猪瘟病毒感染性CDNA载体的制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种猪瘟病毒感染性cDNA载体的制备方法和应用，该载体含有T7启动子和猪瘟病毒标准强毒石门株基因组的cDNA，在T7启动子下游的cDNA中，缺失NS2基因中的1260个碱基对，保留5’端第3752碱基对至PshAI位点第3881碱基对之间130bp的NS2基因片段，其余cDNA序列与石门株感染性克隆cDNA相同。本发明方法简单，操作方便，可构建双价或多价基因工程疫苗，适合猪瘟病毒的鉴别诊断和疫苗的研究中的应用。

1、  一种猪瘟病毒感染性cDNA载体的制备方法，该载体含有T7启动子和猪瘟病毒标准强毒石门株基因组的cDNA，其特征是，在T7启动子下游的cDNA中，缺失NS2基因中的1260个碱基对，保留5’端第3752碱基对至PshAI位点第3881碱基对之间130bp的NS2基因片段，其余cDNA序列与石门株感染性克隆cDNA相同，该cDNA具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列且位于到质粒载体pBR322的SalI和EcoRI双酶切位点之间。

2、  根据权利要求1所述的猪瘟病毒感染性cDNA载体的制备方法，其特征是该载体为CCTCC M203072。

3、  一种权利要求1所述的载体在转录过程中产生的缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。

4、  一种权利要求2所述的载体在转录过程中产生的缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。

5、  权利要求3或4中任何一种病毒在制备猪瘟病毒疫苗或猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

猪瘟病毒感染性cDNA载体的制备方法和应用
                            技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种猪瘟病毒感染性cDNA载体的制备方法，载体表达产生的病毒以及其在猪瘟病毒的鉴别诊断和疫苗研究中的应用。
                            背景技术
猪瘟是猪的一种最重要的急性、接触性传染病，死亡率高达90％以上。国际兽疫局制定的《国际动物卫生法典》中，猪瘟被列入16种法定传染病之一。我国是猪瘟的高发国，猪瘟频繁的爆发流行给养猪业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了我国畜牧业的发展和出口贸易。
猪瘟在世界范围内广泛流行，南美、欧洲和远东的一些国家和地区尤为严重。猪瘟流行的特点是具有高度接触传染性，流行广泛，发病率、死亡率高，危害极大。猪体间的直接接触是CSFV传播的重要途径，病猪的迁移、猪肉和猪肉制品的流通以及人群活动可能是导致猪瘟大面积流行的重要原因。此外，CSFV可在野猪和山羊中传播，吸血节肢动物在一定条件下也会传播CSFV。50年代我国研制出的猪瘟兔化弱毒疫苗应用后，猪瘟在全球的急性发生和大流行得到了有效的控制。但上世纪70年代后期，我国猪瘟的流行又重新抬头，并在形式上发生了很大的变化(Artois et al，2002)：从频发的大流行转为无规律的散发流行，流行速度缓慢，疫点显著减少，病程由急性转为慢性，临床症状由典型变为非典型，病原毒力降低，出现持续感染、胎盘感染、母猪繁殖障碍等(Elber et al，1999；Carrascol et al，2001；Gomez-villamandos et al，2003)。增加免疫剂量和免疫次数，也不能控制猪瘟的发生，而且呈蔓延的趋势。因此，研制新一代疫苗已成当务之急。
自猪瘟发生后，人们一直在寻找其致病机制，但直到现在关于猪瘟病毒致病机制的研究仍进展缓慢，其原因很大一部分归因于缺少合适的细胞研究模型，而缺少细胞研究模型的直接原因则是由于猪瘟病毒进行离体细胞培养时一般不产生致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。最近国外从自然界中分离到3株致细胞病变型(cp型)CSFV毒株。已有研究表明，cp型瘟病毒其实是一对病毒的混合物，由非致细胞病变(ncp型)的野生病毒与干扰缺损颗粒组成，其中干扰缺损颗粒具有典型的亚基因组结构，缺失了从N^pro到NS2的整个编码区域，实验证明这样的DI颗粒能引起宿主细胞产生CPE的特性是可以遗传的。进一步的研究发现，野生型CSFV非结构蛋白NS2和NS3以二联体形式存在，而在干扰颗粒中，NS2基因连同上游的全部编码区被缺失，二联体变成NS3单体，故认为致细胞病变型猪瘟病毒NS3蛋白单体的过量表达是细胞产生CPE的标志。
