咪唑[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡 嗪酮作为药物的应用 【技术领域】
本发明涉及具有式1结构的咪唑[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮作为活性组分用于治疗勃起机能障碍(阳痿)的应用、其制备方法及其包含这些化合物的药物制剂。
本发明进一步涉及具有式1结构的咪唑[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮作为活性组分用于治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关的血管疾病的应用及其包含这些化合物的药物制剂。现有技术
男性阳痿可定义为无性交能力，因为没有勃起和/或不发生射精。勃起机能障碍是在性交强度或持续时间方面勃起不足时所使用的术语。
大约10％的男性患有勃起机能障碍。在40-70岁年龄的男性尤其受此影响，受影响的人数大约为52％。在全世界，有几百万男性患有该疾病(仅在德国就有大约7.5百万)，大多数病例有器质性原因，极少数人是心理上的原因。勃起机能障碍是老年人，特别是患有其它慢性疾病如高血压、动脉粥样硬化和糖尿病的老年人普遍存在的问题。
尽管各种活性成分都能够引起勃起，但它们仅仅在直接注入阴茎(阴茎海绵体内，i.c.)或滴入尿道(尿道内)发挥作用。这种药物治疗形式已经应用10多年了并且包括i.c.注射血管活性物质如罂粟碱、酚苄明、酚妥拉明、百里胺和前列腺素E1(PGE1)。然而，i.c.给予这些物质通常伴发严重的副作用如阴茎异常勃起、疼痛或阴茎纤维化。PGE1可通过尿道内给予，硝酸甘油和长压定可透皮给予(在阴茎上)。然而，这可在男性及其伴侣之间引起副作用。
另一种药物治疗是通过植入假体进行外科介入治疗。这种治疗形式很少有病人接受，因为已经预期到以后的并发症(感染、血液流动障碍)。
勃起机能障碍治疗地突破是由辉瑞在美国和欧洲投入的sildenafil(Viagra)开始。Sildenafil是一种口服有效的磷酸二酯酶5(PDE5)抑制剂，它不直接引起勃起，但增强阴茎在性刺激下释放的一氧化氮(NO)的作用。如同其第二信使cGMP一样，在海绵体(勃起组织)内，NO的作用是血管扩张，结果可使更多的血液流入，引起勃起。
磷酸二酯酶(PDE)是一族异构酶，迄今为止，可能已经分派出10种不同的异构酶。PDE酶通过水解断裂产生在大量细胞中作为第二信使的3’，5’-一磷酸环鸟苷(cGMP)和3’，5’-一磷酸环腺苷(cAMP)。磷酸二酯酶5(PDE5)是cGMP-特异性的并且在人海绵体组织中占优势。抑制人海绵体组织中的PDE5，导致由NO诱导的的细胞内cGMP水平增加。这引起海绵体平滑肌松弛并因此引起勃起。
PDE5抑制剂因此适用于作为勃起机能障碍适应征的治疗剂。与此有关，尤其需要新的、可用作活性组分口服给予的PDE5抑制剂。
咪唑并[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮作为活性组分治疗勃起机能障碍还是完全未知的。
心血管疾病是全世界最常见的死亡原因之一。在WHO成员国，1998年所有死亡者中有30.9％归因于心血管疾病并且其中13.7％独自地归因于冠心病(世界健康报告1999)。然而，心血管疾病不仅仅影响老年人；相反地，从30岁开始，该病的发生率有所增加。它们不仅削弱病人的生活质量而且由于直接和间接的费用问题，其治疗具有巨大的经济意义。除遗传因素外，心血管疾病的发病机理是多方面的，特别是不适当的饮食和肥胖、滥用酒精和尼古丁以及缺乏体育锻炼。
