商标)中观察到的草甘膦残留分析(大豆中的R1是首次开花，PH是xxx；在玉米中V4和V8是叶片的数量；在棉花中OT是PD，并且PH如上；在水稻中If是叶片，pan ini是引发圆锥花序，并且PH如上，在小麦中If是叶片，preboot指在顶部前出现，并且在甜菜中If是叶片)，并且显示经分析的组织和测得的草甘膦的量(Gly(ppm))。
表1.耐受草甘膦作物中草甘膦的残留分析 Trt 组织 草甘膦(ppm)
RR大豆 3×0.75lb，V3/R1/PH 草料 干草 种子 7.60 1.30 0.80
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RR玉米 (GA21) 2×0.75lb，V4/V8 草料 谷粒 干草 0.73 0.07 1.30
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RR棉花 3×1.5lb，OT/PD/PH 种子 1.60
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RR油菜 0.8lb 种子 0.02
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RR水稻 1.5lb 5lf 谷粒 稿秆 0.05 0.05
2×1.12lb，5lf/pan ini 谷粒 稿秆 3.00 3.10
3×1.12lb，5lf/pan ini/PH 谷粒 稿秆 14.80 6.90
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RR小麦 0.75lb，4lf 草料 干草 谷粒 稿秆 2.30 1.20 0.50 0.50
2×0.75lb，4lf/Preboot 草料 干草 谷粒 稿秆 2.60 13.00 7.50 5.30
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RR甜菜 3×0.75lb，2lf/6lf/12lf 顶部 根部 0.40 0.50
3×0.75， 2lf/12lf/12lf+30d 顶部 根部 4.30 6.60
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RR马铃薯 2×1.5lb，2lf/row closure 块茎 4.10
3×1.5lb，2lf/row clo/PH 块茎 8.60
一方面，根据本发明的方法，组合物的施用比率为约0.1磅/英亩至约5磅/英亩的草甘膦有效控制、预防或治疗病原体。但更优选的施用比率范围为约0.5磅/英亩至2.5磅/英亩。最优选的施用比率为约0.75磅/英亩。当草甘膦与杀真菌剂混合使用或草甘膦和杀真菌剂相继使用时，可以降低施用比率以获得最有效的草甘膦和杀真菌剂的有效浓度比率，来提供成本效率的病害控制混合物。本发明证实施用草甘膦和杀真菌剂提供了协同效果。如实施例8中表3中所示，相比2X比率的草甘膦或1X比率的杀真菌剂来说，在1X比率的草甘膦(0.75磅/英亩)后的0.5X比率的杀真菌剂化合物将提供相当的或提高的真菌病害控制作用。预期利用草甘膦和杀真菌剂混合物进一步降低施用比率，这可以有效控制真菌病害。例如，将1X比率的草甘膦与0.4X比率、或0.3X、或0.2X比率或0.1X比率，或介于其中的比率的杀真菌剂相混合可以成本效率地经济地控制真菌病害。此外，混合物中草甘膦比率的降低也可以提供有效地和成本效率地控制真菌病害，例如0.75X比率的草甘膦和0.5X比率杀真菌剂，或0.5X比率的草甘膦和0.5X比率杀真菌剂，或0.25X比率的草甘膦和0.5X比率杀真菌剂，或0.1X比率的草甘膦和0.5X比率杀真菌剂相混合。本发明中预期混合物的比率为0.1X比率的草甘膦和0.1X比率的杀真菌剂，确切的比率可以通过传至病害或病害感染的植物组织的各化合物的有效量，并且根据化学制剂和施用于控制植物真菌病害的本领域技术人员来确定。
将草甘膦组合物施用于植物叶片优选通过喷雾，利用用于喷雾液体的任何常规工具如喷嘴或旋转盘喷雾器来完成。本发明的组合物可用于精耕农业技术，其中装置用于改变施用于不同大田部分的外源化学物质的量，这取决于多种因素，例如尤其是存在的植物种类，植物生长阶段，土壤湿度状况等。在这种技术的一个方面，用喷雾装置操作的全面定位系统可以用于控制施用对不同大田部分所需量的组合物。
草甘膦组合物优选稀释至足以利用标准农业喷雾装置来容易地喷洒。本发明适宜的施用比率根据多种因素而变化，包括活性成分的类型和浓度，以及所涉及的植物品种。通过喷雾施用，将含水组合物施用至大田叶片的有用比率可以在范围为约25至约1,000升/公顷(l/ha)，优选约50至约300l/ha。
III.植物
