说明书因子VIII组合物及其制备和使用方法
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发明背景
因子VIII是内源性凝血级联路径的一种重要组分。在循环中， 因子VIII主要与血管性血友病因子(von Willebrand factor)复合。在由 凝血酶(因子IIa)活化后，它自复合物解离以与因子IXa在内源性凝血 级联中相互作用，此又会活化因子X。一旦自血管性血友病因子复合 物移除，活化的因子VIII即由活化的蛋白质C(APC)、因子Xa及因 子IXa蛋白水解失活，且自血流快速清除。当与正常血管性血友病因 子蛋白复合时，因子VIII的半衰期是约12小时，而在不存在血管性 血友病因子的情况下，因子VIII的半衰期降低至2小时(Tuddenham EG等,Br J Haematol.(1982)52(2):259-267)。
在血友病中，血液凝结受缺乏某些血浆凝血因子干扰。甲型血友 病是一种因子VIII缺乏症，且是一种占血友病病例的80％的隐性性 连锁X染色体病症。管理甲型血友病的护理标准是用重组因子VIII 浓缩物进行的补充疗法。患有重度甲型血友病的受试者具有低于正常 值1-2％的循环促凝血因子VIII水平，且通常采用目的在于保持在各 剂量之间因子VIII高于1％的防治性疗法，此可通常通过一周给予因 子VIII两至三次来达成。患有中等重度血友病(因子VIII水平是正常 值的2-5％)的人占25-30％的血友病事件且在轻微创伤之后显现流血。 患有轻度甲型血友病(因子VIII水平是正常值的5-40％)的人占全部血 友病事件的15-20％，且仅在重大创伤或手术之后发展流血。
外源供应的因子VIII的体内活性受限于蛋白质半衰期较短与结 合因子VIII且减弱或破坏止血功能的抑制剂两者。
多达30％的接受外源供应的因子VIII的甲型血友病患者对因子 VIII发动IgG免疫反应(Towfighi,F.等Comparative measurement of anti-factor VIII antibody by Bethesda assay and ELISA reveals restricted isotype profile and epitope specificity.Acta Haematol(2005)114:84-90)， 此可导致完全抑制它的促凝血活性和/或促进因子VIII更快速清除 (E等High titer inhibitors in severe haemophilia A.A meta-analysis based on eight long-term follow-up studies concerning inhibitors associated with crude or intermediate purity factor VIII products.Throm. Haemost.(1994)72:162-164)。称为FVIII抑制剂的IgG抗体主要针对 A2、A3及C2结构域(Scandella D等Localization of epitopes for human factor VIII inhibitor antibodies by immunoblotting and antibody neutralization.Blood(1989)74:1618-1626)，但也可针对A1、B及C1 结构域来产生。因此，用于具有FVIII抑制剂的患者的治疗选项是有 限的。
通常静脉内给予如因子VIII的大型蛋白质以使药剂在血流中直 接可用。先前已证明肌肉内注射的未修饰因子VIII产生的最大循环 水平仅为正常血浆水平的1.4％(Pool等,Ineffectiveness of Intramuscularly Injected Factor VIII Concentrate in Two Hemophilic Patients.New England J.Medicine(1966)275(10):547-548)。可除通过 静脉内途径以外施用的制剂将大大简化它们的使用，增加安全性，且 导致大量成本节约。
对治疗性蛋白质的化学修饰可改进它的体内清除速率及随后血 清半衰期。常见修饰的一个实例是添加聚乙二醇(PEG)部分，其通常 通过PEG上的醛或N-羟基丁二酰亚胺(NHS)基团与胺基团(例如赖氨 酸侧链或N末端)反应来偶联于蛋白质。然而，缀合步骤可导致形成 需要提取、纯化和/或其它进一步过程的异质产物混合物，所述所有 过程都不可避免地影响产物产率及质量控制。此外，如果在凝血因子 的结合位点附近的氨基酸侧链通过聚乙二醇化过程而变得被修饰，那 么凝血因子的药理学功能可受阻碍。其它方法包括使Fc结构域基因 融合于治疗性蛋白质，此会增加治疗性蛋白质的尺寸，因此降低通过 肾进行清除的速率。在一些情况下，Fc结构域赋予结合FcRn受体， 且通过FcRn受体自溶酶体再循环的能力，从而导致药代动力学半衰 期增加。不幸的是，Fc结构域在重组表达期间不高效折叠，且倾向 于形成称为包涵体的不溶性沉淀。这些包涵体必须被溶解且功能性蛋 白质必须自错误折叠的聚集体复性，此为一种耗时、低效且昂贵的过 程。
发明概述
本发明涉及新型凝血因子VIII融合蛋白组合物及其用途。具体 来说，本文提供的组合物特别用于治疗或改善与甲型血友病、因子 VIII缺乏症、流血性病症和凝血病变相关的病状。在一方面，本发明 提供包含因子VIII(FVIII)和一个或多个延伸重组多肽(XTEN)的分离 的融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白展现促凝血活性。适用于构 建所述融合蛋白的主题XTEN通常是具有非重复序列和非结构化构 象的多肽。在一个实施方案中，一个或多个XTEN连接于选自天然 人因子VIII、因子VIII B结构域缺失序列(“FVIII BDD”)及其序列变 体(全部前述各者总称为“FVIII”或“CF”)的凝血因子FVIII(“CF”)，从 而产生重组因子VIII-XTEN融合蛋白(“CFXTEN”)。CFXTEN的因子 VIII多肽组分包含A1结构域、A2结构域、C1结构域、C2结构域和 任选B结构域或其部分。在一些实施方案中，通过描绘以上提及的 结构域以包含酸性a1、a2和a3间隔子来进一步表征FVIII。在另一 实施方案中，本公开涉及包含融合蛋白的药物组合物及其在用于治疗 因子VIII相关病状的方法和方案中的用途。CFXTEN组合物相较于 未连接于XTEN的FVIII具有增强的药代动力学和药理学性质，此可 允许更便利的给药和改进功效。
在第一方面，本发明涉及包含因子VIII多肽和一个或多个连接 于所述因子VIII的延伸重组多肽(XTEN)的重组因子VIII融合蛋白。 在一些实施方案中，本发明提供包含因子VIII多肽和至少一个延伸 重组多肽(XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽 包含含有a1酸性间隔子区域的A1结构域、含有a2酸性间隔子区域 的A2结构域、含有a3酸性间隔子区域的A3结构域、C1结构域、 C2结构域和任选B结构域的全部或一部分，且其中所述至少一个 XTEN在以下各处连接于所述因子VIII多肽：(i)所述因子VIII多肽 的C末端；(ii)如果存在B结构域的全部或一部分，那么在所述因子 VIII多肽的B结构域内；(iii)在所述因子VIII多肽的所述A1结构域 内；(iv)在所述因子VIII多肽的所述A2结构域内；(v)在所述因子VIII 多肽的所述A3结构域内；(vi)在所述因子VIII多肽的所述C1结构域 内；(vii)在所述因子VIII多肽的所述C2结构域内；(viii)在所述因子 VIII多肽的N末端处，或(ix)在所述因子VIII多肽的两个结构域之间， 其中相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，当通过体外凝血测定进 行测量时，所述融合蛋白保留至少约10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％的促 凝血活性。在一个实施方案中，在前述重组因子VIII融合蛋白中， 至少一个XTEN在于选自表5、表6、表7、表8和表9的位点的1 至6个氨基酸处或内的位点处连接于所述因子VIII多肽。在其它实 施方案中，本发明提供包含因子VIII多肽和至少第一延伸重组多肽 (XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含含有 a1酸性间隔子区域的A1结构域、含有a2酸性间隔子区域的A2结构 域、含有a3酸性间隔子区域的A3结构域、C1结构域、C2结构域和 任选B结构域的全部或一部分，且其中所述第一XTEN在以下各处 连接于所述因子VIII多肽：(i)所述因子VIII多肽的C末端；(ii)如果 存在所述B结构域的全部或一部分，那么在所述因子VIII多肽的所 述B结构域内；(iii)在所述因子VIII多肽的所述A1结构域内；(iv) 在所述因子VIII多肽的所述A2结构域内；(v)在所述因子VIII多肽 的所述A3结构域内；(vi)在所述因子VIII多肽的所述C1结构域内； 或(vii)在所述因子VIII多肽的所述C2结构域内；且当相较于未连接 于XTEN的相应因子VIII蛋白时，所述融合蛋白(a)在本文所述的体 外凝血测定或本领域中已知的其它此类测定中，保留至少约10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、 300％、400％或500％促凝血活性，和/或(b)在本文所述的体外结合测 定或本领域中已知的其它此类测定中，展现与抗因子VIII抗体的结 合降低。在一个实施方案中，在前述重组因子VIII融合蛋白中，至 少一个XTEN在于选自表5、表6、表7、表8和表9的位点的1至 6个氨基酸处或内的位点处连接于所述因子VIII多肽。在其它实施方 案中，本发明提供包含因子VIII多肽和至少第一延伸重组多肽(XTEN) 的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII多肽包含含有a1酸性 间隔子区域的A1结构域、含有a2酸性间隔子区域的A2结构域、含 有a3酸性间隔子区域的A3结构域、C1结构域、C2结构域和任选B 结构域的全部或一部分，且其中所述第一XTEN在选自表6及表7 的插入位点处连接于所述因子VIII多肽且其中相较于未连接于 XTEN的相应因子VIII蛋白，当通过本文所述的体外凝血测定或本领 域中已知的其它此类测定进行测量时，所述融合蛋白保留至少约 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、 300％、400％或500％的促凝血活性。未连接于XTEN的因子VIII蛋 白的非限制性实例包括天然FVIII、BDD FVIII、pBC100和来自表1 的序列。在重组因子VIII融合蛋白的另一实施方案中，当最优比对 时，因子VIII多肽与选自由以下组成的组的序列具有至少约80％序 列同一性、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、 或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％至约100％序列 同一性：表1的序列、图3中描绘的序列和图4中描绘的序列。在另 一实施方案中，融合蛋白包含至少另一在所述因子VIII多肽的C末 端处或在所述因子VIII多肽的B结构域内连接于所述因子VIII多肽 或任选置换所述因子VIII多肽的B结构域的XTEN。在一特定实施 方案中，融合蛋白包含至少一个位于所述因子VIII多肽的B结构域 内或任选置换所述因子VIII多肽的B结构域的XTEN序列。在另一 特定实施方案中，融合蛋白包含至少一个在所述因子VIII多肽的C 末端处连接于所述因子VIII多肽的XTEN序列。在一个实施方案中， 重组因子VIII融合蛋白包含人因子VIII的B结构域缺失的变体，其 中关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，所述B结构域缺失自 在约氨基酸残基编号741至约750处的第一位置开始且在于氨基酸残 基编号1635至约1648处的第二位置处结束。在另一实施方案中，重 组因子VIII融合蛋白包含在所述因子VIII多肽的C末端处连接于所 述因子VIII多肽的第一XTEN序列，和在所述因子VIII多肽的B结 构域内或置换所述因子VIII多肽的B结构域的至少第二XTEN，其 中关于如图3中阐述的全长人因子VIII序列，所述第二XTEN连接 于约氨基酸残基编号741至约750的C末端和氨基酸残基编号1635 至约1648的N末端，其中所述XTEN的累积长度是至少约100个氨 基酸残基。在一个实施方案中，在前述融合蛋白中，第二XTEN在 N745至P1640之间、或在S743至Q1638之间、或在P747至V1642 之间、或在N745与Q1656之间、或在N745与S1657之间、或在 N745与T1667之间、或在N745与Q1686之间、或在R747与V1642 之间、或在T751与T1667之间连接因子VIII氨基酸。在一个实施方 案中，重组因子VIII融合蛋白包含当最优比对时，相较于选自表21 的具有类似长度的序列具有至少约80％序列同一性、或至少约90％、 或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至 少约99％至约100％序列同一性的序列。在另一实施方案中，重组因 子VIII融合蛋白包含至少第二XTEN、任选第三XTEN、任选第四 XTEN、任选第五XTEN和任选第六XTEN，其中所述第二、第三、 第四、第五或第六XTEN各自在选自由以下组成的组的第二、第三、 第四、第五或第六位点处连接于所述因子VIII多肽：来自表5、表6、 表7、表8和表9的插入位点；在成熟因子VIII的氨基酸残基32、 220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 和1910的6个氨基酸内的位置；在所述因子VIII多肽的任何两个邻 近结构域之间的位置，其中所述两个邻近结构域选自由A1和A2结 构域、A2和B结构域、B和A3结构域、A3和C1结构域、以及C1 和C2结构域组成的组；在所述因子VIII多肽的B结构域内的位置， 其中所述第二XTEN连接于天然因子VIII序列的约氨基酸残基编号 741至约750的C末端和氨基酸残基编号1635至约1648的N末端； 和所述因子VIII多肽的C末端。在一个实施方案中，第一XTEN与 第二XTEN相隔至少10个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个 氨基酸、至少200个氨基酸、至少300个氨基酸或至少400个氨基酸。 在包含至少第二XTEN、任选第三XTEN、任选第四XTEN、任选第 五XTEN和任选第六XTEN的重组因子VIII融合蛋白的一个实施方 案中，当最优比对时，各XTEN相较于选自由表4、表13、表14、 表15、表16和表17中的序列组成的组的具有类似长度的XTEN， 具有至少约80％序列同一性、或至少约90％、或至少约91％、或至 少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少 约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或约100％ 序列同一性。在重组因子VIII融合蛋白的另一实施方案中，所述重 组因子VIII融合蛋白包含至少第二XTEN、任选第三XTEN、任选第 四XTEN、任选第五XTEN和任选第六XTEN。在优选实施方案中， 当向受试者施用时，重组因子VIII融合蛋白展现终末半衰期至少约3 小时、或4小时、或6小时、或12小时、或13小时、或14小时、 或16小时、或24小时、或48小时、或72小时、或96小时、或120 小时、或144小时、或7天、或14天、或21天，其中所述受试者选 自人和因子VIII/血管性血友病因子双重敲除小鼠。另外，在这个段 落的实施方案中，相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，融合蛋白 展现与抗因子VIII抗体的结合降低或保留的促凝血活性更大或两者。 在一个实施方案中，当各自通过体外凝血测定加以测定时，相较于未 连接于XTEN的相应因子VIII，在抗FVIII抗体存在下，重组因子 VIII融合蛋白的促凝血活性大至少30％、或40％、50％、80％、100％、 200％、300％、400％或500％。在一个实施方案中，使用毕提斯达 (Bethesda)测定，利用选自由表10的抗体和来自具有因子VIII抑制剂 的甲型血友病患者的多克隆抗体组成的组的抗因子VIII抗体测定融 合蛋白与抗因子VIII抗体的降低的结合，其中融合蛋白的结合降低 和促凝血活性保留是由相较于未连接于XTEN的因子VIII的毕提斯 达效价，融合蛋白的毕提斯达效价降低至少约2、4、6、8、10、12、 15、20、30、40、50、60、70、80、100或200个毕提斯达单位所证 明。
在一个实施方案中，重组因子VIII融合蛋白可例如包含一个或 多个XTEN，其中当最优比对时，所述XTEN相较于一个或多个选自 表4、表13、表14、表15、表16和表17的具有类似长度的XTEN 具有至少约80％序列同一性、或约90％、或约91％、或约92％、或 约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或 约99％至约100％序列同一性。
在另一方面，本发明涉及包含呈特定N末端至C末端构型的 FVIII和一个或多个XTEN的重组因子VIII融合蛋白。在CFXTEN 组合物的一个实施方案中，本发明提供一种式I的重组因子VIII融合 蛋白：
(XTEN)x-CF-(XTEN)y I
其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括 与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN 是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具 有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或 至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序 列。因此，CFXTEN融合组合物可具有XTEN-CF、XTEN-CF-XTEN 或CF-XTEN构型。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式II的 重组因子VIII融合蛋白：
(XTEN)x-(S)x-(CF)-(XTEN)y II
其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括 与表1中阐述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可 任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；x是 0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN是如本文所述的延伸重 组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80％、或至少 约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约 98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种重组因 子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式III：
(XTEN)x-(S)x-(CF)-(S)y-(XTEN)y III
其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括 与表1中阐述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可 任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；x是 0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN是如本文所述的延伸重 组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80％、或至少 约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约 98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式IV的 重组因子VIII融合蛋白：
(A1)-(XTEN)u-(A2)-(XTEN)v-(B)-(XTEN)w-(A3)-(XTEN)x-(C1)-(XTEN)y-(C2)-(XTEN)zIV
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；A3是FVIII的A3结构域；B是FVIII的B结构域， 其可为所述B结构域的片段或剪接变体；C1是FVIII的C1结构域； C2是FVIII的C2结构域；v是0或1；w是0或1；x是0或1；y 是0或1；y是0或1，前提是u+v+x+y+z≥1；且XTEN是如本 文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少 约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约 97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式V的 重组因子VIII融合蛋白：
(XTEN)t-(S)a-(A1)-(S)b-(XTEN)a-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)v-(S)c-(B)-(S)d-(XTEN)w-(S)d-(A3)-(S)e- (XTEN)x-(S)e-(C1)-(S)f-(XTEN)y-(S)f-(C2)-(S)g-(XTEN)z V
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；A3是FVIII的A3结构域；B是FVIII的B结构域， 其可为所述B结构域的片段或剪接变体；C1是FVIII的C1结构域； C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残 基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序 列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f 是0或1；g是0或1；t是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0 或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，前提是t+u+v+w+x+ y+z≥1；且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与 表4中阐述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨 酸或选自表11和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VI的 重组因子VIII融合蛋白：
(XTEN)u-(S)a-(A1)-(S)b-(XTEN)v-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)w-(S)c-(A3)-(S)d-(XTEN)x-(S)d-(C1)- (S)c-(XTEN)y-(S)c-(C2)-(S)f-(XTEN)z VI
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；A3是FVIII的A3结构域；C1是FVIII的C1结构域； C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残 基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序 列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f 是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1；y是0 或1；z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z≥1；且XTEN是如本文 所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约 80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。在式V的 另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VII 的重组因子VIII融合蛋白：
(SP)-(XTEN)x-(CS)x-(S)x-(FVIII_1-745)-(S)y-(XTEN)y-(S)y-(FVIII_1640-2332)-(S)z-(CS)z- (XTEN)z VII
其中就各次出现独立而言，SP是信号肽，优选具有序列 MQIELSTCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO：1611)，CS是表12中所列的 裂解序列，S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可任选包括 可与限制位点相容的氨基酸的间隔子序列，“FVIII_1-745”是因子 FVIII的残基1-745且“FVIII_1640-2332”是FVIII的残基1640-2332， x是0或1，y是0或1，且z是0或1，其中x+y+z＞2；且XTEN是 如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有 至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。 在式VII的一个实施方案中，间隔子序列是GPEGPS(SEQ ID NO： 1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11 和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VIII 重组因子VIII融合蛋白：
(A1)-(S)a-(XTEN)v-(S)a-(A2)-(B1)-(S)b-(XTEN)w-(S)b-(B2)-(A3)-(S)c-(XTEN)x-(S)c-(C1)-(S)d- (XTEN)y-(S)d-(C2)-(S)e-(XTEN)z VIII
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；B1是B结构域的可具有FVIII的残基741至743-750 或者FVIII的约残基741至约残基745的片段；B2是B结构域的可 具有FVIII的残基1635-1686至1689或者FVIII的约残基1640至约 残基1689的片段；A3是FVIII的A3结构域；C1是FVIII的C1结 构域；C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨 基酸残基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间 隔子序列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0 或1；f是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1； y是0或1；z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z≥1；且XTEN是 如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有 至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。 在式VIII的一个实施方案中，间隔子序列是GPEGPS(SEQ ID NO： 1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11 和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式IX的 重组因子VIII融合蛋白：
(A1N)-(S)a-(XTEN)t-(S)b-(A1C)-(A2N)-(S)c-(XTEN)u-(S)d-(A2C)-(BN)-(S)e-(XTEN)v-(S)f-(BC)-(A3N)- (S)g-(XTEN)w-(S)b-(A3C)-(C1N)-(S)i-(XTEN)x-(S)j-(C1C)-(C2N)-(S)k-(XTEN)y-(S)l-(C2C)-(S)m-(XTEN)zIX
其中就各次出现独立而言，A1N是A1结构域的自至少残基编号 1(相对于天然成熟FVIII加以编号)至至多残基编号371的片段，A1c是A1结构域的自至少残基编号2至至多残基编号372的片段，前提 是所述A1N片段的序列在所述A1c片段中不重复；A2N是A2结构域 的自至少残基编号373至至多残基编号739的片段，A2c是A2结构 域的自至少残基编号374至至多残基编号740的片段，前提是所述 A2N片段的序列在所述A2c片段中不重复；BN是B结构域的自至少 残基编号741至至多残基编号1647的片段，Bc是B结构域的自至少 残基编号742至至多残基编号1648的片段，前提是所述BN片段的序 列在所述Bc片段中不重复；A3N是A3结构域的自至少残基编号1649 至至多残基编号2019的片段，A3c是A3结构域的自至少残基编号 1650至至多残基编号2019的片段，前提是所述A3N片段的序列在所 述A3c片段中不重复；C1N是C1结构域的自至少残基编号2020至至 多残基编号2171的片段，C1c是C1结构域的自至少残基编号2021 至至多残基编号2172的片段，前提是所述C1N片段的序列在所述C1c片段中不重复；C2N是C2结构域的自至少残基编号2173至至多残基 编号2331的片段，C2c是C2结构域的自至少残基编号2174至至多 残基编号2332片段，前提是所述C2N片段的序列在所述C2c片段中 不重复；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可任选包括可 与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；a是0或1；b 是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f是0或1；g是0 或1；h是0或1；i是0或1；j是0或1；k是0或1；l是0或1； m是0或1；t是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是 0或1；y是0或1；z是0或1，前提是t+u+v+w+x+y+z≥1； 且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于相较于一个 或多个选自表4的具有类似长度的XTEN，具有至少约80％序列同一 性、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约 95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％至约100％序列同一 性的序列。在式IX的一个实施方案中，间隔子序列是GPEGPS(SEQ ID NO:1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选 自表11和12的序列。在式IX的另一实施方案中，Z是1。在式IX 的融合蛋白的另一实施方案中，V是1且关于如图3中阐述的全长人 因子VIII序列，XTEN连接于约氨基酸残基编号741至约750的C 末端和氨基酸残基编号1635至约1648的N末端。在式IX的融合蛋 白的另一实施方案中，t、u、v、w、x、y和z的总和等于2、3、4、 5或6。在式IX的另一实施方案中，t、u、v、w、x、y和z的总和 等于2，且v是1且z是1。在式IX的融合蛋白的另一实施方案中， t、u、v、w、x、y和z的总和等于3，v和z各自等于1，且t、u、w、 x或y的任一者是1。在式IX的另一实施方案中，t、u、v、w、x、y 和z的总和等于4，v和w和z各自等于1，且t、u、x或y的两者是 1。在式的IX融合蛋白的另一实施方案中，XTEN的累积长度在约 84个至约3000个氨基酸残基之间。在式IX的另一实施方案中，至 少一个XTEN是紧靠对应于成熟天然人因子VIII中选自由以下组成 的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸残基编号32、220、224、 336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910。在式 IX的融合蛋白的另一实施方案中，各XTEN在选自表5、表6、表7、 表8和表9的位点处连接于所述融合蛋白。在式IX的融合蛋白的另 一实施方案中，当最优比对时，各XTEN相较于选自由表4、表13、 表14、表15、表16和表17中的序列组成的组的具有类似长度的XTEN 具有至少约80％、或约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至 少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少 约97％、或至少约98％、或至少约99％、或约100％序列同一性。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式X的 第一重组因子VIII多肽：
(A1)-a1-(A2)-a2-[B] X
和一种包含式XI的第二多肽：
a3-(A3)-(C1)-(C2) XI
其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以异二聚体形式存在； 其中A1是因子VIII的A1结构域；A2是因子VIII的A2结构域；[B] 是因子VIII的B结构域、其片段或被缺失；A3是因子VIII的A3结 构域；C1是因子VIII的C1结构域；C2是因子VIII的C2结构域； a1、a2和a3是酸性间隔子区域；其中所述A1结构域包含XTEN容 许环-1(A1-1)区域和XTEN容许环-2(A1-2)区域；其中所述A2结构域 包含XTEN容许环-1(A2-1)区域和XTEN容许环-2(A2-2)区域；其中 所述A3结构域包含XTEN容许环-1(A3-1)区域和XTEN容许环 -2(A3-2)区域；其中XTEN序列插入区域A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、 A3-1或A3-2的至少一者中；且其中所述重组因子VIII蛋白展现促凝 血活性。在异二聚体的一个实施方案中，第一多肽和第二多肽形成包 含式(A1)–a1–(A2)–a2–[B]–[a3]–(A3)–(C1)–(C2)的单一多肽 链。在一个前述实施方案中，“融合”是指肽键。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式X的 第一重组因子VIII多肽：
(A1)-a1-(A2)-a2-[B] X
和一种包含式XI的第二多肽：
a3-(A3)-(C1)-(C2) XI