冠心病是一种常见的病理状态，它包括心绞痛和心肌梗塞。心绞痛是由冠状动脉粥样硬化引起的多因素病理状态。限制血流的冠状动脉狭窄导致心肌灌注不足，表现形式有稳定型或不稳定型心绞痛、无症状心肌局部缺血、局部缺血性心力衰竭、心病性心律失常或急性心肌梗塞。心肌梗塞是由血栓(血凝块)阻断冠状动脉引起的。所述血栓通常滞留在冠状血管的狭窄处。位于该狭窄处后的心肌区不再得到血液供给。根据梗塞的位置，受影响的区域可大可小。基本治疗包括消除已知的危险因素和通过使用乙酰水杨酸或噻氯匹定，采取医学方法抑制血小板聚集。用血管扩张剂如硝酸酯、β-受体阻滞剂或钙通道阻滞剂治疗心绞痛发作，尽管这些可能具有不需要的作用如低血压、血液重分配(窃流现象)或心脏抑制的副作用。能够明确地找出冠状动脉狭窄部位的病人可进行搭桥手术(指标：冠心病/心绞痛。Guideline019/001 of 22 June 1998 of the Deutsche Gesellschaft furKardiologie-Herz-und Kreislaufforschung in derArbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen MedizinischenFachgesellschaften)。
另一重要的疾病是心力衰竭。各种因素导致心脏的泵出量不再足以确保身体中血液和氧的供给。心脏衰竭的三种形式是：右心衰、左心衰和全心心衰。在右心衰中，右心室不再能够将所需要量的血液泵入肺循环。然而，因为血液继续从体循环到达右心，因为左心室继续不间断地工作，血液尾随回到腹部、肝并甚至回到腿部。左心衰是当左室不再提供必需的输出量时所使用的术语。在该情况下，血液充塞在肺中。 在全心心衰的情况下，通常在右心衰或左心衰发生前，两个心室都受到影响。
心脏机能不全的治疗总是首先集中在基本疾病，例如心病性心律失常(和其它心脏病)或高血压的治疗上。另外，通常使用增强心脏功能或减轻心脏负担(根据心脏机能不全的原因)的药物和去水药物(利尿剂、体积减少)进行治疗。通常认定强心甙(例如地高辛、g-毒毛旋花苷)“节省”心脏的活动，并且这些药物可长期服用。磷酸二酯酶3(PDE3)抑制剂增加心肌中一磷酸环腺苷(cAMP)的浓度，因此通过各种cAMP依赖性蛋白激酶增加收缩力。在各种临床研究中已经显示，PDE3抑制剂(氨力农、米力农)清楚地是收缩力增强剂，但连续使用有降低生命预期价值的趋势。因此，该物质仅可用于急性期(持续时间为使用2-3周)治疗。也可以使用β-肾上腺受体激动剂如多巴胺和多巴丁胺，它们具有直接的增强心肌收缩力作用，但仅适用于急性心衰的治疗。
通过使用血管紧张素转换酶抑制剂(ACE抑制剂，例如卡托普利、依那普利)或血管紧张素受体拮抗剂(例如losartan)、选择性α1-肾上腺受体阻滞剂(例如哌唑嗪)或有机硝酸酯降低后负荷。
仅仅在绝对必要的情况下进行心脏移植。这是当所有其它方法都已经失败时的最后选项。尽管移植，包括其它器官移植，目前已经成为一条治疗途径，但心脏移植并非没有问题。
当肺动脉压上升至25mmHg以上时出现肺动脉高血压。这导致发生肺心病(右心室扩大)。原发性高血压的原因是不清楚的。遗传因素或与药物相关的原因是可能的。原发性肺动脉高血压尤其倾向于30来岁的妇女。继发性肺动脉高血压是由毛细管循环受损引起的并且可能具有各种原因。由于在阻塞性肺气肿、气喘危象、肺纤维化或栓塞时肺动脉狭窄，因此发生前毛细血管充血。其治疗包括降低肺动脉压并因此减轻右心室负担。迄今为止可获得的物质仅仅是那些具有非选择性血管扩张作用的物质(ACE抑制剂、Ca通道阻滞剂、二氢吡啶类)或者仅仅在试验中使用(吸入一氧化氮(NO)，依前列醇(PGI2)或prostacycline、腺苷和PGE1，Medical and Surgical Treatment ofAdvanced Pulmonary Hypertension by Kenneth W. Presberg，Division of pulmonary and Critical Care Medicine，MedicalCollege of Wisconsin，Thoracic Medical and SurgicalManagement，Volume III，Number 2 1996).