为了构建新一代猪瘟疫苗，张楚瑜等在完成了具有我国自主知识产权的三株病毒即猪瘟病毒标准强毒石门株，兔化弱毒疫苗株(C strain)和低毒株39基因组全序列后，又成功构建了猪瘟病毒标准强毒石门株的全基因组感染性cDNA克隆(吴海祥，张楚瑜等，2003年4月  科学通报第8期)，但是这种全基因组感染性cDNA克隆表达产生的是干扰缺损颗粒，这种干扰缺损颗粒并不能单独引起实验动物产生病变，并引起动物产生免疫反应，它必须要有辅助病毒才能致细胞病变。更重要的是，它不能直接作灭活病毒疫苗应用，也不能作减毒疫苗应用。
                            发明内容
本发明的目的在于提供一种人工构建的表达缺陷型猪瘟病毒的载体，该载体能复制，表达和装配成缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。表达产生的病毒能在无其他任何辅助病毒的情况下产生致细胞病变，并能由感然细胞释放子代缺陷型猪瘟病毒作疫苗使用。
本发明的另一个目的是提供一种缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。
本发明的再一个目的是提供一种由缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒在制备猪瘟病毒疫苗或猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。
一种表达猪瘟病毒标准强毒石门株的载体，该载体含有T7启动子和猪瘟病毒标准强毒石门株基因组的cDNA，其特征是，在T7启动子下游的cDNA中，缺失NS2基因中的1260个碱基对，仅保留5’端第3752碱基对至PshAI位点第3881碱基对之间130bp的NS2基因片段，其余cDNA序列与石门株感染性克隆cDNA相同，该cDNA具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，将cDNA片段插入到质粒载体pBR322的SalI和EcoRI双酶切位点之间而获得。该载体由下列方法制备：
A)构建猪瘟病毒标准强毒石门株的有感染性全长基因组克隆，分别得到克隆质粒pGEM70-1，pBlue12-4，pBR456-6；
B)PCR扩增猪瘟病毒标准强毒石门株NS3基因；
C)酶切pBlue12-4，去除大部分NS2基因片段，并同B中产物同框融合，得到重组质粒pD8-8；
D酶切pGEM70-1并连接至pD8-8中，获得缺失NS2基因的重组质粒p5D8-1；
E)将p5D8-1中的5’大片段与pBR456-6中完整的基因组3’大片段连接，连接产物克隆至pBR322载体中，转化E.coli DH10B，提取质粒pSMD8-6，形成表达缺陷型猪瘟病毒的载体。
本发明进一步公开了该载体在转化过程中产生的病毒，在转化转录过程中产生地是缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。
在本发明的一个具体实施例中，表达载体由下列方法制备：
A)构建野毒株的有感染性基因组克隆，分别得到重组质粒pGEM70-1，pBlue12-4，pBR456-6；
B)PCR法扩增NS3基因，用BamHI对PCR产物进行酶切消化，酶切产物在37℃反应3小时后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提纯化，并对回收的酶切产物进行磷酸化处理，反应结束后回收并纯化出NS3基因片段。
C)对pBlue12-4先进行BamHI酶切反应，纯化出酶切产物后继续用PshAI对线性化质粒进行第二次酶切，去除PshAI位点后面大部分NS2基因片段，仅保留其5’端(3752nt)-PshAI位点(3881nt)之间130bp的小片段。PshAI的切点同C中PCR扩增所得到的NS3基因磷酸化的5’平末端同框融合，二者在共有的BamHI粘性末端环化，得到NS2基因大部分缺失的重组质粒pD8-8。
D)将cDNA0片段重组质粒pGEM70-1利用SalI和ClaI进行双酶切消化，在琼脂糖凝胶中回收cDNA插入片段，并连接至重组质粒pD8-8的SalI和ClaI之间，获得缺失NS2基因的5’大片段重组质粒p5D8-1。
E)将p5D8-1携带缺失突变的5’大片段用SalI和BamHI双酶切的方法分离出来，与pBR456-6中完整的基因组3’大片段在BamHI位点连接，然后将连接产物克隆到经SalI和EcoRI双酶切处理的pBR322载体中，连接产物以常规方法转化E.coli DH10B，利用载体上的Ampicillin抗性标记筛选出阳性转化子，提取质粒pSMD8-6，得到了表达缺陷型猪瘟病毒的载体CCTCC M203072.