在本发明的一方面，提供一种施用草甘膦组合物以控制、预防或治疗病害的方法，导致减少对杀真菌剂处理的植物或植物部分的需求，从而降低材料成本、劳动力和环境污染，或延长这些植物产品(如水果、种子等)的保质期。在该方法优选的方面，草甘膦组合物进一步包含杀真菌化合物。术语“植物”包括整个植物及其部分，包括但不限于芽类无性器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花卉及花的器官/结构(如，苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、果瓣、花粉囊和胚珠)，种子(包括胚胎、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)，植物组织(如维管组织、基本组织等)和细胞(如保卫细胞、卵细胞等)，以及它们的产物。可以用于本发明方法中的植物种类包括高级和低级植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)，裸子植物、蕨类植物、马尾类植物、裸蕨植物、lycophytes、苔藓类植物和多细胞藻类。优选地，用于本发明方法中的植物包括任何维管植物，例如单子叶或双子叶植物或裸子植物，包括但不限于，苜蓿、苹果、拟南芥、香蕉、大麦、油菜、蓖麻子、菊花、三叶草、可可、咖啡树、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰、薯蓣属、桉树、牛毛草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、香瓜、芥菜、燕麦、油棕油、油菜、木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆属、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、西红柿、草坪草、小麦以及蔬菜作物如莴苣、芹菜、椰菜、花椰菜、葫芦；水果及坚果树种如苹果、梨、桃、橙、柚、柠檬、酸橙、杏、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，如葡萄、猕猴桃、蛇麻草；果实灌木和荆棘，如树莓、黑莓、醋栗；森林树木，如岑树、松木、杉树、枫树、橡树、栗子树、popular；其中优选苜蓿、油菜、蓖麻子、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻子、芥菜、棕榈油、油菜、花生、马铃薯、大米、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、西红柿和小麦。更优选的是，用于本发明方法中的植物包括任何作物，例如饲料作物、油料作物、谷类作物、果类作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草类作物、制糖作物、饮料作物和林木作物。在高度优选的方面，用于本发明方法中的作物为大豆植物。另一个高度优选的方面，作物为小麦。另一个高度优选的方面，作物为玉米。另一个高度优选的方面，作物为棉花。另一个高度优选的方面，作物为苜蓿。另一个高度优选的方面，作物为甜菜。另一个高度优选的方面，作物为水稻。另一个高度优选的方面，作物为马铃薯。另一个高度优选的方面，作物为西红柿。
在优选的方面，该方法使用耐受草甘膦的植物。这类植物包括已被改良成耐受草甘膦的作物。这类植物可以通过传统培育技术或现代培育技术如遗传工程来改良。在本发明的优选方面，本方法中使用的植物是表达提供对草甘膦耐受的基因的转基因植物。草甘膦耐受性可通过重组DNA技术赋予植物品种，该技术在本领域有描述(例如描述于美国专利号5,312,910；5,310,667；5,463,175中)。优选地，草甘膦耐受性是通过嵌入将改良或天然存在的5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸酯合酶(EPSPS)编码进入植物基因组的基因所引起的。相比较植物中天然的EPSPS而言，由于受到草甘膦的抑制较少，改良的EPSPS赋予对植物的草甘膦耐受性。编码改良的EPSPS的基因来源可以是对草甘膦天然发展为EPSPS抗性的菌株，所设计用以编码改良的EPSPS的合成的双链脱氧核糖核酸，或任何其它来源。
例如，EPSP合酶基因已从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株CP4分离出来，其对草甘膦具有较低的敏感度(美国专利5,633,435)，当在植物中表达为转基因时，赋予植物高水平的草甘磷耐受性。此外，其它EPSPS变种具有较低的草甘膦亲和力，因此也描述了存在草甘磷时保留其催化活性(美国专利4,940,835和5,094,945)。这些变种通常具有比野生型的EPSPS酶更高的对草甘膦的Ki值，这赋予显性草甘膦耐受性表现型，但这些变种也以对PEP具有高Km为特征，这使得酶动力效率更低(Kishore和Shah，Ann.Rev.Biochem.(1988)57：627-663；Sost等，FEBS Lett.(1984)173：238-241；Shulze等，Arch.Microbiol.(1984)137：121-123；Kishore等，Fed.Proc.(1986)45：1506；Sost和Amrhein，Arch.Biochem.Biophys.(1990)282：433-436)。此外，通过将EPSPS融合至叶绿体转运肽(CTP)以在质体中靶向表达，在大量的作物中获得高水平的草甘膦耐受性。植物中的草甘膦耐受性还可以通过植入植物基因组中的DNA分子来获得，所述分子导致野生型EPSPS的高水平生产(Shah等，Science 233：478-481(1986))。在本发明方法中获得草甘膦耐受性的尤其优选的方法涉及允许在植物组织中保存草甘膦的基因，所述植物组织受到植物病原体侵染。