磷酸二酯酶(PDE)是一族异构酶，迄今为止，可能已经分派出10种不同的异构酶。PDE酶通过水解断裂产生在大量细胞中作为第二信使的3’，5’-一磷酸环鸟苷(cGMP)和3’，5’-一磷酸环腺苷(cAMP)。磷酸二酯酶3(PDE3)是cAMP-特异性的，而磷酸二酯酶5(PDE5)是cGMP-特异性的。
正如已经描述过的，在已知的磷酸二酯酶抑制剂中，迄今为止只有几个选择性PDE3抑制剂发现具有有限的治疗心衰作用。
本发明涉及具有式1结构的咪唑[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮作为活性组分在治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关的血管疾病中的应用，它同时并且较强地抑制PDE3和PDE5。抑制心肌中的PDE3导致以一种已知的的方式增加心脏的收缩力(正性肌力作用)。抑制PDE5导致血管特别是动脉血管扩张并因此，例如减少冠状血管或肺动脉的血管阻力。
先前还没有公开过并且首次由本发明式1化合物在技术上实现了同时利用两种作用原理，即通过一种和相同的活性组分引起动脉血管扩张，从而获得对心脏的正性肌力作用和降血压作用。
作为PDE3和PDE5的双重抑制剂，咪唑[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮还是完全未知的。
欧洲专利0 400 583涉及具有下列通式的咪唑喹喔啉其中A代表7或8位的氮原子或CH，B和D代表氮原子或CH或者取代的碳原子，并且其它基团R、R1、R2代表氢或各种有机的取代基。这些化合物具有血管扩张作用。
除各种咪唑并[1，2-a]喹喔啉酮之外，D.D.Davey等人(J.Med.Chem.34(1991)，2671-2677)也已经描述了具有下式结构的2-咪唑[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮其中一方面R1代表氢并且R2代表C2H5，另一方面R1代表2-甲基咪唑并且R2代表CH3。两个化合物的特性都是作为具有正性肌力作用的PDE3抑制剂。
专利申请W0 93/20077涉及具有下式结构的咪唑并喹喔啉酮其中A代表环中具有2个或3个氮原子的5-元杂环，R1可以是NO2或CF3并且X代表具有不超过4个链成员的各种链，其中一些包含氮。
这些化合物作为具有治疗精神病作用和抗局部缺血作用的谷氨酸盐受体拮抗剂描述。
DE专利195 10 965中要求了具有下式结构的吡啶并[3，2-e]-吡嗪酮。这些也包括咪唑并[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮。然而，其中仅仅当A代表N-R3(R3＝H，C1-6烷基)时，R1是氢。描述了所要求物质的抗哮喘性和抗过敏性。本发明描述
本发明涉及具有式1结构的咪唑并[1，5-a]吡啶并[3，2-e]-吡嗪酮其中
A代表O或NH，
R1、R2和R3可以相同或不同并且代表氢，和
-C1-8烷基，其为直链的或支链的、未取代的或由-OH，-SH，-NH2，-NHC1-6-烷基，-N(C1-6-烷基)2，-NHC6-14-芳基，-N(C6-14-芳基)2，-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)，-NO2，-CN，-COOH，-COOC1-5-烷基，-(C＝O)C1-5-烷基，-F，-Cl，-Br，-I，-O-C1-6-烷基，-O-C6-14-芳基，-S-C1-6-烷基，-S-C6-14-芳基，-OSO2C1-6-烷基，-OSO2C6-14-芳基，具有3-14个环上成员的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的碳环，具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的杂环取代一次或多次的，