在本发明中，将载体转染入宿主细胞采用常规的脂质体介导的转染法。在一个具体的实施例中，采用Lipofectamine2000脂质体试剂，将pSMD8-6，CCTCCM203072转染PK15细胞系，培养液是含10％胎牛血清无双抗的DMEM。转染按Lipofectamine2000操作说明书进行，转染6小时后，除去转染介质，并用含1％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有10⁷ pfu vTF7-1，ATCC No.VR-2153。病毒感染2小时后，除去病毒上清液，加入细胞培养基，细胞在含10％胎牛血清的DMEM中进行培养。经72小时的温育后，收集细胞培养上清液即为含有缺陷型猪瘟病毒的液体。
在本发明中，收集病毒采用常用的方法，如反复冻融，差速离心等。
本发明还提供了一种由载体表达产生的缺陷型猪瘟病毒，该载体进行体外转录并转染PK-15细胞，传代后电镜观察到成熟的病毒粒子，感染非免疫猪，证实有致病性。该病毒能在无其他任何辅助病毒的情况下产生致细胞病变现象，并能由感染细胞释放子代缺陷性猪瘟病毒。由本发明产生的缺陷型猪瘟病毒可制备成猪瘟病毒疫苗，也可制备成猪瘟病毒检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
①在本发明提供的表达载体基础上，在基因组操作水平上，可对其中任意一段序列进行结构分析，开发出诊断或鉴别诊断试剂；
②表达载体因在基因组操作水平缺失毒力基因，表达产生的病毒可研制基因缺失疫苗；
③表达载体因在基因操作水平上缺失非必须基因后，加上多聚接头，可构建双价或多价基因工程疫苗；
④在本发明提供的表达载体基础上，在基因操作水平上，在阐明在某一段RNA序列或基因功能后，就可开发阻断病毒复制的药物。
                            附图说明
图1基因组全长cDNA克隆的构建示意图
图2基因组7个cDNA片段重组质粒PCR鉴定：1.pGEMT6-1；2-3.pGEMT5-1；
4-5.pGEMT4-15；6.PCRmarker；7.pGEMT3-1；8.pGEMT2-4；9-10.pGEMT1-a；
11-12.pGEMT70-1
图3全基因组cDNA克隆质粒pT7SM PCR扩增鉴定图：1.95-348nt，254bp；2.517-911nt，395bp；3.2422-2599nt，178bp；4.4848-5088nt，241bp；5.6524-7228nt，705bp；6.10915-11340nt，426bp；7.12108-12290nt，183bp；8.DL2000 marker.
图4全基因组cDNA克隆质粒pT7SM酶切鉴定图：1.λ/H marker；2.pT7SM/BamHI 16038bp；3.pT7SM/KpnI 7074+8964bp；4.pT7SM/HindIII6017+5062+4456+503bp.