预期用于本发明方法中的转基因的耐受草甘膦作物品系包括玉米、棉花、大豆、甜菜、苜蓿、小麦，以及其它作物，这些表达赋予草甘膦耐受性基因的作物已经商品化或正在商品化开发阶段，例如，Roundup Ready棉花1445(美国专利号6,740,488)、Roundup Ready玉米GA21和nk603(美国专利号6,825,400)和Roundup Ready甜菜(美国专利公开20040172669A1)、和Roundup Ready油菜RT73(US20040018518A1)、和Roundup Ready大豆40-3-2。Monsanto公司，St Louis，正在研发的其他Roundup Ready作物，MO包括小麦MON71800(美国专利号6,689,880)、高产的Roundup Ready棉花88913(WO 04/072235)、Roundup Ready苜蓿J-101和J-163(WO04/070020)和ASR368剪股颖(WO 04/053062)。表达耐受草甘膦基因的其它植物品种的转基因品系的生产可以通过本领域已知的技术生产，例如参见美国专利5,312,910；5,310,667；5,463,175。
“转基因植物”指含有在相同品种变种或栽培品种的野生植物中未发现的遗传物质的植物(即“外源”)。遗传物质可以包括转基因、插入突变体(如通过转座子或T-DNA插入突变)，激活标记序列、突变序列、同源重组体或通过嵌合修复术改良的序列。典型地，外来遗传物质已被人工操作引至植物中，但是可以使用本领域技术人员认可的任何方法。
转基因植物可以含有表达载体或表达盒。表达盒(expressioncassette)典型地包含编码多肽的操作连接的序列(即在其调节控制下)，以适当诱导或组成调节允许表达多肽的序列。表达盒可以通过转化或转化亲本植物后育种来引入到植物中。上述的植物指整个植株，包括秧苗和成熟的植株，以及植物部分，例如如种子、果实、叶或根、植物组织、植物细胞或任何其它植物材料如植物外植体，以及它们的后代，并且对于体外系统来说，指模拟生物化学或细胞组分或细胞中的部分。
用于本发明的植物或植物部分包括植物发育的任何阶段的植物。
优选地，在萌芽、秧苗生长、营养生长阶段和再生生长阶段期间进行施用。更优选的是，在营养生长和再生生长阶段期间进行本发明的施用。本文中的营养生长和再生生长阶段也指“成年”或“成熟”植物。
IV.病原体
本发明的方法发现了可用于控制、预防或治疗多种植物病原体的应用。本发明的方法包括对植物病原体侵染的预防性的抑制和治疗性的处理。优选地，本发明的方法抑制或治疗植物病原真菌和细菌。在本发明方法中受到抑制的植物病原体优选包括通过莽草酸生物合成途径产生芳族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的病原体。草甘膦与酶的化学抑制剂的组合可以起到扩大对草甘膦抑制作用敏感的植物病原体谱的作用，所述酶是代谢草甘膦，代谢或氧化莽草酸或3-磷酰莽草酸(例如奎宁-莽草酸脱氢酶)，或预防螯合草甘膦的植物病原体的。植物病原体可以通过其与植物寄主有关的生命周期来进行分类，这些分类包括：专性寄生物、兼性寄生物和兼性腐生物。专性寄生物仅能通过从活的植物细胞获得营养来存活和再生，并且直接与这些细胞相接触，植物的专性真菌寄生物的例子包括但不限于锈菌目(锈菌)、黑粉菌目(黑穗菌和bunts)、白粉菌(白粉)和卵菌(水霉菌和霜霉)。兼性寄生物是通常以其它生物体或死亡生物体的产品上的腐生产品而存在的生物体，但是当条件有利时，其可以变成寄生的。兼性腐生物是通常以植物的寄生物而存在的生物体，但当不能获得敏感性植物寄主时，其可以以腐生物来生存。
本发明的方法可以用于控制、预防或治疗多种植物病原体的侵染，所述植物病原体包括专性寄生物、兼性寄生物和兼性腐生物，其中包括但不限于如下：子囊菌类真菌如黑星菌属、柄球菌属、白粉菌属、Monolinia、蔓枯菌属和钩丝壳属；担子菌类真菌，如锈菌属、丝核菌属和柄锈菌属；半知菌类真菌，如葡萄孢属、小黑菌核病菌属、喙孢霉属、镰刀菌属(即F.monoliforme)、壳针孢属、尾孢属、链格孢属、梨孢属和假尾孢属(即小麦基腐病菌)；卵菌类真菌，如疫霉属(即寄生疫霉、P.medicaginis、大豆疫霉菌)、霜霉属(即烟草霜霉菌)、盘梗霉属、腐霉属和单轴霉属；以及其它真菌，例如指疫霉菌(Scleropthora macrospora)、Sclerophthora rayissiae、Sclerosporagraminicola、高粱霜霉病、菲律宾霜霉病、甘蔗霜霉病、玉米霜霉病、玉米壳锈菌、玉米灰斑病、高梁炭疽病、小麦赤霉病、玉米大斑病菌、Kabatiellu zeae和玉米小斑病菌；以及细菌如丁香假单细胞菌、烟草假单胞杆菌、水稻欧文氏杆菌；以及支原体、类支原体、立克次氏体和类似立克次氏体的生物体，例如皮尔斯病害、苜蓿矮化病、伪桃病、紫苑黄化病、Peach X-disease、玉米矮化病和桃黄化病。尤其优选的病原体包括但不限于：柄锈菌、丝核菌、GGT、条锈病、亚洲大豆锈病(豆层锈菌)、镰刀菌、轮枝菌、灰色叶斑病、疫霉菌和玉米锈病。
因此，控制、预防或治疗的病害包括，例如苜蓿植物的病害如根腐病(Phytophora medicaginis，P.megasperma)；水稻植物的病害如稻瘟病(稻瘟病菌)、长蠕孢叶枯病(水稻长蠕孢属，水稻旋孢腔菌)、恶苗病(藤仓赤霉菌)、禾生腐霉菌(根霉属菌)、纹枯病(立枯丝核菌)等，燕麦病害如冠锈病(冠锈病菌)等，大麦的病害如白粉病(白粉菌)、叶枯病(Rhynchsporium secalis)、叶斑病(小麦根腐病菌)、黄斑病(大麦条纹病，禾内脐蠕孢)、网斑病(Pyrenophra