-C2-8链烯基，其为单-或多不饱和的、直链的或支链的、未取代的或由-OH，-SH，-NH2，-NHC1-6-烷基，-N(C1-6-烷基)2，-NHC6-14-芳基，-N(C6-14-芳基)2，-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)，-NO2，-CN，-COOH，-COOC1-5-烷基，-(C＝O)C1-5-烷基，-F，-Cl，-Br，-I，-O-C1-6-烷基，-C6-14-芳基，-S-C1-6-烷基，-S-C6-14-芳基，-OSO2C1-6-烷基，-OSO2C6-14-芳基，具有3-14个环成员的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的碳环，具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的杂环取代一次或多次的，
-C2-8炔基，其为单-或多不饱和的、直链的或支链的、未取代的或由-OH，-SH，-NH2，-NHC1-6-烷基，-N(C1-6-烷基)2，-NHC6-14-芳基，-N(C6-14-芳基)2，-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)，-NO2，-CN，-COOH，-COOC1-5-烷基，-(C＝O)C1-5-烷基，-F，-Cl，-Br，-I，-O-C1-6-烷基，-O-C6-14-芳基，-S-C1-6-烷基，-S-C6-14-芳基，-OSO2C1-6-烷基，-OSO2C6-14-芳基，具有3-14个环成员的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的碳环，具有5-15个环成员和1-6个杂原子、优选N、O和S的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的杂环取代一次或多次的，
-具有3-14个环成员的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的碳环，其是未取代的或由-OH，-SH，-NH2，-NHC1-6-烷基，-N(C1-6-烷基)2，-NHC6-14-芳基，-N(C6-14-芳基)2，-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)，-NO2，-CN，-COOH，-COOC1-5-烷基，-(C＝O)C1-5-烷基，-F，-Cl，-Br，-I，-O-C1-6-烷基，-O-C6-14-芳基，-S-C1-6-烷基，-S-C6-14-芳基，-OSO2C1-6-烷基，-OSO2C6-14-芳基取代一次或多次的，
-具有5-15个环成员和1-66个杂原子、优选N、O和S的单-，二-或三环饱和的或者单-或多不饱和的杂环，其是未取代的或由-OH，-SH，-NH2，-NHC1-6-烷基，-N(C1-6-烷基)2，-NHC6-14-芳基，-N(C6-14-芳基)2，-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)，-NO2，-CN，-COOH，-COOC1-5-烷基，-(C＝O)C1-5-烷基，-F，-Cl，-Br，-I，-O-C1-6-烷基，-O-C6-14-芳基，-S-C1-6-烷基，-S-C6-14-芳基，-OSO2C1-6-烷基，-OSO2C6-14-芳基取代一次或多次的。
本发明的基本组成部分是，式1化合物在9位具有氮原子并且含有A＝O或NH片段A，它是作为本发明治疗勃起机能障碍治疗剂基本结构的前提。
本发明A＝O的式1化合物是新的。本发明A＝NH的式1化合物可从专利DE 195 10 965中获知，所述专利文献在现有技术中已经作为参考引用过。
本发明也涉及生理上可耐受的式1化合物的盐，它可通过用无机或有机酸中和碱或通过用无机或有机碱中和酸或通过将叔胺季铵化得到季铵盐获得。
在式1化合物具有一个不对称碳原子的情况下，本发明涉及D型、L型和D，L混合物，在具有一个以上不对称碳原子情况下，本发明涉及非对映异构体形式。
本发明进一步涉及制备本发明式1化合物的方法。
