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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201310615142.4(22)申请日 2013.11.28CGMCCNo：7826 2013.06.28C12N 1/20(2006.01)A01N 63/02(2006.01)A01P 3/00(2006.01)A01G 7/06(2006.01)C12R 1/465(2006.01)(71)申请人辽宁省农业科学院地址 110161 辽宁省沈阳市沈河区东陵路84号(72)发明人梁春浩 刘长远 白元俊 关天舒王辉 刘丽 于舒怡 黄玉茜赵达 臧超群 李柏宏(74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司 21107代理人韩辉(54) 。
2、发明名称一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株、制剂及其应用(57) 摘要一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株、制剂及其应用，其特点是：该生防菌株为来源于葡萄园表层土壤暗黑链霉菌PY-1菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC.No：7826；该生防菌剂中的活性成分为暗黑链霉菌PY-1的次生代谢产物，其中暗黑链霉菌PY-1接种在500mL三角瓶内的200mL的PSA培养液中培养5d，将发酵液离心30min，上清液经滤膜过滤获得原液，原液在稀释后对葡萄进行喷雾，对辣椒进行灌根；该生防菌剂对茄子茎枯病、茄子根腐病、番茄红粉病、番茄晚疫病、黄瓜炭疽病、玉米穗腐。
3、病、高粱弯孢叶斑病、小麦根腐病也有一定的抑制作用。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页(10)申请公布号 CN 104450547 A(43)申请公布日 2015.03.25CN 104450547 A1/1页21.一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株，其特征在于所述生防菌株为来源于葡萄园土壤的放线菌PY-1菌株，该放线菌PY-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC .No：7826，保藏日期2013年6月28日。2.一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂，其特征在于所。
4、述生防菌剂中的活性成分为放线菌PY-1的次生代谢产物，其中放线菌PY-1经过发酵离心去除菌体后再稀释300500倍。3.权利要求2所述能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌剂的制备方法，其特征在于（1）菌种制备：暗黑链霉菌PY-1菌株，PSA培养基活化培养，培养培养温度2530，暗条件下培养4d；PSA培养基成分：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL；（2）生防制剂制备：液体培养基成分：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，装液量为200mL（500m L三角瓶），接种量为1109cfu，发酵温度27，150r/min振荡发酵培养5d，获得发酵液。4.权利要求2所述。
5、能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂的用途，其特征在于将发酵液12000/min离心30min，上清液经0.45m滤膜过滤即制备成能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂原液，取上清液体稀释300500倍后喷雾防治葡萄霜霉病和灌根防治辣椒疫病。权 利 要 求 书CN 104450547 A1/6页3一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株、 制剂及其应用 技术领域0001 本发明涉及一种生防菌株、制剂及其应用,特别是涉及一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株、制剂及其应用，属于有益生防菌株制成的生防制剂技术领域。背景技术0002 葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola。
6、 (Berk. and Curt.) Berl. and de Toni)引起的真菌性病害，是一种世界性的古老病害,遍布国内外葡萄产区,是葡萄主要的叶部病害之一。该病害最早发现于北美洲东部的野生葡萄上，1870年欧洲引入美洲抗根瘤蚜砧木，葡萄霜霉病菌进入欧洲。几年后，霜霉病菌首次在法国南部大面积发生，随后遍及整个欧洲，成为当地葡萄的首要病害。19世纪后期欧洲种葡萄(vitis vinifera)向全球引种栽培，葡萄霜霉病随之遍及各大洲葡萄产地。我国各葡萄产区均有霜霉病的分布，尤其在多雨潮湿地区发生普遍,给葡萄生产造成严重的经济损失。葡萄霜霉病的发生可造成叶片焦枯早落，树势衰弱，新梢生长不良，果。