teres)、麦类黑穗病(小麦网腥黑粉菌)、散黑穗病(裸黑粉菌)等，小麦的病害如白粉病(白粉菌)、颖斑病(颖枯球腔菌，颖枯病病菌)、条锈病(条锈病菌)、枯萎病(肉孢核瑚菌)、眼斑病(假尾孢菌)、雪霉病(伯劳氏蠕孢丛赤壳菌，雪腐镰刀菌)、茎锈病(柄锈菌)、黑雪枯萎病(雪腐菌核病菌)、疤病(小麦赤霉病菌)、叶锈病(隐匿柄锈菌，担子菌纲锈菌)、条纹病(小黑菌核病菌)、烂黑穗病(小麦网腥黑粉菌)、斑点叶枯病(壳针孢菌)、散黑穗病(黑粉菌菌)等；玉米的病害如苗猝倒病(德巴利腐霉)等；黑麦的病害如紫雪霉病(雪腐镰刀菌)等；马铃薯的病害如晚疫病(蔓延疫霉)等；烟草植物的病害如霜霉病(烟草霜霉)、根腐病(烟草寄生疫霉)、叶枯病(烟草蛙眼病)、花叶病(烟草花叶病毒)等；糖用甜菜的病害如叶斑病(甜菜褐斑病菌)、苗猝倒病(德巴利腐霉、立枯丝核菌、瓜果腐霉菌)等；辣椒的病害如灰霉病(灰色葡萄孢菌)等；菜豆的病害如灰霉病(灰色葡萄孢菌)、核盘霉根腐病(核盘霉腐菌)(油菜核病菌)、南方枯萎病(伏革菌)等；蚕豆的病害如白粉病(蓼白粉菌、白粉病菌)、锈病(蚕豆锈菌、锈病菌)、灰霉病(灰色葡萄孢菌)等；花生的病害如褐斑病(花生球腔菌)等；卷心菜的病害如猝倒枯萎病(立枯丝核病菌)等；黄瓜的病害如白粉病(苍耳单丝壳菌)、茎基腐病(尖孢镰刀菌)、蔓枯病(蔓枯病菌)、霜霉病(黄瓜霜霉病菌)、灰霉病(灰色葡萄孢菌)、核种腐病(油菜核病菌)、炭疽病(炭疽病毛盘菌)、猝倒枯萎病(尖孢镰刀菌、瓜果腐霉菌、立枯丝核病菌)、花叶病(黄瓜花叶病毒)等；小松菜(komatsuna)的病害如交链孢霉素黑斑病(芸苔生链格孢菌)、根肿病(根肿菌)等；芹菜的病害如大斑型斑枯病(小壳针孢菌)等；萝卜的病害如枯黄病(尖孢镰刀菌)等；番茄的病害如枯萎病(尖孢镰刀菌)、根腐病(致病疫霉菌)、叶斑病(Alternaria solani)、灰霉病(灰色葡萄孢菌)、叶枯病(辣椒疫霉菌)、黑腐病(Alternaria tomato)等；茄子的病害如褐腐病(辣椒疫霉菌)，维管束枯萎病原菌如黄萎病(黄萎病菌)等；大白菜的病害例如黑腐病(Alternaria japonica)、根肿病(根肿菌)等；甜椒的病害例如根腐病(疫霉菌)、灰霉病(灰色葡萄孢菌)等；生菜的病害例如灰霉病(灰色葡萄孢菌)等；柑橘类水果的病害例如荚枯病(柑橘树脂病菌)等；梨的病害例如疤病(黑星病菌)、黑腐病(Alternaria kikuchiana)、褐斑病(梨锈病菌)等；葡萄的病害例如霜霉病(葡萄生单轴霉菌)、灰霉病(灰色葡萄孢菌)、黑腐病(黑星病菌)等，桃子的病害，例如缩叶病(Taphrina deformans)、Shot hole(Mycosphaerella cerasella)等，苹果病害，例如白粉病(Podosphaera leucotria)、Scab(cladsporium carpophilum)、灰霉病(Botrytis cinerea)、黑腐病(Venturia inaegualis)、褐斑病(苹果锈菌)、白根腐病(褐座坚壳菌)、叶斑病(斑点落叶病菌)等；以及其它谷物、水果和蔬菜例如油菜、向日葵、胡萝卜、胡椒、草莓、甜瓜、猕猴桃、洋葱、韭菜、红薯、无花果、梅花、芦笋、柿子、大豆、小豆、西瓜、茼蒿、菠菜、茶叶等的病害。从而，化合物(I.sup.0)或其盐显示出对由如下微生物引起的病害的高活性，尤其是梨孢属、旋孢菌属、弯孢霉菌属、核腔菌属、链格孢菌属和与它们同类的其它微生物。由这些微生物引起的病害实例包括水稻植物的稻瘟病、稻瘟病和谷粒脱色病，大麦的点斑病、条纹病和网斑病，小麦的条纹病和点斑病，玉米叶斑病，马铃薯早疫病，小松菜的交链孢霉素黑斑病，西红柿的叶环斑病及黑腐病，大白菜的黑腐病，梨的黑腐病和苹果孢叶斑病等。
并非所有的植物病原体会对目前的草甘膦组合物制剂的抑制作用同样地敏感。在本发明中现已观察到，在目前市售的制剂对植物病害的作用存在差异。例如图2比较了Roundup WeatherMAX(MonsantoCo.St Louis，MO)和TouchdownTM IQ(Syngenta Corp)的草甘膦制剂，结果表明WeatherMAX比Touchdown提供了更好的病害控制。WeatherMAX是特别配制以提供草甘膦快速吸入植物组织。如果施用于植物的草甘膦被更快地吸收并转移至病原体侵染的位置，将会更有效的抑制与植物细胞和组织(例如维管组织)接触，并且与植物细胞或组织交换化学品的植物病原体。本发明人预期可以对目前的制剂进行改进，以提供用于控制耐受草甘膦植物上的病原体的特别配制的草甘膦组合物。目前的制剂是为杂草吸收所设计的，通常用来处理杂草秧苗和快速生长阶段的杂草。预期用于病害控制的草甘膦制剂将会在生长后期施用于作物，例如当植物开花或在生产种子或果实的过程中，正是在这些发展阶段使得植物病害对作物产量的影响最大。叶片是为提供植物生长、种子、果实以及储存器官发育所需的光合产物的源组织。保护这些作物叶片免受由于真菌侵染的病害对于保护作物产量是重要的。单子叶作物的顶叶有助于大幅度提高作物产量，保护叶片免受病害在保护单子叶作物产量中是尤其重要的。双子叶作物叶片通常提供与植物结果结构紧密相关的光合作用的产物，保护这些叶片免受病害在保护双子叶作物产量中是尤其重要的。根部向植物提供水分和矿物质，保护根部免受病害在保持作物产量中是尤其重要的。改善制剂吸收性(包括局部吸收性和整株植物吸收性)吸入可以包括加入助剂，例如烷氧基化脂肪胺、有机硅氧烷类、壬基苯酚环氧乙烷缩聚物和其它本领域已知的助剂。提高草甘膦吸收性和效力的适宜助剂的实例包括聚氧化烯醇烷基胺、聚氧化烯烷基铵盐、聚氧化烯烷基胺氧化物、聚氧化烯叔和季醚胺、聚氧化烯醚胺氧化物、单-和二-(聚亚氧烷基醇)磷酸酯、聚氧化烯烷基醚以及它们的组合物。优选的助剂为聚氧化乙烯可可和牛脂胺，聚氧化乙烯C8-18烷基氧基丙基胺、聚氧化乙烯C16-22烷基醚以及它们的组合物。这些助剂的实例可见美国专利号：5,668,085、5,683,958、5,703,015、6,063,733、6,121,199、6,121,200、6,184,182、6,245,713、6,365,551、RE37,866，以及美国专利申请公开号US2003/0104943 A1。