按照本发明，具有上述A、R1、R2和R3含义的通式1化合物可通过下述方法制备：将具有相同A、R1、R2和R3含义的式2的3-氨基吡啶与氰酸盐在有机溶剂中在酸存在下反应，
随后，将用该方法制备的具有相同A、R1、R2和R3含义的式3的脲在有机溶剂中加热，以环化成本发明的式1化合物，
制备式3脲的变化方法包括使用碱金属氰酸盐，它是本发明制备方法特别优选的。
制备式3脲的变化方法包括在质子溶剂、特别优选在乙酸中反应，它是本发明制备方法优选的。
制备式3脲的变化方法包括在无机酸、特别优选是在与所使用溶剂可混合的浓无机酸，例如在浓盐酸存在下反应，它是本发明制备方法优选的。
环化式3脲的变化方法包括使用沸点＞80℃的溶剂、特别优选是沸点＞100℃的溶剂，它是形成本发明式1化合物的本发明制备方法优选的。
环化式3脲的变化方法包括在＞80℃的反应温度下，特别优选在＞100℃的反应温度下进行反应，它是形成本发明式1化合物的本发明制备方法优选的。
本发明化合物的特别有利之处是它们可作为新的勃起机能障碍适应征治疗剂通过口服给予。
本发明的进一步组成部分是，实施例中所描述的本发明化合物的溶液特别优选地用于口服给予。
在性交前口服给予5-200mg化合物代表优选的治疗方案。所述化合物也可以作为溶液剂通过非肠道、口服、颊(buccally)或舌下使用。
本发明的组成部分还包括，除了常规生理上可耐受的载体和/或稀释剂或助剂外还包含一种或多种本发明式1化合物的药物产品及其这些药物产品的制备方法。
本发明式1化合物和包含本发明式1化合物的药物可单独和彼此结合使用。
本发明的进一步组成是本发明化合物可在兽医中用作治疗剂来预防和治疗雄性动物勃起机能障碍。选择化合物的剂量、给药方案和药物制剂应考虑物种差异和兽医医嘱的要求。
本发明进一步涉及具有式1结构的咪唑并[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮及其作为治疗剂在治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关的血管疾病中的应用。其中
A代表O或NH，
R1和R2可相同或不同并且可代表氢，和
-C1-5烷基，其为直链的或支链的、未取代的或由-OH，-SH，-NH2，-NO2，-CN，-COOH，-F，-Cl，-Br，-I，-O-C1-6-烷基，-S-C1-6-烷基取代一次或多次的，并且
R3代表氢，和
-C1-5烷基，其为直链的或支链的、未取代的或由-OH，-SH，-NH2，-NO2，-CN，-COOH，-F，-Cl，-Br，-I，-O-C1-6-烷基，-S-C1-6-烷基或苯基取代一次或多次的。
本发明的基本组成部分是，式1化合物在9位具有氮原子并且包含A＝O或NH的片段A，它是作为本发明治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关血管疾病治疗剂基本结构的前提。
关于所述本发明式1化合物作为治疗剂在治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关血管疾病的应用，本发明也涉及这些化合物生理上可耐受的盐，它们可通过用无机或有机酸中和碱或通过用无机或有机碱中和酸或通过将叔胺季铵化得到季铵盐获得。
关于所述本发明式1化合物作为治疗剂在治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关血管疾病的应用，在式1化合物具有一个不对称碳原子的情况下，本发明涉及D型、L型和D，L混合物，而在具有一个以上不对称碳原子情况下，本发明涉及非对映异构体形式。
关于所述本发明式1化合物作为治疗剂在治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关血管疾病的应用，本发明化合物可通过系统给药方式，例如通过静脉内、肌内和皮下，和口服给药方式给予。口服给予本发明化合物是特别优选的。
本发明的进一步组成部分是，在作为治疗剂治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关血管疾病的应用中，实施例中所描述的本发明化合物的溶液特别优选地用于口服给予。