其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以异二聚体形式存在； 其中A1是因子VIII的A1结构域；A2是因子VIII的A2结构域；[B] 是因子VIII的B结构域、其片段或被缺失；A3是因子VIII的A3结 构域；C1是因子VIII的C1结构域；C2是因子VIII的C2结构域； a1、a2和a3是酸性间隔子区域；其中XTEN序列插入a3中；且其 中所述重组因子VIII蛋白展现促凝血活性。在异二聚体的一个实施 方案中，第一多肽和第二多肽形成包含式(A1)–a1–(A2)–a2–[B]– [a3]–(A3)–(C1)–(C2)的单一多肽链。在一个前述实施方案中，“融 合”是指肽键。
在前述式X和XI多肽的实施方案中，XTEN容许环包含在表面 暴露的可挠性环结构内，且其中根据以DSSP数据库的登录号2R7E 储存的成熟因子VIII的二级结构，A1-1位于β链1与β链2之间， A1-2位于β链11与β链12之间，A2-1位于β链22与β链23之间， A2-2位于β链32与β链33之间，A3-1位于β链38与β链39之间 且A3-2位于β链45与β链46之间。在前述式X和XI多肽的其它 实施方案中，包含A1-1的表面暴露的可挠性环结构对应于天然成熟 人因子VIII中自约氨基酸15至约氨基酸45的区域。在前述式X和 XI多肽的其它实施方案中，A1-1对应于天然成熟人因子VIII中自约 氨基酸18至约氨基酸41的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施 方案中，包含A1-2的表面暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人因 子VIII中自约氨基酸201至约氨基酸232的区域。在前述式X和XI 多肽的其它实施方案中，A1-2对应于天然成熟人因子VIII中自约氨 基酸218至约氨基酸229的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施 方案中，包含A2-1的表面暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人因 子VIII中自约氨基酸395至约氨基酸421的区域。在前述式X和XI 多肽的其它实施方案中，A2-1对应于天然成熟人因子VIII中自约氨 基酸397至约氨基酸418的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施 方案中，包含A2-2的表面暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人因 子VIII中自约氨基酸577至约氨基酸635的区域。在前述式X和XI 多肽的其它实施方案中，A2-2对应于天然成熟人因子VIII中自约氨 基酸595至约氨基酸607的区域。在前述式X和XI多肽的其它实施 方案中，包含A3-1的表面暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人因 子VIII中自约氨基酸1705至约氨基酸1732的区域。在前述式X和 XI多肽的其它实施方案中，A3-1对应于天然成熟人因子VIII中自约 氨基酸1711至约氨基酸1725的区域。在前述式X和XI多肽的其它 实施方案中，包含A3-2的表面暴露的可挠性环结构对应于天然人成 熟人因子VIII中自约氨基酸1884至约氨基酸1917的区域。在前述 式X和XI多肽的其它实施方案中，A3-2对应于天然成熟人因子VIII 中自约氨基酸1899至约氨基酸1911的区域。在前述式X和XI多肽 的其它实施方案中，XTEN序列插入区域A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、 A3-1或A3-2的至少两者中。在前述式X和XI多肽的其它实施方案 中，XTEN序列是紧靠对应于成熟天然人因子VIII中选自由以下组成 的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸残基编号32、220、224、 336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910。在前 述式X和XI多肽的其它实施方案中，另一XTEN序列插入a3酸性 间隔子区域中。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，另一XTEN 序列插入紧靠对应于氨基酸1656的氨基酸的下游的a3酸性间隔子 中。在前述式X和XI多肽的其它实施方案中，A1结构域包含XTEN 容许环-1(A1-1)区域和XTEN容许环-2(A1-2)区域，其中A2结构域包 含XTEN容许环-1(A2-1)区域和XTEN容许环-2(A2-2)区域，且其中 A3结构域包含XTEN容许环-1(A3-1)区域和XTEN容许环-2(A3-2) 区域，且其中另一XTEN序列插入区域A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、 A3-1或A3-2的至少一者中。在前述式X和XI多肽的其它实施方案 中，另一XTEN序列是紧靠对应于成熟天然人因子VIII中选自由以 下组成的组的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸残基编号32、220、 224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905和 1910。在式X和XI多肽的前述实施方案中，融合蛋白展现未连接于 XTEN的相应因子VIII的促凝血活性的至少约30％、40％、50％、60％、 70％或80％或90％，其中所述促凝血活性是通过体外凝血测定加以测 定。
在所有实施方案中，当在细胞培养基中表达且通过体外凝血测定 加以测定时，多肽可例如展现体外促凝血活性超过0.5IU/ml或1.0 或1.5或2.0IU/ml。促凝血活性可通过显色测定、单级凝结测定(例 如aPTT)或两者测量。
在一些实施方案中，其中重组因子VIII融合蛋白包含因子VIII 以及至少第一和第二XTEN，所述至少第一XTEN与所述至少第二 XTEN相隔至少10个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、 至少200个氨基酸、至少300个氨基酸或至少400个氨基酸。
在优选实施方案中，重组因子VIII融合蛋白包含因子VIII以及 至少第一XTEN和任选至少第二、或任选至少第三、或任选至少第 四XTEN，所述融合蛋白相较于未连接于XTEN的相应因子VIII展 现与抗因子VIII抗体的结合降低。可体内或通过体外测定评估降低 的结合。在一个实施方案中，体外测定是ELISA测定，其中相较于 未连接于XTEN的FVIII，抗FVIII抗体与融合蛋白的结合降低至少 约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或至少约40％或更多。 在另一实施方案中，体外测定是毕提斯达测定，其中融合蛋白的结合 降低是由相较于未连接于XTEN的因子VIII的毕提斯达效价，融合 蛋白的毕提斯达效价降低至少约2、4、6、8、10、12、15、20、30、 40、50、60、70、80、100或200个毕提斯达单位所证明。在体外测 定中，抗因子VIII抗体选自表10的抗体和来自具有因子VIII抑制剂 的甲型血友病患者的多克隆抗体。在展现与因子VIII抑制剂抗体的 结合降低的包含因子VIII以及至少第一和第二XTEN的重组因子 VIII融合蛋白的特定实施方案中，所述第一XTEN在所述因子VIII 多肽的C2结构域内连接于所述因子VIII多肽，且所述第二XTEN在 所述因子VIII多肽的A1或A2结构域内连接于所述因子VIII多肽， 其中相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，所述融合蛋白展现与因 子VIII抑制剂抗体的结合降低，其中所述因子VIII抑制剂抗体能够 结合位于所述A1、A2或C2结构域内的表位，且此外，其中所述融 合蛋白展现促凝血活性。在前述融合蛋白的一个实施方案中，第二 XTEN在因子VIII多肽的A2结构域内连接于所述因子VIII多肽且因 子VIII抑制剂抗体结合因子VIII多肽的A2结构域。在前述融合蛋 白的另一实施方案中，第二XTEN在因子VIII多肽的C2结构域内连 接于所述因子VIII多肽且因子VIII抑制剂抗体结合因子VIII多肽的 C2结构域。相较于未连接于XTEN的相应因子VIII，当通过ELISA 测定加以测定时，抗因子VIII抗体与融合蛋白的结合降低至少约5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％，其中所述抗因子VIII 抗体选自由表10中的抗体和来自具有因子VIII抑制剂的甲型血友病 受试者的多克隆抗体组成的组。前述融合蛋白可进一步包含至少三个 XTEN，其中至少第三XTEN在选自以下的位点处连接于因子VIII： 在B结构域内或置换B结构域、在C末端处、以及在选自表7或表 9的插入位点的1、2、3、4、5或6个氨基酸处或内。在与抗因子 VIII抗体的结合降低的实施方案中，相较于未连接于XTEN的相应因 子VIII，当通过体外凝血测定(例如显色或单级凝结测定)加以测定时， 融合蛋白在抗FVIII抗体存在下的促凝血活性大至少10％、20％、30％、 40％、50％、80％、100％、200％、300％、400％或500％或更多。
在所有实施方案中，融合蛋白的XTEN的特征可例如在于XTEN 包含至少36、或至少42、或至少72、或至少96、或至少144、或至 少288、或至少400、或至少500、或至少576、或至少600、或至少 700、或至少800、或至少864、或至少900、或至少1000、或至少 2000至约3000个氨基酸残基或甚至更多残基；甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基的总和占XTEN 的总氨基酸残基的至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或 至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％；XTEN 大致上是非重复的以致(i)XTEN不含有三个相同连续氨基酸，除非氨 基酸是丝氨酸；(ii)至少约80％的XTEN序列由非重叠序列基序组成， 所述序列基序各自包含约9至约14、或约12个由四至六个选自甘氨 酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的 氨基酸组成的氨基酸残基，其中在各非重叠序列基序中，任何两个连 续氨基酸残基都不出现超过两次；或(iii)XTEN序列的子序列计分小 于10；XTEN具有大于90％、或大于95％、或大于99％无规卷曲形 成率(如通过GOR算法所确定)；XTEN具有小于2％α螺旋和2％β 折叠(如通过Chou-Fasman算法所确定)；当通过TEPITOPE算法分析 时，XTEN缺乏预测的T细胞表位，其中关于通过所述算法进行所述 预测的TEPITOPE阈值计分的阈值是–9，且其中所述融合蛋白展现终 末半衰期长于至少约12小时、或至少约24小时、或至少约48小时、 或至少约72小时、或至少约96小时、或至少约120小时、或至少约 144小时、或至少约21天或更长。在一个实施方案中，重组因子VIII 融合蛋白包含可与另一XTEN相同或不同的至少第二、或至少第三、 或至少第四XTEN。根据一种不同方法，当最优比对时，CFXTEN融 合蛋白的至少一个、至少第二、或至少第三、或至少第四XTEN相 较于一个或多个选自表4、表13、表14、表15、表16和表17的具 有类似长度的XTEN各自具有至少约80％序列同一性、或约90％、 或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、 或约97％、或约98％或约99％至约100％序列同一性。在另一不同方 法中，CFXTEN融合蛋白的至少一个、至少第二、或至少第三、或至 少第四XTEN相较于选自以下的序列各自具有至少90％、或约91％、 或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、 或约98％、或约99％至约100％序列同一性：AE42_1、AE42_2、 AE42_3、AG42_1、AG42_2、AG42_3、AG42_4、AE144_1A、 AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、 AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AG144_1、AG144_2、AG144_A、 AG144_B、AG144_C、AG144_F、AG144_3、AG144_4、AE288_1、 AE288_2、AG288_1和AG288_2。
在一个实施方案中，CFXTEN重组因子VIII融合蛋白的因子VIII 组分包含一个、两个或三个选自相对于成熟人因子VIII编号的残基 R1648、Y1680和R1689的氨基酸取代，其中所述取代选自丙氨酸、 甘氨酸和苯丙氨酸。所述取代的非限制性实例包括R1648A、Y1680F 和R1689A。
在另一实施方案中，当通过尺寸排阻色谱或类似方法测量时， CFXTEN融合蛋白展现表观分子量因子至少约1.3、或至少约2、或 至少约3、或至少约4、或至少约5、或至少约6、或至少约7、或至 少约8、或至少约9、或至少约10。
在CFXTEN融合蛋白的一些实施方案中，一个或多个XTEN将 通过一个或两个各自可由选自由因子XIa、因子XIIa、激肽释放酶 (kallikrein)、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、弹性 蛋白酶-2(Elastase-2)、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20组成 的组的哺乳动物蛋白酶裂解的裂解序列连接于FVIII，其中由所述哺 乳动物蛋白酶在所述裂解序列处进行的裂解使因子VIII序列自 XTEN序列释放，且其中释放的因子VIII序列相较于未裂解融合蛋白 展现促凝血活性增加。在一个实施方案中，裂解序列可由因子XIa裂 解。
根据一种不同方法，CFXTEN融合蛋白包含至少三个位于因子 VIII多肽的不同位置处的XTEN，其中所述不同位置选自：在来自选 自表5、表6、表7、表8和表9的位点的1至6个氨基酸处或内的 插入位置；在成熟因子VIII的氨基酸残基32、220、224、336、339、 390、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910的1至6个 氨基酸处或内的位置；在因子VIII序列中任何两个邻近结构域之间 的位置，其中所述两个邻近结构域选自由A1和A2、A2和B、B和 A3、A3和C1、以及C1和C2组成的组；关于如图3中阐述的全长 人因子VIII序列，在自在约氨基酸残基编号741至约750处的第一 位置开始且在于氨基酸残基编号1635至约1648处的第二位置处结束 的内部B结构域缺失内的位置；和因子VIII序列的C末端，其中多 个XTEN的累积长度是至少约100至约3000个氨基酸残基且其中融 合蛋白相较于未连接于XTEN的相应因子VIII保留至少约30％、或 约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％的 促凝血活性，其中促凝血活性是通过体外凝血测定加以测定。在一个 前述实施方案中，当向受试者施用时，融合蛋白相较于缺乏所述 XTEN的相应因子VIII多肽展现终末半衰期延长，其中当向受试者施 用时，所述融合蛋白展现终末半衰期至少约3小时、或4小时、或6 小时、或12小时、或13小时、或14小时、或16小时、或24小时、 或48小时、或72小时、或96小时、或120小时、或144小时、或 7天、或14天、或21天。在一个实施方案中，受试者选自由人和因 子VIII/血管性血友病因子双重敲除小鼠组成的组。在一个前述实施 方案中，融合蛋白不包含选自GTPGSGTASSSP(SEQ ID NO:31)、 GSSTPSGATGSP(SEQ ID NO:32)、GSSPSASTGTGP(SEQ ID NO: 33)、GASPGTSSTGSP(SEQ ID NO:34)和
GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP(SEQ ID NO:59)的序列。在另一前述实施方案中，融合蛋白不含 有由
GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP(SEQ ID NO:59)、
PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSG TASSS(SEQ ID NO:71)或
PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSA STGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPS ASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSST PSGATGS(SEQ ID NO:80)组成的XTEN序列。
在另一方面，本发明涉及相较于未连接于XTEN的FVIII具有增 强的药代动力学性质，包括提高的参数的CFXTEN融合蛋白，其中 所述增强的性质包括但不限于相较于未连接于XTEN的FVIII，终末 半衰期变长、曲线下面积变大、血液浓度保持在治疗窗内的时间增加、 导致血液浓度在治疗窗内的连续剂量之间的时间增加、以及以IU计 的可施用的剂量随时间降低，但仍然导致血液浓度高于为促凝血作用 所需的阈值浓度。在一些实施方案中，当向受试者施用时，CFXTEN 融合蛋白相较于缺乏所述XTEN的相应因子VIII多肽展现终末半衰 期延长。受试者可为人或小鼠，如因子VIII/血管性血友病因子双重 敲除小鼠。在一个前述实施方案中，当向受试者施用时，相较于未连 接于XTEN的相应因子VIII，CFXTEN展现终末半衰期长至少约2 倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约10倍、或约20倍。在一 个实施方案中，当向受试者施用时，CFXTEN融合蛋白展现终末半衰 期至少约3小时、或4小时、或6小时、或12小时、或13小时、或 14小时、或16小时、或24小时、或48小时、或72小时、或96小 时、或120小时、或144小时、或7天、或14天、或21天。在其它 实施方案中，实施方案的融合蛋白的增强的药代动力学性质是相较于 未连接于XTEN且以类似剂量向受试者施用的相应FVIII，维持有需 要的受试者中的促凝血融合蛋白的循环血液浓度高于0.01IU/ml、或 0.05IU/ml、或0.1IU/ml、或0.2IU/ml、或0.3IU/ml、或0.4IU/ml 或0.5IU/ml的阈值浓度持续的时期长至少约2倍、或至少约3倍、 或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至 少约10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍的性质。 半衰期和高于阈值浓度花费的时间的增加允许相较于未连接于 XTEN的相应FVIII，降低给药频率以及降低向受试者施用的融合蛋 白(以摩尔当量计)的量。在一个实施方案中，相较于未连接于XTEN 且使用类似剂量方案向受试者施用的相应FVIII，使用治疗有效剂量 方案向受试者施用主题融合蛋白导致融合蛋白的血液水平的至少两 个连续Cmax峰值和/或Cmin谷底值之间的时间增加至少2倍、或至 少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少8倍、或至 少10倍、或至少约20倍、或至少约40倍、或至少约60倍或更高。
在优选实施方案中，CFXTEN融合蛋白相较于未连接于XTEN 的相应因子VIII保留至少约30％、或约40％、或约50％、或约60％、 或约70％、或约80％、或约90％的促凝血活性，其中促凝血活性是 通过体外凝血测定，如但不限于显色测定或单级或两级凝结测定加以 测定。
根据一种不同方法，本发明提供包含因子VIII多肽和至少一个 延伸重组多肽(XTEN)的重组因子VIII融合蛋白，其中所述因子VIII 多肽包含A1结构域、A2结构域、A3结构域、C1结构域、C2结构 域和任选B结构域的全部或一部分，且其中所述至少一个XTEN在 选自残基编号18-32、或40、或211-224、或336-403、或599、或 745-1640、或1656-1728、或1796-1804、或1900-1912、或2171-2332 的插入位点处连接于所述因子VIII多肽；且其中所述融合蛋白相较 于未连接于XTEN的相应因子VIII保留至少约30％、或约40％、或 约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％的促凝血活性。 在一个前述实施方案中，融合蛋白包含至少第二XTEN、或至少第三、 或至少第四XTEN，其中所述XTEN在于选自表5、表6、表7、表8 和表9的位点的1至6个氨基酸处或内的位点处连接于因子VIII。在 另一实施方案中，本发明提供一种重组因子VIII融合蛋白，其进一 步包含在选自表5、表6、表7、表8、表9的插入位点处、在于来自 图8的一个或多个插入位置处的插入位置的N末端或C末端侧的6 个氨基酸处或内、以及在一个或多个来自图9的插入范围内连接于所 述FVIII多肽的至少第二XTEN、或至少第三、或至少第四XTEN， 其中至少两个XTEN由具有至少100至约400个氨基酸的氨基酸序 列分隔。
本发明提供CFXTEN，其中XTEN的XTEN半径比率是至少2.3 或至少2.5，且由具有至少约20个氨基酸残基、或至少约50、或至 少约100、或至少约200、或至少约300、或至少约400个氨基酸残 基的氨基酸序列分隔。在其它实施方案中，CFXTEN包含至少四个 XTEN，其中所述XTEN的XTEN半径比率是至少2.3、或至少2.5、 或至少2.8，且其中四个XTEN中连接于融合蛋白的至少三者由具有 至少约20个氨基酸残基、或至少约50、或至少约100、或至少约200、 或至少约300、或至少约400个氨基酸残基的氨基酸序列分隔，且第 四XTEN连接在B结构域(或其片段)内或在C结构域(或其末端)内。
在一些实施方案中，主题组合物被构造来相较于未连接于XTEN 的相应FVIII，对受试者中的清除受体具有降低的结合亲和力。在一 个实施方案中，CFXTEN融合蛋白展现对FVIII的清除受体的结合亲 和力在未连接于XTEN的相应FVIII的结合亲和力的约0.01％-30％、 或约0.1％至约20％、或约1％至约15％、或约2％至约10％的范围内。 在另一实施方案中，相较于未连接于XTEN的相应FVIII，对清除受 体的亲和力降低的融合蛋白的主动清除降低且半衰期相应增加长至 少约2倍、或3倍、或至少4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或 至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、或至 少约12倍、或至少约15倍、或至少约17倍、或至少约20倍。
在一实施方案中，本发明提供一种包含FVIII和一个或多个 XTEN的重组因子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白相较于未连接于 XTEN的FVIII展现在生理条件下的溶解度增加至少3倍、或至少约 4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至少约8倍、 或至少约9倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少20倍、或 至少40倍、或至少60倍。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述的任 何实施方案的融合蛋白和药学上可接受的载体。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗受试者的凝血病变的方 法，其包括向所述受试者施用包含凝结有效量的药物组合物的组合 物。在所述方法的一个实施方案中，在所述施用之后，促凝血因子 VIII的血液浓度维持在约0.05、或1、或1.5IU/ml或更高持续至少所 述施用之后48小时。在另一实施方案中，本发明提供一种使受试者 的血液凝结的方法，其包括使凝结有效量的药物组合物与血液接触。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗具有因子VIII的循环 抑制剂的受试者的凝血病变的方法，其包括向所述受试者施用包含治 疗有效量的CFXTEN的药物组合物的组合物，其中所述组合物相较 于包含未连接于XTEN且使用类似量施用的相应因子VIII的组合物 展现在所述受试者中的促凝血活性更大。在所述方法的一个实施方案 中，凝血病变是甲型血友病。在另一实施方案中，凝血病变是创伤或 手术或感染的结果。
本发明提供一种治疗受试者的流血事件的方法，其包括向所述受 试者施用包含凝结有效量的CFXTEN药物组合物的组合物，其中所 述凝结有效量的融合蛋白相较于未连接于XTEN且使用类似量向所 述受试者施用的相应因子VIII遏止流血事件持续的时期长至少3倍、 或至少4倍、或至少5倍。未连接于XTEN的相应因子VIII的非限 制性实例包括天然FVIII、表1的序列、BDD-FVIII和pCB0114FVIII。
在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗甲型血友病患者的 医药方案的CFXTEN重组因子VIII融合蛋白，所述方案包括包含 CFXTEN融合蛋白的药物组合物。在所述医药方案的一个实施方案 中，方案进一步包括确定为在甲型血友病患者中实现止血所需的包含 CFXTEN的药物组合物的量的步骤。在另一实施方案中，用于治疗甲 型血友病受试者的医药方案包括以有效量连续两剂或更多剂向受试 者施用药物组合物，其中相较于未连接于XTEN且使用类似剂量施 用的因子VIII，所述施用导致至少一个、两个或三个与甲型血友病相 关的参数较大改善至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、 或60％、或70％、或80％、或90％。改善的参数的非限制性实例包 括促凝血FVIII的血液浓度、活化的部分凝血酶原(aPTT)测定时间减 少、单级或两级凝结测定时间减少、流血事件的发作延迟、显色测定 时间减少、流血测定时间减少、流血事件解决、或相对于天然FVIII 的毕提斯达效价降低。
在另一方面，本发明提供编码CFXTEN融合蛋白的任一实施方 案的融合蛋白的分离的核酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸是 编码实施方案的CFXTEN融合蛋白的序列的互补序列。在一个实施 方案中，分离的核酸进一步包含编码信号肽的序列，其中所述序列是 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGA TTCTGCTTTAGT(SEQ ID NO:1613)或其互补序列。在另一实施方案 中，本发明提供一种包含编码融合蛋白的核酸或其互补序列的表达载 体。在另一实施方案中，本发明提供一种包含前述表达载体的分离的 宿主细胞。在另一实施方案中，本发明提供一种产生任何实施方案的 融合蛋白的方法，其包括提供包含表达载体的宿主细胞；培养所述宿 主细胞以实现所述融合蛋白的产生；以及回收所述融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的融合蛋白，其包含当 最优比对时，相较于选自表21的具有类似长度的序列具有至少约 80％序列同一性、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或 约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％至约 100％序列同一性的多肽。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，其包含选自以 下的多核苷酸序列：(a)当最优比对时，相较于选自表21的具有类似 长度的序列具有至少约80％序列同一性、或约90％、或约91％、或 约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、 或约98％或约99％至约100％序列同一性的序列，或(b)(a)的多核苷 酸的互补序列。在另一实施方案中，分离的核酸包含连接于(a)的核酸 的5’末端的序列ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGT GCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID NO:1613)或所述序列 的连接于(b)的3’末端的互补序列。
明确涵盖的是重组因子VIII融合蛋白可展现本文公开的性质的 一者或多者或任何组合。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并 入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公 布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图简述
本发明的特征和优势可通过参照以下详细描述和阐述说明性实 施方案的附图加以进一步说明。
图1显示在加工和凝结期间的FVIII构造和结构域的空间排列的 图示，且意图表示天然FVIII与B结构域缺失的变体两者。A1结构 域在残基1至372(编号是相对于成熟形式的FVIII序列NCBI蛋白质 RefSeq NP_000123且涵盖a1残基)的范围内，A2结构域在残基373 至740的范围内，B结构域在残基741至1648的范围内，A3结构域 在残基1649至2019(涵盖a3酸性区域)的范围内，C1结构域在2020 至2172的范围内，且C2结构域在残基2173至2332的范围内。BDD 变体包括在范围741至1648之间的缺失，从而留下一些剩余残基或 不留下剩余残基，其中非限制性BDD剩余序列是 SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:1614)。图1A显示在加工之前单链 FVIII的结构域构造。箭头指示在残基R372、R740、R1648和R1689 处的在加工和FVIII转化成FVIIIa时被裂解的位点。图1B显示已通 过在R1648残基处裂解加工成异二聚体的FVIII分子，其中A3结构 域的a3酸性区域指示在A3的N末端上。图1C显示通过在R372、 R740和R1689残基处裂解加工成FVIIIa异三聚体的FVIII分子。
图2是凝血级联的示意图，其显示通向共同路径的内源性和外源 性臂。
图3描绘成熟人因子VIII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1592)。
图4描绘缺失一部分B结构域的因子VIII序列(SEQ ID NO: 1593)。
图5说明FVIII连接于XTEN的CFXTEN构型的若干实例(XTEN 显示为粗波形线)。在所有情况下，FVIII都可为FVIII的天然或BDD 形式，或移除整个B结构域(包括天然裂解位点)的单链形式。图5A 从左到右显示单链因子VIII的三种变化形式，即XTEN连接于N末 端、C末端以及两个XTEN连接于N末端和C末端。图5B从左到右 显示成熟异二聚体FVIII的六种变化形式，即XTEN连接于A1结构 域的N末端；XTEN连接于C2结构域的C末端；XTEN连接于A1 结构域的N末端和C2结构域的C末端；XTEN连接于A1结构域的 N末端和A3结构域的N末端；XTEN连接于C2结构域的C末端和 通过残余B结构域氨基酸连接于A3结构域的N末端；以及XTEN 连接于A1结构域的N末端、通过残余B结构域氨基酸连接于A2结 构域的C末端以及连接于C2结构域的C末端。图5C从左到右显示， 单链因子VIII的三种变化形式：XTEN连接于A1结构域的N末端， XTEN连接在A1结构域的表面环内以及XTEN连接在A3结构域的 表面环内；XTEN连接在A2结构域的表面环内，XTEN连接在C2 结构域的表面环内以及XTEN连接于C2结构域的C末端；XTEN连 接于A1结构域的N末端和在C1结构域的表面环内以及连接于C结 构域的C末端。图5D从左到右显示成熟异二聚体FVIII的六种变化 形式，即XTEN连接于A1结构域的N末端，XTEN连接在A1结构 域的表面环内以及XTEN连接在A3结构域的表面环内；XTEN连接 在A2结构域的表面环内，和XTEN连接在C1结构域的表面环内以 及XTEN连接于C2结构域的C末端；XTEN连接于A1结构域的N 末端，XTEN连接在A1结构域的表面环内，XTEN连接在A3结构 域的表面环内以及XTEN连接于C2结构域的C末端；XTEN连接于 A1结构域的N末端，XTEN通过B结构域的残余氨基酸连接于A3 结构域的N末端以及XTEN连接在C2结构域的表面环内；XTEN连 接在A2结构域的表面环内，XTEN通过B结构域的残余氨基酸连接 于A3结构域的N末端，XTEN连接在C1结构域的表面环内以及 XTEN连接于C2结构域的C末端；以及XTEN连接在B结构域内或 BDD变体的残余B结构域残基之间(且本发明也涵盖以下变化形式： 其中XTEN置换连接A2和A3结构域的B结构域全部(包括所有天然 裂解位点)，从而产生单链形式的因子VIII)。这个图也包括其中一个 或多个XTEN序列插入在B结构域内且所得融合物在细胞内加工期 间在一个或多个位点处(例如，在R1648位点处)被裂解的所有变化形 式。
图6是XTEN插入在B结构域内以及连接于C2结构域的C末 端的CFXTEN构建体的图形描绘，其说明XTEN的导致形成可覆盖 因子VIII邻近于XTEN的部分的无规卷曲的非结构化特征。在下图 中，图式描绘当XTEN呈无规卷曲时，它可采用产生会阻断因子VIII 抑制剂抗体的结合的空间位阻的构象，所述抗体否则将对邻近于 XTEN插入位点的表位具有亲和力。
图7是对FVIII B结构域缺失序列进行的用以鉴定XTEN在FVIII 序列内的插入位点的各种分析的图形描绘。A-H行的各者处于跨越 FVIII BDD序列的Y轴值的任意标度上以使低值表示对XTEN插入 物的预测耐受性较高的区域，其中残基编号在X轴上。A行显示结 构域边界；这行中的所有中断都表示可能接受XTEN的边界。B行显 示外显子边界；即所述行中的各阶跃都表示新外显子。C行显示由于 在晶体中缺乏次序而在X射线结构中不可见的区域。标记的D行表 示使用相应程序FoldIndex以及RONN计算的多个次序预测结果，所 述FoldIndex见于万维网站点bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex(2011年 2月23日末次访问)上(参见Jaime Prilusky,Clifford E.Felder,Tzviya Zeev-Ben-Mordehai,Edwin Rydberg,Orna Man,Jacques S.Beckmann, Israel Silman和Joel L.Sussman,2005,Bioinformatics based on the Kyte &Doolitlle algorithm)，所述RONN见于万维网站点 strubi.ox.ac.uk/RONN(2011年2月23日末次访问)上(参见Yang,Z.R., Thomson,R.,McMeil,P.和Esnouf,R.M.(2005)RONN:the bio-basis function neural network technique applied to the detection of natively disordered regions in proteins Bioinformatics 21:3369-3376)。E和F行 是基于可在GenBank中获得的来自11种哺乳动物的FVIII基因的多 个序列比对加以计算。E行表示个别残基的保守性。F行表示FVIII 的含3个氨基酸的区段的保守性。G和H行表示在11个哺乳动物 FVIII基因的多个序列比对中观察到的间隙和插入。J行通过氨基酸 编号列出基于组合以上多个测量结果所获得的XTEN插入点。
图8描绘使用图8中描绘的信息且如实施例34的测定中所确认， 在FVIII B结构域缺失序列(SEQ ID NO:1594)中鉴定为XTEN的活性 插入点的位点。