7、实质量降低，品质变劣，植株抗寒性差。0003 目前化学药剂是防治葡萄霜霉病的主要措施。由于一些生产者盲目打药，随意增加农药使用次数和使用量，更有甚者使用高毒、高残留农药，导致病菌抗药性增强，有益微生物群体数量下降，果品污染，葡萄果品质量降低，危害消费者健康，影响葡萄产品在国内、国际市场竞争力，严重制约葡萄产业的可持续发展。0004 辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的真菌病害，是我国危害最严重、分布最广泛的蔬菜土传真菌病害，也是世界范围内普遍存在的毁灭性土传病害之一。该病菌最早于1918年在美国新墨西哥州发现，此后在世界辣椒种植区普遍大面积发生，其中美国、巴西。
8、、印度、墨西哥、俄罗斯、韩国、日本、法国、意大利、阿根廷等国家发病较重。我国首次于20世纪50年代在江苏省发现，迄今在全国10多个省（区）市辣椒主产区均有严重发生的报道。该病可在辣椒生长发育过程中的任何时期和各部位均可发病，既是一种发病周期性短的病害，又是一种蔓延性快的毁灭性病害。一般在高温高湿的田块，重茬地，低洼地，排水不良的田地等发病均较重。按照田间发病规律可分为暴发型与蔓延型。暴发型发病较轻的田块病株率可达到20，严重的地块可达80以上甚至全部枯死，毁灭性很大，损失极为严重；蔓延型是指发病地点具有明显的发病中心，发病部位主要集中在枝杈处和茎基处，形成黑褐色条斑。0005 辣椒疫病属于蔬菜。
9、土传病害，病菌在土壤中存活和危害，防治难度大，因此农民常使用一些灭生性药剂和巨毒药剂进行防治。由于上述药剂可造成土壤板结、透气性下降，农药残留，病菌抗性增强，辣椒产品污染及施药风险性加大等一系列问题，既增加了农民的投入、破坏了生态环境，又对消费者健康构成直接或潜在的威胁，影响辣椒产业的健康发展。0006 放线菌最早由Cohn(1872)发现，目前发现的放线菌大约有69个属，1687个种(阮继生等，1990)，主要以链霉菌属、诺卡菌属和小单孢菌属等为主(魏艳敏等，2000)。在已发现的放线菌中，半数以上的属种对多种细菌、真菌有拮抗活性。农业生产中应用于生物说 明 书CN 104450547 A2。
10、/6页4防治的放线菌主要是链霉菌属(Streptomyces)，其次为诺卡菌属(Nocardia)、游动放线菌(Actinoplanes)、小单孢菌属(Micromonospora)等(方羽生等，2001)。放线菌孢子抗逆性较强，可产生多种抗生素，还可诱导寄主植物产生抗性(梁亚萍等，2007)。其菌体及其代谢产物已被开发为多种生物制剂，为农业生产做出巨大贡献。0007 生防放线菌在防治植物病害中的应用主要通过对生防放线菌菌体的直接利用、抗生素的利用、酶等次生代谢物的利用以及增强植物的抗病性等途径实现。0008 利用放线菌抑菌方式及作用特点，将放线菌制成活菌制剂进行植物病害生物防治，具有无毒、无。
11、残留、专一性强，与环境兼容性好等优点。目前世界各大药物研究所开发出的抗生素及其衍生物达数千种，许多种类被大量用于药物生产和农业应用(阮继生等，1990)。用于农业生产中的抗生素，如防治水稻纹枯病的井冈霉素，防治蔬菜真菌性病害的武夷霉素及防治作物细菌性病害的中生菌素等在农业生产上发挥了重要作用(蔡艳，2002)。另外，“5406”抗生菌制剂就也是活菌制剂运用于病害生防的典型例子，该制剂主要成分为细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)(尹莘耘，1983)，细黄链霉菌能够产生多种抗生素和激素，不仅能够抑制植物病原菌生长，其分泌的激素还能促进植物生长。将“5406”活菌制剂进行。
12、拌种，能够有效防治苗木立枯病，增强植物防病能力，达到增产、增收的效果。另一种放线菌活菌制剂-Mycostop(Kortemaa et al.,1997)，是由灰绿链霉菌(S.griseovidis)的孢子和菌丝制成的，该菌由Kemira从泥煤中分离获得，主要用来防治一些常见的土传病害，如瓜果腐烂病、植物枯、黄萎病和立枯病等。康照l号活菌制剂，其有效成分是分离自青藏高原的密旋链霉菌活性孢子，不仅能够有效防治茄子黄萎病，而且该菌在较低浓度下对茄子生长具有促进作用，能够提高茄子产量(牛瑞生等，2010)。黄麻链霉菌(S. corchorusii)NF0919菌株（菌种专利号为ZL2010102368。
13、86.1），代谢产物能有效防治由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌（Physalospora baccae）侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌（Alternaria viticola）引发的葡萄穗轴褐腐（枯）病、Coniothyrium dlodiella侵染引发的葡萄白腐病、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌（Elsinae ampelina)侵染引发的葡萄黑痘病等多种植物病害（杨敬辉等，2012）。有些放线菌可通过影响植物生长，增强植物的抗病性，达到防治病害的目的。放线菌能够降解土壤中部分有。