所述化合物也可以以溶液形式通过非肠道、颊或舌下使用。
本发明的组成部分还包括，除了常规生理上可耐受的载体和/或稀释剂或助剂外还包含一种或多种本发明式1化合物的药物产品及其这些药物产品的制备方法。
所述本发明式1化合物和包含所述本发明式1化合物的药物可单独和彼此结合使用。
所述本发明式1化合物在体外同时并且比较强抑制PDE3和PDE5。
已经发现，所述本发明式1化合物在体内引起心脏收缩力增强(正性肌力作用)并同时引起血管、特别是动脉血管扩张。
本发明的组成部分是，所述本发明化合物的双重作用原理使得抑制发生血压严重改变和与氧不足有关心律失常的危险成为可能。
本发明的一个方面是，本发明式1化合物尤其可用于治疗急性期心衰、冠心病和肺心病。实施例8-甲氧基-3-甲基-1-丙基咪唑并[1，5-a]吡啶并[3，2-e]吡嗪酮(1)
将29.6g(0.1mol)3-氨基-6-甲氧基-2-(4-甲基-2-丙基咪唑-1-基)吡啶加到165ml乙酸中，并加入11.8g(0.14mol)氰酸钾在15ml水的溶液中。然后，在搅拌下，加入15.5ml浓盐酸(37％浓度)，并将该化合物在25-30℃下搅拌4小时。然后向该反应溶液中加入400ml水，并用浓氢氧化钠溶液调至pH8。当在冰上冷却时，N-[6-甲氧基-2-(4-甲基-2-丙基咪唑-1-基)吡啶-3-基]脲结晶出来。分离该中间体，用水洗涤并在60℃下干燥。
将该脲在100ml DMF中煮沸回流4小时。通过随后用冰冷却该反应溶液，产物结晶出来。分离，用DMF洗涤并在80℃下干燥。
收率：14g(理论值的51％)
熔点：294-295℃
大量其它式1化合物可通过使用实施例中所指出方法的适当变化制备，其中，下列化合物通过举例方式列出：化合物 A R1 R2 R3 熔点[℃] 1 O C3H7 CH3 CH3 294-295(DMF) 2 O H H CH3 314-317(DMF) 3 O H CH3 CH3 321-323(DMF) 4 O CH3 H CH3 309-311(DMF) 5 O C3H7 H CH3 289-290(DMF) 6 O C2H5 CH3 H 320分解(DMF) 7 O C2H5 CH3 CH3 314-315(DMF) 8 NH C2H5 CH3 CH2-C6H5 276-278(DMF) 9 O C2H5 CH3 (CH2)3-OH 303-305分解(DMF) 10 O C2H5 CH3 CH2(C＝O)CH3 312-314分解(DMF) 11 O C2H5 CH3 CH2-2-吡啶基 299-301(DMF) 12 O C6H5 H CH3 323(DMF) 13 O H C6H5 CH3 326分解(DMF)用于化合物1口服给药的溶液的制备
将化合物1例如以10-50mg/ml的比例溶解在1N盐酸中。进一步用蒸馏水稀释，以1∶9的比例加入10％(体积比)聚乙二醇660-12-羟基硬脂酸酯(SolutolHS15)，得到澄清的溶液，它包含1-5mg/ml的化合物1并且用作可饮用的或可注射的溶液剂。本发明化合物在治疗勃起机能障碍中的生物学作用
本发明化合物是磷酸二酯酶5的强抑制剂。例如，其治疗能力在体外通过增强NO对鼠成纤维细胞中细胞内cGMP水平的作用和松弛人海绵体得到证明。磷酸二酯酶5抑制作用
PDE5的活性在从人血小板获得的酶制剂中得到证明。将人血用枸橼酸抗凝。在室温下，在700×g离心20分钟使得上清液中富含血小板的的血浆与红细胞和白细胞分离。将血小板通过超声溶解并用于PDE5测定中。磷酸二酯酶的活性可通过进行一些修改的Thompson等人所描述的方法(Thompson，W.J.；Appleman，M.M.，环核苷酸磷酸二酯酶的测定和多分子形式酶的拆分.Adv.Cycl.Nucl.Res.1979，10，69-92)测定。
反应混合物包含50mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM MgCl2、各种浓度的抑制剂、酶制剂和测定各异构酶PDE5所必需的其它组分(见下)。通过加入底物，即0.5μm[3H[-cGMP(大约6000CPM/测定)开始反应。最终体积为100ml。