图9描绘使用图8和或实施例34中描绘的信息外加各插入点周 围的被视为适于插入XTEN的一定跨度的氨基酸，在FVIII B结构域 缺失序列(SEQ ID NO:1595)中被鉴定用于插入XTEN的位点的范围。
图10是通过如对于图7所述鉴定插入点，随后使用分子生物学 技术在各个插入点处插入单一XTEN(黑色棒条)来产生的CFXTEN文 库的装配的示意图。表达并回收构建体，接着评估FVIII活性和药代 动力学性质以鉴定导致性质增强的那些CFXTEN构型。
图11是CFXTEN组分文库的装配的示意图，其中单一或连接于 各种长度的XTEN(黑色棒条)的FVIII BDD结构域的区段以组合方式 装配成编码CFXTEN的基因的文库，可接着评估所述文库的FVIII 活性和药代动力学性质以鉴定导致性质增强的那些CFXTEN构型。
图12说明具有XTEN(显示为粗波形线)的CFXTEN构型的若干 实例，其中某些XTEN可通过插入可由促凝血蛋白酶裂解的裂解序 列(由黑色三角指示)加以释放。图12A说明具有两个末端可释放 XTEN的scFVIII。图12B说明与图12A相同的构型，但具有连接A3 和C1结构域的额外非可释放XTEN。图12C说明具有两个末端可释 放XTEN的成熟异二聚体FVIII。图12D说明与10C相同的构型，但 具有连接A3和C1结构域的额外非可释放XTEN。
图13是装配、产生和评估XTEN中的代表性步骤的示意流程图。
图14是装配编码融合蛋白的CFXTEN多核苷酸构建体中的代表 性步骤的示意流程图。个别寡核苷酸501退火成序列基序502(如含 12个氨基酸的基序(“12-mer”))，其被连接于来自文库的其它序列基序 以产生涵盖所需长度的XTEN 504的集合，且连接于较小浓度的含有 BbsI和KpnI限制位点的寡聚物503。将连接产物的所得集合进行凝 胶纯化且切割具有所需长度的XTEN的条带，从而产生具有封堵序 列(stopper sequence)505的分离的XTEN基因。将XTEN基因克隆 至填充载体中。在这个情况下，载体编码任选CBD序列506和GFP 基因508。接着用BbsI/HindIII进行消化以移除507和508且放置终 止密码子。接着将所得产物克隆至BsaI/HindIII消化的含有编码FVIII 的基因的载体中，从而产生编码FVIII-XTEN融合蛋白的基因500。
图15是装配编码包含CF和XTEN的融合蛋白的基因、所述基 因以融合蛋白形式表达和回收、以及所述融合蛋白作为候选CFXTEN 产物加以评估中的代表性步骤的示意流程图。
图16说明使用供体XTEN序列来产生截短XTEN。图16A提供 AG864的序列(SEQ ID NO:1596)，其中加下划线序列用于产生序列 长度576(SEQ ID NO:1597)。图16B提供AG864的序列(SEQ ID NO: 1598)，其中加下划线序列用于产生序列长度288(SEQ ID NO:1599)。 图16C提供AG864的序列(SEQ ID NO:1600)，其中加下划线序列用 于产生序列长度144(SEQ ID NO:1601)。图16D提供AE864的序列 (SEQ ID NO:1602)，其中加下划线序列用于产生序列长度576(SEQ ID NO:1603)。图16E提供AE864的序列(SEQ ID NO:1604)，其中加 下划线序列用于产生序列长度288(SEQ ID NO:1605)。图16F提供用 于产生四个144长度的序列(按照出现顺序分别是SEQ ID NO 1607-1610)的AE864的序列(SEQ ID NO:1606)(双下划线指示144序 列中的首个氨基酸，其中单下划线表示那个序列的其余部分)。
图17是以将XTEN元件引入FVIII编码序列中的不同策略设计 因子VIII-XTEN表达载体的图示。图17A显示编码融合于编码FVIII 的序列的3’末端的XTEN的表达载体。图17B描绘编码插入编码单 一FVIII的编码序列的中部中的XTEN元件的表达载体。图17C描绘 编码两个XTEN元件：一个插入FVIII编码序列的内部，且另一融合 于FVIII编码序列的3’末端的表达载体。
图18说明编码XTEN的基因的组合基因装配的过程。在这种情 况下，基因自6个碱基片段装配且各片段可以4种不同密码子形式(A、 B、C和D)获得。这允许在装配含12个氨基酸的基序时实现理论多 样性4096。
图19显示在皮下或静脉内施用的单剂的连接于不同长度的非结 构化多肽的GFP不同组合物之后，在食蟹猕猴中的药代动力学分布 图(血浆浓度)，如实施例41中所述。组合物是GFP-L288、GFP-L576、 GFP-XTEN_AF576、GFP-Y576和XTEN_AD836-GFP。在注射之后 各种时间分析血液样本且使用用于捕获的针对GFP的多克隆抗体和 相同多克隆抗体的用于检测的生物素化制剂，通过ELISA测量血浆 中的GFP的浓度。结果呈现为在给药之后相对于时间(小时)的血浆浓 度，且特别显示XTEN_AD836-GFP(即XTEN序列长度最长的组合物) 的半衰期可观增加。序列长度最短的构建体GFP-L288具有最短半衰 期。
图20显示来自XTEN_AE864融合于GFP的N末端的融合蛋白 的稳定性研究的样本的SDS-PAGE凝胶(参见实施例42)。在37℃下 在食蟹猕猴血浆和大鼠肾溶解产物中孵育GFP-XTEN多达7天。此 外，也评估向食蟹猕猴施用的GFP-XTEN。在0、1和7天取样且通 过SDS PAGE分析，然后用针对GFP的抗体使用蛋白质印迹分析进 行检测。
图21显示对相对于分子量已知的蛋白质标准物测量的胰高血糖 素-XTEN构建体样本的尺寸排阻色谱分析的结果，其中图输出为吸 光度对滞留体积，如实施例40中所述。胰高血糖素-XTEN构建体是 1)胰高血糖素-Y288；2)胰高血糖素Y-144；3)胰高血糖素-Y72；和4) 胰高血糖素-Y36。结果指示表观分子量随XTEN部分的长度增加而 增加(对于数据，参见实施例40)。
图22显示由用如所指定的构建体转化的细胞的细胞培养物表达 的蛋白质的蛋白质印迹的结果(实施例25)。泳道1-12中的样本分别 是：MW标准物、FVIII(42.5ng)、pBC0100B、pBC0114A、pBC0100、 pBC0114、pBC0135、pBC0136、pBC0137、pBC0145、pBC0149和 pBC0146。泳道8、9和12显示与估计MW是95kDa的具有C末端 XTEN288的FVIII一致的条带。泳道7和11显示与估计MW是175 kDa的具有C末端XTEN42的FVIII一致的条带。泳道2-6显示与 FVIII和重链一致的条带。泳道10和23显示与重链一致的条带。泳 道7显示与重链和连接的XTEN42一致的条带。
图23显示对自流体动力学注射质粒DNA的FVIII和血管性血友 病因子双重敲除小鼠获得的样本的FVIII测定的结果，如实施例36 中所详述。
图24是如实施例30中所述向HemA或FVIII/VWF双重敲除小 鼠施用的rBDD-FVIII和纯化CFXTEN融合蛋白pBC0145和 pBC0146(具有C末端XTEN)的药代动力学性质的图形和表格描绘， 其显示CFXTEN在两种小鼠品系中的半衰期均增强。
图25是使用在HemA小鼠中进行的细胞培养物PK测定，向 HemA(图25A)或FVIII/VWF双重敲除小鼠(图25B)施用的 rBDD-FVIII和CFXTEN融合蛋白pSD0050和pSD0062(具有内部插 入的XTEN)的药代动力学性质的图形和表格描绘。如实施例32中所 述，显示剂量、5分钟回收率和半衰期(T1/2)，从而强调在两种小鼠 品系中，相较于阳性对照FVIII，CFXTEN的回收率和半衰期得以增 强。
图26是使用pBC0114BDD-FVIII和含有三个在残基18、745和 2332处的144个氨基酸的XTEN插入的CFXTEN构建体 LSD0049.002滴定GMA8021FVIII抑制剂的图形描绘。数据指示相 较于FVIII阳性对照，为在50％程度上抑制CFXTEN所需的以μg/ml 计的抗体量右移约0.7数量级。
图27是算法SegScore的逻辑流程图的示意图。在图中，以下图 例适用：i，j-用于穿过整个序列的控制回路中的计数器；HitCount- 这个变量是记录子序列在嵌段中遇到相同子序列多少次的计数器； SubSeqX-这个变量保存被检查冗余度的子序列；SubSeqY-这个变量保 存SubSeqX被检查所针对的子序列；BlockLen-这个变量保存使用者 确定的嵌段长度；SegLen-这个变量保存区段长度。程序被硬编码来 产生长度是3,4,5,6,7,8,9和10的子序列的计分；Block-这个变量 保存一串长度BlockLen。所述串主要由来自输入XTEN序列的字母 组成且由i计数器的位置所确定；SubSeqList-这是保存所有产生的子 序列计分的清单。
图28描绘对11个氨基酸的假设XTEN(SEQ ID NO:1591)应用算 法SegScore以确定重复性。由N个氨基酸组成的XTEN序列被分成 N-S+1个长度是S的子序列(在这个情况下S＝3)。对所有子序列进行 逐对比较且计算相同子序列的平均数目以产生子序列计分1.89。
图29是在暴露于针对FVIII的GMA8021抗体之后，测定的 CFXTEN中的FVIII活性与pBC114FVIII阳性对照的FVIII活性的个 别构建体比率值的图，分组是根据构建融合蛋白中的XTEN的数目 (参见实施例28)。结果显示CFXTEN保留FVIII活性的能力与并入的 XTEN的数目增加基本上成线性关系。
图30描绘成熟B结构域缺失的(BDD)人FVIII构建体的一级序 列和结构域结构(实施例46)。显示引入的NheI和ClaI限制位点的位 置。应注意氨基酸编号对应于成熟FVIII的一级序列中的氨基酸位置 (图30)。个别结构域是通过灰色线/框加以限定，其中用灰色文本鉴 定结构域。酸性区域(a1、a2、a3)用虚线框指示。实心楔/三角指示FVIII 活化成FVIIIa时的凝血酶裂解位点。空心楔/三角指示细胞内蛋白水 解加工成双链形式的FVIII的位点。六角形指示N连接的糖基化的位 点。圆圈指示Tyr硫酸化的位点。引入cDNA中以有助于XTEN插入 /重组的独特非天然限制位点(NheI，GCTAG；ClaI，ATCGAT)用灰色 以双下划线加以突出。
图31提供图30中所述的FVIII构建体的图解表示，其指示结构 域组构以及天然和非天然限制位点的位置。
图32显示结构数据集2R7E、3CDZ和PM0076106的图示ASA View输出结果。显示结构域A1、A2、A3、C1和C2中的氨基酸的 可及溶剂面积(ASA)。对存放在由结构生物信息学研究合作协会(Res earch Collaboratory for Structural Bioinformatics)(RCSB；http://www. rcsb.org/pdb)维护的蛋白质数据库(Protein Data Bank)中的X射线结 晶坐标3CDZ(Ngo等,Structure 16:597-606(2008))和2R7E(Shen等, Blood 111:1240-1247(2008))、以及对存放在由Consorzio Interuniv ersitario per le Applicazioni di Supercalcolo per Università e Riserc a(CASPUR)和罗马大学生物化学科学系(Department of Biochemical Sciences of the University of Rome)维护的蛋白质模型数据库(Protei n Model Database)(http://mi.caspur.it/PMDB/main.php)中的由分子动 力学模拟研究获得的预测细化FVIII结构的原子坐标PM0076106(Ven kateswarlu,BMC Struct.Biol.10:7(2010))进行分析。
图33显示XTEN插入位点的位置的结构示意图。对应于FVIII 的晶体结构(PDB：2R7E)的中心图式由结构域A1、A2、A3、C1和 C2的详细视图围绕。β链和α螺旋显示为条带表示。环显示为α碳 管。在XTEN插入位点处的氨基酸显示为CPK球形表示。各图中的 编号指示根据图30中的编号的XTEN插入位点的位置。
图34显示图33中所示的XTEN插入位点的位置的结构示意图， 其中所得重组FVIII蛋白显示FVIII活性。
图35显示图34中所示的XTEN插入位点的位置的结构示意图， 其中所得重组FVIII蛋白显示FVIII活性。
图36显示图35中所示的XTEN插入位点的位置的结构示意图， 其中所得重组FVIII蛋白显示FVIII活性。
图37显示FVIII的结构域A1、A2、A3、C1和C2的ClustalW 多个序列比对，其显示导致重组FVIII蛋白显示FVIII活性(黑色框、 白色文本)或不显示FVIII活性(灰色框、粗体文本)的XTEN插入位置。
图38显示对以标识符2R7E存放在蛋白质数据库处的天然活性 人FVIII晶体结构中的两条多肽链的二级结构的DSSP图解表示(参见 实施例47)。氨基酸序列编号与图30中的蛋白质序列相同。β折叠区 域显示为实心箭头且指定为β1至β66。XTEN容许环的位置由交叉 影线框表示。结构域A1XTEN容许环指定为环A1-1和环A1-2。结 构域A2XTEN容许环指定为环A2-1和环A2-2。结构域A3XTEN容 许环指定为环A3-1和环A3-2。
图39显示对以标识符2R7E存放在蛋白质数据库处的天然活性 人FVIII晶体结构中的两条多肽链的二级结构的DSSP图解表示(参见 实施例47)。氨基酸序列编号与图30中的蛋白质序列相同。β折叠区 域显示为实心箭头且指定为β1至β66。XTEN容许环的位置由交叉 影线框表示。结构域A1XTEN容许环指定为环A1-1和环A1-2。结 构域A2XTEN容许环指定为环A2-1和环A2-2。结构域A3XTEN容 许环指定为环A3-1和环A3-2。
图40显示FVIII的结构域A1、A2、A3、C1和C2的ClustalW 多个序列比对，其显示导致重组FVIII蛋白显示FVIII活性(黑色框、 白色文本)或不显示FVIII活性(灰色框、粗体文本)的XTEN插入位置。 XTEN容许环的位置由虚线矩形指示(参见实施例47)。
图41.图41A呈现人FVIII(PDB:2R7E)的前视结构示意图，其显 示结构域A1、A2、A3、C1和C2的位置(用虚线加圆圈)和以CPK球 形表示加以突出的XTEN容许环A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1和 A3-2的位置。图41B呈现人FVIII(PDB:2R7E)的侧视结构示意图， 其显示结构域A1、A2、A3、C1和C2的位置(用虚线加圆圈)和以CPK 球形表示加以突出的XTEN容许环A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1 和A3-2的位置。
图42显示分离的人FVIII(PDB:2R7E)A结构域的顶视结构示意 图，其显示以CPK球形表示加以突出的XTEN容许环的位置。图42B、 42D和42F显示分离的人FVIII(PDB:2R7E)A结构域的侧视结构示意 图，其显示以CPK球形表示加以突出的XTEN容许环的位置。
图43显示各种因子VIII B结构域缺失和个别突变的序列。4-10 行显示各种B结构域缺失，其中指示的XTEN连接侧接B结构域残 余残基或A3结构域残基。R1648A突变由箭头在5和8行中指示， 而Y1680F突变由箭头在8-10行中指示。
图44是具有单一XTEN插入物的各种CFXTEN的显色和aPTT 测定活性的条形图(实施例49)。
图45是具有2个XTEN插入物的各种CFXTEN的显色和aPTT 测定活性的条形图(实施例49)。
图46是具有3个XTEN插入物的各种CFXTEN的显色和aPTT 测定活性的条形图(实施例49)。
图47是相较于BDD-FVIII对照，施用的各种具有单一XTEN插 入物的CFXTEN在DKO小鼠中的血浆水平的图，其显示通过在各个 位置处插入XTEN实现半衰期长10至20倍(实施例50)。
图48是相较于BDD-FVIII对照，施用的各种具有一个、两个和 三个XTEN插入物的CFXTEN在DKO小鼠中的血浆水平的图，其 显示相较于单一或两个插入物，通过包括额外XTEN插入物实现半 衰期增加(实施例51)。
图49是在毕提斯达测定中用实施例52中所述的三种血友病患者 血清(图49A-C)或绵羊抗FVII(图49D)测定的样本中的剩余因子VIII 促凝血活性的绘制抑制曲线的图，其显示相较于未连接于XTEN的 FVIII，两个CFXTEN分子的抑制曲线明显左移。
发明详述
在描述本发明的实施方案之前，应了解所述实施方案是仅通过举 例方式提供，且本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于 实施本发明。众多变化、改变和替代在不脱离本发明的情况下现将被 本领域技术人员所想到。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由 本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在实施 或测试本发明时可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的 方法和材料，但以下描述适合的方法和材料。在起冲突的情况下，以 包括定义的专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅具有说明性 而非意图具有限制性。众多变化、改变和替代在不脱离本发明的情况 下现将被本领域技术人员所想到。
定义
在本申请的情形下，除非另外指定，否则以下术语具有归于它们 的含义：
除非上下文另外明确规定，否则如在说明书和权利要求中所用， 单数形式“一个”和“所述”包括复数个提及物。举例来说，术语“一个 细胞”包括复数个细胞，包括其混合物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指代任何长度 的氨基酸聚合物。聚合物可为线性或分支的，它可包含修饰的氨基酸， 且它可被非氨基酸打断。所述术语也涵盖已例如通过形成二硫键形 成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作(如与标记性组 分缀合)加以修饰的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸， 包括但不限于D或L两种光学异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟 物。标准单字母代码或三字母代码用于指定氨基酸。
术语“结构域”在关于因子VIII多肽使用时是指全长结构域或其 功能性片段，例如因子VIII的A1结构域、A2结构域、A3结构域、 B结构域、C1结构域和/或C2结构域的全长或功能性片段。
术语“天然L-氨基酸”是指甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬 氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯 丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸 (R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸 (S)和苏氨酸(T)的L光学异构体形式。
如应用于序列以及如本文所用的术语“非天然存在”是指不具有 哺乳动物中所见的野生型或天然存在的序列的对应物、不互补于哺乳 动物中所见的野生型或天然存在的序列、或不与哺乳动物中所见的野 生型或天然存在的序列具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。举例 来说，当适合地比对时，非天然存在的多肽或片段相较于天然序列可 共有至多99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更 小氨基酸序列同一性。
术语“亲水性”和“疏水性”是指物质与水具有的亲和程度。亲水性 物质对水具有强烈亲和力，倾向于溶解于水中，与水混合，或由水湿 润，而疏水性物质大致上对水缺乏亲和力，倾向于排斥而非吸收水且 倾向于不溶解于水中或与水混合或由水湿润。氨基酸可基于它们的疏 水性加以表征。已开发许多尺度。一个实例是由Levitt,M等,J Mol Biol(1976)104:59开发的尺度，其列于Hopp,TP等,Proc Natl Acad Sci USA(1981)78:3824中。“亲水性氨基酸”的实例是精氨酸、赖氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别感兴趣的是亲水性氨基 酸天冬氨酸、谷氨酸以及丝氨酸和甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
“片段”在应用于蛋白质时是天然生物活性蛋白质的保留至少一 部分治疗和/或生物活性的截短形式。“变体”在应用于蛋白质时是与 天然生物活性蛋白质具有序列同源性的保留生物活性蛋白质的至少 一部分治疗和/或生物活性的蛋白质。举例来说，相较于参照生物活 性蛋白质，变体蛋白质可共有至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。如本文所用，术 语“生物活性蛋白质部分”包括如例如通过定点诱变、合成编码基因、 插入而故意地修饰的蛋白质或通过突变而偶然地修饰的蛋白质。
术语“序列变体”是指相较于它们的天然或原始序列，已通过插 入、缺失或取代一个或多个氨基酸加以修饰的多肽。插入可位于蛋白 质的任一末端或两个末端处，和/或可位于氨基酸序列的内部区域内。 一个非限制性实例是在生物活性有效负载蛋白质的序列内插入 XTEN序列。在缺失变体中，移除如本文所述的多肽中的一个或多个 氨基酸残基。因此，缺失变体包括有效负载多肽序列的全部片段。在 取代变体中，移除且用替代残基置换多肽的一个或多个氨基酸残基。 在一方面，取代在性质上是保守性的且这个类型的保守性取代在本领 域中是熟知的。
如本文所用，“内部XTEN”是指已插入凝血因子的序列中的 XTEN序列。内部XTEN可通过将XTEN序列插入如FVIII的凝血因 子的序列中来构建，所述插入是通过在凝血因子的结构域内的两个邻 近氨基酸之间(“结构域内”)或在两个结构域之间(“结构域间”)插入来 实现或其中XTEN置换凝血因子的部分内部序列。
如本文所用，“末端XTEN”是指已融合于凝血因子的N末端或C 末端或融合在凝血因子的N末端或C末端中或融合于凝血因子的N 末端或C末端的蛋白水解裂解序列或接头的XTEN序列。末端XTEN 可融合于凝血因子的天然末端。或者，末端XTEN可置换凝血因子 的一部分末端序列。
术语“XTEN释放位点”是指CFXTEN融合蛋白中可由哺乳动物 蛋白酶识别且裂解，从而实现XTEN或XTEN的一部分自CFXTEN 融合蛋白释放的裂解序列。如本文所用，“哺乳动物蛋白酶”是指通常 存在于哺乳动物的体液、细胞或组织中的蛋白酶。XTEN释放位点可 被工程化来由各种哺乳动物蛋白酶(也称为“XTEN释放蛋白酶”)裂 解，所述哺乳动物蛋白酶如FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIIa、FVIIIa、 FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17、 MMP-20或在凝结事件期间存在的任何蛋白酶。可利用能够识别确定 裂解位点的其它等效蛋白酶(内源性或外源性)。可针对所用蛋白酶调 整和定制裂解位点。
当提及第一多肽连接于第二多肽时，术语“在…内”涵盖分别使所 述第一或第二多肽的N末端连接于所述第二或第一多肽的C末端的 连接，以及将所述第一多肽插入所述第二多肽的序列中。举例来说， 当XTEN“在因子VIII多肽的结构域内”连接时，所述XTEN可连接 于N末端、C末端，或可插入所述结构域中。
如本文所用，术语“位点”在用于指代XTEN插入在如因子VIII 的生物多肽内或向如因子VIII的生物多肽插入的位点时表示连接所 述XTEN所处的氨基酸位置。当描述编号位点，如XTEN插入在因 子VIII内或向因子VIII插入的第一、第二、第三、第四、第五或第 六位点时，各位点将理解为表示因子VIII中的不同位点；例如，所 述第二位点是与所述第一位点不同的因子VIII位置，所述第三位点 不同于所述第二和所述第一位点等。
如应用于本文提供的CFXTEN多肽的一种或多种形式的“活性” 或“促凝血活性”是指无论通过体外、离体或体内测定所测量，都能够 结合靶标凝血蛋白底物或辅因子且促进凝结事件的能力。所述测定包 括但不限于单级凝结测定、两级凝结测定、显色测定和ELISA测定。 “生物活性”是指体外或体内生物功能或作用，包括但不限于受体或配 体结合、或FVIII凝血因子对在本领域中通常已知的凝血的作用、或 细胞、生理或临床反应，包括遏止流血事件。
如本文所用，术语“ELISA”是指如本文所述或如本领域中另外已 知的酶联免疫吸附测定。
“宿主细胞”包括可为或已为主题载体的接受者的个别细胞或细 胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代。由于天然、偶然或故 意突变，子代可不必与原始亲本细胞完全相同(在形态方面或在总 DNA互补序列的基因组方面)。宿主细胞包括用本发明的载体体内转 染的细胞。
“分离的”在用于描述本文公开的各种多肽时是指已被鉴定且与 它的天然环境的组分分离和/或自所述天然环境的组分回收的多肽。 它的天然环境的污染物组分是将通常干扰多肽的诊断或治疗用途的 物质，且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。如为本领域 技术人员显而易知，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗 体或其片段不需要“分离”以将它与它的天然存在的对应物区分。此 外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、 抗体或其片段可与它的天然存在的对应物区分，因为每体积分子的浓 度或数目通常大于它的天然存在的对应物的浓度或数目。一般来说， 通过重组手段制备且在宿主细胞中表达的多肽被视为“分离的”。
“分离的”多核苷酸或多肽编码核酸或其它多肽编码核酸是被鉴 定且与在多肽编码核酸的天然来源中它通常与之缔合的至少一种污 染物核酸分子分离的核酸分子。分离的多肽编码核酸分子不同于它在 自然界中所见的形式或配置。因此，分离的多肽编码核酸分子不同于 当它存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子。然而，分离的多 肽编码核酸分子包括通常表达多肽的细胞中含有的多肽编码核酸分 子，在所述细胞中，例如核酸分子在不同于天然细胞的位置的染色体 或染色体外位置中。
“嵌合”蛋白含有至少一种在序列中不同于在自然界中存在的位 置的位置中包含至少一个区域的融合多肽。所述区域可通常以单独蛋 白质形式存在且在融合多肽中集合在一起；或它们可通常以相同蛋白 质形式存在，但以新型排列置放在融合多肽中。可例如通过化学合成， 或通过产生并翻译其中以所需关系编码肽区域的多核苷酸来产生嵌 合蛋白。
“缀合的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文中可互换使用。 这些术语是指通过无论什么手段(包括化学缀合或重组手段)将两种 或更多种化学元素、序列或组分接合在一起。举例来说，如果启动子 或增强子影响序列的转录，那么使它可操作地连接于编码序列。通常， “可操作地连接”是指所连接的DNA序列是连续的，且在阅读相中或 框内。“框内融合”是指以维持原始ORF的正确阅读框的方式接合两 个或更多个开放阅读框(ORF)以形成连续较长ORF。因此，所得重组 融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的区段 的单一蛋白质(所述区段在自然界中通常不这样接合)。
在多肽的情形下，“线性序列”或“序列”是多肽中呈氨基末端至羧 基末端方向的一定顺序的氨基酸，其中在序列中彼此相邻的残基在多 肽的一级结构中是连续的。“部分序列”是多肽的一部分的已知在一个 或两个方向上包含其它残基的线性序列。
“异源”是指源于某一实体，所述实体就基因型而言不同于它与之 比较的实体的其余部分。举例来说，自它的天然编码序列移除且可操 作地连接于除天然序列以外的编码序列的甘氨酸富集序列是异源甘 氨酸富集序列。如应用于多核苷酸、多肽的术语“异源”是指多核苷酸 或多肽源于某一实体，所述实体就基因型而言不同于它与之比较的实 体的其余部分的基因型。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。 它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷 酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，且可执 行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或 基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座 (locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体 RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、 具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探 针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸 类似物。如果存在，那么可在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结 构的修饰。核苷酸的序列可由非核苷酸组分打断。可在聚合之后，如 通过与标记组分缀合来进一步修饰多核苷酸。
术语“多核苷酸的互补序列”表示相较于参照序列，具有互补碱基 序列和逆向定向，以致它可以完全保真度与参照序列杂交的多核苷酸 分子。
如应用于多核苷酸的“重组”是指多核苷酸是体外克隆、限制和/ 或连接步骤、以及产生可潜在于宿主细胞中表达成重组蛋白的构建体 的其它程序的各种组合的产物。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用。它们是指含有至 少一个能够在转录和翻译之后，编码特定蛋白质的开放阅读框的多核 苷酸。基因或基因片段可为基因组的或cDNA，只要多核苷酸含有至 少一个可涵盖整个编码区或其区段的开放阅读框即可。“融合基因” 是由至少两种连接在一起的异源多核苷酸组成的基因。
“同源性”或“同源”或“序列同一性”是指两个或更多个多核苷酸序 列之间或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使 用如BestFit的程序来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、 相似性或同源性时，可使用缺省设置，或可选择如blosum45或 blosum80的适当计分矩阵来使一致性、相似性或同源性计分最优化。 优选地，同源的多核苷酸是在如本文定义的严格条件下杂交且相较于 那些序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选 95％、更优选97％、更优选98％、以及甚至更优选99％序列同一性的 那些多核苷酸。同源的多肽优选具有至少70％、优选至少80％、甚 至更优选至少90％、甚至更优选至少95-99％、以及最优选100％相同 的序列同一性。
“连接”是指在两个核酸片段或基因之间形成将它们连接在一起 的磷酸二酯键的过程。为将DNA片段或基因连接在一起，DNA的末 端必须可彼此相容。在一些情况下，在核酸内切酶消化之后，末端将 直接可相容。然而，可能必要的是首先使通常在核酸内切酶消化之后 产生的交错末端转化成钝末端以使得它们对于连接可相容。
术语“严格的条件”或“严格的杂交条件”包括涉及多核苷酸将在 比与其它序列更大的可检测程度上(例如，超过背景至少2倍)与它的 靶标序列杂交所处的条件。通常，部分地关于进行洗涤步骤所处的温 度和盐浓度来表述杂交的严格性。通常，严格条件将为以下条件：其 中在pH 7.0至8.3下，盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01至 1.0M Na离子浓度(或其它盐)且温度是至少约30℃(对于短多核苷酸 (例如10至50个核苷酸)而言)和至少约60℃(对于长多核苷酸(例如大 于50个核苷酸)而言)—举例来说，“严格条件”可包括在37℃下在50％ 甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60℃至65℃下在 0.1×SSC/1％SDS中洗涤3次，各次15分钟。或者，可使用温度约 65℃、60℃、55℃或42℃。SSC浓度可自约0.1至2×SSC变化，其 中SDS是以约0.1％存在。所述洗涤温度通常选择为低于特定序列在 确定离子强度和pH下的热熔点约5℃至20℃。Tm是50％靶标序列 杂交于完全匹配探针所处的温度(在确定离子强度和pH下)。用于计 算Tm的等式和用于核酸杂交的条件是熟知的且可见于Sambrook,J. 等,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001中。通常，阻断试剂用于阻断非特异性 杂交。所述阻断试剂包括例如约100-200μg/ml的剪切和变性的鲑鱼 精子DNA。有机溶剂(如在约35-50％v/v浓度下的甲酰胺)也可在特 定情况(如RNA:DNA杂交)下使用。关于这些洗涤条件的适用变化将 易于为本领域普通技术人员显而易知。
如应用于多核苷酸序列的术语“同一性百分比”、“序列同一性百 分比”和“同一性％”是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序 列之间匹配的残基的百分比。所述算法可以标准化和可复现方式在所 比较的序列中插入间隙以使两个序列之间的比对最优化，且因此实现 两个序列的更有意义比较。同一性百分比可在整个确定多核苷酸序列 的长度上加以测量，或可在较短长度，例如在取自较大确定多核苷酸 序列的片段(例如具有至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、 至少210或至少450个连续残基的片段)的长度上加以测量。所述长 度仅是示例性的，且应了解，由本文在表、图或序列表中所示的序列 支撑的任何片段长度都可用于描述在其上测量同一性百分比的长度。 序列同一性百分比是通过以下方式来计算：在比较窗上比较两个最优 对准的序列，确定匹配位置(相同残基存在于两个多肽序列中所处的 位置)的数目，用比较窗中的位置总数(即，窗口大小)除匹配位置的数 目，以及用100乘以结果以产生序列同一性百分比。当将比较不同长 度的序列时，最短序列限定比较窗的长度。当计算序列同一性时，不 考虑保守性取代。
关于本文鉴定的多肽序列的“序列同一性百分比(％)”定义为在比 对序列且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不将任何 保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，查询序列中与第二参照 多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确 定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能 的各种方式实现，所述方式例如使用可公开获得的计算机软体，如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技 术人员可确定适于测量比对的参数，包括为在所比较序列的全长上实 现最大对准所需的任何算法。同一性百分比可在整个确定多肽序列的 长度上加以测量，或可在较短长度，例如在取自较大确定多肽序列的 片段(例如具有至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少 70或至少150个连续残基的片段)的长度上加以测量。所述长度仅是 示例性的，且应了解，由本文在表、图或序列表中所示的序列支撑的 任何片段长度都可用于描述在其上测量同一性百分比的长度。