图5缺失NS2基因的克隆质粒pSMD8的图谱
图6克隆质粒pSMD8的酶切鉴定图谱：1.pT7SM/BamHI 16038bp；2.pSMD8/BamHI 14778bp；3.pSMD8/HindIII
6017+5062+3196+503bp；4.λ/H marker.图7克隆质粒pSMD8的PCR扩增鉴定图：1.1-348nt，348bp；2.95-911nt，817bp；3.517-1735nt，1218bp；4.4265-5088nt，0bp；5.3350-5671nt，1062bp；6.11678-12298nt，620bp；7.DL2000 marker.
图8缺陷型病毒vSMD8特意性片断的RT-PCR检测图。
                          具体实施方式
下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例1  猪瘟病毒全基因的克隆及表达载体的构建
①将生理盐水10倍稀释猪瘟病毒Shimen株冻干毒(由北京中国兽医药品监察所提供)，耳静脉接种2月龄非免疫猪(由湖北省畜牧兽医研究所提供)。接毒24h后猪体温达40℃，出现猪瘟临床症状，第7天体温由42℃转而下降时，立即前腔静脉采血，加EDTA抗凝作为实验材料。
②用Promega公司生产的RNA提取试剂盒从抗凝全血分离总RNA。在Shimen株病毒已测全基因组序列的基础上，设计7对引物，利用RT-PCR的方法分相互重叠的7个片段扩增出全基因组cDNA，设计引物时在5’UTR上游添加SalI位点和T7启动子序列，在3’UTR的下游添加SacII基因组线性化位点和EcoRI克隆位点，以便于全基因组克隆和在体内进行的转录。逆转录酶采用M-MLV(Promega)；PCR采用Expand高保真系统(Roche)，扩增产物在3’端有一个突出的A，经纯化后用TA法克隆至pGEM-T(Promega)中。
③各片段PCR产物筛选出阳性克隆经测序验证后用于连接基因组全长cDNA。以基因组中部的BamHI单一酶切位点为界，全基因组分成5’和3’半分子，两部分单独进行连接。连接过程中所得的每一个片断都进行鉴定，5’和3’半分子在BamHI位点相连并克隆至低拷贝pBR322质粒的SacI和EcoRI位点之间，获得全基因组cDNA克隆pT7SM。
实施例2  猪瘟病毒全基因组表达载体的确认
全基因组克隆质粒pT7SM的鉴定采用PCR扩增和酶切鉴定同时进行。PCR鉴定选用基因组上随机分布的7对引物，对全基因组的酶切签定选用BamHI、KpnI和HindIII三种限制性内切酶。
实施例3  表达载体缺陷型猪瘟病毒载体的制备
在获得猪瘟病毒全基因克隆的基础上构建缺失NS2基因的缺陷性猪瘟病毒
①NS3基因的扩增。在猪瘟病毒基因组中，NS2基因与NS3基因紧密相连，对NS2基因的缺失首先采用了PCR方法，扩增下游的NS3基因，再在NS2基因上游P7基因的后面用酶切方法将NS2基因切除，并将NS3基因同框融合到P7的下游。NS3基因扩增时，将上游引物NS3(+)与cDNA3的下游引物P3D配对(如图所示)，以质粒pGEMT3-1为模板，使用Pfu DNA聚合酶，进行PCR扩增，目标产物在3’端包含了基因组中部的单一酶切位点BamHI。Pfu PCR反应体系在冰浴中配制，pGEMT3-1质粒100倍稀释溶液1ul作为扩增模板，在50ul反应体系中加入0.85ul Pfu DNA聚合酶，延伸时间2min，运行33个循环后扩增结束。目标产物5’平末端起始于NS3基因第一个三联体密码子的第二个碱基。
②NS3基因3’端的BamHI酶切反应。PCR扩增的NS3基因产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检查，将符合预期大小的特异性DNA条带用手术刀切下，用NucleoTrap凝胶回收试剂盒回收PCR产物。约1.5ug PCR产物在50ul体系中用BamHI进行酶切消化，便于下一步将NS3基因克隆到载体中。酶切产物在37℃反应3小时后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提纯化，为在NS3基因5’端的磷酸化提供模板。