将试验物质在DMSO中配制成储备液。DMSO在反应混合物中的浓度为1％v/v。该DMSO浓度对PDE5活性没有影响。通过加入底物开始反应后，将试样在37℃下培养30分钟。通过将试管在110℃下加热2分钟终止反应。将试样在冰中再保留10分钟。加入30μl5’-核苷酸酶(1mg/ml，从衲脊响尾蛇毒液的悬浮液中获得)，然后在37℃下培养10分钟。将试样储存在冰上，各加入400μl Dowex-水-乙醇(1+1+1)混合物并且在充分搅拌后，将它们在冰上再培养15分钟。将反应容器在3000×g下离心20分钟。将200μl等份试样的上清液直接转移到闪烁器中。加入3ml闪烁剂后，将试样在β-计数器上测定。当测定PDE5时，在100μM IBMX存在下测定各种情况下的非特异性酶活性并从测定值减去。
对于本发明化合物来说，其测定的抑制磷酸二酯酶5的IC50值在10-9-10-5M范围。
例如，对于所选择实施例来说，其测定的IC50值如下： 实施例IC50[μmol/l] 1 0.01 5 0.12 7 0.10 8 0.07诱导成纤维细胞(鼠)产生NO
鼠胎儿的肺成纤维细胞(RFL-6)代表适宜的、研究NO对细胞内cGMP水平的作用受哪些因素影响的介质(Ishii等人，1991)。该基本原理可应用于海绵体中的血管平滑肌。
本发明化合物以浓度依赖方式提高由NO供体S-亚硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺诱导的细胞内cGMP水平增加。
因此，例如，化合物1在0.010μmol/1浓度下引起cGMP水平的显著升高。因此，化合物1的活性是使用非特异性PDE抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)获得的活性的10,000倍。人海绵体的体外松驰作用
将在器官浴中的条状人海绵体预先用去甲肾上腺素收缩。测定试验化合物的松驰作用，以浓度的函数表示。
本发明化合物具有松驰作用，它依赖于浓度、依赖于预先用去甲肾上腺素收缩的条状海绵体。因此，例如，对于化合物1来说，其测定的EC50为0.35μmol/l。本发明化合物在治疗心衰、肺动脉高血压和与低灌注有关的血管疾病中的生物学作用
本发明式1化合物是磷酸二酯酶3和磷酸二酯酶5的双重抑制剂。例如，其治疗能在体外通过增强NO对鼠成纤维细胞中细胞内cGMP水平的作用得到证明。磷酸二酯酶3抑制作用
PDE 3的活性在从人血小板获得的酶制剂中得到证明。将人血用枸橼酸抗凝。在室温下，在700×g离心20分钟使得上清液中富含血小板的的血浆与红细胞和白细胞分离。将血小板通过超声溶解并用于PDE3测定中。磷酸二酯酶的活性可通过进行一些修改的Thompson等人所描述的方法(Thompson，W.J.；Appleman，M.M.，环核苷酸磷酸二酯酶的测定和多分子形式酶的拆分.Adv.Cycl.Nucl.Res.1979，10，69-92)测定。
反应混合物包含50mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM MgCl2、各种浓度的抑制剂、酶制剂和测定各异构酶PDE3所必需的其它组分(见下)。通过加入底物，即0.5μm[3H]-cAMP(大约6000CPM/测定)开始反应。最终体积为100ml。
将试验物质在DMSO中配制成储备液。DMSO在反应混合物中的浓度为1％v/v。该DMSO浓度对PDE3活性没有影响。通过加入底物开始反应后，将试样在37℃下培养30分钟。通过将试管在110℃下加热2分钟终止反应。将试样在冰中再保留10分钟。加入30μl 5’-核苷酸酶(1mg/ml，从衲脊响尾蛇毒液的悬浮液中获得)，然后在37℃下培养10分钟。将试样储存在冰上，各加入400μl Dowex-水-乙醇(1+1+1)混合物并且在充分搅拌后，将它们在冰上再培养15分钟。将反应容器在3000×g下离心20分钟。将200μl等份试样的上清液直接转移到闪烁器中。加入3ml闪烁剂后，将试样在β-计数器上测定。当测定PDE3时，在100μM IBMX存在下测定各种情况下的非特异性酶活性并从测定值减去。