如本文在多肽的情形下所用的术语“非重复性”是指在肽或多肽 序列中缺乏内部同源性程度或内部同源性程度有限。术语“大致上非 重复”可指例如存在少许或不存在以下情况：在序列中四个连续氨基 酸是相同氨基酸类型；或指多肽具有10或更小的子序列计分(下文定 义)或指以自N末端至C末端的顺序不存在构成多肽序列的序列基序 的样式。如本文在多肽的情形下所用的术语“重复性”是指在肽或多肽 序列中的内部同源性的程度。相反，“重复”序列可含有短氨基酸序列 的多个相同拷贝。举例来说，目标多肽序列可分成n-mer序列且可对 相同序列的数目进行计数。高度重复序列含有大部分相同序列，而非 重复序列含有少许相同序列。在多肽的情形下，序列可含有具有确定 或可变长度的较短序列或基序的多个拷贝，其中所述基序自身具有非 重复序列，从而致使全长多肽大致上是非重复的。测量非重复性所处 的多肽的长度可自3个氨基酸至约200个氨基酸、约自6个氨基酸至 约50个氨基酸、或自约9个氨基酸至约14个氨基酸变化。在多核苷 酸序列的情形下使用的“重复性”是指序列中的内部同源性程度，例如 像给定长度的相同核苷酸序列的频率。重复性可例如通过分析相同序 列的频率来测量。
“载体”是将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞 之间转移插入的核酸分子的核酸分子，优选在适当宿主中自我复制。 所述术语包括主要起将DNA或RNA插入细胞中的作用的载体、主 要起复制DNA或RNA的作用的复制载体、和起转录和/或翻译DNA 或RNA的作用的表达载体。也包括提供一种以上上述功能的载体。 “表达载体”是在引入适当宿主细胞中时可转录且翻译成多肽的多核 苷酸。“表达系统”通常暗示包含可起产生所需表达产物的作用的表达 载体的适合宿主细胞。
如应用于多肽的“血清降解抗性”是指多肽能够抵抗在血液或其 组分中的降解的能力，所述降解通常涉及血清或血浆中的蛋白酶。血 清降解抗性可通过通常在约37℃下组合蛋白质与人(或视情况小鼠、 大鼠、猴)血清或血浆通常持续一定范围的天数(例如0.25、0.5、1、2、 4、8、16天)来测量。这些时间点的样本可进行蛋白质印迹测定且用 抗体检测蛋白质。抗体可针对蛋白质中的标签。如果蛋白质在蛋白质 印迹上显示单一条带(其中蛋白质的尺寸与注射的蛋白质的尺寸一 致)，那么未发生降解。在这个示例性方法中，如通过蛋白质印迹或 等效技术判断的50％蛋白质降解所处的时间点是蛋白质的血清降解 半衰期或“血清半衰期”。
如本文所用的术语“t1/2”是指计算为ln(2)/Kel的终末半衰期。Kel是通过对数浓度对时间曲线的终末线性部分的线性回归计算的终末 消除速率常数。半衰期通常是指为沉积在活生物体中的一半数量的施 用物质由正常生物过程代谢或消除所需的时间。术语“t1/2”、“终末半 衰期”、“消除半衰期”和“循环半衰期”在本文中可互换使用。
“主动清除”是指蛋白质除通过过滤或凝聚以外自循环移除所凭 借的机制，且其包括由细胞、受体、代谢或降解介导的自循环移除蛋 白质。
“表观分子量因子”和“表观分子量”是关于由特定氨基酸序列展 现的表观分子量相对增加或降低的量度的相关术语。表观分子量是使 用尺寸排阻色谱(SEC)或类似方法，通过与球状蛋白质标准物进行比 较来测定，且用“表观kD”单位计量。表观分子量因子是表观分子量 与实际分子量之间的比率；后者是通过基于氨基酸组成添加组成中各 类型的氨基酸的计算分子量或通过根据在SDS电泳凝胶中与分子量 标准物的比较进行估计来预测。
术语“流体动力学半径”或“斯托克斯半径(Stokes radius)”是溶液 中分子的有效半径(Rh，以nm计)，其是通过假定物体穿过溶液且由 溶液的粘性所抵抗来测量。在本发明的实施方案中，XTEN融合蛋白 的流体动力学半径测量结果与作为一种更直观量度的‘表观分子量因 子’相关。蛋白质的“流体动力学半径”影响它在水溶液中的扩散速率 以及它在大分子的凝胶中迁移的能力。蛋白质的流体动力学半径是通 过它的分子量以及通过它的结构(包括形状和紧密性)来测定。用于测 定流体动力学半径的方法在本领域中是熟知的，如通过使用如美国专 利号6,406,632和7,294,513中所述的尺寸排阻色谱(SEC)。大多数蛋 白质具有球状结构，此是蛋白质具有最小流体动力学半径所可具有的 最紧密三维结构。一些蛋白质采用随机和开放的非结构化或‘线性’构 象且因此相较于具有类似分子量的典型球状蛋白质具有大得多的流 体动力学半径。
“生理条件”是指活宿主中的一组条件以及体外条件，包括模拟活 受试者的那些条件的温度、盐浓度、pH。已建立具有生理相关条件 的用于体外测定的宿主。通常，生理缓冲液含有生理浓度的盐且调整 至在约6.5至约7.8、且优选约7.0至约7.5的范围内的中性pH。多 种生理缓冲液列于Sambrook等(2001)中。生理相关温度在约25℃至 约38℃、且优选约35℃至约37℃的范围内。
“反应性基团”是可偶联于第二反应性基团的化学结构。反应性基 团的实例是氨基、羧基、硫氢基、羟基、醛基、叠氮基。一些反应性 基团可被活化来促进与第二反应性基团偶联。活化的非限制性实例是 羧基与碳二亚胺反应、羧基转化成活化的酯、或羧基转化成叠氮化物 官能团。
“控制释放剂”、“缓慢释放剂”、“长效制剂(depot formulation)”和 “持续释放剂”可互换用于指代相对于在不存在试剂下施用多肽时的 释放持续时间，能够延长本发明多肽的释放持续时间的试剂。本发明 的不同实施方案可具有不同释放速率，从而产生不同治疗量。
术语“抗原”、“靶标抗原”和“免疫原”在本文中可互换用于指代抗 体片段或抗体片段基治疗剂与其结合或针对其具有特异性的结构或 结合决定簇。
如本文所用的术语“有效负载”是指具有生物或治疗活性的蛋白 质或肽序列；即小分子的药效团的对应物。有效负载的实例包括但不 限于凝血因子、细胞因子、酶、激素、以及血液和生长因子。
如本文所用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制或中和本 文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鉴定多肽的拮抗剂的 方法可包括使天然多肽与候选拮抗剂分子接触以及测量一种或多种 通常与天然多肽相关的生物活性的可检测变化。在本发明的情形下， 拮抗剂可包括蛋白质、核酸、碳水化合物、抗体或降低生物活性蛋白 质的作用的任何其它分子。
术语“激动剂”是以广义使用且包括模拟本文公开的天然多肽的 生物活性的任何分子。适合激动剂分子明确包括天然多肽、肽、小有 机分子等的激动剂抗体或抗体片段、片段或氨基酸序列变体。用于鉴 定天然多肽的激动剂的方法可包括使天然多肽与候选激动剂分子接 触以及测量一种或多种通常与天然多肽相关的生物活性的可检测变 化。
如本文所用，“治疗”或“缓和”或“改善”可互换使用且是指施用药 物或生物制剂以实现治疗益处，治愈现存病状或减轻现存病状的严重 性，或实现防治性益处，预防或降低病状发作的可能性或病状发生的 严重性。就治疗益处而言，其是指根除或改善所治疗的潜伏病状或与 潜伏病状相关的一种或多种生理症状以使在受试者中观察到改善，纵 使受试者可能仍然受潜伏病状折磨。
如本文所用的“治疗作用”或“治疗益处”是指由施用本发明的融 合蛋白产生的生理作用，包括但不限于减轻、改善或预防人或其它动 物的疾病，或另外增强人或动物的身体或精神良好状态，而非能够诱 导产生针对生物活性蛋白质具有的抗原性表位的抗体。对于防治性益 处，可向处于发展特定疾病、所述疾病的病状或症状(例如，诊断有 甲型血友病的受试者的流血)的风险下的受试者，或向尽管可能尚未 对这个疾病作出诊断，但报告疾病的一种或多种生理症状的受试者施 用组合物。
如本文所用的术语“治疗有效量”和“治疗有效剂量”是指当以一 次或重复剂量向受试者施用时，单独或作为融合蛋白组合物的一部分 的药物或生物活性蛋白质能够对疾病病况或病状的任何症状、方面、 测量参数或特征具有任何可检测有益作用的量。所述作用无需是绝对 有益的。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其 鉴于本文提供的详细公开内容。
如本文所用的术语“治疗有效剂量方案”是指用于单独或作为融 合蛋白组合物的一部分连续施用多次剂量(即，至少两次或两次以上) 的生物活性蛋白质的时程，其中所述剂量是以治疗有效量给予以对疾 病病况或病状的任何症状、方面、测量参数或特征产生持续有益作用。
I).一般技术
除非另外指示，否则本发明的实施采用免疫学、生物化学、化学、 分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规 技术，所述技术属于本领域的技能。参见Sambrook,J.等,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001；“Current protocols in molecular biology”,F.M.Ausubel等 编,1987；丛书“Methods in Enzymology,”Academic Press,San Diego, CA.；“PCR 2:a practical approach”,M.J.MacPherson,B.D.Hames和 G.R.Taylor编,Oxford University Press,1995；“Antibodies,a laboratory manual”Harlow,E.和Lane,D.编,Cold Spring Harbor Laboratory,1988； “Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,”第 11版,McGraw-Hill,2005；以及Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,”第4版,John Wiley&Sons,Somerset, NJ,2000，其内容以引用的方式整体并入本文。
II).凝血因子VIII
本发明部分地涉及包含连接于一个或多个延伸重组蛋白(XTEN) 的因子VIII凝血因子(CF)的组合物，从而产生CFXTEN融合蛋白组 合物。如本文所用，“CF”是指因子VIII(FVIII)或FVIII的模拟物、序 列变体和截短形式，如下所述。
“因子VIII”或“FVIII”或“FVIII蛋白”是指凝血因子蛋白质及其物 种(包括人、猪、犬、大鼠或鼠类FVIII蛋白)和序列变体，包括但不 限于含有2351个氨基酸的单链前体蛋白质(具有19个氨基酸的疏水 性信号肽)；约270-330kDa的含有2332个氨基酸的成熟因子VIII辅 因子蛋白质，其具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2；以及FVIII的 非酶“活性”或辅因子形式(FVIIIa)，其为具有由于在R1648之后进行 蛋白水解裂解而形成的两条链的循环异二聚体，其具有含有氨基酸 1-1648(相对于成熟FVIII形式加以编号)的主要由A1-A2-B组成的重 链形式(在90-220kD的范围内)和含有氨基酸1649-2232的80kDa轻 链A3-C1-C2，所述各形式示意性描绘于图1中。此外且如本文所用， A1、A2和A3结构域各自涵盖酸性间隔子区域；分别为a1、a2和a3 酸性区域。因此，应了解，描述为具有A1、A2、A3、B、C1和C2 结构域的CFXTEN构建体包括a1、a2和a3酸性区域。如本文所用， “因子VIII”或“FVIII”或“FVIII多肽”也包括变体形式，包括具有取代、 添加和/或缺失的蛋白质，只要变体保留如促凝血活性的所需生物活 性即可。数万种功能性FVIII变体已被构建且可用作如本文所述的重 组FVIII蛋白。参见PCT公布号WO 2011/069164A2、WO 2012/006623 A2、WO 2012/006635A2或WO 2012/006633A2，其全部以引用的方 式整体并入本文。已知许多功能性FVIII变体。此外，已在血友病患 者中鉴定FVIII中之数百种非功能性突变。参见例如Cutler等,Hum. Mutat.19:274-8(2002)，其以引用的方式整体并入本文。此外，来自 人的FVIII与来自其它物种的FVIII之间的比较已鉴定可能为功能所 需的保守残基。参见例如Cameron等,Thromb.Haemost.79:317-22 (1998)和US 6,251,632，其以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，人因子VIII结构域是由以下氨基酸残基所 界定：A1，残基Ala1-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；B，残基 Ser741-Arg1648；A3，残基Ser1649-Asn2019；C1，残基 Lys2020-Asn2172；C2，残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括 残基Ser1649-Tyr2332。在另一实施方案中，残基Arg336-Arg372通 常称为a1区域，且Arg372由凝血酶所裂解。在某些实施方案中，a2 区域是A1结构域的一部分。在另一实施方案中，残基 Glu1649-Arg1689称为a3酸性区域。在某些实施方案中，a3酸性区 域是A3结构域的一部分。在另一实施方案中，天然FVIII蛋白具有 下式：A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2，其中A1、A2和A3是结构相关 的“A结构域”，B是“B结构域”，C1和C2是结构相关的“C结构域”， 且a1、a2和a3是酸性间隔子区域。在前式中且参照图30中的一级 氨基酸序列位置，人FVIII的A1结构域自Ala1延伸至约Arg336， a1间隔子区域自约Met337延伸至约Arg372，A2结构域自约Ser373 延伸至约Tyr719，a2间隔子区域自约Glu720延伸至约Arg740，B结 构域自约Ser741延伸至约Arg1648，a3间隔子区域自约Glu1649延 伸至约Arg1689，A3结构域自约Ser1690延伸至约Asn2019，C1结 构域自约Lys2020延伸至约Asn2172，且C2结构域自约Ser2173延 伸至Tyr2332(Saenko等,2005,J Thromb Hemostasis,1,922-930)。除特 定蛋白水解裂解位点以外，对FVIII的结构域和区域之间的边界的位 置的指定在不同参考文献中可有所不同。因此，本文中指示的边界是 通过使用术语“约”来指定为大致边界。
所述因子VIII包括截短序列，如其中一部分或大部分B结构域 序列缺失的B结构域缺失的“BDD”序列(如美国专利号6,818,439和 7,632,921中公开或引用的BDD序列)。BDD FVIII的一实例是 或(重组BDD FVIII)，其包含对应于图30的 氨基酸1至743的第一多肽，融合于对应于图30的氨基酸1638至 2332的第二多肽。可用于产生本发明的重组蛋白的示例性BDD FVIII 构建体包括但不限于缺失对应于成熟人FVIII的氨基酸747-1638(图 30)的氨基酸的FVIII(Hoeben R.C.等J.Biol.Chem.265(13): 7318-7323(1990)，其以引用的方式整体并入本文)、以及缺失对应于 成熟人FVIII的氨基酸771–1666或氨基酸868-1562(图30)的氨基酸 的FVIII(Meulien P.等Protein Eng.2(4):301-6(1988)，其以引用的方 式整体并入本文)。
此外，涵盖包括异源氨基酸插入或取代(如天冬氨酸取代位置75 处的缬氨酸)的序列、或重链和轻链是由接头共价连接的单链 FVIII(scFVIII)。如本文所用，“FVIII”将为因子VIII分子的具有凝血 因子VIII的典型特征的任何功能性形式，所述形式在向例如患有甲 型血友病的受试者的所述受试者施用时能够纠正人因子VIII缺乏。 如美国专利或申请号4,757,006；4,965,199；5,004,804；5,198,349, 5,250,421；5,919,766；6,228,620；6,818,439；7,138,505；7,632,921； 和20100081615中所述，已分离、表征和克隆FVIII或序列变体。
人因子VIII由存在于X染色体的长臂尖端(q28)的单拷贝基因编 码。它包含接近186,000个碱基对(bp)且占X染色体的约0.1％(White, G.C.和Shoemaker,C.B.,Blood(1989)73:1-12)。人FVIII氨基酸序列自 如美国专利号4,965,199中所示的cDNA加以推断，所述专利以引用 的方式整体并入本文。由cDNA序列获得的天然成熟人FVIII(即，无 分泌信号肽但在其它翻译后加工之前)呈现为图3。
编码成熟因子VIII mRNA的DNA见于26个大小在69至3,106bp 的范围内的单独外显子中。分隔外显子的25个插入内含子区域大小 在207至32,400bp的范围内。完整基因由约9kb外显子和177kb内 含子组成。三个重复A结构域具有约30％序列同源性。B结构域含 有约25个预测糖基化位点中的19个，且A3结构域据信含有对血管 性血友病因子的结合位点。串联C结构域在A3结构域之后且彼此具 有约37％同源性(White,G.C.和Shoemaker,C.B.,Blood(1989) 73:1-12)。
在新合成的前体单链分子中，B结构域分隔天然因子FVIII的 A2结构域和A3结构域。B结构域的准确边界已以不同方式报道为自 前体序列的氨基酸712延伸至1648(Wood等,Nature(1984) 312:330-337)或报道为氨基酸741–1648(Pipe,SW,Haemophilia(2009) 15:1187–1196以及美国专利号7,560,107)或氨基酸740-1689(Toole,JJ. Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:5939-5942)。如本文所用，“B结 构域”是指成熟因子VIII的氨基酸741-1648。如本文所用，“FVIII B 结构域缺失”或“FVIII BDD”是指氨基酸741至1648中的任何氨基酸、 片段或全部缺失的FVIII序列。在一个实施方案中，FVIII BDD变体 保留来自N末端(如本文所用的“B1”)和C末端(如本文所用的“B2”)的 B结构域的剩余氨基酸。在一种FVIII BDD变体中，B结构域剩余氨 基酸是SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:1614)。在一种FVIII BDD 变体中，B1剩余物是SFS且B2剩余物是QNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:1615)。在另一FVIII BDD变体中，B1剩余物是SFSQN(SEQ ID NO:1616)且B2剩余物是PPVLKRHQR(SEQ ID NO:1617)。“B结构 域缺失的因子VIII”、“FVIII BDD”或“BDD FVIII”可具有美国专利号 6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、 6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、 5,112,950、4,868,112和6,458,563中公开的完全或部分缺失，所述专 利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，本发明的B 结构域缺失的因子VIII序列包含在美国专利号6,316,226(也在US 6,346,513中)的第4栏第4行至第5栏第28行以及实施例1-5处公开 的任一缺失。在另一实施方案中，B结构域缺失的因子VIII是 S743/Q1638 B结构域缺失的因子VIII(SQ形式因子VIII)(例如，氨基 酸744至氨基酸1637缺失的因子VIII，例如，具有全长因子VIII的 氨基酸1-743和氨基酸1638-2332的因子VIII)。在一些实施方案中， 本发明的B结构域缺失的因子VIII具有在美国专利号5,789,203(以及 US 6,060,447、US 5,595,886和US 6,228,620)的第2栏第26-51行以 及实施例5-8处公开的缺失。在一些实施方案中，B结构域缺失的因 子VIII具有以下中所述的缺失：美国专利号5,972,885的第1栏第25 行至第2栏第40行；美国专利号6,048,720的第6栏第1-22行以及 实施例1；美国专利号5,543,502的第2栏第17-46行；美国专利号 5,171,844的第4栏第22行至第5栏第36行；美国专利号5,112,950 的第2栏第55-68行，图2以及实施例1；美国专利号4,868,112的第 2栏第2行至第19栏第21行以及表2；美国专利号7,041,635的第2 栏第1行至第3栏第19行、第3栏第40行至第4栏第67行、第7 栏第43行至第8栏第26行、以及第11栏第5行至第13栏第39行； 或美国专利号6,458,563的第4栏第25-53行。在一些实施方案中，B 结构域缺失的因子VIII缺失大部分B结构域，但仍然含有B结构域 的为在体内将初级翻译产物蛋白水解加工成两条多肽链所必需的氨 基末端序列，如WO 91/09122中所公开，所述专利以引用的方式整 体并入本文。在一些实施方案中，构建缺失氨基酸747-1638，即实际 上完全缺失B结构域的B结构域缺失的因子VIII。Hoeben R.C.等J. Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)，其以引用的方式整体并入本 文。B结构域缺失的因子VIII也可含有因子VIII的氨基酸771–1666 或氨基酸868-1562的缺失。Meulien P.等Protein Eng.2(4):301-6 (1988)，其以引用的方式整体并入本文。作为本发明的一部分的其它 B结构域缺失包括：缺失氨基酸982至1562或760至1639(Toole等, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797至1562(Eaton 等Biochemistry(1986)25:8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公 布申请号WO 87/04187))、747-1560(Sarver等,DNA(1987)6:553-564)、 741至1648(Pasek(PCT申请号88/00831))、或816至1598或741至 1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)第82期:16-25；EP 295597))， 所述文献和专利各自以引用的方式整体并入本文。可在本发明的实施 方案中利用的任何因子VIII序列中进行各前述缺失。
凝结中涉及的蛋白质包括因子I、因子II、因子III、因子IV、因 子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、 因子XII、因子XIII、蛋白质C和组织因子(共同或个别“凝结蛋白”)。 内源性和外源性凝结路径中的主要凝结蛋白的相互作用显示于图2 中。大多数凝结蛋白以酶原形式存在，但当活化时展现促凝血蛋白酶 活性，其中它们活化另一凝结蛋白，从而有助于内源性或外源性凝血 路径和凝块形成。在内源性凝血级联路径中，FVIII与活化的因子IX、 因子X、钙和磷脂的复合物缔合。因子VIII异二聚体不具有酶活性， 但在由凝血酶或因子Xa蛋白水解活化之后，异二聚体变得具有作为 酶因子IXa的辅因子的活性，其中因子VIIIa的活性的特征在于它能 够形成因子IXa和X的呈适于由因子IXa活化因子X的构象的膜结 合位点。在由凝血酶裂解后，活化的FVIII(FVIIIa)自血管性血友病因 子解离且结合带负电荷的磷脂PL，且所得复合物作为因子IXa的辅 因子参与在因子X活化(因子X酶(tenase))复合物中。在C2结构域以 及A3结构域中的氨基酸残基1649至1689内是血管性血友病因子 (vWF)结合位点，其用于与血管性血友病因子复合，所得循环复合物 保护FVIII免遭在血液中快速降解(Weiss HJ等Stabilization of factor VIII in plasma by the von Willebrand factor.Studies on posttransfusion and dissociated factor VIII and in patients with von Willebrand's disease. J Clin Invest(1977)60:390)。
活化的因子VIII是包含A1结构域和A2结构域以及包括结构域 A3-C1-C2的轻链的异三聚体。因子IX的活化是通过自分子两步移除 活化肽(Ala 146-Arg 180)来实现(Bajaj等,Human factor IX and factor IXa,METHODS IN ENZYMOLOGY.1993)。第一裂解是由因子XIa 或因子VIIa/组织因子在Arg 145-Ala 146位点处进行。第二且限速裂 解是在Arg 180-Val 181处进行。活化移除35个残基。活化的人因子 IX以通过一个使酶连接于Gla结构域的二硫桥固持在一起的C末端 重链(28kDa)和N末端轻链(18kDa)的异二聚体形式存在。因子IXa 又与活化的因子VIII协力活化因子X。或者，因子IX和X可均由通 过外源性路径产生的与脂质化组织因子复合的因子VIIa活化。因子 Xa接着参与凝血酶原转化成凝血酶所凭借的最终共同路径，且凝血 酶又使纤维蛋白原转化成血纤维蛋白以形成凝块。
凝血过程中的缺陷可导致凝块形成所花费的时间延长的流血病 症(凝血病变)。所述缺陷可为先天性的或获得性的。举例来说，甲型 血友病和乙型血友病是特征在于分别缺乏FVIII和FIX的遗传性疾 病。换句话说，生物活性因子VIII纠正源于受甲型血友病折磨的个 体的血浆中的凝血缺陷。重组FVIII已显示是有效的且已被核准用于 治疗成年患者和儿科患者的甲型血友病，且也用于阻止流血事件或预 防与创伤和/或手术相关的流血。因子VIII的当前治疗用途在治疗展 现因子VIII缺乏的个体以及患有血管性血友病(Von Willebrand’s disease)的那些个体方面可存在问题。此外，以补充疗法接受因子VIII 的个体常产生针对这些蛋白质的常降低或消除所结合的FVIII的促凝 血活性的抗体。由于降低或打消治疗功效的这些抗体的存在，连续治 疗是极度困难的。
在一方面，本发明涵盖在CFXTEN融合蛋白组合物中包括与人 FVIII一致的FVIII序列、与FVIII序列具有同源性的序列、天然序列 (如来自人、非人灵长类动物、哺乳动物(包括家养动物))、或截短形 式的FVIII；其全部保留天然FVIII的至少一部分促凝血活性且适用 于预防、治疗、介导或改善甲型血友病或与创伤、手术或缺乏凝血因 子VIII相关的流血事件。可通过标准同源性搜索技术(如NCBI BLAST)或在公开数据库中得到与FVIII具有同源性的序列，所述数 据库如化学文摘服务数据库(Chemical Abstracts Services Database)(例 如CAS登记)、GenBank、全球蛋白质资源(Universal Protein Resource)(UniProt)和订阅提供的数据库，如GenSeq(例如Derwent)。
在一个实施方案中，并入主题CFXTEN组合物中的FVIII是序 列对应于自然界中所见的FVIII蛋白的重组多肽。在另一实施方案中， FVIII是天然序列的保留相应天然FVIII的至少一部分促凝血活性的 非天然FVIII序列变体、片段、同源物或模拟物。在另一实施方案中， FVIII是全部或一部分B结构域缺失的截短变体(“FVIII BDD”)，其可 呈异二聚形式或可保持为单链(“scFVIII”)，后者描述于Meulien等, Protein Eng.(1988)2(4):301-306中。FVIII BDD的非限制性实例是在 以下处缺失氨基酸的因子VIII序列：在残基编号741与残基编号1640 之间(相对于天然成熟FVIII加以编号)、或在残基编号745与残基编 号1640之间、或在残基编号745与残基编号1640之间、或在残基编 号741与残基编号1690之间、或在残基编号745与残基编号1667之 间、或在残基编号745与残基编号1657之间、或在残基编号747与 残基编号1642之间、或在残基编号751与残基编号1667之间。
在另一实施方案中，将异源序列并入FVIII中，所述异源序列可 包括如以下更充分描述的XTEN。表1提供由本发明的CFXTEN融 合蛋白涵盖的FVIII的氨基酸序列的非限制性清单。在一些实施方案 中，并入CFXTEN融合蛋白中的FVIII包括相较于选自表1的具有 类似长度的氨基酸序列，具有至少约70％序列同一性、或者80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一性 的蛋白质。
表1：FVIII氨基酸序列
本发明也涵盖包含具有在表1的FVIII序列中进行的各种氨基酸 缺失、插入和取代的保留促凝血活性的FVIII的CFXTEN。多肽序列 中的氨基酸的保守性取代的实例显示于表2中。在相较于本文公开的 特定序列，FVIII的序列同一性小于100％的CFXTEN的实施方案中， 本发明涵盖用其它19种天然L-氨基酸的任一者取代给定FVIII的可 在FVIII序列内任何位置处的给定氨基酸残基，包括邻近氨基酸残基。 如果任一取代导致促凝血活性不合需要变化，那么可采用一种替代性 氨基酸且通过本文所述的方法(例如表49的测定)，或使用例如美国 专利号5,364,934(其内容以引用的方式整体并入本文)中阐述的用于 保守性和非保守性突变的任何技术和指导方针；或使用本领域中通常 已知的方法评估构建体蛋白质。在一优选取代中，CFXTEN实施方案 的FVIII组分是通过用甘氨酸或丙氨酸置换R1648残基(相对于天然 成熟形式的FVIII加以编号)来修饰以防止对异二聚体形式的蛋白水 解加工。在另一取代中，CFXTEN实施方案的FVIII组分是通过用苯 丙氨酸置换Y1680残基(相对于天然成熟形式的FVIII加以编号)来修 饰。在另一实施方案中，CFXTEN实施方案的FVIII组分是通过用苯 丙氨酸置换Y1680残基(相对于天然成熟形式的FVIII加以编号)且用 甘氨酸或丙氨酸置换R1648残基(相对于天然成熟形式的FVIII加以 编号)来修饰。
在一个实施方案中，融合蛋白组合物的FVIII具有一个或多个被 设计来降低FVIII抑制剂在由表9的抗体识别的表位处的结合的氨基 酸取代，包括但不限于在以下处的取代：Lys(377)、Lys(466)、Lys(380)、 Ser(488)、Arg(489)、Arg(490)、Leu(491)、Lys(493)、Lys(496)、His(497)、 Lys(499)、Lys(512)、Lys(523)、Lys(556)、Met(2199)、Phe(2200)、 Leu(2252)、Val(2223)和Lys(2227)。此外，变体可包括例如其中在或 接近全长天然氨基酸序列或FVIII的结构域的N末端或C末端处添 加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽，只要变体保留天然肽的一些 (如果不是全部)促凝血活性即可。相较于天然循环FVIII保留至少一 部分(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％、或至少95％或更多)促凝血活性的所得FVIII序列被视为适用于 本发明的融合蛋白组合物。FVIII变体的实例在本领域中是已知的， 包括美国专利和申请号6,316,226；6,818,439；7,632,921；20080227691 中所述的那些，所述专利和申请以引用的方式并入本文。在一个实施 方案中，FVIII序列变体具有在氨基酸位置75(相对于天然成熟形式的 FVIII加以编号)处取代缬氨酸的天冬氨酸。
表2：示例性保守性氨基酸取代
原始残基 示例性取代
Ala(A) val；leu；ile
Arg(R) lys；gln；asn
Asn(N) gin；his；lys；arg
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Pro
His(H) asn:gin:lys:arg
Ile(I) leu；val；met；ala；phe:正亮氨酸
Leu(L) 正亮氨酸:ile:val；met；ala:phe
Lys(K) arg:gin:asn
Met(M) leu；phe；ile
Phe(F) leu:val:ile；ala
Pro(P) Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp:phe:thr:ser
Val(V) Ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸
III).延伸重组多肽
在一方面，本发明提供适用作用以连接于FVIII多肽和/或并入 FVIII多肽内，从而产生CFXTEN融合蛋白的融合蛋白配偶体(partner) 的XTEN多肽组合物。XTEN通常是具有非天然存在的大致上非重复 序列的多肽，所述序列在生理条件下具有低程度或不具有二级或三级 结构。XTEN通常具有约36至约3000个氨基酸，其中大多数或全部 是小亲水性氨基酸。如本文所用，“XTEN”明确排除完整抗体或抗体 片段(例如单链抗体和Fc片段)。XTEN多肽具有作为融合蛋白配偶体 的效用，因为它们在连接于FVIII蛋白以产生CFXTEN融合蛋白时 起各种作用，从而赋予某些合乎需要的药代动力学、物理化学、药理 学和医药性质。所述CFXTEN融合蛋白组合物相较于未连接于XTEN 的相应FVIII具有增强的性质，从而使得它们适用于治疗如以下更充 分描述的与FVIII缺乏或流血病症相关的某些病状。
对待融合于用于产生本发明融合蛋白组合物的FVIII蛋白的 XTEN的选择准则通常涉及XTEN的物理/化学性质的属性和构象结 构，所述构象结构又用于对FVIII融合蛋白组合物赋予增强的医药、 药理学和药代动力学性质。XTEN的非结构化特征和物理/化学性质 部分地由不相称地限于4-6个亲水性氨基酸的总体氨基酸组成、可定 量非重复设计中的氨基酸的连接、以及XTEN多肽的长度所致。在 为XTEN所共有但不为多肽所共有的一有利特征中，本文公开的 XTEN的性质不依赖于绝对一级氨基酸序列，如由表4的示例性序列 的多样性所证明，在不同长度范围内具有相似性质，其中许多性质在 实施例中加以记载。本发明的XTEN可展现一种或多种或全部以下 有利性质：非结构化构象、构象可挠性、水溶性增强、高度蛋白酶抗 性、低免疫原性、与哺乳动物受体的结合较低、确定电荷度和流体动 力学(或斯托克斯)半径增加；可使得它们特别适用作融合蛋白配偶体 的性质。相较于未连接于XTEN的FVIII，XTEN赋予包含融合于 XTEN的FVIII的融合蛋白的增强的性质的非限制性实例包括总体溶 解度和/或代谢稳定性增加、对蛋白水解的敏感性降低、免疫原性降 低、在皮下或肌肉内施用时吸收速率降低、与FVIII清除受体的结合 降低、与抗有效负载抗体的反应性降低、与底物的相互作用增强、和 /或当向受试者施用时药代动力学性质增强。相较于未连接于XTEN 的FVIII，CFXTEN组合物的增强的药代动力学性质包括终末半衰期 更长(例如，2倍、3倍、4倍或更长)、曲线下面积(AUC)增加(例如， 25％、50％、100％或更大)、分布体积更低、以及在皮下或肌肉内注 射之后吸收增强(这是相较于必须静脉内施用的可商购FVIII形式的 一个优势)。此外，据信包含裂解序列(以下更充分描述)的CFXTEN 组合物允许持续释放生物活性FVIII，以使施用的CFXTEN充当储槽 (depot)。明确涵盖的是本发明CFXTEN融合蛋白可展现本文公开的 改进性质的一者或多者或任何组合。由于这些性质增强，据信当以类 似剂量下施用时，CFXTEN组合物相较于未连接于XTEN的FVIII 允许以较小频率给药。所述CFXTEN融合蛋白组合物具有治疗如本 文所述的某些因子VIII相关病状的效用。
本领域已知用于测定如包含XTEN的CFXTEN组合物的蛋白质 的物理/化学性质的多种方法和测定。所述性质包括但不限于二级或 三级结构、溶解度、蛋白质聚集、稳定性、绝对和表观分子量、纯度 和均一性、熔融性质、污染和水含量。用以测定这些性质的方法包括 分析性离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、反相HPLC、 光散射、毛细管电泳、圆二色性、差示扫描量热法、荧光、HPLC- 离子交换、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼(Raman)光谱术、折射 法和紫外光/可见光谱术。其它方法公开于Arnau等,Prot Expr and Purif(2006)48,1-13中。