进一步预期与表面活性剂相组合的草甘膦制剂也将提高草甘膦对病原体的效果，所述表面活性剂通过将草甘膦保持和散布在叶表面上来提供与叶表面上的植物病原体的更好接触。这些制剂提供用于将草甘膦组合物散布在叶表面并且提高草甘膦接触并且吸入真菌孢子或菌丝体的表面活性剂，从而当病原体接触如此处理过的叶表面时，其也将接触草甘膦。此外，当该制剂与真菌孢子或菌丝体接触时，用于接触杀真菌剂的表面活性剂可以提高草甘膦吸入真菌细胞。
病害抗性的评价可以根据本领域已知的方法来进行。参见Uknes等，(1993)Molecular Plant Microbe Interactions 6：680-685；Gorlach等，(1996)Plant Cell 8：629-643；Alexander等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7327-7331(1993)。本领域技术人员会认识到，用于测定由植物病原体所致植物侵染和病害的方法取决于病原体和待测试的植物。
如下所包括的实施例用以说明本发明的各方面。本领域技术人员应当理解的是，在实施例中所公开的由本发明人发现的如下具有代表性的技术在本发明实践中起到良好作用，并且从而可以认为组成了其实践的优选方式。然而，根据本说明书的公开内容，本领域技术人员应当理解的是可以在已公开的具体方面进行许多改变，并且这些改变仍旧获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
具体实施方式
实施例
实施例1：草甘膦对植物病原体的体外作用
体外筛选认为草甘膦是一种非常弱的控制一系列病原有机的杀真菌剂。表2显示，当多种真菌植物病原体在含有不同浓度的草甘膦的生长介质上生长时，来测定EC90浓度(浓度为90％具有的例如抑制真菌细胞繁殖或统计学上降低真菌生长水平的最大效力)。这些数据证实了体外抑制真菌生长需要高浓度的草甘膦。因此，当用草甘膦处理时观察耐受草甘膦植物时，出人意外地发现了显示对真菌病害抗性的结果。表1中所示的草甘膦残留分析暗示对于有效抑制真菌病原体来说，植物组织中的草甘膦水平太低了。当病原体与植物细胞接触的时候，真菌病原体对于草甘膦效果的敏感性可能会改变。在真菌病原体和寄主植物细胞之间发生的化学交换允许草甘膦进入真菌细胞，这在体外试验中不明显。
表2.草甘膦对真菌细胞生长的体外效力 真菌 体外EC90，ppm 作物
壳针孢菌 ＜100 小麦
假尾孢菌 ＜100 小麦
葡萄孢菌 ＜100 蔬菜/草莓
丝核菌 1000 马铃薯/大豆
疫霉菌 1000 小麦/马铃薯
镰刀菌 1000 小麦/马铃薯
顶囊壳菌 1000 小麦
柄锈菌 5000 小麦
梨孢菌 5000 水稻
实施例2：在耐受草甘膦小麦中的病害治疗
将水、表面活性剂(0.1％的溶液)、草甘膦制剂(WeatherMAX(草甘膦钾盐)、UltraMAX(草甘膦IPA盐)的组合物，或无表面活性剂(IPA-盐)的草甘膦组合物在不同生长阶段施用于耐受草甘膦小麦植物，所述植物预先用叶锈病(小麦锈病菌)接种过，以测试病害控制。将3、5和7叶期的小麦植物用小麦锈病菌孢子接种并且进行培养以让孢子萌发。
在用上述组合物处理后1天(1DAT)，对植物进行病害评价。此外，将5叶期的小麦植物用作未处理对照。
所有的十一(11)株未处理的小麦植物显示了严重的叶锈病症状。8株水处理的小麦植物(3叶期)中的7株显示病害症状。同样地，在3叶和7叶期用表面活性剂处理的植物显示几乎完全的病害侵染。8株3叶期小麦植物中的6株在1DAT显示病害症状，同时所有4株7叶期小麦植物显示病害症状。
相反，用草甘膦组合物处理的植物显示显著的完全的病害控制。利用1X比率(等于0.75磅/英亩，通过第5叶)施用的比率获得病害处理。在小麦植物的5叶期用1X草甘膦组合物(RoundupWeatherMAX制剂)进行处理，11株经处理的植物均未显示病害症状。在用1X的Roundup WeatherMAX施用处理后，在3叶期植株中，8株经接种的植物中均未显示病害症状，7叶期的4株经接种的植物中均未显示侵染症状。
这些结果证实草甘膦组合物可以用于在耐受草甘膦小麦植物中治疗真菌侵染，例如叶锈病。
实施例3：组织中草甘膦的浓度和病害预防的关系
为了确定植物组织中草甘膦的浓度和病害控制之间的关系，在用柄锈菌孢子接种前，用草甘膦组合物处理耐受草甘膦的小麦植株。采用四种不同的方案。首先，将3叶或5叶期的整株植株用1X的WeatherMAX Roundup草甘膦组合物喷雾处理。在施用草甘膦后1天或14天，用柄锈菌孢子接种每个所处理植物的一片成熟叶片。随后将经接种的植物在100％相对湿度下培养24小时以萌发孢子。接种后12天，评价病情，测定植物组织中的草甘膦浓度。病情可以根据脓疱的发展和病变的发展宏观地进行评价。
草甘膦处理后1天和处理后14天接种都可以预防病害症状。图1显示，未用草甘膦处理的对照植物在接种后12天显示约25％至约30％的脓疱发展。相反，用草甘膦处理的植物在接种后12天显示低于1％的脓疱发展。
此外，病害预防与组织中草甘膦的浓度直接相关。例如，组织中草甘膦的浓度为20至80ppm时预防脓疱和病变的发展，同时低至约10ppm的草甘膦预防脓疱的发展。用14C草甘膦处理的叶片的自动射线照相证实草甘膦浓度均匀分布在接种叶片上。
实施例4：RoundupWeatherMAX制剂与TouchdownTM IQ制剂的比较