③NS3基因5’端的磷酸化。PCR扩增的NS3基因在5’平末端为-OH基团，为了能够与载体进行有效的连接，5’平末端必须为磷酸基团，为此对上一步回收的酶切产物进行了磷酸化处理，反应按照前述程序在T4多聚核苷酸激酶介导下进行，反应结束后同样用Nucleo Trap凝胶回收试剂盒纯化出NS3基因片段。
④pBlue12-4质粒的双酶切反应。取cDNA1与cDNA2连接产物的克隆质粒pBlue12-4首先进行BamHI酶切反应，反应结束后进行酶切产物纯化，并继续用切点位于基因组3881nt位置的PshAI位点对线性化质粒进行第二次酶切在pBlue12-4中去除PshAI位点后面全部的NS2基因
片段，仅保留其5’端(3752nt)-PshAI位点(3881nt)之间130bp的小片段，该片段编码NS2蛋白N端43个氨基酸，并多出第44个三联密码子的第一个核苷酸A。pBlue12-4质粒在PshAI位点消化得到的是平末端，而且PshAI的切点位于NS2基因第44个三联密码子的第一个核苷酸A后面，正好可以同上述PCR扩增所得到的NS3基因磷酸化的5’平末端同框融合(NS3基因5’端第1个三联密码子少一个核苷酸G)，然后二者在共有的BamHI粘性末端环化，得到NS2基因大部分缺失的重组质粒，缺失片段从NS2基因3882nt位置开始，到NS3基因5’端第一个核苷酸5141nt位置止，长度为1260bp，属于同框缺失。pBlue12-4的双酶切反应参照前述进行，BamHI酶切酶切后对酶切产物进行纯化，继续用PshAI酶切，产物用凝胶电泳分离出载体片段，后者与已处理好的NS3基因进行同框融合。连接反应体系于16℃反应过夜，进行两个平末端的连接。次日将反应管移至4℃下继续连接16h。所得连接产物用大肠杆菌DH5a转化、筛选，获得重组质粒pD8-8。
⑤在pD8-8中插入cDNA0。所获得的pD8-8重组质粒携带了cDNA1片段、NS2基因已缺失1260bp的cDNA2以及与其同框融合的NS3基因5’端部分片段，不包含cDNA0片段。将cDNA0片段重组质粒pGEM70-1利用SalI和ClaI进行双酶切消化，在琼脂糖凝胶中回收cDNA插入片段，并连接至重组质粒pD8-8SalI和ClaI之间，获得缺失NS2基因的5’大片段重组质粒p5D8-1(如图所示)。
⑥缺陷性病毒亚基因组cDNA的连接。将p5D8-1携带缺失突变的5’大片段用SalI和BamHI双酶切的方法分离出来，与前述的pBR456-6中完整的基因组3’大片段在BamHI位点连接，然后将连接产物克隆到经SalI和EcoRI双酶切处理的pBR322载体中(如图所示)，连接产物以常规方法转化E.coli DH10B，利用载体上的Ampicillin抗性标记筛选出阳性转化子，提取质粒pSMD8-6(简称pSMD8)。该表达载体于2003年9月30日送交国家知识产权局指定的，位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC-M203072。
实施例4  缺陷型猪瘟病毒的制备
用质粒pSMD8-6转染PK-15和PK-15/SM两种宿主细胞，均出现了典型的致细胞病变效应。
                                  SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>猪瘟病毒感染性cDNA克隆载体，产生的病毒及其应用
<130>猪瘟病毒感染性cDNA克隆载体，产生的病毒及其应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>11038
<212>DNA
<213>猪瘟病毒
<400>1
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