CFXTEN的XTEN组分被设计来在生理条件下充当变性肽序列， 不管聚合物的延伸长度如何。“变性”描述肽在溶液中的特征在于肽骨 架的构象自由度较大的状态。大多数肽和蛋白质在高浓度变性剂存在 下或在高温下采用变性构象。呈变性构象的肽具有例如特征圆二色性 (CD)光谱且特征在于缺乏长程相互作用，如通过NMR所确定。“变 性构象”和“非结构化构象”在本文中是同义使用。在一些实施方案中， 本发明提供在生理条件下主要缺乏二级结构的XTEN序列。在其它 情况下，XTEN序列在生理条件下大致上缺乏二级结构以使XTEN可 采用无规卷曲构象。如在这个情形下使用的“主要缺乏”是指XTEN序 列的至少50％XTEN氨基酸残基不促成二级结构，如通过本文所述 的手段所测量或确定。如在这个情形下使用的“大致上缺乏”是指 XTEN序列的至少约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约 95％、或至少约99％XTEN氨基酸残基不促成二级结构，如通过本文 所述的方法所测量或确定。
本领域中已建立多种方法来辨别在给定多肽中存在或不存在二 级和三级结构。具体来说，二级结构可例如通过在“远紫外”光谱区(1 90-250nm)中进行圆二色性光谱术来以分光光度方式测量。如α螺旋 和β折叠的二级结构元件各自产生CD光谱的特征形状和幅度，缺乏 这些结构元件也是这样。也可通过某些计算机程序或算法预测多肽序 列的二级结构，所述程序或算法如熟知的Chou-Fasman算法(Chou,P. Y.等(1974)Biochemistry,13:222-45)和Garnier-Osguthorpe-Robson (“GOR”)算法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996),GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequenc e.Methods Enzymol 266:540-553)，如美国专利申请公布号2003022 8309A1中所述。对于给定序列，算法可预测是否存在一些或完全不 存在二级结构，表示为序列中形成例如α螺旋或β折叠的总残基数和 /或残基的百分比或序列中预测会导致形成无规卷曲(其缺乏二级结构) 的残基的百分比。
在一个实施方案中，主题融合蛋白组合物中使用的XTEN序列 的α螺旋百分比在0％至小于约5％的范围内，如通过Chou-Fasman 算法所确定。在另一实施方案中，融合蛋白组合物的XTEN序列的β 折叠百分比在0％至小于约5％的范围内，如通过Chou-Fasman算法 所确定。在一些实施方案中，融合蛋白组合物的XTEN序列的α螺 旋百分比在0％至小于约5％的范围内且β折叠百分比在0％至小于约 5％的范围内，如通过Chou-Fasman算法所确定。在一些实施方案中， 融合蛋白组合物的XTEN序列的α螺旋百分比小于约2％且β折叠百 分比小于约2％。融合蛋白组合物的XTEN序列具有高度无规卷曲百 分比，如通过GOR算法所确定。在一些实施方案中，XTEN序列具 有至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、 至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、 且最优选至少约99％无规卷曲，如通过GOR算法所确定。在一些实 施方案中，融合蛋白组合物的XTEN序列的α螺旋百分比在0％至小 于约5％的范围内且β折叠百分比在0％至小于约5％的范围内，如通 过Chou-Fasman算法所确定；且具有至少约90％无规卷曲，如通过 GOR算法所确定。在其它实施方案中，融合蛋白组合物的XTEN序 列具有小于约2％的α螺旋百分比和小于约2％的β折叠百分比、至 少约90％无规卷曲，如通过GOR算法所确定。
1.非重复序列
意图CFXTEN实施方案的XTEN序列大致上是非重复的。一般 来说，重复氨基酸序列具有聚集或形成较高级结构的倾向，如由天然 重复序列(如胶原蛋白和亮氨酸拉链)所例证。这些重复氨基酸也可倾 向于形成接触，从而产生结晶或伪结晶结构。相反，非重复序列的聚 集倾向较低使得能够设计带电荷氨基酸的频率相对较低的长序列 XTEN，如果序列是重复的，那么所述长序列XTEN将另外可能聚集。 主题XTEN的非重复性可通过评估一种或多种以下特征加以观察。 在一个实施方案中，“大致上非重复”XTEN序列具有约36、或至少 72、或至少96、或至少144、或至少288、或至少400、或至少500、 或至少600、或至少700、或至少800、或至少864、或至少900、或 至少1000、或至少2000至约3000个或更多个氨基酸残基，或具有 的长度在约36至约3000、约100至约500、约500至约1000、约1000 至约3000个氨基酸和残基的范围内，其中序列中无三个连续氨基酸 是相同氨基酸类型，除非所述氨基酸是丝氨酸，在所述情况下，至多 三个连续氨基酸是丝氨酸残基。在另一实施方案中，如以下更充分所 述，“大致上非重复”XTEN序列包含具有9至14个氨基酸残基的基 序，其中所述基序由4至6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝 氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，且其中任 一基序中的任何两个连续氨基酸残基的序列在所述序列基序中不重 复超过两次。
多肽或基因的重复程度可通过计算机程序或算法或通过本领域 中已知的其它手段加以测量。根据本发明，本文公开将用于计算如 XTEN的特定多肽的重复程度的算法，且提供由算法分析的序列的实 例(参见以下实施例)。在一方面，预定长度的多肽的重复性可根据由 等式1给出的公式加以计算(在下文中称为“子序列计分”)：
子序列计分
其中：m＝(多肽的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且 计数i＝序列i内各独特子序列的累积出现次数
称为“SegScore”的算法被开发来应用前述等式定量如XTEN的多 肽的重复性，从而提供子序列计分，其中通过确定长度“s”的独特子 序列在设置长度中出现的次数(“计数”)，除以序列的预定长度内的子 序列的绝对数目来分析预定氨基酸长度“n”的序列的重复性。图27描 绘SegScore算法的逻辑流程图，而图28描绘如何获得具有11个氨 基酸且子序列长度是3个氨基酸残基的假想XTEN的子序列计分的 示意图。举例来说，预定多肽长度200个氨基酸残基具有192个重叠 9氨基酸子序列和198个3-mer子序列，但任何给定多肽的子序列计 分将取决于独特子序列的绝对数目以及各独特子序列(是指不同氨基 酸序列)在序列的预定长度中出现的频率。
在本发明的情形下，“子序列计分”是指各独特3-mer框跨越累积 XTEN多肽的200个连续氨基酸的出现次数总和除以独特3-mer子序 列在含有200个氨基酸的序列内的绝对数目。由重复和非重复多肽的 200个连续氨基酸获得的所述子序列计分的实例呈现于实施例45中。 在一个实施方案中，本发明提供一种包含一个XTEN的CFXTEN， 其中所述XTEN的子序列计分小于12、更优选小于10、更优选小于 9、更优选小于8、更优选小于7、更优选小于6、且最优选小于5。 在另一实施方案中，本发明提供包含至少两个至约六个XTEN的 CFXTEN，其中XTEN的200个氨基酸的子序列计分小于10、更优 选小于9、更优选小于8、更优选小于7、更优选小于6、且最优选小 于5。在本文所述的CFXTEN融合蛋白组合物的实施方案中，融合蛋 白的具有子序列计分10或更低(即9、8、7等)的XTEN组分也大致 上是非重复的。
据信本发明的XTEN的非重复特征连同在XTEN中占优势的特 定类型的氨基酸一起而非绝对一级序列赋予CFXTEN融合蛋白的许 多增强的物理化学和生物性质。这些增强的性质包括所得CFXTEN 相较于包含具有重复序列的多肽的融合蛋白，融合蛋白在宿主细胞中 的表达程度更高、编码XTEN的基因的遗传稳定性更大、溶解度更 大、聚集倾向更小、以及药代动力学增强。这些增强的性质允许更高 效制造，降低商品成本，且有助于配制包含XTEN的含有极高蛋白 质浓度(在一些情况下超过100mg/ml)的药物制剂。此外，各实施方 案的XTEN多肽序列被设计来具有低程度的内部重复性以降低或大 致上消除在向哺乳动物施用时的免疫原性。当向哺乳动物施用时，由 主要限于仅三个氨基酸(如甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸)的短重复基序组 成的多肽序列可产生相对较高抗体效价，尽管在这些序列中不存在预 测T细胞表位。这可能由多肽的重复性质引起，因为已显示具有重复 表位的免疫原(包括蛋白质聚集体、交联免疫原和重复碳水化合物)具 有高度免疫原性且可例如导致B细胞受体交联，从而导致B细胞活 化。(Johansson,J.等(2007)Vaccine,25:1676-82；Yankai,Z.等(2006) Biochem Biophys Res Commun,345:1365-71；Hsu,C.T.等(2000) Cancer Res,60:3701-5)；Bachmann MF等Eur J Immunol.(1995) 25(12):3445-3451)。
2.示例性序列基序
本发明涵盖用作融合配偶体的包含多个较短序列单元或基序的 XTEN，其中所述基序的氨基酸序列是非重复的。尽管使用利用多聚 化序列基序的文库进行“构筑嵌段”方法来产生XTEN序列，但满足非 重复性质。因此，尽管XTEN序列可由少至四种不同类型的序列基 序的多个单元组成，但因为所述基序自身通常由非重复氨基酸序列组 成，所以总体XTEN序列被设计来致使序列大致上是非重复的。
在一个实施方案中，XTEN具有含有大于约36至约3000、或约 100至约2000、或约144至约1000个氨基酸残基或甚至更长的大致 上非重复序列，其中所述XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、 或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％由非重叠 序列基序组成，且其中所述基序各自具有约9至36个氨基酸残基。 在其它实施方案中，XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、或至 少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或约100％由非重叠序列 基序组成，其中所述基序各自具有9至14个氨基酸残基。在其它实 施方案中，XTEN序列的至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、 或至少约95％、或至少约97％、或约100％由非重叠序列基序组成， 其中所述基序各自具有12个氨基酸残基。在这些实施方案中，优选 的是序列基序由大致上(例如，90％或90％以上)或仅小亲水性氨基酸 组成，以使总体序列具有非结构化可挠性特征。包括在XTEN中的 氨基酸的实例是例如精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸。由于如密码子优化、 装配多核苷酸编码序列基序、蛋白质的表达、表达的蛋白质的电荷分 布和溶解度、以及二级和三级结构的测试变量，发现具有本文公开的 增强的特征的XTEN组合物主要或仅包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝 氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)残基，其中序列被设计成 大致上是非重复的。在一个实施方案中，XTEN序列主要具有四至六 种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨 酸(E)或脯氨酸(P)的氨基酸，所述氨基酸排列在长度大于约36至约 3000、或约100至约2000、或约144至约1000个氨基酸残基的大致 上非重复序列中。在一些实施方案中，XTEN序列是由4、5或6种 类型的选自由以下组成的组的氨基酸构成：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)或脯氨酸(P)。在一些实施方案中， XTEN具有大于约36至约1000、或约100至约2000、或约400至约 3000个氨基酸残基的序列，其中所述序列的至少约80％由非重叠序 列基序组成，其中所述基序各自具有9至36个氨基酸残基且其中各 所述基序的至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或 至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％或100％由4至6 种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨 酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，且其中全长XTEN中的任一氨基酸 类型的含量不超过30％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约 90％由非重叠序列基序组成，其中所述基序各自具有9至36个氨基 酸残基，其中所述基序由4至6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，且其中 全长XTEN中的任一氨基酸类型的含量不超过40％、或约30％、或 25％、或约17％。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％由非 重叠序列基序组成，其中所述基序各自具有12个由4至6种类型的 选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯 氨酸(P)的氨基酸组成的氨基酸残基，且其中全长XTEN中的任一氨 基酸类型的含量不超过40％、或30％、或约25％。在其它实施方案 中，XTEN序列的至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、 或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％ 至约100％由非重叠序列基序组成，其中所述基序各自具有12个由甘 氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P) 组成的氨基酸残基。
在其它实施方案中，XTEN包含大于约36至约3000个氨基酸残 基的大致上非重复序列，其中所述序列的至少约80％、或至少约90％、 或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、 或约97％、或约98％、或约99％由9至14个氨基酸残基的非重叠序 列基序组成，其中所述基序由4至6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨 酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成， 且其中任一基序中的任何两个连续氨基酸残基的序列在所述序列基 序中不重复超过两次。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％、 或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、 或约97％、或约98％、或约99％由12个氨基酸残基的非重叠序列基 序组成，其中所述基序由四至六种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、 丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，且其中 任一序列基序中的任何两个连续氨基酸残基的序列在所述序列基序 中不重复超过两次。在其它实施方案中，XTEN序列的至少约90％、 或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、 或约97％、或约98％、或约99％由12个氨基酸残基的非重叠序列基 序组成，其中所述基序由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸 (T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成，且其中任一序列基序中的任何两个 连续氨基酸残基的序列在所述序列基序中不重复超过两次。在其它实 施方案中，XTEN由12个氨基酸的序列基序组成，其中所述氨基酸 选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯 氨酸(P)，且其中任一序列基序中的任何两个连续氨基酸残基的序列 在所述序列基序中不重复超过两次，且其中全长XTEN中的任一氨 基酸类型的含量不超过30％。前述实施方案是大致上非重复XTEN 序列的实例。以下详述其它实例。
在一些实施方案中，本发明提供包含一个、或两个、或三个、或 四个、五个、六个或更多个具有约36至约1000个氨基酸残基或累积 具有约100至约3000个氨基酸残基的非重复XTEN序列的CFXTEN 组合物，其中所述序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、 或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、 或约98％、或约99％至约100％由四个或更多个选自表3的氨基酸序 列的非重叠序列基序的多个单元组成，其中总体序列保持大致上非重 复。在一些实施方案中，XTEN包含非重叠序列基序，其中所述序列 的约80％、或至少约85％、或至少约90％、或约91％、或约92％、 或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、 或约99％或约100％由选自自表3选择的单一基序家族(从而产生家族 序列)的非重叠序列的多个单元组成。如本文所用，“家族”是指XTEN 具有仅选自来自表3的单一基序种类(即AD、AE、AF、AG、AM、 AQ、BC或BD XTEN)的基序，且选择XTEN中不来自家族基序的任 何其它氨基酸以实现所需性质，如允许通过编码核苷酸并入限制位 点，并入裂解序列，或实现与CFXTEN的FVIII凝血因子组分的更 好键联。在XTEN家族的一些实施方案中，XTEN序列包含AD基序 家族或AE基序家族或AF基序家族或AG基序家族或AM基序家族 或AQ基序家族或BC家族或BD家族的非重叠序列基序的多个单元， 从而所得XTEN展现上述同源性范围。在其它实施方案中，XTEN包 含来自表3的两个或更多个基序家族的基序序列的多个单元。可选择 这些序列以实现由以下更充分描述的基序的氨基酸组成赋予的所需 物理/化学特征，包括如净电荷、亲水性、缺乏二级结构或缺乏重复 性的性质。在上文于这个段落中所述的实施方案中，可使用本文所述 的方法选择并装配并入XTEN中的基序以获得约36至约3000个氨 基酸残基的XTEN。
表3:具有12个氨基酸的XTEN序列基序和基序家族
*表示当以各种排列一起使用时产生“家族序列”的个别基序序列
在XTEN家族的一些实施方案中，XTEN序列包含AD基序家族、 AE基序家族或AF基序家族或AG基序家族或AM基序家族或AQ 基序家族或BC家族或BD家族的非重叠序列基序的多个单元，从而 所得XTEN展现上述同源性范围。在其它实施方案中，XTEN包含被 选择来实现可由以下更充分描述的基序的氨基酸组成赋予的所需物 理化学特征的来自表3的两个或更多个基序家族的基序序列的多个 单元，所述特征包括如净电荷、缺乏二级结构或缺乏重复性的性质。 在上文于这个段落中所述的实施方案中，可使用本文所述的方法选择 并装配并入XTEN中的基序或基序的各部分以获得约36、约42、约 72、约144、约288、约576、约864、约1000、约2000至约3000 个氨基酸残基或任何中间长度的XTEN。适用于并入主题CFXTEN 中的XTEN家族序列的非限制性实例呈现于表4中。意图关于表4 提及的指定序列具有表4中阐述的那个序列，而一般化提及例如 AE144序列意图涵盖具有144个氨基酸残基的任何AE序列；例如 AE144_1A、AE144_2A等，或一般化提及例如AG144序列意图涵盖 具有144个氨基酸残基的任何AG序列，例如AG144_1、AG144_2、 AG144_A、AG144_B、AG144_C等。
表4:XTEN多肽
在其它实施方案中，CFXTEN组合物包含一个或多个长度在约 36至约3000个氨基酸残基的范围内的非重复XTEN序列，其中所述 序列的至少约80％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、 或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％ 至约100％由非重叠36个氨基酸的序列基序组成，所述基序选自表 13-17的一个或多个多肽序列，呈家族序列形式，或其中基序选自两 个或更多个基序家族。
在CFXTEN融合蛋白的XTEN组分的小于100％的氨基酸由4、 5或6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、 谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸组成，或小于100％序列由来自表3 的序列基序或表4和13-17的XTEN序列组成的那些实施方案中， XTEN的其它氨基酸残基选自任何其它14种天然L-氨基酸，但优先 选自亲水性氨基酸以使XTEN序列含有至少约90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％亲水性氨基酸。不是 甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸 (P)的XTEN氨基酸分散在整个XTEN序列中，位于序列基序内或之 间，或集中在XTEN序列的一个或多个短链段中例如以在XTEN组 分与FVIII组分之间产生接头。在CFXTEN的XTEN组分包含除甘 氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P) 以外的氨基酸的所述情况下，优选的是小于约2％或小于约1％氨基 酸是疏水性残基以使所得序列通常缺乏二级结构，例如不具有超过 2％α螺旋或2％β折叠，如通过本文公开的方法所确定。在构建XTEN 时有利性较小的疏水性残基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。另外，可设计XTEN序列以含有小 于5％或小于4％或小于3％或小于2％或小于1％或不含有以下氨基 酸：半胱氨酸(以避免形成二硫化物和氧化)、甲硫氨酸(以避免氧化)、 天冬酰胺和谷氨酰胺(以避免脱酰胺)。因此，在一些实施方案中， CFXTEN融合蛋白的除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、 谷氨酸(E)和脯氨酸(P)之外也包含其它氨基酸的XTEN组分具有促成 α螺旋和β折叠的残基小于5％(如通过Chou-Fasman算法所测量)的序 列且具有至少90％、或至少约95％或95％以上无规卷曲形成率(如通 过GOR算法所测量)。
3.序列的长度
在另一方面，本发明提供用于并入CFXTEN组合物中的具有不 同长度的XTEN，其中基于待在融合蛋白中实现的性质或功能选择 XTEN序列的长度。视预定性质或功能而定，CFXTEN组合物包含位 于FVIII序列内部或FVIII结构域之间的短长度或中等长度XTEN和 /或位于如本文所述的融合蛋白中的可充当载体的较长XTEN序列。 尽管不意图具有限制性，但XTEN或XTEN的片段包括具有约6至 约99个氨基酸残基的短区段、约100至约399个氨基酸残基的中等 长度、和约400至约1000且多达约3000个氨基酸残基的较长长度。 因此，用于并入主题CFXTEN中的XTEN涵盖长度是约6、或约12、 或约36、或约40、或约42、或约72或约96、或约144、或约288、 或约400、或约500、或约576、或约600、或约700、或约800、或 约864、或约900、或约1000、或约1500、或约2000、或约2500、 或多达约3000个氨基酸残基的XTEN或XTEN的片段。或者，XTEN 序列的长度可为约6至约50、约50至约100、约100至150、约150 至250、约250至400、约400至约500、约500至约900、约900至 1500、约1500至2000、或约2000至约3000个氨基酸残基。并入主 题CFXTEN中的XTEN的准确长度可变化而不不利地影响CFXTEN 组合物的活性。在一个实施方案中，用于本文公开的CFXTEN中的 一个或多个XTEN的长度是36个氨基酸、42个氨基酸、144个氨基 酸、288个氨基酸、576个氨基酸或864个氨基酸且可选自一个XTEN 家族序列；即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。在另一实 施方案中，用于本文公开的CFXTEN中的两个或更多个XTEN的长 度是36个氨基酸、42个氨基酸、144个氨基酸、288个氨基酸、576 个氨基酸或864个氨基酸且可选自两个XTEN家族序列；即AD、AE、 AF、AG、AM、AQ、BC或BD，其中AE和AG家族序列的组合是 优选的。在一些实施方案中，包含一个或多个本文使用的XTEN的 CFXTEN含有选自表4中的任一序列的XTEN，其可直接或通过本文 公开的间隔子序列连接于FVIII组分。
在其中XTEN充当可挠性接头，或插入FVIII序列的外部环或无 序区域中以增加区域的体积、可挠性或亲水性，或被设计来干扰FVIII 的清除受体以增强药代动力学性质，或干扰FVIII抑制剂的结合或其 它抗FVIII抗体，或其中短长度或中等长度的XTEN用于促进组织渗 透或改变CFXTEN融合蛋白与它的靶标的相互作用的强度，或其中 合乎需要的是在FVIII序列内的多个位置处在短长度或中等长度的区 段中分布XTEN的累积长度的特定CFXTEN构型设计中，本发明涵 盖一个、两个、三个、四个、五个或更多个短或中等XTEN序列插 入在一个或多个FVIII结构域之间或内或插入在外部环内，或插入在 FVIII序列中的其它位点处的CFXTEN组合物，所述其它位点如但不 限于在或邻近于表5、表6、表7、表8和表9中鉴定或如图8-9中说 明的插入位点处的位置。在一个前述实施方案中，CFXTEN融合蛋白 含有多个XTEN区段，例如至少两个、或至少三个、或至少四个、 或至少五个或更多XTEN区段，其中所述XTEN区段可相同或它们 可不同且其中当通过本文公开的一种测定加以测定时，CFXTEN保留 天然FVIII的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多 的促凝血活性。在其中XTEN充当载体以增加融合蛋白的体积，或 改变CFXTEN融合蛋白与它的靶标的相互作用的强度，或增强融合 蛋白的药代动力学性质的其它特定CFXTEN构型设计中，本发明涵 盖一个或多个中等长度或较长长度XTEN序列插入在C末端处、B 结构域(或BDD序列的残余物)内、一个或多个FVIII结构域之间或内、 外部环内、或FVIII序列中的其它位点处的CFXTEN组合物，所述 其它位点如但不限于表5、表6、表7、表8和表9中鉴定或如图8-9 中说明的插入位点。然而，据信将多个短长度至中等长度的XTEN 并入CFXTEN组合物中会对融合蛋白赋予相较于在较少但较长长度 XTEN中具有相同数目的氨基酸的CFXTEN融合蛋白增强的性质， 但仍然产生具有促凝血活性和延长的半衰期的组合物；其基本原理在 本文中关于多个XTEN的获得半径加以详述。
在其中CFXTEN融合蛋白包含多个XTEN序列的实施方案中， XTEN序列中总残基的累积长度大于约100至约3000、或约200至 约2000、或约400至约1000个氨基酸残基且XTEN可相同或它们可 在序列、净电荷或长度方面不同。在包含多个XTEN的CFXTEN的 一个实施方案中，当与具有类似长度的序列最优比对时，个别XTEN 序列相较于选自表3、4和13-17的基序或XTEN或其片段各自展现 至少约80％序列同一性，或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性。
如以下更充分所述，公开以下各方法：其中CFXTEN是通过选 择XTEN的长度和它在CFXTEN内的并入位点来设计以赋予 CFXTEN融合蛋白的靶标半衰期、促凝血活性的保持、与FVIII抑制 剂的结合降低或物理化学性质(例如，稳定性或溶解度)增强；产生并 表达编码构建体；以及分离并回收重组CFXTEN融合蛋白。一般来 说，相较于较短累积长度，例如短于约280个残基，累积长度长于约 400个残基的XTEN并入CFXTEN组合物中导致半衰期较长。在一 个实施方案中，涵盖包含具有长序列长度至少约400、或至少约600、 或至少约800、或至少约900、或至少约1000个或更多个氨基酸的至 少单一XTEN作为载体的CFXTEN融合蛋白设计。在另一实施方案 中，将多个XTEN并入融合蛋白中以实现累积长度至少约400、或至 少约600、或至少约800、或至少约900、或至少约1000个或更多个 氨基酸，其中XTEN可相同或它们可在序列或长度方面不同。如本 文所用，当超过一个XTEN并入CFXTEN融合蛋白中时，“累积长度” 意图涵盖以氨基酸残基数计的总长度。两个前述实施方案被设计来在 向受试者施用之后赋予相较于包含较短累积XTEN长度的CFXTEN 增加的生物可用度和/或增加的终末半衰期，但仍然产生促凝血活性 和止血作用。当皮下或肌肉内施用时，相较于类似剂量的具有较短累 积长度XTEN的CFXTEN或未连接于XTEN的FVIII，Cmax降低但 曲线下面积(AUC)增加，由此有助于能够维持CFXTEN组合物的有 效水平持续较长时期且允许在给药之间的时期增加至2、4、7、10、 14或21天，如以下更充分所述。因此，除本文所述的其它物理化学 性质之外，XTEN对施用的CFXTEN赋予储槽性质。
当XTEN用作载体时，本发明利用的是发现增加非重复非结构 化多肽的长度会增强XTEN的非结构化性质且相应增强包含XTEN 载体的融合蛋白的物理/化学和药代动力学性质。如在实施例中更充 分所述，按比例增加XTEN的长度(即使由重复顺序的单一家族序列 基序(例如，表3的四个AE基序)所产生)导致序列相较于较短XTEN 长度具有较高无规卷曲形成百分比(例如，90％或更高)(如通过GOR 算法所确定)或α螺旋或β折叠的含量降低(例如，小于2％)(如通过 Chou-Fasman算法所确定)。此外，如实施例中所述，增加非结构化 多肽融合配偶体的长度导致融合蛋白相较于非结构化多肽配偶体具 有较短序列长度的融合蛋白，终末半衰期不成比例增加(例如，多达 50、100、200小时或200小时以上)。以下更充分描述CFXTEN相较 于未连接于XTEN的FVIII增强的药代动力学性质。
在另一方面，本发明提供用以自较长“供体”XTEN序列产生短长 度或中等长度的XTEN的方法，其中较长供体XTEN序列在N末端 或C末端处被截短，或自供体序列的内部产生片段，由此导致短长 度或中等长度XTEN。在非限制性实例中，如图16A-C中所示意性描 绘，可截短864个氨基酸残基的AG序列以产生具有144个残基的 AG序列、具有288个残基的AG序列、具有576个残基的AG序列 或其它中等长度，而可截短864个残基的AE序列(如图16D、E中所 描绘)以产生多个144个残基的AE序列、具有288或576个残基的 AE序列或其它较短或中等长度。明确涵盖的是所述方法可与本文所 述的任何XTEN实施方案一起或与表4或13-17中所列的任何序列一 起用于产生所需长度的XTEN。在优选实施方案中，包含多个XTEN 的CFXTEN具有与选自AE42_1、AE42_2、AE42_3、AG42_1、AG42_2、 AG42_3、AG42_4、AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、 AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AG144_1、 AG144_2、AG144_A、AG144_B、AG144_C、AG144_F、AG144_3、 AG144_4、AE288_1、AE288_2、AG288_1、AG288_2和AG288_DE 的序列展现至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约 92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％、或100％序列同一性 的XTEN。
4.净电荷
在其它实施方案中，XTEN多肽的非结构化特征可通过并入具有 净电荷的氨基酸残基和/或降低疏水性氨基酸在XTEN序列中的总体 百分比(例如小于5％或4％或3％或2％或1％)来增强。总体净电荷和 净电荷密度是通过修改XTEN序列中带正电荷或负电荷氨基酸的含 量来控制，其中净电荷通常表示为除由具有相反电荷的残基抵消的那 些残基之外，多肽中促成带电荷状态的氨基酸的百分比。在一些实施 方案中，组合物的XTEN的净电荷密度可高于+0.1或低于-0.1电荷/ 残基。就本文蛋白质或肽的“净电荷密度”而言，其是指净电荷除以蛋 白质或肽原中的氨基酸总数。在其它实施方案中，XTEN的净电荷可 为约0％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、 约8％、约9％、约10％约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、 约16％、约17％、约18％、约19％、或约20％或更多。基于净电荷， 一些XTEN具有等电点(pI)1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、 5.0、5.5、6.0或甚至6.5。在优选实施方案中，XTEN将具有在1.5 与4.5之间的等电点且在生理条件下携带净负电荷。
因为人或动物中的大多数组织和表面具有净负电荷，所以在一些 实施方案中，XTEN序列被设计来具有净负电荷以使含有XTEN的组 合物与如血管、健康组织或各种受体的各种表面之间的非特异性相互 作用最小。在不受特定理论束缚下，由于XTEN多肽的个别地携带 净负电荷且跨越XTEN多肽的序列分布的个别氨基酸之间的静电排 斥，XTEN可采用开放构象。在一些实施方案中，设计至少90％或 95％带电荷残基由如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸或甘氨酸的其 它残基分隔的XTEN序列，此导致电荷更均一分布，表达或纯化特 性更好。净负电荷在延长序列长度的XTEN中的所述分布可产生非 结构化构象，其又可导致流体动力学半径有效增加。在优选实施方案 中，主题XTEN的负电荷是通过并入谷氨酸残基来赋予。通常，谷 氨酸残基跨越XTEN序列被均一间隔。在一些情况下，XTEN中每 20kDa XTEN可含有约10-80、或约15-60、或约20-50个谷氨酸残基， 其可导致XTEN具有将具有极类似pKa的带电荷残基，此可增加产 物的电荷均质性且使它的等电点尖锐，增强所得CFXTEN融合蛋白 的物理化学性质，且因此简化纯化程序。举例来说，当需要具有负电 荷的XTEN时，XTEN可仅选自由于并入的谷氨酸而具有约17％净 电荷的AE家族序列，或可包括不同比例的表3的含谷氨酸基序以提 供所需净电荷程度。AE XTEN的非限制性实例包括但不限于表4和 14的36、42、144、288、576、624、864和912AE家族序列或其片 段。在一个实施方案中，表4或13-17的XTEN序列可被修饰来包括 其它谷氨酸残基以实现所需净负电荷。因此，在一个实施方案中，本 发明提供XTEN，其中XTEN序列含有约1％、2％、4％、8％、10％、 15％、17％、20％、25％或甚至约30％谷氨酸。在一个实施方案中， 除谷氨酸之外，本发明也涵盖将多达5％天冬氨酸残基并入XTEN中 以实现净负电荷。