多种草甘膦制剂是市售的。本发明人预期这些制剂在其影响真菌病害发展的能力方面可以会不同。为控制小麦叶锈病，在RoundupReady小麦上进行的以预防或治疗施用的WeatherMAX和TouchdownTM IQ比较结果如图2所示。制剂的施用比率为1/8X到1X。在用锈菌孢子接种后1天(1DAI)或接种后三天(3DAI)进行处理。在接种后10天通过确定叶片侵染百分比来测定锈病。证实两种制剂都具有降低叶片侵染百分比的能力，WeatherMAX制剂比TouchdownTM制剂提供了更大有利之处，更低的剂量比率。本发明提供将WeatherMAX制剂及其有效施用比率用于耐受草甘膦植物上处理真菌病害的用途。预期其它的草甘膦制剂提供增强的耐受草甘膦植物吸收或增强的植物病原体的吸收，特别是真菌病原体。
实施例5：用于预防病害的草甘膦的移动
利用大田施用条件和使用比率，将14C-草甘膦喷洒至小麦植物的整个顶部。从喷雾中隔离出顶部完全展开的叶片(一片)(未处理的叶片)。用草甘膦处理后1天(1DAT)，用柄锈菌孢子人工侵染未处理的叶片，以产生叶锈病。
用柄锈菌接种后11天(DAI)的分析显示，随着喷雾剂量的增加发病率降低。在隔离叶片中的草甘膦分析显示，在0或11DAI，随着组织中的草甘膦的增加病害减少。在1.3ppm草甘膦下，喷雾施用1/2X比率的Roundup，获得完全的病害预防。由于未处理叶片从喷雾中隔离，在组织中的草甘膦确实源于从韧皮部的迁移。结果表明，韧皮部-移动草甘膦与所观察到的病害预防相关，并且锈菌病原体是通过草甘膦与与含有系统移动的草甘膦的植物组织相接触而获得的。
实施例6：系统获得抗性
为了测试病害控制、预防或治疗与诱导系统获得抗性(SAR)的关系，进行了本文所述的时间过程RNA印迹(Northern blot)分析。
将耐受草甘膦的小麦植株(3-4叶期)分为三(3)组，并且用如下组合物之一进行喷雾：来自Roundup(WeatherMAX)、RoundupWeatherMAX(0.75磅/英亩)或INA(2，6-二氯异烟酸，在0.1％表面活性剂空白中浓度为200ppm)的0.1％表面活性剂空白。引入SAR基因处理后0至144小时，从三种处理各取样一半的植物。
在用三种组合物之一处理后1天，用叶锈菌孢子(小麦锈病菌)接种剩余的处理植物。将经接种的植物在湿润的房间(dew chamber)中培养24小时。在接种后的0至120小时中的各时间点从接种植物收集叶片组织。
从各样本获得的叶片组织是均匀的，并且按照如下标准方法分离所有的RNA。在琼脂凝胶上分离所有的RNA，并且转至硝酸纤维膜用于Northern杂交。将含有经分离的全部RNA的膜与放射性同位素标记的典型SAR基因、WIR2(PR5)和WCI3杂交。
RNA印迹分析表明PR5基因被诱发于所有3种处理和孢子接种的叶片组织中。然而，用Roundup WeatherMAX处理的植物是唯一未被侵染的植物。Northern结果表明引入PR5诱导基因与病害控制不相关，从而其不是造成叶锈病抗性的原因。WCI3基因是通过INA处理诱发的，但叶未赋予叶锈病抗性。Northern结果表明引入测试的SAR基因与在RR小麦中的叶锈病抗性不相关。
实施例7：草甘膦作为侵染后处理
为确定草甘膦是否能治疗侵染后的病害，用锈菌孢子接种耐受草甘膦小麦植株(3叶期)的顶叶。根据所使用的处理，随后让孢子萌发。使用7种处理：1)不处理，2)接种孢子前表面活性剂处理，3)在接种孢子后、但孢子萌发前用表面活性剂处理，4)在接种后、但萌发前用1X的草甘膦处理，5)萌发后(接种后0天(DAI))用1X的草甘膦处理，6)在1DAI用1X的草甘膦处理，和7)在4DAI(病害仍然存在)用1X的草甘膦处理。11DAI平估病害率。
未处理或仅用表面活性剂处理的植物叶片显示介于10％和约25％之间的侵染水平，如图1所示。相反，用草甘膦处理的植物未显示侵染或所存在的侵染不进一步发展。例如，在4DAI用1X比率草甘膦处理的植物显示不再发展脓疱，其中在处理时已经存在病害。相反，未处理的植物基本上显示了脓疱的发展。这些结果表明草甘膦组合物可以用于治疗植物中真菌侵染。
实施例8：草甘膦用于控制、防治或治疗大豆锈病
亚洲大豆锈病是一种严重的大豆叶面病害，其在种植大豆的亚洲出现，但是近年来更多地出现在南非、巴拉圭、阿根廷和巴西。引起亚洲大豆锈病的真菌，即豆层锈菌已经在美国本土发现。草甘膦组合物用于控制、预防或治疗大田条件下的耐受草甘膦的大豆植株(RR)中的病害。
将单次施用比率的Roundup(lX＝0.75磅ae/英亩或0.84公斤ae/ha)或多次施用量分时间施用于易受锈病影响的大豆品种。用Roundup处理的植物不用任何杀真菌剂处理，并且让亚洲大豆锈病自然侵染。此外耐受草甘膦的大豆植株可以生长在温室中，并且人为地用孢子侵染以引起病害侵染。
对于将草甘膦组合物用于耐受草甘膦大豆植物以控制、预防或治疗锈病而言，观察经处理和未处理植物的病害率和所获得的结果。与常规的大豆相比，RR大豆(约在V4阶段喷雾)中锈病的发展延迟7-10天。在早期的观察中，与常规的大豆相比，RR大豆中的锈病严重度更低。在多种RR大豆品种中，以及在巴西的多种大田场所观察到该结果。在生长季节，通常低至中等比率的草甘膦处理提供降低亚洲大豆锈病的病害率。