14、机物质，如能够降解几丁质、木质素、纤维素等，并将这些物质转化成有利于植物吸收的营养物质，使植物长势增强从而提高植物抗病能力。放线菌的某些代谢物质还可促进植物生长(姜钰等，2005)，从而有效错开了致病菌对寄主植物的最适侵染时期而达到防病效果。0009 目前，葡萄霜霉病和辣椒疫病在防治仅依靠化学农药，不仅对果品和环境造成严重污染，而且威胁到食品安全。利用生防菌剂防治葡萄霜霉病和辣椒疫病在研究方面报道较少，尚无登记产品。因此，人们亟待能有一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病生防制剂的出现。发明内容0010 本发明的目的就在于针对至今还没有一种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂的现状，而发明了一种能防治。
15、葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株、制剂及其应用。本发明的生防菌株来源于葡萄园表面土壤，对植物本身、环境及人畜安全，也不像化学农药那样说 明 书CN 104450547 A3/6页5具有高毒、高残留等缺点，且其在发酵、生产加工及使用过程中均不产生有害物质，无毒副作用。0011 PY-1从葡萄园表层（510cm）土壤中分离获得，在ISP2琼脂、ISP3琼脂、ISP4琼脂、ISP5琼脂及Bennetts琼脂培养基上生长7d后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好、多分支；孢子丝松散螺旋形，孢子圆柱形、光滑。经生理生化试验及对16S rDNA序列测定后与GenBank比对 与暗黑链霉菌（S。
16、treptomyces atratus）相似性99.5%，定名为暗黑链霉菌。0012 表1 菌株PY-1的培养特征。0013 Table 1 The cultural characteristic of strain PY-1 培养基基内菌丝气生菌丝可溶性色素Bennetts培养基棕色灰白色棕红色ISP2培养基棕色灰白色棕红色ISP3培养基棕色灰白色棕红色ISP4培养基淡黄色灰色棕红色ISP5培养基棕色无气丝棕红色本发明给出的这种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌株，其特点是来源于葡萄园表层土壤暗黑链霉菌PY-1菌株，该暗黑链霉菌PY-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：。
17、北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC .No：7826，保藏日期2013年6月28日。0014 本发明给出的这种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂，其特点是所述生防菌剂中的活性成分为暗黑链霉菌PY-1的次生代谢产物，其中暗黑链霉菌PY-1接种在500mL三角瓶内的200mL的PSA培养液中，接种量109cfu,27、150r/min下培养5d。将发酵液12000/min离心30min，上清液经0.45m滤膜过滤获得原液，原液在稀释300倍500倍后对葡萄进行喷雾，对辣椒进行灌根。0015 本发明给出的这种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂的制备方法，其特点是。0016 1菌种。
18、制备。暗黑链霉菌PY-1菌株，PSA培养基活化培养，培养温度2530，暗条件下培养4d。PSA培养基成分：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。0017 2生防制剂制备。液体培养基成分：马铃薯200g，煮沸30min，过滤取其滤液，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。装液量为200mL（500mL三角瓶），接种量为1109cfu，发酵温度27， 150r/min振荡发酵培养5d，将发酵液12000/min离心30min，上清液经0.45m滤膜过滤即制备成能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂原液。0018 本发明给出的这种能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防菌剂的用途，其特点是将含有暗黑链霉菌。
19、的发酵液稀释300500倍后防治葡萄霜霉病和辣椒疫病。0019 与现有技术相比,本发明的有益效果是。0020 本发明的生防菌株暗黑链霉菌PY-1来源于葡萄园表层土壤，对植物本身、环境及人畜都是安全的，不会像一部分农药那样有剧毒性，且其在发酵、生产加工及使用过程中均不产生有害物质，无毒副作用。0021 本发明的生防制剂对预防和治疗葡萄霜霉病和辣椒疫病有良好的防治效果。在离体叶片葡萄霜霉病菌防治试验中，本发明的生防制剂防治效果达到95.85%，在辣椒疫病菌平板对峙试验中，本发明的生防制剂防治效果达到了88.56%；在沈阳和锦州两地进行的说 明 书CN 104450547 A4/6页6田间防治葡萄霜。
20、霉病试验中，本发明的生防制剂稀释300倍液防治效果达到了84.35%和82.36%，比52.5%抑快净2000倍的防治效果稍差，远好于58%甲霜锰锌1000倍防治效果好；在两地防治辣椒疫病的田间防效试验中，本发明的生防制剂稀释300倍液防治效果达到了77.36%和78.25%，比25%甲霜灵WP750倍略差，高于80%代森锰锌750倍和50%烯酰吗啉1750倍的防治效果，应用前景广阔。具体实施方案0022 下面结合具体实例对本发明的技术方案做详细介绍。0023 实施例1。0024 1菌种制备。暗黑链霉菌PY-1菌株，PSA培养基活化培养，培养温度2530，暗条件下培养4d。PSA培养基成分：马。