在不需要净电荷的其它实施方案中，XTEN可选自例如AG XTEN组分，如表3的AG基序或表3的不具有净电荷的那些AM基 序。AG XTEN的非限制性实例包括但不限于表4和16的36、42、 144、288、576和864AG家族序列或其片段。在另一实施方案中， XTEN可包含不同比例的AE和AG基序以具有视为针对给定用途而 言最优的净电荷或维持给定物理化学性质。
在不受特定理论束缚下，预期CFXTEN组合物的具有较高净电 荷的XTEN与如血管、组织或各种受体的各种带负电荷表面的非特 异性相互作用较小，此将进一步有助于主动清除降低。相反，据信 CFXTEN组合物的具有低净电荷(或不具有净电荷)的XTEN将与表面 具有较高程度的相互作用，鉴于细胞(例如，血小板)和血管表面对凝 血过程和凝血因子活化强度的已知作用，此可加强相关凝血因子的活 性(Zhou,R.等,Biomaterials(2005)26(16):2965-2973；London,F.等 Biochemistry(2000)39(32):9850–9858)。
本发明的组合物的XTEN通常不具有带正电荷氨基酸或具有低 含量的带正电荷氨基酸。在一些实施方案中，XTEN可具有小于约 10％具有正电荷的氨基酸残基、或小于约7％、或小于约5％、或小于 约2％、或小于约1％具有正电荷的氨基酸残基。然而，本发明涵盖 其中将有限数目的具有正电荷的氨基酸(如赖氨酸)并入XTEN中以允 许赖氨酸的ε胺与肽上的反应性基团、接头桥、或待缀合于XTEN骨 架的药物或小分子上的反应性基团之间缀合的构建体。在一个前述实 施方案中，主题CFXTEN的XTEN具有约1个至约100个之间的赖 氨酸残基、或约1至约70个赖氨酸残基、或约1至约50个赖氨酸残 基、或约1至约30个赖氨酸残基、或约1至约20个赖氨酸残基、或 约1至约10个赖氨酸残基、或约1至约5个赖氨酸残基、或者仅单 一赖氨酸残基。使用前述含赖氨酸的XTEN，可构建包含XTEN、FVIII 凝血因子加适用于治疗凝血病变病状的化学治疗剂或其它凝血因子 或辅因子的融合蛋白，其中并入XTEN组分中的药剂的最大分子数 目是根据并入XTEN中的赖氨酸或具有反应性侧链的其它氨基酸(例 如，半胱氨酸)的数目来确定。
因为疏水性氨基酸对多肽赋予结构，所以本发明规定XTEN中 的疏水性氨基酸的含量将通常小于5％、或小于2％、或小于1％疏水 性氨基酸含量。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白的XTEN组 分中的甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸含量通常小于5％、或小于2％、 且最优选小于1％。在另一实施方案中，主题CFXTEN组合物的XTEN 将具有以下序列，所述序列具有小于10％具有正电荷的氨基酸残基、 或小于约7％、或小于约5％、或小于约2％具有正电荷的氨基酸残基， 甲硫氨酸和色氨酸残基的总和将小于2％，且天冬酰胺和谷氨酰胺残 基的总和将小于总XTEN序列的5％。
5.低免疫原性
在另一方面，本文提供的XTEN序列具有低程度的免疫原性或 大致上是非免疫原性的。若干因素可促成XTEN的低免疫原性，例 如非重复序列、非结构化构象、高度溶解性、低程度自聚集或缺乏自 聚集、序列内低程度蛋白水解位点或缺乏蛋白水解位点、以及XTEN 序列中低程度表位或缺乏表位。
构象表位是由蛋白质表面的主要由蛋白质抗原的多个不连续氨 基酸序列组成的区域所形成。蛋白质的准确折叠使这些序列呈可由宿 主体液免疫系统识别为“外来物”的明确稳定空间构型或表位，从而导 致产生针对蛋白质的抗体或活化细胞介导的免疫反应。在后述情况 下，个体中对蛋白质的免疫反应深受随那个个体的HLA-DR异型的 肽结合特异性而变的T细胞表位识别影响。MHC II类肽复合物由T 细胞的表面上的同源T细胞受体啮合连同如CD4分子的某些其它共 受体的交叉结合一起可诱导T细胞内的活化状态。活化导致细胞因子 释放，从而进一步活化如B细胞的其它淋巴细胞以产生抗体或活化T 杀伤细胞作为完全细胞免疫反应。
肽结合给定MHC II类分子以在APC(抗原递呈细胞)表面上递呈 的能力取决于许多因素；最显著取决于它的一级序列。在一个实施方 案中，较低程度的免疫原性是通过设计抵抗抗原递呈细胞中的抗原加 工的XTEN序列，和/或选择不充分结合MHC受体的序列来实现。 本发明提供具有大致上非重复XTEN多肽的CFXTEN融合蛋白，所 述XTEN多肽被设计来降低与MHC II受体的结合，以及避免形成T 细胞受体或抗体结合的表位，从而产生低程度的免疫原性。免疫原性 的避免可至少部分归因于XTEN序列的构象可挠性的结果，即由于 氨基酸残基的选择和顺序而缺乏二级结构。举例来说，特别感兴趣的 是在水溶液中或在可产生构象表位的生理条件下采用紧密折叠构象 的倾向较低的序列。使用常规治疗规范和给药施用包含XTEN的融 合蛋白将通常不导致形成针对XTEN序列的中和抗体，且也降低 CFXTEN组合物中FVIII融合配偶体的免疫原性。
在一个实施方案中，主题融合蛋白中利用的XTEN序列可大致 上不含由人T细胞识别的表位。先前已公开出于产生免疫原性较小的 蛋白质的目的消除所述表位；参见例如WO 98/52976、WO 02/079232 和WO 00/3317，其以引用的方式并入本文。已描述针对人T细胞表 位的测定(Stickler,M.等(2003)J Immunol Methods,281:95-108)。特别 感兴趣的是可加以寡聚化而不产生T细胞表位或非人序列的肽序列。 这是通过以下方式来实现：测试同向重复的这些序列中存在T细胞表 位以及出现不是人序列的6至15-mer，且具体来说9-mer序列，且接 着改变XTEN序列的设计以消除或破坏表位序列。在一些实施方案 中，通过限制XTEN的预测会结合MHC受体的表位的数目，XTEN 序列大致上是非免疫原性的。随着能够结合MHC受体的表位的数目 降低，存在T细胞活化潜力以及T辅助细胞功能相伴降低、B细胞活 化或上调降低以及抗体产生降低。可通过例如像TEPITOPE(Sturniolo, T.等(1999)Nat Biotechnol,17:555-61)的表位预测算法确定预测的T 细胞表位的低程度，如实施例46中所示。蛋白质内给定肽框的 TEPITOPE计分是那个肽框结合多个最常见人MHC等位基因的 Kd(解离常数、亲和力、解离速率)的对数，如Sturniolo,T.等(1999) Nature Biotechnology 17:555中所公开。计分历经至少20个对数在约 10至约-10(对应于结合约束10e10Kd至10e-10Kd)的范围内，且可通过 避免在肽于MHC上展示期间充当锚定残基的疏水性氨基酸(如M、I、 L、V、F)来降低。在一些实施方案中，在TEPITOPE阈值计分约-5 或-6或-7或-8或-9下，或在TEPITOPE计分-10下，并入CFXTEN 中的XTEN组分不具有预测的T细胞表位。如本文所用，计分“-9” 是比计分-5更严格的TEPITOPE阈值。
在另一实施方案中，通过限制来自XTEN的序列的已知蛋白水 解位点，从而降低将XTEN加工成可结合MHC II受体的小肽来致使 本发明XTEN序列(包括并入主题CFXTEN融合蛋白中的那些)大致 上是非免疫原性的。在另一实施方案中，通过使用大致上缺乏二级结 构，从而由于结构的熵较高而赋予对许多蛋白酶的抗性的序列来致使 XTEN序列大致上是非免疫原性的。因此，TEPITOPE计分降低以及 自XTEN消除已知蛋白水解位点致使包括CFXTEN融合蛋白组合物 的XTEN的XTEN组合物大致上不能由哺乳动物受体(包括免疫系统 的那些受体或靶向FVIII的活性清除受体)所结合。在一个实施方案 中，CFXTEN融合蛋白的XTEN结合哺乳动物受体的Kd可>100nM， 或Kd大于500nM，或对哺乳动物细胞表面受体或循环多肽受体的 Kd大于1μM。
另外，XTEN的非重复序列和相应缺乏表位限制B细胞结合 XTEN或由XTEN活化的能力。重复序列被识别且可与甚至少许B 细胞形成多价接触，且由于多个T细胞非依赖性受体的交联，可刺激 B细胞增殖和抗体产生。相反，尽管XTEN可在它的延伸序列上与许 多不同B细胞接触，但由于序列缺乏重复性，各个别B细胞仅可与 个别XTEN接触一次或少数几次。在不受任何理论束缚下，XTEN刺 激B细胞增殖以及因此刺激免疫反应的倾向通常低得多。在一个实 施方案中，CFXTEN相较于未融合于XTEN的相应FVIII具有降低的 免疫原性。在一个实施方案中，向哺乳动物施用多达三次胃肠外剂量 的CFXTEN产生在血清稀释度1:100下可检测但在稀释度1:1000下 不可检测的抗CFXTEN IgG。在另一实施方案中，向哺乳动物施用多 达三次胃肠外剂量的CFXTEN产生在血清稀释度1:100下可检测但 在稀释度1:1000下不可检测的抗FVIII IgG。在另一实施方案中，向 哺乳动物施用多达三次胃肠外剂量的CFXTEN产生在血清稀释度 1:100下可检测但在稀释度1:1000下不可检测的抗XTEN IgG。在前 述实施方案中，哺乳动物可为小鼠、大鼠、兔或食蟹猕猴。
相对于具有高度重复性的序列，具有非重复序列的XTEN的另 一特征是非重复XTEN与抗体形成较弱接触。抗体是多价分子。举 例来说，IgG具有两个相同结合位点且IgM含有10个相同结合位点。 因此，针对重复序列的抗体可以高亲合力与所述重复序列形成多价接 触，此可影响所述重复序列的效能和/或消除。相反，针对非重复XTEN 的抗体可产生单价相互作用，从而导致免疫清除的可能性较小，以致 CFXTEN组合物可在循环中保持的时期增加。此外，据信如图6中所 示意性描绘，XTEN的可挠性非结构化性质提供邻近于XTEN插入位 点的FVIII区域的空间遮蔽且提供针对由FVIII抑制剂结合的空间位 阻。
在另一方面，适用作融合配偶体的主题XTEN具有高流体动力 学半径；这是一种在一些实施方案中对并有XTEN的CFXTEN融合 蛋白赋予表观分子量相应增加，而在其它实施方案中增强针对FVIII 抑制剂和抗FVIII抗体的空间位阻，从而降低它们结合CFXTEN的 能力的性质。如实施例26中所详述，XTEN连接于治疗性蛋白质序 列导致CFXTEN组合物相较于未连接于XTEN的治疗性蛋白质可具 有增加的流体动力学半径、增加的表观分子量和增加的表观分子量因 子。举例来说，在需要半衰期延长的治疗剂应用中，其中具有高流体 动力学半径的XTEN并入包含治疗性蛋白质的融合蛋白中的组合物 可使组合物的流体动力学半径有效增大超出约3-5nm的肾小球孔尺 寸(对应于表观分子量约70kDa)(Caliceti.2003.Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277)，从而导致循环蛋白质的肾清除率 降低，伴有终末半衰期相应增加和其它药代动力学性质增强。蛋白质 的流体动力学半径是由它的分子量以及由它的结构(包括形状或紧密 性)来赋予。在不受特定理论束缚下，由于肽的个别电荷之间的静电 排斥或由序列中缺乏赋予二级结构的潜力的特定氨基酸赋予的固有 可挠性，XTEN可采用开放构象。相较于具有类似序列长度和/或分 子量的具有二级和/或三级结构的多肽(如典型球状蛋白质)，XTEN多 肽的开放、延伸和非结构化构象可具有更大成比例流体动力学半径。 用于测定流体动力学半径的方法在本领域中是熟知的，如通过使用如 美国专利号6,406,632和7,294,513中所述的尺寸排阻色谱(SEC)。实 施例26证明XTEN长度增加会导致流体动力学半径、表观分子量和 /或表观分子量因子成比例增加，且因此允许相对于表观分子量或流 体动力学半径的所需截止值定制CFXTEN。因此，在某些实施方案中， 可用XTEN构造CFXTEN融合蛋白以使融合蛋白可具有流体动力学 半径至少约5nm、或至少约8nm、或至少约10nm、或约12nm、或 约15nm、或约20nm或约30nm或更大。在前述实施方案中，由 CFXTEN融合蛋白中的XTEN赋予的大流体动力学半径可导致所得 融合蛋白的清除率降低、终末半衰期增加以及平均滞留时间增加。
通常，成熟形式的FVIII组分的实际分子量是约265kDa，而在 FVIII BDD的情况下，实际分子量是约165kDa。视XTEN组分的长 度而定，包含FVIII BDD加一个或多个XTEN的CFXTEN融合蛋白 的实际分子量在约200至约270kDa的范围内。如实施例中所述，当 CFXTEN融合蛋白的分子量是由尺寸排阻色谱分析获得时，由于二级 结构的程度较低的XTEN开放构象导致它们所并入的融合蛋白的表 观分子量增加。在一些实施方案中，包含FVIII和至少一个或多个 XTEN的CFXTEN展现表观分子量至少约400kD、或至少约500kD、 或至少约700kD、或至少约1000kD、或至少约1400kD、或至少约 1600kD、或至少约1800kD、或至少约2000kD。因此，包含一个或 多个XTEN的CFXTEN融合蛋白展现的表观分子量比融合蛋白的实 际分子量大约1.3倍、或约2倍、或约3倍或约4倍、或约8倍、或 约10倍、或约12倍、或约15倍。在一个实施方案中，本文公开的 任何实施方案的分离的CFXTEN融合蛋白展现在生理条件下表观分 子量因子大于约1.3、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或 约7、或约8、或约10或大于约15。在另一实施方案中，相对于融 合蛋白的实际分子量，CFXTEN融合蛋白在生理条件下具有表观分子 量因子约3至约20、或约5至约15、或约8至约12、或约9至约10。 据信主题CFXTEN组合物的表观分子量增加会由于各因素的组合而 增强融合蛋白的药代动力学性质，所述因素包括主动清除降低、由 FVIII抑制剂的结合降低、以及毛细管和静脉流血损失降低。
IV).CFXTEN组合物
本发明提供包含具有连接于一个或多个XTEN序列的因子VIII 的融合蛋白的组合物，其中当向受试者中施用时，所述融合蛋白起替 换或增大内源性或接触活化的凝血路径中存在的FVIII的量的作用。 本发明解决对增加向有需要的受试者外源施用的因子VIII的终末半 衰期的长久切身需要。一种增加治疗性蛋白质的循环半衰期的方式是 确保所述蛋白质的肾清除率或代谢降低。增加终末半衰期的另一方式 是降低治疗性蛋白质的无论由受体、蛋白质的活性代谢或其它内源性 机制介导的主动清除。两者均可通过使蛋白质缀合于聚合物来实现， 所述聚合物一方面能够对蛋白质赋予增加的分子尺寸(或流体动力学 半径)且因此肾清除率降低，且另一方面干扰蛋白质结合清除受体或 有助于代谢或清除的其它蛋白质。因此，本发明的某些目标包括但不 限于提供循环或终末半衰期较长的改进FVIII分子，降低FVIII组合 物的必要施用次数或频率，相较于天然凝血因子VIII保留至少一部 分活性，和/或增强相较于目前可用因子VIII制剂，更高效、更有效、 更经济和/或以更大安全性治疗凝血缺乏症和流血不受控制的能力。
因此，本发明提供包含共价连接于一个或多个延伸重组多肽 (“XTEN”)的FVIII，从而产生CFXTEN融合蛋白组合物的重组因子 VIII融合蛋白组合物。如本文所用的术语“CFXTEN”意图涵盖包含至 少一个有效负载区域和至少一个其它区域的融合多肽，所述至少一个 有效负载区域包含能够具有与FVIII凝血因子相关的促凝血活性的 FVIII或FVIII的一部分，所述至少一个其它区域包含一个或多个可 分散在所述有效负载区域内和/或连接于末端的XTEN多肽。在一个 实施方案中，FVIII是天然FVIII。在另一实施方案中，FVIII是天然 序列的保留天然FVIII的至少一部分促凝血活性的序列变体、片段、 同源物或模拟物，如本文所公开。适于包括在组合物中的FVIII的非 限制性实例包括表1的序列或与表1的序列具有至少80％、或至少 90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至 少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列 同一性的序列。在一优选实施方案中，FVIII是B结构域缺失的 (BDD)FVIII序列变体，如来自表1的那些BDD序列或本领域中已知 的其它所述序列。在另一优选实施方案中，CFXTEN包含B结构域 缺失的(BDD)表达有天然19个氨基酸的信号序列的FVIII序列变体， 所述信号序列在蛋白质成熟期间被裂解。
本发明的组合物包括当向有需要的受试者施用时适用于介导或 预防或改善与因子VIII缺乏或内源性产生的FVIII中的缺陷相关的病 状、或与创伤、手术、因子VIII缺乏或缺陷相关的流血病症的融合 蛋白。特别感兴趣的是寻求相较于天然FVIII，其药代动力学参数增 加、溶解度增加、稳定性增加或一些其它医药性质增强，或增加其终 末半衰期将改进功效、安全性，或导致给药频率降低和/或改进患者 管理的CFXTEN融合蛋白组合物。本文公开的实施方案的CFXTEN 融合蛋白展现如本文详述的改进性质和/或实施方案的一者或多者或 任何组合。在一些实施方案中，当相较于未连接于XTEN且以类似 剂量向有需要的受试者(例如，患有甲型血友病的受试者，如人或小 鼠或猴)施用的FVIII时，CFXTEN融合组合物当向受试者施用时保 持水平高于阈值至少0.01-0.05、或0.05至0.1、或0.1至0.4IU/ml 持续更长时期。
主题组合物的FVIII(特别是表1中公开的那些)连同它们的相应 核酸和氨基酸序列一起可在公开数据库中以及在专利和一次文献中 获得，所述数公开据库如化学文摘服务数据库(例如CAS登记)、 GenBank、全球蛋白质资源(UniProt)、订阅提供的数据库，如 GenSeq(例如Derwent)。可适用于表达主题CFXTEN序列的多核苷酸 序列可为编码给定FVIII(例如，全长或成熟)的野生型多核苷酸序列， 或在一些情况下，序列可为野生型多核苷酸序列的变体(例如，编码 野生型生物活性蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸的DNA序列 已例如针对在特定物种中的表达加以优化；或编码野生型蛋白质的变 体(如定点突变体或等位基因变体)的多核苷酸)。完全属于熟练技术人 员的能力的是利用本领域中已知的方法和/或连同本文提供且在实施 例中更充分描述的指导和方法一起，使用FVIII的野生型或共有 cDNA序列或密码子优化变体来产生由本发明涵盖的CFXTEN构建 体。
在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含连接于包括但不限于 如表4中阐述的AE或AG家族的具有42、144、288、576或864个 氨基酸的序列的单一XTEN(例如，如上所述的XTEN)的单一FVIII 分子，所述FVIII分子展现与表1的序列的至少约80％序列同一性、 或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％、 或100％序列同一性。在另一实施方案中，CFXTEN包含连接于两个 XTEN的单一FVIII，其中所述XTEN可相同或它们可不同。在另一 实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含连接于一个、两个、三个、四个、 五个、六个或更多个XTEN序列的单一FVIII分子，其中所述FVIII 是当最优比对时，相较于选自表1的蛋白质序列，具有至少约80％ 序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或 至少约99％、或100％序列同一性的序列，且当最优比对时，相较于 选自表3、4和13-17的任一者的一个或多个序列，所述一个或多个 XTEN各自具有至少约80％序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性。在其中CFXTEN 具有两个或更多个XTEN的前述实施方案中，XTEN可相同或它们可 为不同序列。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含单一FVIII， 当最优比对时，相较于选自表1的具有类似长度的序列，所述FVIII 展现至少约80％序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性，其中各部分与三 个、四个、五个、六个或更多个XTEN序列交替分散且由所述XTEN 序列连接，所述XTEN序列可相同或可不同且其中当最优比对时， 相较于选自表3、4和13-17的任一者的序列或其片段，各自具有至 少约80％序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、或至少约99％、或100％序列同一性。在另一实施方案中，本 发明提供一种CFXTEN融合蛋白，其包含当最优比对时，与来自表 21的序列具有至少约80％序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、或至少约99％、或100％序列同一性的序列。
1.CFXTEN融合蛋白构型
本发明提供具有以特定N末端至C末端构型连接的CF和XTEN 组分的CFXTEN融合蛋白组合物。
在CFXTEN组合物的一个实施方案中，本发明提供一种式I的 融合蛋白：
(XTEN)x-CF-(XTEN)y I
其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括 与来自表1的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN 是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具 有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或 至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序 列。因此，CFXTEN融合组合物可具有XTEN-CF、XTEN-CF-XTEN 或CF-XTEN构型。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式II的 融合蛋白：
(XTEN)x-(S)x-(CF)-(XTEN)y II
其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括 与表1中阐述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可 任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；x是 0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN是如本文所述的延伸重 组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80％、或至少 约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约 98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种重组因 子VIII融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式III：
(XTEN)x-(S)x-(CF)-(S)y-(XTEN)y III
其中就各次出现独立而言，CF是如本文定义的因子VIII，包括 与表1中阐述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可 任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；x是 0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且XTEN是如本文所述的延伸重 组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约80％、或至少 约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约 98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式IV的 重组因子VIII融合蛋白：
(A1)-(XTEN)u-(A2)-(XTEN)v-(B)-(XTEN)w-(A3)-(XTEN)x-(C1)-(XTEN)y-(C2)-(XTEN)zIV
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；A3是FVIII的A3结构域；B是FVIII的B结构域， 其可为所述B结构域的片段或剪接变体；C1是FVIII的C1结构域； C2是FVIII的C2结构域；v是0或1；w是0或1；x是0或1；y 是0或1；y是0或1，前提是u+v+x+y+z≥1；且XTEN是如本 文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少 约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约 97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式V的 重组因子VIII融合蛋白：
(XTEN)t-(S)a-(A1)-(S)b-(XTEN)u-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)v-(S)c-(B)-(S)d-(XTEN)w-(S)d-(A3)-(S)e- (XTEN)x-(S)e-(C1)-(S)f-(XTEN)y-S)f-(C2)-(S)g-(XTEN)z V
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；A3是FVIII的A3结构域；B是FVIII的B结构域， 其可为所述B结构域的片段或剪接变体；C1是FVIII的C1结构域； C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残 基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序 列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f 是0或1；g是0或1；t是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0 或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，前提是t+u+v+w+x+ y+z≥1；且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与 表4中阐述的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％ 序列同一性的序列。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨 酸或选自表11和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VI的 重组因子VIII融合蛋白：
(XTEN)u-(S)a-(A1)-(S)b-(XTEN)v-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)w-(S)c-(A3)-(S)d-(XTEN)x-(S)d-(C1)- (S)e-(XTEN)y-(S)e-(C2)-(S)f-(XTEN)z VI
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；A3是FVIII的A3结构域；C1是FVIII的C1结构域； C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残 基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序 列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f 是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1；y是0 或1；z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z≥1；且XTEN是如本文 所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有至少约 80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。在式V的 另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VII 的重组因子VIII融合蛋白：
(SP)-(XTEN)x-(CS)x-(S)、-(FVIII_1-745)-(S)y-(XTEN)y-(S)y-(FVIII_1635-2332)-(S)z-(CS)z- (XTEN)z VII
其中就各次出现独立而言，SP是信号肽，优选具有序列 MQIELSTCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO：1611)，CS是表12中所列的 裂解序列，S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的可任选包括 可与限制位点相容的氨基酸的间隔子序列，“FVIII_1-745”是因子 FVIII的残基1-745且“FVIII_1635-2332”是FVIII的残基1635-2332， x是0或1，y是0或1，且z是0或1，其中x+y+z＞2；且XTEN 是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具 有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或 至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序 列。在式VII的一个实施方案中，间隔子序列是GPEGPS(SEQ ID NO： 1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11 和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式VIII 的重组因子VIII融合蛋白：
(A1)-(S)a-(XTEN)v-(S)a-(A2)-(B1)-(S)b-(XTEN)w-(S)b-(B2)-(A3)-(S)c-XTEN)x-(S)c-(C1)-(S)d- (XTEN)y-(S)d-(C2)-(S)e-(XTEN)z VIII
其中就各次出现独立而言，A1是FVIII的A1结构域；A2是FVIII 的A2结构域；B1是B结构域的可具有FVIII的残基741至743-750 或者FVIII的约残基741至约残基745的片段；B2是B结构域的可 具有FVIII的残基1635-1686至1689或者FVIII的约残基1640至约 残基1689的片段；A3是FVIII的A3结构域；C1是FVIII的C1结 构域；C2是FVIII的C2结构域；S是具有1个至约50个之间的氨 基酸残基的可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间 隔子序列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0 或1；f是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1； y是0或1；z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z≥1；且XTEN是 如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与表4中阐述的序列具有 至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至 少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的序列。 在式VIII的一个实施方案中，间隔子序列是GPEGPS(SEQ ID NO： 1612)。在式V的另一实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11 和12的序列。
在CFXTEN组合物的另一实施方案中，本发明提供一种式IX的 重组因子VIII融合蛋白：
(A1N)-(S)a-(XTEN)t-(S)b-(A1C)-(A2N)-(S)c-(XTEN)u-(S)d-(A2C)-(BN)-(S)e-(XTEN)v-(S)f-(BC)-(A3N)- (S)g-(XTEN)w-(S)h-(A3C)-(C1N)-(S)f-(XTEN)x-(S)j-(C1C)-(C2N)-(S)k-(XTEN)y-(S)l-(C2C)-(S)m-(XTEN)zIX
其中就各次出现独立而言，A1N是A1结构域的自至少残基编号 1(相对于天然成熟FVIII加以编号)至至多残基编号371的片段，A1c是A1结构域的自至少残基编号2至至多残基编号372的片段；A2N是A2结构域的自至少残基编号373至至多残基编号739的片段，A2c是A2结构域的自至少残基编号374至至多残基编号740的片段；BN是B结构域的自至少残基编号741至至多残基编号1647的片段，Bc是B结构域的自至少残基编号742至至多残基编号1648的片段；A3N是A3结构域的自至少残基编号1649至至多残基编号2019的片段， A3c是A3结构域的自至少残基编号1650至至多残基编号2019的片 段；C1N是C1结构域的自至少残基编号2020至至多残基编号2171 的片段，C1c是C1结构域的自至少残基编号2021至至多残基编号 2172的片段；C2N是C2结构域的自至少残基编号2173至至多残基 编号2331的片段，C2c是C2结构域的自至少残基编号2174至至多 残基编号2332的片段；S是具有1个至约50个之间的氨基酸残基的 可任选包括可与限制位点相容的裂解序列或氨基酸的间隔子序列；a 是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f是0 或1；g是0或1；h是0或1；i是0或1；j是0或1；k是0或1； l是0或1；m是0或1；t是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0 或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，前提是t+u+v+w+x+ y+z≥1；且XTEN是如本文所述的延伸重组多肽，包括但不限于与 表4中阐述的序列具有至少90％同一性的序列。在式IX的一个实施 方案中，间隔子序列是GPEGPS(SEQ ID NO:1612)。在式IX的另一 实施方案中，间隔子序列是甘氨酸或选自表11和12的序列。
式IV-VIII的实施方案涵盖以下CFXTEN构型：其中一个或多个 长度在约6个氨基酸至≥1000个氨基酸的范围内的XTEN(例如，选自 表3、4和13-17的任一者的序列或其片段、或展现与其的至少约 90-99％或更高序列同一性的序列)插入并连接在因子VIII的邻接结构 域之间或连接于FVIII的N末端或C末端。在式V-VIII的其它实施 方案中，本发明进一步提供以下构型：其中XTEN通过可任选包含 可与限制位点相容的氨基酸或可包括裂解序列(例如，以下更充分描 述的表11和12的序列)的间隔子序列连接于FVIII结构域以使XTEN 编码序列(在限制位点的情况下)可整合入CFXTEN构建体中，且在裂 解序列的情况下，XTEN可在适于所述裂解序列的蛋白酶作用下自融 合蛋白释放。
式VI-VIII的实施方案不同于式V的那些实施方案，因为式 VI-VIII的FVIII组分仅是因子VIII的保留B结构域的短残余序列的 B结构域缺失形式(“FVIII BDD”)，其序列的非限制性实例提供于表1 中，其中一个或多个长度在约6个氨基酸至≥1000个氨基酸的范围内 的XTEN或XTEN的片段(例如，选自表3、4和13-17的任一者的序 列)插入并连接在因子VIII的邻接结构域之间和/或在B结构域残基的 剩余物(如表8的那些)之间。式IX的实施方案通常不同于其它式的 那些实施方案，因为一个或多个XTEN各自插入在FVIII的结构域内 而非在结构域之间，和/或具有连接于FVIII的C末端(或通过间隔子 序列连接于FVIII的C末端)的XTEN。