在巴西的温室中进行研究，以确认早期的大田观察和测试草甘膦和杀真菌剂组合处理的作用。用草甘膦和杀真菌剂(Opera)处理两种含有40-3-2转基因插入的Roundup Ready大豆栽培品种，RR8000和RR8045。该处理(trt)为处理1：无草甘膦喷雾并且无Opera杀真菌剂，处理2：在V3(V3＝第三个植物叶片期)开始每两周施用1X比率的草甘膦，无Opera杀真菌剂，直至最终的病害评价；处理3：在V3开始每两周施用2X的草甘膦，无Opera杀真菌剂，直至最终的病害评价；处理4：在V3开始每两周施用1X的Opera(根据制造者的标签)，无草甘膦，直至最终的病害评价；处理5：在V3开始每两周施用0.5X的Opera，无草甘膦，直至最终的病害评价；处理6：在V3开始每两周先后喷雾1X的草甘膦、0.5X的Opera，直至最终的病害评价。结果如表3所示。用处理1无喷雾处理的RR8000和RR8045栽培品种的植物分别显示81.7％和93.3％的锈病。用1X草甘膦处理的处理2显示高达56天时间点降低了锈病百分比；用2X草甘膦处理的处理3显示在最初三个时间点对RR8000和RR8045的高水平的病害减少作用，在56天时间点增至30.0％和73.3％。用1X Opera处理的处理4在所有的时间点在两种栽培品种中都显示了高水平的病害减少作用。用0.5X Opera处理的处理5在最初两个时间点显示了高水平的病害控制作用，随后在56天时间点增至30.0％和33.3％。用1X草甘膦加上0.5X Opera处理的处理6显示高水平的病害控制作用，尤其是在42和56天的时间点。这些结果表明草甘膦处理控制耐受草甘膦的大豆中的大豆锈病，并且当与杀真菌剂组合处理时其作用是增效的。
表3.草甘膦(glyp)和Opera杀真菌剂对两种经处理的RoundupReady大豆栽培品种上的亚洲大豆锈病的病害百分比的作用的温室研究 RR 栽培品种 14天-1 次喷雾 28天-2 次喷雾 42天-3 次喷雾 56天-4 次喷雾
RR8000 处理1没有喷雾 40.0 56.7 71.7 81.7
处理2 glyp 1X 23.3 41.7 48.3 88.3
处理3 glyp 2X 10.0 10.0 10.0 30.0
处理4 Opera 1X 3.3 3.3 6.7 13.3
处理5 Opera.5X 10.0 10.0 23.3 30.0
处理6 glyp1X+O.5X 10.0 10.0 10.0 13.3
RR8045 处理1没有喷雾 56.7 71.7 81.7 93.3
处理2 glyp 1X 50.0 56.7 71.7 86.7
处理3 glyp 2X 3.3 10.0 13.3 73.3
处理4 Opera 1X 6.7 10.0 16.7 16.7
处理5 Opera.5X 10.0 13.3 26.7 33.3
处理6 glyp1X+O.5X 3.3 10.0 13.3 13.3
进行大田研究以进一步确认温室研究。将相同的栽培品种种植在三个重复小区，并且如温室研究所述进行处理。表4显示的大田研究结果表明草甘膦处理大大降低了由于亚洲大豆锈菌侵染所导致的病害的百分比。当与草甘膦1X比率(23.3％)和Opera的0.5X比率处理(21.7％)相比，草甘膦+杀真菌剂处理RR8000显示了降低病害的增效作用(13.3％)。所有的处理有效预防RR8045栽培品种的病害。这些结果进一步提供证据，证实了草甘膦对于在大田环境中控制耐受草甘膦大豆中的亚洲大豆锈病是有用的，并且草甘膦和杀真菌剂的混合物是尤其有效的。
表4.草甘膦(glyp)和Opera杀真菌剂对两种经处理的RoundupReady大豆栽培品种上的亚洲大豆锈病的病害百分比的作用的大田试验 栽培品种 处理 病害％
RR8000 没有喷雾 50.0
glyp 1x 23.3
glyp 2x 10.0
Opera 1x 6.7
Opera.5x 21.7
glyp1x+O.5x 13.3
RR8045 没有喷雾 60.0
glyp 1x 0.0
glyp 2x 1.7
Opera 1x 0.0
Opera.5x 0.0
glyp 1x+O.5x 3.3
将Roundup WeatherMAX(WMAX)与杀真菌剂、杀虫剂或二者的桶混物用于大豆测试。在南美洲大豆锈病是一种严重的病害，并且在在美国也受到严重关注。进行测试以研发用于将草甘膦的WMAX制剂与如表5所列的用于杂草控制和大豆锈病控制的多种市售杀真菌剂的混合物的使用方法。在使用耕作或Roundup WMAX减少杂草之后，在大田中种植Roundup Ready大豆。待种植约3周后，所有的小区接受Roundup WMAX的苗后植物施用。在大豆发育的R1阶段(第一花期)，将WMAX单独或WMAX+杀真菌剂的混合物用于处理小区，处理列于表5中。待R1处理后7和21天获得杂草控制的百分比数据，大豆安全性(坏死％、萎黄病、生长率)：处理后5天，进行病害评定，以及大豆产率评定(蒲式耳/英亩)。这些混合物和处理旨在同时对大豆提供杂草和害物控制作用，例如真菌害物控制如大豆锈病；以及昆虫害物控制如蚜虫控制。
表5.草甘膦加上农药的混合物(杀真菌剂和杀虫剂) 混合物号 R1，开花 R1后14至21天
1 WMAX
2 WMAX
3 WMAX+Quadris
4 WMAX+Bravo
5 WMAX+Stratego
6 WMAX+Tilt
7 WMAX+Folicur
8 WMAX+Headline
9 WMAX+Quadris
10 WMAX+Bravo
11 WMAX+Stratego
12 WMAX+Tilt
13 WMAX+Folicur
14 WMAX+Headline
15 WMAX+Warrior+Quadris
16 WMAX+Warrior