21、铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20 g, 蒸馏水1000mL。0025 2生防制剂制备。液体培养基成分：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL。装液量为200mL（500mL三角瓶），接种量为1109cfu，发酵温度27， 150r/min振荡发酵培养5d，将发酵液12000/min离心30min，上清液经0.45m滤膜过滤即制备成能防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的生防制剂原液，加水稀释300倍开展室内防治试验。0026 室内离体防治葡萄霜霉病效果评价。0027 利用离体叶片进行室内防效试验，设计4个不同处理，每个处理4次重复。0028 处理1：先喷布葡萄霜霉菌孢子囊悬浮液，24h后喷布暗黑。
22、链霉菌PY-1发酵滤液。0029 处理2：先喷布暗黑链霉菌PY-1发酵滤液，24h后喷布霜霉病菌孢子囊悬浮液。0030 处理3：只喷布暗黑链霉菌PY-1发酵滤液。0031 处理4：只喷布霜霉病菌孢子囊悬浮液。0032 每个处理25片叶片，共计100片，接种霜霉病孢子囊浓度为106个/mL。试验按照农业部药检所药效试验准则（二）葡萄霜霉病分级标准进行调查，计算病情指数。5d后调查发病情况，结果见表2，处理1和处理2防效均超过95%以上，且差异不明显。0033 表2 PY-1对葡萄霜霉病离体叶片防控效果。0034 Table 2 The control effect of strain PY-1 。
23、against Plasmopara viticolain vivo condition处理调查叶片总数病情指数防效(%)差异显著性=0.05处理1 100 2.34 95.85 b处理2 100 2.04 96.38 b处理3 100 0 100 a处理4 100 56.42 - -实施例2。0035 室内平板对执法防治辣椒疫病菌防治效果评价。0036 利用平板对峙法进行室内防效试验，设计2个不同处理。0037 处理1：利用暗黑链霉菌PY-1发酵滤液5mL与PDA培养基15mL混合制成含毒平板，然后接直径6mm辣椒疫霉菌菌碟。0038 处理2：直接在PDA培养基中央接6mm辣椒疫霉病菌菌碟。。
24、0039 待处理2长满后调查，结果见表3，处理1的抑菌率达88.56%。0040 表3 PY-1对辣椒疫病平板对峙试验防控效果。说 明 书CN 104450547 A5/6页70041 Table 3 The control effect of stain PY-1 against Phytophthora capsici处理调查总皿数（个）平均病菌直径（cm）抑菌率(%)处理1PY-1 16 0.98 88.56处理2CK 16 8.54 -利用本生防制剂在沈阳和锦州两地进行防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的田间防效试验，调查结果见表47。暗黑链霉菌PY-1发酵滤液对葡萄霜霉病和辣椒疫病均有较好的防。
25、治效果。在葡萄霜霉病防治上，本发明的300倍防效达到82%以上，略差于52.5%抑快净2000倍的防治效果，未到达差异显著性，好于58%甲霜锰锌1000倍的防治效果，差异显著。其中本发明700倍防效也好于58%甲霜锰锌1000倍的防治效果，且达到差异显著水平。在辣椒疫病防治上，本发明的300倍防效达到77%以上，略差于25%甲霜灵750倍的防治效果，但未到达差异显著水平，好于80%甲霜锰锌750倍和50%烯酰吗啉1750倍的防治效果，达到差异显著水平。其中本发明500倍防效与80%的代森锰锌750倍相当。0042 试验证明，暗黑链霉菌PY-1发酵滤液是防治葡萄霜霉病和辣椒疫病较好的生防制剂。综。
26、合考虑，暗黑链霉菌PY-1发酵滤液稀释300500倍是防治葡萄霜霉病和辣椒疫病的适宜浓度。0043 表 4 PY-1对葡萄霜霉病田间防治效果（沈阳）。0044 Table 4 The control effect of stain PY-1 with different concentration against Plasmopara viticola in field in Shenyang表 5 PY-1对葡萄霜霉病田间防治效果（锦州）。0045 Table 5 The control effect of stain PY-1 with different concentration ag。
27、ainst Plasmopara viticola in field in Jinzhou表6 不同处理防治辣椒疫病的效果分析（沈阳）。说 明 书CN 104450547 A6/6页80046 Table 6 The control effect of stain PY-1 with different concentration against Phytophthora capsici in Shenyang表7 不同处理防治辣椒疫病的效果分析（锦州）。0047 Table 7 The control effect of stain PY-1 with different concentration against Phytophthora capsici in Jinzhou说 明 书CN 104450547 A。