在CFXTEN的一些实施方案中，融合蛋白包含FVIII的B结构 域缺失形式，其中关于全长人因子VIII序列，所述B结构域缺失自 在约氨基酸残基编号745处的第一位置开始且在于氨基酸残基编号 1635至约1690处的第二位置处结束，且XTEN连接B结构域缺失的 第一位置和第二位置。在一个前述实施方案中，B结构域缺失的第一 位置和第二位置选自表8的位置。在另一前述实施方案中，至少一个 XTEN连接第一和第二位置，其中所述至少一个XTEN连接因子VIII 氨基酸残基745和氨基酸残基1640、或氨基酸残基741和氨基酸残 基1640、或氨基酸残基741和氨基酸残基1690、或氨基酸残基745 和氨基酸残基1667、或氨基酸残基745和氨基酸残基1657、或氨基 酸残基745和氨基酸残基1657、或氨基酸残基747和氨基酸残基 1642、或氨基酸残基751和氨基酸残基1667。在CFXTEN的一个实 施方案中，其中因子VIII包含连接在这个段落的实施方案中所述的B 结构域缺失的第一位置和第二位置的XTEN，所述XTEN是当最优比 对时，相较于选自表4、表13、表14、表15、表16和表17的任一 者的具有类似长度的序列，具有至少80％、或至少约90％、或至少 约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约 99％或100％序列同一性的序列，其中所述CFXTEN保留天然FVIII 的至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或 至少约70％、或至少约80％、或至少约90％促凝血活性。
本发明涵盖XTEN插入在FVIII的结构域之间或内或在或邻近于 表5、表6、表7、表8和表9的插入点或图8-9中说明的那些插入点 处的所有可能排列，其中另一XTEN任选连接于FVIII的N末端或C 末端，任选通过选自表12的另一裂解序列连接，从而产生CFXTEN 组合物；其非限制性实例描绘于图5和12中。在一个实施方案中， CFXTEN包含表1的FVIII BDD序列，其中一个或多个相较于来自 表3、4和13-17的任一者的序列或其片段各自具有至少约80％、或 至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至 少约98％、或至少约99％或99％以上序列同一性的XTEN插入在 FVIII BDD序列的任何两个残余B结构域氨基酸之间，从而产生单链 FVIII融合蛋白，其中CFXTEN保留天然FVIII的至少约30％、或至 少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少 约80％、或至少约90％的促凝血活性。在前述实施方案中，CFXTEN 可具有表4和13-17的任一者的连接于融合蛋白的N末端或C末端 的另一XTEN序列。在另一实施方案中，CFXTEN包含插入在表8 中阐述的位点处的至少第一XTEN，其中所述CFXTEN保留天然 FVIII的至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、 或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的促凝血活性。在式 VII融合蛋白的一个实施方案中，CFXTEN包含表1的FVIII BDD序 列，其中相较于来自表3、4和13-17的任一者的序列或其片段，各 自具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、 或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％或100％序列同一性的 两个或更多个XTEN连接于FVIII-BDD序列，其中至少一个XTEN 自FVIII BDD序列的残余B结构域氨基酸的FVIII裂解位点氨基酸 R740的约3至约20个氨基酸残基至C末端侧以及自FVIII裂解位点 氨基酸R1689的约3至约20个氨基酸残基至N末端侧插入，从而产 生单链FVIII融合蛋白，且一个或两个XTEN是由裂解序列连接于 FVIII-BDD序列的N末端和/或C末端，其中在通过裂解裂解序列释 放XTEN之后，CFXTEN展现天然FVIII的至少约40％、或至少约 50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％ 的促凝血活性。
在一个实施方案中，A3结构域包含a3酸性区域或其部分。在另 一实施方案中，至少一个XTEN插入在a3酸性区域或其部分内、a3 酸性区域或其部分的N末端、a3酸性区域或其部分的C末端或其组 合。在某些实施方案中，至少一个XTEN插入在C2结构域内、C2 结构域的N末端、C2结构域的C末端或其组合。在其它实施方案中， 因子VIII包含全部或一部分B结构域。在其它实施方案中，至少一 个XTEN插入在全部或一部分B结构域内、B结构域的N末端、B 结构域的C末端或其组合。
2.具有内部XTEN的CFXTEN融合蛋白构型
在另一方面，本发明提供用一个或多个位于FVIII序列内部的 XTEN序列构造的CFXTEN。在一个实施方案中，本发明提供用一个 或多个位于FVIII序列内部的XTEN序列构造以赋予如但不限于以下 的性质的CFXTEN：相较于无并入的XTEN的FVIII，稳定性增加、 对蛋白酶的抗性增加、对清除机制(包括但不限于与清除受体或FVIII 抑制剂的相互作用)的抗性增加、以及亲水性增加。
本发明涵盖FVIII的不同构型或序列变体可用作一个或多个 XTEN插入其中的平台。这些构型包括但不限于天然FVIII、FVIII BDD和单链FVIII(scFVIII)以及那些构型的变体。在scFVIII的情况 下，本发明提供可通过置换FVIII的加工位点的一个或多个氨基酸来 构建的CFXTEN。在一个实施方案中，用于CFXTEN中的scFVIII 是通过用甘氨酸或丙氨酸置换FVIII序列RHQREITR(SEQ ID NO: 1698)中的R1648以防止蛋白水解加工成异二聚体形式来产生。明确 涵盖的是本文公开的具有1648FVIII残基的任何CFXTEN实施方案 可具有在位置1648处取代精氨酸的甘氨酸或丙氨酸。在一些实施方 案中，本发明提供包含scFVIII的CFXTEN，其中围绕R1648加工位 点的序列部分用XTEN置换，如图10A和10B中所说明。在一个实 施方案中，B结构域的至少约60％、或约70％、或约80％、或约90％、 或约95％、或约97％或更多是用本文公开的XTEN序列(包括R740、 R1648或R1689裂解位点的一者或多者)置换。在另一实施方案中， CFXTEN的在于R740和R1689处的FXIa裂解位点之间的FVIII B 结构域序列(其中也保留在XTEN的切割位点与起始位点之间的至少 1-5个邻近B结构域氨基酸以允许蛋白酶进入切割位点)被XTEN置 换。在另一实施方案中，CFXTEN的在于N745和P1640处的FXIa 裂解位点之间的FVIII B结构域序列被XTEN置换。在其它实施方案 中，本发明提供CFXTEN FVIII BDD序列变体，其中缺失B结构域 的各部分但仅一个FXI R740或R1689活化位点(以及B结构域的1-5 个邻近氨基酸)留在构建体内，其中在由FXIa裂解之后，XTEN保持 连接在轻链或重链的一端处，如图5B和5D中所说明。在一个前述 实施方案中，CFXTEN包含FVIII BDD序列，其中缺失N745至P1640 之间或S743至Q1638之间或P747至V1642之间或N745与Q1656 之间或N745与S1657之间或N745与T1667之间或N745与Q1686 之间或R747与V1642之间或T751与T1667之间的氨基酸且XTEN 序列连接在这些氨基酸之间，从而连接重链和轻链，且可进一步包含 插入在外部表面环中、FVIII结构域之间、或FVIII BDD序列的N末 端或C末端处(如一个或多个来自表5、表6、表7、表8和表9的插 入位点或图8-9中说明的那些插入位点)的另一XTEN。在另一前述实 施方案中，CFXTEN包含FVIII BDD序列，其中缺失K713至Q1686 之间或残基741与1648之间的氨基酸且XTEN连接在两个氨基酸之 间，且另一XTEN可插入在表面环中、FVIII结构域之间、或FVIII BDD 序列的N末端或C末端处，包括但不限于一个或多个来自表5、表6、 表7、表8和表9的插入位点或图8-9中说明的那些插入位点。在一 些实施方案中，所述CFXTEN序列可具有一个或多个展现与来自表4 和13-17的任一者的XTEN序列的至少约80％、或至少约90％、或 至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至 少约99％或100％序列同一性的XTEN。
本发明涵盖呈各种构型的具有内部XTEN的其它CFXTEN；示 例性构型的示意图说明于图5和10中。适于XTEN插入位点的区域 包括FVIII的已知结构域边界、外显子边界、通过X射线结晶学分析 和由FVIII的分子动态模拟获得的结构模型鉴定的已知表面(外部)环 和溶剂可及表面积位点、具有低有序度(通过图7图例中所述的程序 评估)的区域、在不同物种间的同源性较低/缺乏保守性的区域、以及 亲水性区域。在另一实施方案中，基于FVIII推定清除受体结合位点 选择XTEN插入位点。在另一实施方案中，CFXTEN包含插入在以 下位置处的XTEN：不在紧密邻近于牵涉于甲型血友病中的列于甲型 血友病突变、搜寻、测试和资源中心(Haemophilia A Mutation,Search, Test and Resource Site，HAMSTeRS)数据库中的突变范围内 (Kemball-Cook G等The factor VIII Structure and Mutation Resource Site:HAMSTeRS version 4.Nucleic Acids Res.(1998)26(1):216-219)。 在另一实施方案中，XTEN插入的潜在位点包括在FVIII表位内能够 由存在于敏化血友病患者中的抗FVIII抗体结合且不另外充当蛋白质 相互作用位点的残基。被考虑排除作为XTEN插入位点的区域和/或 位点包括因子VIII的在各种相互作用中重要的残基/区域，包括其它 凝结蛋白、围绕由蛋白酶凝血酶、因子Xa、活化的蛋白质C所作用 的各精氨酸活化/失活裂解位点的残基、围绕信号肽加工位点(残基1) 的残基(如果构建体含有信号肽)、已知与如FIXa、FX/FXa、凝血酶、 活化的蛋白质C、蛋白质C的蛋白质S辅因子、血管性血友病因子的 其它蛋白质相互作用的区域、已知在凝血中与磷脂辅因子相互作用的 位点、结构域相互作用中涉及的残基、配位Ca++或Cu++离子的残基、 S-S分子内键结中涉及的半胱氨酸残基、甲型血友病受试者中产生的 FVIII中影响促凝血活性的记载氨基酸插入和点突变位点、以及在研 究实验室中于FVIII中产生的影响促凝血活性的突变位点。考虑用于 插入(以延长半衰期)或用于排除(为移除耗费的FVIIIa或FXa所需)的 位点包括已知与硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)或低密度脂蛋白受体相关 蛋白质(LPR)相互作用的区域。
通过分析如实施例34中所述的前述标准，不同插入位点或跨越 FVIII BDD序列的插入位点的范围已被鉴定和/或确认为用于插入 XTEN的候选位点，其非限制性实例列于表5、表6、表7、表8和 表9中且示意性显示于图8和9中。在一个实施方案中，CFXTEN在 FVIII的个别结构域之间，即在A1与A2之间、或在A2与B之间、 或在B与A3之间、或在A3与C1之间、或在C1与C2结构域之间 包含XTEN插入物。在另一实施方案中，CFXTEN包含插入在B结 构域内或BDD序列的剩余残基之间的XTEN。在另一实施方案中， CFXTEN包含插入在编码FVIII基因的已知外显子边界处的XTEN， 因为外显子表示在其它蛋白质序列的情形下具有高起作用概率的进 化保守序列模块。在另一实施方案中，CFXTEN包含插入在根据FVIII 的x射线结构鉴定的表面环内的XTEN。在另一实施方案中，CFXTEN 包含插入在通过X射线结构分析鉴定为具有低或不具有检测电子密 度的低序区域内的XTEN。在另一实施方案中，CFXTEN包含插入在 通过结构预测算法(如但不限于FoldIndex、RONN以及Kyte和 Doolitlle算法)预测的低序区域内的XTEN。在另一实施方案中， CFXTEN包含插入在亲水性氨基酸的频率较高的序列区域内的 XTEN。在另一实施方案中，CFXTEN包含插入在能够由敏化血友病 患者中天然存在的抗FVIII抗体结合的表位内的XTEN。在另一实施 方案中，CFXTEN包含插入在于来自不同物种的FVIII序列间具有低 序列保守性和/或序列区段长度差异的序列区域内的XTEN。在另一 实施方案中，CFXTEN包含连接于N末端和/或C末端的XTEN。在 另一实施方案中，本发明提供具有选自两个或更多个来自以上所列的 实施方案的准则的插入XTEN的CFXTEN构型。在另一实施方案中， 本发明提供具有至少一个、或者至少两个、或者至少三个、或者至少 四个、或者至少五个或更多个插入因子VIII序列中的XTEN的 CFXTEN构型，其中插入点处于或邻近于选自表5、表6、表7、表8 和表9的插入残基氨基酸或图8-9中说明的那些插入残基氨基酸的至 少一个、两个、三个、四个或五个或六个或更多个氨基酸的N末端 或C末端侧；或者在来自表5、表6、表7、表8和表9的插入残基 氨基酸的一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个氨基酸内； 或在图9中对于示例性FVIII BDD序列示意性描绘的插入残基氨基酸 的各种间距内。
如上所述，一个或多个内部定位的XTEN或XTEN的片段的序 列长度可为6至1000个或更多个氨基酸残基。在其中CFXTEN具有 一个或两个或三个或四个或五个或更多个在FVIII内部的XTEN序列 的一些实施方案中，所述XTEN序列可相同或可不同。在一个实施 方案中，当最优比对时，相较于选自表3、4和13-17的任一者的XTEN 的类似长度或片段或基序，各内部定位的XTEN具有至少约80％序 列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％ 或100％序列同一性。在另一实施方案中，本发明提供一种用一个或 多个插入在FVIII BDD序列内部的XTEN构造的CFXTEN，所述 FVIII BDD序列相较于表1的序列具有至少约80％序列同一性、或者 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一 性，其中插入位于表5、表6、表7、表8和表9、图8中指示的插入 点或插入点范围处或在如图9中所说明的插入范围内。本领域技术人 员应了解，在表5、表6、表7、表8和表9的插入点处插入在FVIII 序列内的XTEN是通过它的N末端和C末端连接于侧接FVIII氨基 酸(或通过如上所述的连接间隔子或裂解序列)，而连接于FVIII的N 末端或C末端的XTEN将仅连接于单一FVIII氨基酸(或连接于如上 所述的连接间隔子或裂解序列氨基酸)。仅举例来说，具有三个内部 XTEN的CFXTEN的变化形式可具有：并入在FVIII BDD残基741 与1640、残基18与19、以及残基1656与1657之间的XTEN(如本 文所述)；或并入在FVIII BDD残基741与1640、残基1900与1901 之间以及在于残基2332处的C末端处的XTEN；或并入在FVIII BDD 残基26与27、残基1656与1657、以及残基1900与1901之间的XTEN； 或并入在FVIII BDD残基741与1640、残基1900与1901之间以及 在于残基2332处的C末端处的XTEN。
在评估具有插入来自表5的位置中的XTEN的CFXTEN融合蛋 白时，发现在某些区域中插入FVIII序列产生具有良好表达和促凝血 活性保持的CFXTEN。因此，在优选实施方案中，本发明提供用一个 或两个或三个或四个或五个或六个或更多个插入FVIII BDD序列内 部或连接于FVIII BDD序列的XTEN构造的CFXTEN融合蛋白，所 述XTEN相较于选自表4和13-17的任一者的XTEN各自具有至少 约80％序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％序列同一性，所述FVIII BDD序列相较于表1的序列具 有至少约80％序列同一性、或者81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性，其中插入位于表7中阐述的一个或 两个或三个或四个或五个或六个或更多范围内的插入点处。在前述实 施方案中，相较于未连接于XTEN的相应FVIII，具有XTEN插入物 的CFXTEN融合蛋白保留至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％或90％或更高的促凝血活性。
在评估具有插入一个或多个来自表5的位置中的XTEN的 CFXTEN融合蛋白时，惊人地发现高百分比的具有XTEN插入物的 融合蛋白保留促凝血活性，如实施例25中所述。因此，本发明提供 用一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个XTEN构造的CFXTEN 融合蛋白，其中当通过本文所述的凝血测定加以测定时，相较于未连 接于XTEN的相应FVIII，所得融合蛋白展现至少约10％、或20％、 或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％或更 高的促凝血活性。在一优选实施方案中，本发明提供包含一个或两个 或三个或四个或五个或六个或更多个连接于FVIII BDD序列的 XTEN的CFXTEN融合蛋白，所述XTEN相较于选自表4和13-17 的任一者的XTEN，各自具有至少约80％序列同一性、或者81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，所述FVIII BDD序列相较于表1的序列具有至少约80％序列同一性、或者81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，其 中插入位于一个或多个选自表5、表6、表7、表8和表9的插入点 处，且其中当通过本文所述的测定(例如显色测定)加以体外测定时， 相较于未连接于XTEN的相应FVIII，所得融合蛋白展现至少约30％、 或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％或更 高的促凝血活性。因为主题CFXTEN融合蛋白相较于天然FVIII通 常展现终末半衰期增加，所以本领域技术人员应了解，当以治疗组合 物形式向有需要的受试者施用时，相对于等摩尔量的天然FVIII具有 较低促凝血活性的CFXTEN将然而是可接受的。在另一实施方案中， CFXTEN融合蛋白包含一个或两个或三个或四个或五个或更多个连 接于FVIII BDD序列的XTEN，所述XTEN相较于选自表4和13-17 的任一者的XTEN各自具有至少约80％序列同一性、或者81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，所述FVIII BDD序列相较于表1的序列具有至少约80％序列同一性、或者81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，其 中插入位于一个或多个选自表5、表6、表7、表8和表9的插入点 或插入点范围处，其中当在细胞培养基中表达且在显色测定中测定 时，所得融合蛋白展现至少约0.5IU/ml、或至少约0.75IU/ml、或至 少约1.0IU/ml、或至少约1.5IU/ml、或至少约2.0IU/ml、或至少约 2.5IU/ml、或至少约3IU/ml、或至少约4IU/ml、或至少约5IU/ml、 或至少约7IU/ml、或至少约10IU/ml、或至少约20IU/ml、或至少 约30IU/ml FVIII活性，其中培养和表达是根据本文所述的方法；例 如，实施例25的方法。
据信发现其中FVIII保留至少一部分它的促凝血活性的插入位点 也将允许插入当在那些相同位点的一者或多者中融合于FVIII蛋白 时，具有与半衰期的延长相关的非结构化或结构化特征的其它肽和多 肽。非限制性实例包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白的Fc片段、 人绒毛膜促性腺激素的C末端肽(CTP)的β亚单位、HAP序列、转铁 蛋白、美国专利申请号20100292130的PAS多肽、聚甘氨酸接头、 聚丝氨酸接头、具有6-40个选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、 苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的两种氨基酸类型的氨基酸的具有 尤其自小于50％至大于50％的不同程度二级结构的肽和短多肽，所 述实例将适于在鉴定的活性插入位点中插入FVIII。
在本文所述的融合蛋白实施方案中，CFXTEN融合蛋白可进一步 包含一个或多个来自表12的裂解序列或本领域中已知的其它序列， 所述裂解序列位于FVIII和XTEN序列的交叉点的6个氨基酸残基之 间或内，所述裂解序列可包括给定内部XTEN序列中的两个裂解序 列。在一个实施方案中，包含裂解序列的CFXTEN具有两个相同裂 解序列，各自位于一个或多个内部XTEN的相应末端处或接近所述 相应末端以使当由结合且裂解那个序列的蛋白酶裂解时，XTEN自融 合蛋白释放。以下更充分描述可被裂解的序列且示例性序列提供于表 12中。
表5:连接于FVIII BDD序列的XTEN的插入位置
指示XTEN的基于成熟全长人FVIII的氨基酸编号的插入点，其 中插入可在所指示氨基酸的N末端或C末端侧上
具有746-1639缺失的FVIII BDD中的下游序列
表6.连接于FVIII多肽的XTEN的示例性插入位置
离插入残基的距离是指相距可进行插入所处的指定插入残基(残 基“0”)的N末端(负数)或C末端(正数)的相对氨基酸数目。符号“-x” 指插入位点相距指定插入残基的N末端侧x个氨基酸。类似地，符 号“+x”是指插入位点相距指定插入残基的C末端侧x个氨基酸。
举例来说，“-1,+2”指示在表示为-1、0、+1或+2的氨基酸残基 的N末端或C末端进行插入。
表7.连接于FVIII多肽的XTEN的其它示例性插入位置
指示相对于成熟人FVIII的氨基酸编号加以编号的插入位点的范 围
表8.FVIII多肽的B结构域缺失的变体内的示例性XTEN插入 位置
XTEN插入点范围 第一插入残基 第二插入残基
740-1640 R P
740-1690 R S
741-1648 S R
743-1638 S Q
745-1638 N Q
XTEN插入点范围 第一插入残基 第二插入残基
745-1640 N P
745-1656 N Q
745-1657 N S
745-1667 N T
745-1686 N Q
747-1642 R V
751-1667 T T
指示连接在B结构域缺失的变体和邻近A3结构域内的氨基酸， 其中氨基酸是相对于成熟人FVIII的氨基酸编号加以编号
指示由插入BDD-FVIII中的XTEN连接的氨基酸
表9.连接于FVIII多肽的XTEN的产生促凝血活性的示例性插 入位置
具有746-1639缺失的FVIII BDD中的下游序列
在另一方面，本发明提供组分的文库和用以产生源于编码FVIII 区段、XTEN和连接于XTEN的适用于制备编码主题CFXTEN的基 因的FVIII区段的核苷酸的文库的方法。在第一步骤中，产生、表达 编码插入在表5中鉴定或图8-9中说明的插入位点的1-6个氨基酸处 或内的各种单一位点中的FVIII和XTEN的基因的文库，且回收 CFXTEN并评估活性和药代动力学，如图15中所说明。显示性质增 强的那些CFXTEN接着用于产生编码FVIII区段和插入位点加XTEN 的基因，其中来自各增强的插入的组分在文库中加以表示，如图11 中所说明。在一个实施方案中，使用标准重组技术以如图11中所说 明的组合方式装配文库组分，从而产生具有多个内部以及N和C末 端XTEN的CFXTEN的各排列，所述CFXTEN可包括表5、表6、 表7、表8和表9或如图8-9中所说明的插入位点或邻近于所述那些 插入位点的插入位点。将接着评估所得构建体的活性和增强的药代动 力学，且进一步评估相较于未连接于XTEN的FVIII，产生具有增强 的性质，例如降低的主动清除、对蛋白酶的抗性、降低的免疫原性和 增强的药代动力学的CFXTEN的那些候选物。
3.XTEN容许环
如在本文中其它地方详细所述以及如图33-36中所说明，发明者 已认识到各FVIII“A”结构域包含XTEN序列可插入其中而不消除重 组蛋白的促凝血活性、或重组蛋白在体内或在体外在宿主细胞中表达 的能力的至少两个“XTEN容许环”。发明者已鉴定XTEN容许环为具 有连同其它属性一起，高表面或溶剂暴露以及高构象可挠性的区域。 A1结构域包含XTEN容许环-1(A1-1)区域和XTEN容许环-2(A1-2) 区域，A2结构域包含XTEN容许环-1(A2-1)区域和XTEN容许环 -2(A2-2)区域，A3结构域包含XTEN容许环-1(A3-1)区域和XTEN容 许环-2(A3-2)区域。
在某些方面，如上所述的重组FVIII蛋白包含至少一个插入 XTEN容许环A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2的至少一者 中的XTEN序列，其中所述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体 内或在体外在宿主细胞中表达。在某些方面，如上所述的重组FVIII 蛋白包含至少两个插入FVIII中，例如插入两个不同XTEN容许环 A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中的XTEN序列，其中所 述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体内或在体外在宿主细胞中 表达。或者，如上所述的重组FVIII蛋白可包含两个或更多个插入单 一XTEN容许环中的XTEN序列，其中有或无XTEN序列插入其它 XTEN容许环中，其中所述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体 内或在体外在宿主细胞中表达。在某些方面，如上所述的重组FVIII 蛋白可包含至少一个插入至少一个如上所述的XTEN容许环中的 XTEN序列，且可进一步包含一个或多个插入a3中的XTEN序列， 其中所述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体内或在体外在宿主 细胞中表达。在某些方面，本发明的重组FVIII蛋白可包含三个、四 个、五个、六个或更多个插入一个或多个XTEN容许环中或插入a3 中的XTEN序列，其中所述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体 内或在体外在宿主细胞中表达。
在某些方面，如上所述的重组FVIII蛋白包含至少一个插入a3 中的XTEN序列，其中所述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体 内或在体外在宿主细胞中表达。在某些方面，本发明的重组FVIII蛋 白包含至少一个插入a3中的XTEN序列，且进一步包含一个或多个 插入一个或多个如上所述的XTEN容许环中的XTEN序列，其中所 述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体内或在体外在宿主细胞中 表达。
发明者已认识到本发明的重组FVIII蛋白在FVIII A结构域区域 的各者中包含至少两个XTEN容许环，此允许插入XTEN序列，同 时具有促凝血活性且仍然能够在体内或在体外由宿主细胞表达。已测 定FVIII的具有不同分辨率程度的各种晶体结构。通过X射线结晶学 和分子动态模拟测定的FVIII和FVIIIa的这些结构用于产生FVIII的 可及表面积和构象可挠性的模型。举例来说，人FVIII的晶体结构已 由Shen等Blood 111:1240-1247(2008)和Ngo等Structure 16: 597-606(2008)所测定。这些结构的数据可自蛋白质数据库(Protein Data Bank)(pdb.org)分别根据登录号2R7E和3CDZ获得。
人FVIII的重链和轻链的根据Shen等晶体结构预测的二级结构 再现于图37A和37B中。根据Shen等晶体结构预测的各种β链在图 8A和8B中进行连续编号。在某些实施方案中，XTEN容许环A1-1、 A1-2、A2-1、A2-2、A3-1和A3-2含在FVIII的A结构域中的表面暴 露的可挠性环结构内。根据成熟FVIII的以PDB数据库的登录号 2R7E(PDB:2R7E)储存且如图8A和8B中所示的二级结构，A1-1位于 β链1与β链2之间，A1-2位于β链11与β链12之间，A2-1位于β 链22与β链23之间，A2-2位于β链32与β链33之间，A3-1位于 β链38与β链39之间且A3-2位于β链45与β链46之间。图8A和 8B中所示的PDB登录号2R7E的二级结构对应于根据DSSP程序的 标准化二级结构指定(Kabsch和Sander,Biopolymers,22:2577-2637 (1983))。成熟FVIII的以PDB登录号2R7E储存的DSSP二级结构可 在于万维网站点swift.cmbi.ru.nl/gv/dssp/处可用的DSSP数据库(2012 年2月9日最后一次访问)处获取(Joosten等,39(增刊1):D411-D419 (2010))。
在某些方面，包含A1-1的表面暴露的可挠性环结构对应于天然 成熟人FVIII中自图30的约氨基酸15至约氨基酸45的区域。在某 些方面，A1-1对应于天然成熟人FVIII中自图30的约氨基酸18至约 氨基酸41的区域。在某些方面，包含A1-2的表面暴露的可挠性环结 构对应于天然成熟人FVIII中自图30的约氨基酸201至约氨基酸232 的区域。在某些方面，A1-2对应于天然成熟人FVIII中自图30的约 氨基酸218至约氨基酸229的区域。在某些方面，包含A2-1的表面 暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人FVIII中自图30的约氨基酸 395至约氨基酸421的区域。在某些方面，A2-1对应于天然成熟人 FVIII中自图30的约氨基酸397至约氨基酸418的区域。在某些方面， 包含A2-2的表面暴露的可挠性环结构对应于天然成熟人FVIII中自 图30的约氨基酸577至约氨基酸635的区域。在某些方面，A2-2对 应于天然成熟人FVIII中自图30的约氨基酸595至约氨基酸607的 区域。在某些方面，包含A3-1的表面暴露的可挠性环结构对应于天 然成熟人FVIII中自图30的约氨基酸1705至约氨基酸1732的区域。 在某些方面，A3-1对应于天然成熟人FVIII中自图30的约氨基酸1711 至约氨基酸1725的区域。在某些方面，包含A3-2的表面暴露的可挠 性环结构对应于天然成熟人FVIII中自图3的约氨基酸1884至约氨 基酸1917的区域。在某些方面，A3-2对应于天然成熟人FVIII中自 图30的约氨基酸1899至约氨基酸1911的区域。
在某些方面，本发明的重组FVIII蛋白包含一个或多个插入FVIII 的一个或多个XTEN容许环中，或插入a3区域中的XTEN序列，其 中所述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可在体内或在体外在宿主细 胞中表达。待插入的XTEN序列包括使FVIII的体内半衰期或体内或 体外稳定性增加的那些XTEN序列。
在某些方面，本发明的重组FVIII蛋白包含紧靠一个或多个对应 于成熟天然人FVIII中包括但不限于以下的一个或多个氨基酸的氨基 酸的下游插入的XTEN序列：图30的氨基酸18、图30的氨基酸26、 图30的氨基酸40、图30的氨基酸220、图30的氨基酸224、图30 的氨基酸399、图30的氨基酸403、图30的氨基酸599、图30的氨 基酸603、图30的氨基酸1711、图30的氨基酸1720、图30的氨基 酸1725、图30的氨基酸1900、图30的氨基酸1905、图30的氨基 酸1910或其任何组合；包括本文所述的FVIII的BDD变体中的相应 插入。
在某些方面，本发明的重组FVIII蛋白包含单独或与一个或多个 插入A结构域的XTEN容许环(例如如上所述的A1-1、A1-2、A2-1、 A2-2、A3-1或A3-2)中的XTEN序列组合的至少一个插入FVIII的a3 区域中的XTEN序列，其中所述重组FVIII蛋白具有促凝血活性且可 在体内或在体外在宿主细胞中表达。在某些方面，至少一个XTEN 序列紧靠对应于图30的氨基酸1656的氨基酸的下游插入a3区域中。 在某些方面，本发明的重组FVIII蛋白包含插入如所述的a3区域中 的XTEN序列，且进一步包括一个或多个紧靠一个或多个对应于成 熟天然人FVIII中包括但不限于以下的一个或多个氨基酸的氨基酸的 下游插入的XTEN序列：图30的氨基酸18、图30的氨基酸26、图 30的氨基酸40、图30的氨基酸220、图30的氨基酸224、图30的 氨基酸399、图30的氨基酸403、图30的氨基酸599、图30的氨基 酸603、图30的氨基酸1711、图30的氨基酸1720、图30的氨基酸 1725、图30的氨基酸1900、图30的氨基酸1905、图30的氨基酸 1910或其任何组合。
本领域技术人员应了解，异源蛋白质可插入其中的天然FVIII蛋 白的容许环的前述方面也可适用于本文所述的B结构域缺失的FVIII 变体；例如表1中阐述的序列。在实施本发明时，应了解表1的 BDD-FVIII序列可取代上述各种实施方案的重组FVIII蛋白，且据信 所得构建体将类似地保留促凝血活性。
4.干扰FVIII结合剂
本发明的一个目标在于提供用于罹患如甲型血友病的凝血病变 的人患者中的促凝血CFXTEN融合蛋白组合物，所述患者具有结合 FVIII的影响CFXTEN融合蛋白的活性或半衰期的天然或获得性抗 体、抑制剂或其它蛋白质或分子，其中CFXTEN相较于未连接于 XTEN的相应FVIII保留更大量的促凝血活性。如本文所用，“FVIII 结合剂”是指能够结合天然FVIII或本发明的包含天然、衍生或重组 产生的因子VIII或其片段的重组因子VIII融合蛋白的任何分子。明 确涵盖的是FVIII结合剂包括抗FVIII抗体和FVIII抑制剂以及能够 特异性结合FVIII的其它蛋白质。在一方面，本发明提供展现与干扰 FVIII的促凝血活性的抗FVIII抗体或FVIII抑制剂的结合降低的促凝 血CFXTEN融合蛋白。如本文所用，“抗FVIII抗体”或“抗因子VIII 抗体”是指能够结合FVIII或本发明的CFXTEN的FVIII组分的抗体， 所述抗体包括但不限于表10的抗体或来自具有FVIII抑制剂的甲型 血友病患者的多克隆抗体。术语抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、 抗体片段和抗体片段克隆。如本文所用，“FVIII抑制剂”或“抗FVIII 抑制剂抗体”是指能够结合FVIII或本发明的CFXTEN的FVIII组分 且通过任何手段降低FVIII或CFXTEN的FVIII组分的促凝血活性的 抗体。在另一方面，本发明提供在FVIII抑制剂存在下保留促凝血活 性的CFXTEN融合蛋白。在另一方面，本发明提供包含相较于未连 接于XTEN的FVIII，在FVIII结合剂存在下展现终末半衰期增加的 FVIII的CFXTEN融合蛋白。