以适用于安全储存、运输和分装，稳定化学组合物，与溶剂相混合并且指导使用的容器中来提供农业化学品。本发明提供一种草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的混合物，或草甘膦化合物和杀虫剂化合物的混合物，或草甘膦化合物和杀真菌剂化合物和杀虫剂化合物(Warrier)的混合物的容器。该容器还进一步提供有效使用混合物的说明。本发明的容器可以是适用于储存化学品混合物的任何材料。本发明的容器可以是适于船运化学混合物的任何材料。所述材料可以是纸板、塑料、金属或这些材料的复合物。该容器可以具有的体积为0.5升、1升、2升、3-5升、5-10升、10-20升、20-50升或根据需要的更大的体积。提供草甘膦化合物和杀真菌剂化合物的桶混物，将其施用至作物以达到各化合物的有效剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且可以根据作物、气候条件和所使用的施用装置来改进和进一步发展的。
实施例9：草甘膦用于预防或控制玉米锈病
玉米锈病菌是引起玉米中普通型锈病的真菌，而南方型锈病是由多堆柄锈菌导致的。进行大田试验以确定是否草甘膦处理RoundupReady玉米nk603杂交品种和自交品种能降低由玉米锈病导致的病害率。用普通型锈病孢子或南方型锈病孢子接种耐受草甘膦的玉米植物和非耐受草甘膦的对照植物。
以30磅/平方英寸，用2号喷嘴boom(8002喷嘴)从CO2背式喷雾器中，以RoundupWeatherMAX制剂(4.5lbs./Gal，49％a.i.)来施用草甘膦。在接种前(处理#1，在接种锈菌孢子前约5小时)、接种后14天(处理#2)，和接种后28天(处理#3)进行处理。在每次处理时间，将草甘膦以2X比率(1.5lb./A)和3X比率(2.25lb./A)来施用草甘膦。在试验小区中测试两种杂交玉米系列(DKC53-33和DKC60-09)和两种自交玉米系列(87DIA4NK603A和90DJD28NK603A)。小区大小为2行，每行10次重复＝20行/处理，每行2.5英尺＝50英尺宽，15英尺长＝750平方英尺，43560平方英尺/英亩＝0.0172英亩/处理。病害等级采取从1到9的等级，其中1＝抗性，并且9＝敏感。用于该分析中的等级是最后三个等级数据的平均值(约接种后5周，接种后7周和接种后9周)。
杂交玉米的测试结果表明，对照小区的平均病害等级为4.1(对于每一品系)，在2X比率下处理#1的平均病害等级为3.6，在3X比率下平均病害等级为3.0。处理#2和#3具有分别为4.1和3.9的病害等级。自交玉米试验表明，对照小区的平均病害等级为5.0和4.9(对每一品系)，在2X比率下处理#1的平均病害等级为4.0，在3X比率下平均病害等级为3.2。接种后处理显示病害等级为4.4和4.9。
在这些试验中，天然普通型锈病侵染的出现要早于人工接种的锈病侵染，从而该对照(未接种/未喷雾，以及接种/未喷雾)显示大致相同的病害等级。这些结果表明草甘膦处理减少了玉米锈菌病害的严重性，尤其当在侵染过程的早期时施用时。
实施例10：在Roundup Ready棉花中黄萎病的控制
黄萎病是一种侵袭超过300种木本和草本寄主植物的土壤生真菌枯萎病病原体。尤其重要的植物是茄类植物，例如西红柿、马铃薯和茄子。其它重要的作物是苜蓿、向日葵、花生和棉花。大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是引发棉花黄萎病的生物体。
在三种遗传背景下，用Roundup Ready棉花测试草甘膦降低棉花黄萎病病害症状的能力。种植棉花种子，在2和5真叶期用22盎司的WeatherMax Roundup喷洒出苗植物。大约在种植后3个月和4个月观察植物的枯萎症状。经草甘膦处理的植物显示症状减少，并且比相邻的未经处理的小区中的植物更有生命力。与停止生长的未处理的植物相比，经处理的植物继续生长。观察表明，中度黄萎病抗性与具有草甘膦耐受性遗传背景的敏感性棉花系列受益于草甘膦处理，从而降低了黄萎病病害的严重程度。遭受其它棉花枯萎病害特别是镰刀菌枯萎病的棉花植物预期受益于草甘膦处理。
实施例11
植物5-烯醇丙酮酰基莽草酸酯-3-磷酸合酶(EPSPS)对草甘膦非常敏感，动力学研究显示玉米EPSPS对草甘膦具有的Ki是0.5μM，这相当于大约0.15ppm的草甘膦在植物组织中。基于X射线结晶学的EPSPS结构研究已确定催化作用中所涉及的关键氨基酸。这些氨基酸都是高度保守(conserved)的种类，并且用于表征草甘膦和EPSPS之间的相互作用。事实上，现有的4种独特的氨基酸基序已经用于将EPSPS酶分成草甘膦敏感性或抗性变种(美国专利5,633,435)。公共数据库的搜索显示了如表6所示的12种真菌的基因组序列。我们推论并排列真菌EPSPSs的氨基酸序列，并且得出的结论是，所有12种归为草甘膦敏感性。草甘膦敏感性EPSPS的存在对于草甘膦具有控制真菌害物的活性是必需的，尽管在真菌害物细胞中存在的其它过程会影响草甘膦可能具有的效果水平，例如存在草甘膦新陈代谢过程，或草甘膦的传运、或者螯合过程。我们分析的结果表明，真菌很可能具有草甘膦敏感性EPSPS，当用草甘膦组合物处理的时候，其会转化以对真菌细胞生长和发育进行抑制或遏止。
表6EPSPS基因标识 真菌属种类名称 基因标识6320332 酿酒酵母菌 基因标识45201161 棉花假囊酵母 基因标识46444923 白色念珠菌SC5314 基因标识19115593 粟酒裂殖酵母菌 基因标识6226554 构巢曲霉 基因标识44889967 烟曲霉 基因标识38102656 稻瘟病菌70-15 基因标识32415183 链孢霉 基因标识46116890 玉蜀黍赤霉PH-1 基因标识49074134 玉米黑粉菌521 基因标识25005077 水稻纹枯病菌 基因标识2492977 卡氏肺孢子虫菌 基因标识31087950 叶锈病菌
所有出版物、专利及专利申请被引入本文以作参考，引用相同的程度就如同各单个的出版物或专利申请被具体而单个指明被作为参考文献引入一样。