对于本发明化合物来说，其测定的抑制磷酸二酯酶3的IC50值在10-9-10-5M范围内。
例如，对于所选择实施例来说，其测定的IC50值如下： 实施例IC50[μmol/l] 1 0.02 5 0.04 7 0.07 8 0.07磷酸二酯酶5抑制作用
PDE5的活性在从人血小板获得的酶制剂中得到证明。将人血用枸橼酸抗凝。在室温下，在700×g离心20分钟使得上清液中富含血小板的的血浆与红细胞和白细胞分离。将血小板通过超声溶解并用于PDE5测定中。磷酸二酯酶的活性可通过进行一些修改的Thompson等人所描述的方法(Thompson，W.J.；Appleman，M.M.，环核苷酸磷酸二酯酶的测定和多分子形式酶的拆分.Adv.Cycl.Nucl.Res.1979，10，69-92)测定。
反应混合物包含50mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM MgCl2、各种浓度的抑制剂、酶制剂和测定各异构酶PDE5所必需的其它组分(见下)。通过加入底物，即0.5μM[3H]-cGMP(大约6000CPM/测定)开始反应。最终体积为100ml。
将试验物质在DMSO中配制成储备液。DMSO在反应混合物中的浓度为1％v/v。该DMSO浓度对PDE5活性没有影响。通过加入底物开始反应后，将试样在37℃下培养30分钟。通过将试管在110℃下加热2分钟终止反应。将试样在冰中再保留10分钟。加入30μl 5’-核苷酸酶(1mg/ml，从衲脊响尾蛇毒液的悬浮液中获得)，然后在37℃下培养10分钟。将试样储存在冰上，各加入400μl Dowex-水-乙醇(1+1+1)混合物并且在充分搅拌后，将它们在冰上再培养15分钟。将反应容器在3000×g下离心20分钟。将200μl等份试样的上清液直接转移到闪烁器中。加入3ml闪烁剂后，将试样在β-计数器上测定。当测定PDE5时，在100μM IBMX存在下测定各种情况下的非特异性酶活性并从测定值减去。
对于本发明化合物来说，其测定的抑制磷酸二酯酶5的IC50值在10-9-10-5M范围内。例如，对于所选择实施例来说，其测定的IC50值如下： 实施例IC50[μmol/l] 1 0.01 5 0.12 7 0.10 8 0.07诱导成纤维细胞(鼠)产生NO
鼠胎儿的肺成纤维细胞(RFL-6)代表适宜的、研究NO对细胞内cGMP水平的作用受哪些因素影响的介质(Ishii等人，1991)。该基本原理可应用于海绵体中的血管平滑肌。
发明化合物以浓度-依赖方式提高由NO供体S-亚硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺诱导的细胞内cGMP水平增加。
因此，例如，化合物1在0.010μmol/l浓度下引起cGMP水平的显著升高。因此，化合物1的活性是使用非特异性PDE抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)获得的活性的10,000倍。麻醉状态下长耳短腿小猎犬的循环分析
4只体重为9.0-15.0kg的长耳短腿小猎犬用于该研究中。将动物静脉内给予80mg/kg cloralose和400mg/kg乌拉坦进行麻醉。给狗插管，但不通过人工方法换气。
然后将臂动脉准备好用于记录外周血压。通过右颈动脉引入末端微尖的导管用于记录左室收缩压/舒张压。通过热稀释法测定心输出量。为此，通过股静脉引入Swan-Ganz导管。固定导管，这样可在其尖端测定肺动脉的血压。注射3.0ml生理盐水(温度4.0℃)并通过主动脉干中的温度的变化测定心输出量。
通过四肢记录表面ECG。该ECG参数自动进行评估。
计算机辅助系统获得并计算所有的血压。
例如，在这些研究中可能显示，以剂量依赖方式胃内给予0.25-3.0mg/kg的剂量范围的本发明化合物1后，心脏的收缩力增加(左室血压升高4倍)，心输出量增加2倍。尽管心脏工作量大大增加，但动脉血压仅在初期略有上升，并且压力幅度增加。高剂量略降低收缩压。
尽管化合物1引起心输出量巨大的和长期的增加，但未观察到与氧不足有关的心律失常或期外收缩，这证明化合物1具有强冠状动脉扩张作用。