大多数针对人因子VIII的抑制性抗体通过结合位于因子VIII的 A2结构域或C2结构域中的表位，从而破坏与这些结构域相关的特定 功能来起作用(美国专利号6,770,744；Fulcher等Localization of human factor FVIII inhibitor epitopes to two polypeptide fragments.Proc.Natl. Acad.Sci.USA(1985)82:7728-7732；Scandella等Epitope mapping of human factor VIII inhibitor antibodies by deletion analysis of fVIII fragments expressed in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1988)85:6152-6156)。尽管报道68％抑制性抗体是针对A2和/或C2 结构域，但3％针对A1结构域起作用且46％针对a3酸性区域起作用 (Lavigne-Lissalde,G.等Characteristics,mechanisms of action,and epitope mapping of anti-factor VIII antibodies.Clin Rev Allergy Immunol(2009)37:67-79)。举例来说，某些重链特异性抑制剂与A2 结构域的18.3kD氨基末端区段反应(Scandella D等1988)；Lollar P 等Inhibition of human factor VIIIa by anti-A2subunit antibodies.J Clin Invest 1994；93:2497)。FVIII在C2结构域中在氨基酸2302与2332之 间含有磷脂结合位点，且在C2结构域中也存在连同A3结构域中的 氨基酸1649-1689一起起作用的血管性血友病因子结合位点。C2结 构域也具有当由抑制剂结合时，阻断由凝血酶或因子Xa活化FVIII 的表位。特异性结合轻链的抑制剂识别A3结构域中的表位或C2结 构域中的主要抗原性区域且可通过阻止FVIII结合磷脂或降低FVIII 自血管性血友病因子的解离速率来导致促凝血活性降低(Gilles JG等 Anti-factor VIII antibodies of hemophiliac patients are frequently directed towards nonfunctional determinants and do not exhibit isotypic restriction.Blood(1993)82:2452；Shima M等A factor VIII neutralizing monoclonal antibody and a human inhibitor alloantibody recognizing epitopes in the C2 domain inhibit factor VIII binding to von Willebrand factor and to phosphatidylserine.Thromb Haemost(1993)69:240)。单克 隆FVIII抑制剂的非限制性实例列于表9中。在具有高效价抑制剂的 患者中，存在发展在特定关节中复发性流血的风险增加，此可最终导 致生活质量降低、残疾或因过度失血死亡(美国专利申请号 20120065077；Zhang等,Clinic.Rev.Allerg.Immunol.,37:114-124 (2009)；Gouw和van den Berg,Semin.Thromb.Hemost.,35:723-734 (2009))。
在不意图受任何特定理论束缚下，据信并入CFXTEN融合蛋白 中的XTEN的非结构化特征允许XTEN采用导致针对将另外结合 FVIII表位的抑制剂的空间位阻的构象。如图6中所说明，当并入的 XTEN采用各种无规卷曲构象时，它在空间上覆盖融合蛋白的FVIII 组分的各区域且在空间上干扰抑制剂结合FVIII表位的能力。
在一个实施方案中，本发明提供相较于未连接于XTEN的相应 因子VIII和/或天然FVIII，展现促凝血活性以及在结合因子VIII的 C2结构域的抗体存在下结合降低的CFXTEN。在另一实施方案中， 本发明提供相较于未连接于XTEN的相应因子VIII或天然FVIII，展 现促凝血活性以及在结合因子VIII的A2结构域的抗体存在下结合降 低的CFXTEN。在另一实施方案中，本发明提供相较于未连接于 XTEN的相应因子VIII或天然FVIII，展现促凝血活性以及在结合因 子VIII的A2和C2结构域的抗体存在下结合降低的CFXTEN。在一 个实施方案中，本发明提供相较于未连接于XTEN的相应FVIII，展 现促凝血活性以及在选自由表10的抗体组成的组的抗体存在下结合 降低的CFXTEN。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白展现与抗 体GMA8021的结合降低。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白展 现与抗体GMA8008的结合降低。在另一实施方案中，CFXTEN融合 蛋白展现与抗体ESH4的结合降低。在另一实施方案中，CFXTEN融 合蛋白展现与抗体ESH8的结合降低。在另一实施方案中，CFXTEN 融合蛋白展现与抗体B02C11的结合降低。在另一实施方案中，相较 于未连接于XTEN的相应FVIII，在来自具有多克隆抗体FVIII抑制 剂的甲型血友病受试者的血浆存在下，CFXTEN融合蛋白展现结合降 低以及更大程度的促凝血活性，其中所述更大程度的促凝血活性是通 过如毕提斯达测定的体外测定或本文所述的其它测定来测定。
展现由FVIII抑制剂的结合降低的CFXTEN可具有一个或两个 或三个或四个或五个或六个或更多个个别XTEN，其实施方案在本文 中加以公开。在这个段落的前述实施方案中，当在体外在能够测定抗 体与FVIII的结合的测定(如本文以下所述的测定或本领域中已知的 那些测定)中评估时，CFXTEN展现至少5％、或10％、或15％、或 20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％或更少与抗体的 结合。或者，可如实施例中所述，通过相较于未连接于XTEN的FVIII， 在抗体存在下保持较高程度的促凝血活性来评估主题CFXTEN与 FVIII结合抗体的结合降低。因此，在关于由本文所述的FVIII抑制 剂的结合降低的实施方案中，相较于未连接于XTEN且与抗体反应 的相应FVIII，CFXTEN当与抗FVIII抗体反应时在凝血测定(如本文 以下所述)中展现至少5％、或10％、或15％、或20％、或30％、或 40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或100％、或200％、或 300％、或400％、或500％或更高的活性。在前述事项中，抗FVIII 抗体可为来自表9的抗体或来自甲型血友病受试者的循环抗FVIII抗 体。在另一实施方案中，本发明提供CFXTEN，其中当利用毕提斯达 测定和选自表10的抗FVIII抗体或多克隆抗FVIII抗体制剂(如但不 限于来自具有FVIII抑制剂的甲型血友病受试者的血浆)测定时，相较 于未连接于XTEN且在类似条件下测定的FVIII，测定的融合蛋白产 生的毕提斯达效价小至少约2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、 50、60、70、80、100或200个毕提斯达单位。在另一实施方案中， 本发明提供CFXTEN，其中当在利用毕提斯达测定和多克隆抗FVIII 抗体制剂(如但不限于来自具有FVIII抑制剂的甲型血友病受试者的 血浆)的类似条件下测定时，相较于未连接于XTEN的FVIII，测定的 融合蛋白产生小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于25％、 或小于20％、或小于15％、或小于14％、或小于13％、或小于12％、 或小于11％、或小于10％毕提斯达单位。
表10:抗因子VIII抗体
American Diagnostica Inc.因特网站点，URL在万维网上位于 americandiagnostica.com/html/Product_Detail.asp？idCategory＝5&idSub Category＝104&idpro＝ESH-8，按照它在2012年1月12日的原样
Green Mountain Antibodies因特网站点,URL在万维网上位于 greenmoab.com/product_details/16316/21582.html，按照它在2012年1 月12日的原样
针对抑制剂和抗体结合的测定
可使用本领域中已知的方法测定本发明的融合蛋白以确认由 FVIII抑制剂的结合降低。可使用的测定包括但不限于使用如蛋白质 印迹的技术的竞争性和非竞争性测定系统、放射免疫测定、ELISA、 “夹心式”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反 应、免疫扩散测定、凝集测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、凝结 测定、因子VIII抑制剂测定等。所述测定在本领域中是常规且熟知 的(参见例如Ausubel等编,1994,Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,John Wiley & Sons,Inc.,New York，其以引用的方式 整体并入本文)。以下简要描述示例但不意图具有限制性。
毕提斯达测定和奈美根(Nijmegen)改进形式的毕提斯达测定是熟 知为检测FVIII抑制剂的方法的因子VIII抑制剂测定(Kasper CK等 Proceedings:A more uniform measurement of factor VIII inhibitors. Thromb Diath Haemorrh.(1975)34(2):612)。然而，测定可被改进来使 用如多克隆或单克隆抗FVIII抗体(包括表10的抗体)的抑制剂和如实 施例52中所述的方法测定抑制剂与FVIII组合物的结合。简而言之， 改进的毕提斯达测定涉及在设定浓度下混合滴定体积的测试样本与 等体积的抑制剂。在37℃下孵育混合物2小时，随后通过如显色测 定的凝血测定分析因子浓度。类似地，孵育具有天然因子VIII水平 的参照血浆，接着作为阳性对照加以测定。终点是产生阳性对照的 50％FVIII活性的效价，以毕提斯达单位加以报道。在奈美根改进形 式的毕提斯达测定中，用咪唑缓冲液使测定样本稳定且使对照样本与 不完全血浆而非缓冲液混合(Verbruggen B等The Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors:improved specificity and reliability.Thromb Haemost.(1995)73(2):247-251)。
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样本，在聚丙烯酰胺凝胶 (例如，8％–20％SDS-PAGE，视抗原的分子量而定)中使蛋白质样本 电泳，将蛋白质样本自聚丙烯酰胺凝胶转移至如硝酸纤维素、PVDF 或尼龙的膜中，在封闭溶液(例如，具有3％BSA或脱脂奶的PBS)中 封闭膜，在洗涤缓冲液(例如，PBS-吐温20)中洗涤膜，用于封闭缓冲 液中稀释的一抗(目标抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，用于封 闭缓冲液中稀释的缀合于酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸 酶)或放射性分子(例如，32P或125I)的二抗(其识别一抗，例如抗人 抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，以及检测抗原的存在。本领 域技术人员将可了解可改进参数以增加检测的信号以及降低背景噪 声。对于关于蛋白质印迹方案的进一步讨论，参见例如Ausubel等编, 1994,Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,John Wiley & Sons,Inc.,New York,10.8.1。
ELISA测定可检测针对FVIII的抗体而与它们阻断FVIII的促凝 血活性的能力无关，且已被用于检测甲型血友病患者中产生的抗 FVIII。在131名患有甲型血友病的具有抑制剂的患者的群体中， ELISA技术产生97.7％灵敏性和78.8％特异性，且具有高阴性预测值 (98.6％)[Martin,P.G.等Evaluation of a novel ELISA screening test for detection of factor VIII inhibitory antibodies in haemophiliacs.Clin Lab Haematol(1999)21:125-128]。其他研究者已发现在用于检测抗FVIII Ab的ELISA测定中，毕提斯达效价与吸光度值之间存在高度显著关 联(Towfighi,F.等Comparative measurement of anti-factor VIII antibody by Bethesda assay and ELISA reveals restricted isotype profile and epitope specificity.Acta Haematol(2005)114:84-90)，从而具有能够检 测非抑制性抗FVIII抗体的附加优势。测定方案包括制备结合配体， 其可包括包含因子VIII多肽或CFXTEN融合蛋白的样本，用抗体涂 布96孔微量滴定板的孔，添加配体测试样本且孵育，接着添加检测 抗体且孵育，随后洗涤且添加碱性磷酸酶或过氧化物酶缀合的二抗并 再孵育一段时期，随后添加TMB底物且处理以由分光光度计在450 nm下进行读数。在ELISA中，目标抗体或抑制剂不必缀合于可检测 化合物；代之以可添加缀合于可检测化合物的二抗(其识别目标抗体 或抑制剂)至孔中。此外，替代用抗体涂布孔，可将配体涂布至孔中。 本领域技术人员将可了解可改进参数以增加检测的信号以及本领域 中已知的ELISA的其它变化形式(参见例如，Ausubel等编,1994, Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,John Wiley&Sons,Inc., New York,11.2.1)。
标准或改进凝血测定用于测量FVIII结合剂的结合降低。在一种 示例性方法(进一步描述于实施例28中)中，首先通过使用不同量的 抑制性抗体，在37℃下与表达含有His/Myc双重标签的野生型FVIII 的基础载体一起孵育2小时进行滴定实验来确定待在测定中利用的 给定FVIII抑制剂的最优浓度。通过本文所述的Coatest测定程序测 量FVIII活性。导致最优抑制FVIII活性的最低浓度用于测定中。在 测定中，使FVIII抑制剂抗体在最优浓度下与个别测试样本混合且在 37℃下孵育2小时。接着收集所得测试样本且连同CFXTEN的未处 理等分试样和阳性对照一起用于Coatest活性测定中以评估各测试样 本的残余和基线FVIII活性。
本发明提供制备展现与FVIII结合剂(包括FVIII抑制剂)的结合 降低以及促凝血活性保持的CFXTEN的方法。在一个实施方案中， 制备与FVIII抑制剂的结合降低的CFXTEN的方法包括以下步骤： 选择与表1的序列具有至少90％序列同一性的FVIII序列，选择一个、 两个、三个、四个、五个或六个或更多个各自与来自表4的具有类似 长度的XTEN序列具有至少70％、或至少80％、或至少90％、或至 少95-99％序列同一性的XTEN，产生被设计来在或邻近于选自表5、 表6、表7、表8和表9的位置处定位所述XTEN的表达构建体，表 达和回收所得CFXTEN，以及在本文所述的测定中测定所得融合蛋白 以确认CFXTEN融合蛋白的结合降低。通过本发明方法，相较于未 连接于XTEN的相应FVIII，CFXTEN展现与FVIII结合剂(包括但不 限于表10的抗体或来自甲型血友病受试者的抗FVIII抗体)的结合降 低至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、 或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％， 且保留至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、 或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％的促凝血活性。
多达8-10％甲型血友病患者具有结合FVIII而不影响它的促凝血 性质的抗体；它们因此不被分类为FVIII抑制剂。然而，据信抗体结 合FVIII会产生由先天性免疫反应清除或更易经受蛋白水解降解的免 疫复合物(Kazatchkine MD.Circulating immune complexes containing anti-VIII antibodies in multi-transfused patients with haemophilia A.Clin Exp Immunol.(1980)39(2):315-320)。因此，本发明的一目标在于提供 包含一个或多个XTEN的展现针对FVIII的不是抑制剂的抗体的结合 降低的CFXTEN融合蛋白，其中相较于未连接于XTEN的相应FVIII 或由所述抗体结合的天然FVIII，CFXTEN的降解或清除降低至少 5％、或10％、或15％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、 或70％或更低。可通过体外和体内方法测定相较于未连接于XTEN 的FVIII或天然FVIII，针对CFXTEN的抗体的结合降低。体外方法 包括以上提及的ELISA和蛋白质印迹方法。可通过使用动物模型或 在人临床试验中体内评估CFXTEN的降解或清除降低。在一种类型 的试验中，优选通过静脉内输注向患有因子VIII缺乏症的具有促进 治疗性人因子VIII的降解或清除的抗体的各组患者分别施用因子 VIII或CFXTEN。施用的测试物品的剂量在介于5与50IU/kg体重、 优选10-45IU/kg之间的范围内，且最优选是40IU/kg体重。在各施 用之后约1小时，在功能性单级或显色凝血测定中测量因子VIII或 CFXTEN自血液样本的回收率以评估活性且通过ELISA、HPLC或类 似测定限定完整因子VIII等效物的量。在输注之后约5-10小时再次 获取样本，且测量回收率。因子VIII自样本的总回收率和消失速率 可预示抗体效价，且因子VIII与CFXTEN的结果比较指示CFXTEN 的清除和/或降解的降低程度。在一个实施方案中，CFXTEN融合蛋 白展现与促进清除但不另外抑制完整天然FVIII的促凝血活性的抗 FVIII抗体的结合降低至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少 20％、或至少25％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至 少70％、或至少80％。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白展现 与促进FVIII的降解的抗FVIII抗体的结合降低至少5％、或至少10％、 或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少40％、或至少50％、 或至少60％、或至少70％、或至少80％。在这个段落的前述实施方 案中，或者，抗FVIII抗体的结合降低的特征在于相较于与未连接于 XTEN的相应FVIII的结合，FVIII抗体与融合蛋白的KD值相较于 FVIII增加至至少2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或10倍、或33 倍、或100倍、或330倍、或至少1000倍。在一个实施方案中，相 较于未连接于XTEN的FVIII，当向具有抗FVIII抗体的受试者施用 时，包含一个或多个XTEN的展现与抗FVIII抗体的反应性降低的 CFXTEN融合蛋白展现终末半衰期增加至至少48小时、或至少72 小时、或至少96小时、或至少120小时、或至少144小时、或至少 14天、或至少21天。在前述实施方案中，受试者可为人甲型血友病 受试者或它可为具有循环抗FVIII抗体的小鼠甲型血友病受试者。
本发明的另一方面是CFXTEN融合蛋白用于具有FVIII抑制剂 的受试者的凝血病变的特定疗法的用途。本发明提供一种治疗具有循 环FVIII抑制剂的受试者的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施 用凝结有效量的CFXTEN融合蛋白，其中所述融合蛋白相较于未连 接于XTEN的相应因子VIII或相较于使用类似量和施用途径向所述 受试者施用的天然因子VIII展现更大促凝血活性和/或凝结有效浓度 持续时间更长。在所述方法的一个实施方案中，受试者中的FVIII抑 制剂是抗FVIII抗体。在另一实施方案中，FVIII抑制剂是中和抗FVIII 抗体。在一个实施方案中，FVIII抑制剂是结合FVIII的A1结构域的 抗FVIII抗体。在另一实施方案中，FVIII抑制剂是结合FVIII的A2 结构域的抗FVIII抗体。在另一实施方案中，FVIII抑制剂是结合FVIII 的A3结构域的抗FVIII抗体。在另一实施方案中，FVIII抑制剂是结 合FVIII的C1结构域的抗FVIII抗体。在另一实施方案中，FVIII抑 制剂是结合FVIII的C2结构域的抗FVIII抗体。在另一实施方案中， FVIII抑制剂是结合FVIII的C2与A2结构域两者的抗FVIII抗体。 在另一实施方案中，FVIII抑制剂结合能够由表10的一种或多种抗体 结合的FVIII表位。在另一实施方案中，FVIII抑制剂是来自具有FVIII 抑制剂抗体的甲型血友病受试者的多克隆抗体。
本发明的一目标是产生具有XTEN的CFXTEN，插入XTEN以 使对将另外结合FVIII且中和促凝血活性或导致FVIII清除或降解的 FVIII结合剂的空间干扰最大化。因此，在一种方法中，本发明提供 包含一个或多个XTEN的CFXTEN，其中所述XTEN邻近于FVIII 抑制剂或抗FVIII抗体的结合位点插入。在一个实施方案中，XTEN 在选自表5、表6、表7、表8和表9的在由表10的抗体结合的FVIII 表位的约50、或约100、或约150、或约200、或约250、或约300 个氨基酸内的位置处连接于FVIII。在另一实施方案中，XTEN在A2 或C2结构域中由表10的抗体结合的FVIII表位的约50、或约100、 或约150、或约200、或约250、或约300个氨基酸内连接于FVIII。 因此，本发明提供包含一个或多个XTEN的CFXTEN融合蛋白，其 中相较于未连接于XTEN的相应FVIII或天然FVIII，由FVIII抑制 剂与融合蛋白的FVIII组分的结合降低，且CFXTEN保留促凝血活 性。在上文于这个段落中所述的前述实施方案中，融合蛋白可通过本 文以下所述的测定、实施例的测定或本领域中已知的其它测定加以测 定，且抑制剂可为表10的抗体，可为多克隆抗FVIII，或可为来自具 有FVIII抑制剂的甲型血友病受试者的血液或血浆。
在另一方面，CFXTEN被设计来使XTEN可在其上采用覆盖融 合蛋白的无规卷曲构象的区域最大化，由此对将另外结合融合蛋白的 FVIII组分上的表位的抗FVIII抗体产生空间位阻。据信相较于具有 较少XTEN，但具有近似相同总XTEN氨基酸数的CFXTEN，将多 个XTEN并入CFXTEN中会提供XTEN组分的较高总流体动力学半 径。根据经验，可基于尺寸排阻色谱计算蛋白质的流体动力学半径， 且使用所述方法获得的若干融合蛋白的结果描述于实施例中。或者， XTEN多肽(如并入本文公开的实施方案中的那些XTEN多肽)的半径 可通过数学公式加以估计，因为有限类型的所利用氨基酸具有可定量 的已知特征。在一个实施方案中，根据由等式II给出的公式计算单 一XTEN多肽的最大半径(在下文中称为“XTEN半径”)：
XTEN半径＝(√XTEN长度0.2037)+3.4627 II
在另一实施方案中，根据由等式III给出的公式计算CFXTEN中 所有XTEN区段的最大XTEN半径的总和：
其中：n＝XTEN区段的数目
且i是迭代子
在另一实施方案中，根据由等式IV给出的公式计算包含多个 XTEN的CFXTEN的XTEN半径总和与相等长度(总氨基酸残基数与 CFXTEN的总氨基酸残基数相等)的单一XTEN的XTEN半径的比率 (下文称为“XTEN半径比率”)：
其中：n＝XTEN区段的数目
且i是迭代子
在将等式应用于XTEN时，本领域技术人员应了解，计算值表 示可视用于表达XTEN多肽的宿主细胞而变化或降低的最大值。据 信尽管大肠杆菌(E.coli)表达将产生实现计算值的XTEN，但在其中 XTEN可被糖基化的真核宿主细胞中表达可导致多肽的半径小于最 大计算值。所述差异可通过如尺寸排阻色谱的方法来定量，其方法详 述于实施例中。
为设计使XTEN可在其上采用无规卷曲构象的区域最大化的 CFTEN，发现XTEN半径比率高于2的CFXTEN设计提供的在融合 蛋白上的覆盖范围大于值<2的设计。因此，在一个实施方案中，本 发明提供其中XTEN半径比率是至少2.0、或2.1、或2.2、或2.3、 或2.4、或2.5、或2.6、或2.7、或2.8、或2.9、或3.0、或3.1、或 3.2、或3.3、或3.4、或3.5或更大的CFXTEN。在一些实施方案中， 本发明提供其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的CFXTEN， 其包含至少三个XTEN，其中各XTEN具有至少42至约288个氨基 酸且其中至少两个XTEN连接于融合蛋白，其中两个XTEN之间相 隔不少于约100、或约200、或约300、或约400、或约500个氨基酸。 在其它实施方案中，本发明提供其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5 或更大的CFXTEN，其包含至少四个XTEN，其中各XTEN具有至 少42至约288个氨基酸且其中至少三个XTEN连接于融合蛋白，其 中三个XTEN的任何两者之间相隔不少于约100、或约200、或约300、 或约400个氨基酸。
在另一实施方案中，本发明提供一种其中XTEN半径比率是至 少2.0-3.5或更大的CFXTEN，所述CFXTEN包含至少三个XTEN， 其中各XTEN具有至少42至约288个氨基酸且其中三个XTEN中连 接于融合蛋白的至少两者由具有至少100、或约200、或约300至约 400个氨基酸的氨基酸序列分隔，且第三XTEN连接在B结构域(或 其片段)内或C结构域(或其末端)内。在另一实施方案中，本发明提 供一种其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的CFXTEN，所述 CFXTEN包含至少四个XTEN，其中各XTEN具有至少42至约288 个氨基酸且其中四个XTEN中连接于融合蛋白的至少三者由具有至 少300至约400个氨基酸的氨基酸序列分隔且第四XTEN连接在B 结构域(或其片段)内或C结构域(或其末端)内。
在其它实施方案中，本发明提供其中XTEN半径比率是至少 2.0-3.5或更大的CFXTEN，所述CFXTEN包含至少五个XTEN，其 中四个XTEN具有至少42至约144个氨基酸，其中至少四个XTEN 连接于融合蛋白，其中四个XTEN的任何两者之间相隔不少于约100、 200、或约300、或约400个氨基酸且第五XTEN连接在B结构域(或 其片段)内或C结构域(或其末端)内。在一个实施方案中，本发明提 供一种其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的CFXTEN，所述 CFXTEN包含至少五个XTEN，其中四个XTEN具有至少42至约144 个氨基酸，其中连接于融合蛋白的至少三个XTEN由具有至少300 至约400个氨基酸的氨基酸序列分隔，第四XTEN连接在B结构域(或 其片段)内且第五XTEN连接在C结构域(或其末端)内。
在一方面，本发明提供其中XTEN半径比率是至少2.0、或2.1、 或2.2、或2.3、或2.4、或2.5、或2.6、或2.7、或2.8、或2.9、或 3.0、或3.1、或3.2、或3.3、或3.4、或3.5或更大的CFXTEN，且组 合物不包含某些序列。在一个前述实施方案中，本发明提供其中 XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的CFXTEN，前提是融合蛋白 不包含来自表50或表51的任一者的序列。在另一前述实施方案中， 本发明提供其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的CFXTEN， 前提是融合蛋白不包含具有AG家族XTEN序列的序列。在另一前述 实施方案中，本发明提供其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大 的CFXTEN，前提是融合蛋白不包含选自GTPGSGTASSSP(SEQ ID NO:31)、GSSTPSGATGSP(SEQ ID NO:32)、GSSPSASTGTGP(SEQ ID NO:33)、GASPGTSSTGSP(SEQ ID NO:34)的序列。在另一前述实 施方案中，本发明提供其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的 CFXTEN，前提是融合蛋白不包含选自GTPGSGTASSSP(SEQ ID NO: 31)、GSSTPSGATGSP(SEQ ID NO:32)、GSSPSASTGTGP(SEQ ID NO: 33)、GASPGTSSTGSP(SEQ ID NO:34)和
GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP(SEQ ID NO:59)的任一序列。在另一前述实施方案中，本发明提 供其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的CFXTEN，前提是融 合蛋白不包含选自
GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP(SEQ ID NO:59)、
PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSG TASSS(SEQ ID NO:71)或
PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSA STGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPS ASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSST PSGATGS(SEQ ID NO:80)的序列。在另一前述实施方案中，本发明 提供其中XTEN半径比率是至少2.0-3.5或更大的CFXTEN，前提是 融合蛋白不包含由
GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGS AP(SEQ ID NO:59)、
PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSG TASSS(SEQ ID NO:71)或
PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSG ATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGT SSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSA STGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPS ASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSST PSGATGS(SEQ ID NO:80)组成的XTEN序列。
在一方面，本发明提供用以产生具有XTEN的CFXTEN的方法， 插入XTEN以使对将另外结合FVIII且中和促凝血活性或导致FVIII 清除或降解的FVIII结合剂的空间干扰最大化。因此，在一个实施方 案中，本发明提供一种包括以下步骤的方法：选择与表1的序列具有 至少90％序列同一性的FVIII序列，自表4选择三个或更多个XTEN， 其中XTEN半径比率是至少2.0、或2.1、或2.2、或2.3、或2.4、或 2.5、或2.6、或2.7、或2.8、或2.9、或3.0、或3.1、或3.2、或3.3、 或3.4、或3.5或更大，产生被设计来在或邻近于选自表5、表6、表 7、表8和表9的位置处定位所述XTEN的表达构建体，其中三个或 更多个XTEN是至少300至400个氨基酸，表达和回收所得CFXTEN， 以及在本文所述的测定中测定所得融合蛋白以确认CFXTEN融合蛋 白的结合降低。通过本发明方法，CFXTEN展现与FVIII结合剂(包 括但不限于表10的抗体)的结合降低至少5％、或至少10％、或至少 15％、或至少20％、或至少25％、或至少40％、或至少50％、或至 少60％、或至少70％、或至少80％，且展现促凝血活性。
5.具有间隔子和裂解序列的CFXTEN融合蛋白构型
在另一方面，本发明提供用一个或多个并入XTEN中或邻近于 XTEN的间隔子序列构造的CFXTEN，所述间隔子序列被设计来向组 合物并入或增强功能性或性质，或作为装配或制造融合蛋白组合物的 辅助手段。所述性质包括但不限于包括裂解序列以允许释放组分，包 括可与核苷酸限制位点相容以允许XTEN编码核苷酸键联于FVIII编 码核苷酸或有助于构建表达载体的氨基酸，以及设计接头以降低 CFXTEN融合蛋白的区域中的空间位阻。
在一实施方案中，可在XTEN序列与FVIII组分之间引入间隔子 序列以降低空间位阻以使得FVIII组分可采用它的所需三级结构和/ 或与它的靶标底物或加工酶适当相互作用。对于间隔子和鉴定合乎需 要间隔子的方法，参见例如George等(2003)Protein Engineering 15:871–879，其以引用的方式明确并入本文。在一个实施方案中，间 隔子包含一种或多种长度在1–50个氨基酸残基、或约1–25个残基、 或约1-10个残基之间的肽序列。排除裂解位点的间隔子序列可包含 20种天然L氨基酸的任一者，且将优选具有XTEN样性质，因为大 多数残基将为在空间上不受阻碍的亲水性氨基酸，如但不限于甘氨酸 (G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、脯氨酸(P)和天 冬氨酸(D)。间隔子可为单一甘氨酸残基、聚甘氨酸或聚丙氨酸，或 主要是甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基的组合的混合物。在一个实施方 案中，排除裂解位点氨基酸的间隔子序列具有约1至10个由选自甘 氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P) 的氨基酸组成且大致上缺乏二级结构的氨基酸；例如如通过 Chou-Fasman和/或GOR算法所确定，二级结构小于约10％、或小于 约5％。在一个实施方案中，间隔子序列是GPEGPS(SEQ ID NO: 1612)。在另一实施方案中，间隔子序列是连接于表12的裂解序列的 GPEGPS(SEQ ID NO:1612)。此外，间隔子序列被设计来避免引入T 细胞表位，此可通过避免或限制间隔子中所用疏水性氨基酸的数目来 部分地加以实现；表位的确定在以上以及在实施例中加以描述。
在一特定实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含一个或多个连接在 有效负载FVIII序列与一个或多个并入融合蛋白中的XTEN的接合点 处的间隔子序列，其中所述间隔子序列包含可与编码限制位点的核苷 酸相容的氨基酸。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含一个或 多个连接在有效负载FVIII序列与一个或多个并入融合蛋白中的 XTEN的接合点处的间隔子序列，其中所述间隔子序列包含可与编码 限制位点的核苷酸相容的氨基酸且所述氨基酸和所述一个或多个间 隔子序列氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、 谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。在另一实施方案中，CFXTEN融合蛋白包含 一个或多个连接在有效负载FVIII序列与一个或多个并入融合蛋白中 的XTEN的接合点处的间隔子序列，其中所述间隔子序列包含可与 编码限制位点的核苷酸相容的氨基酸且所述一个或多个间隔子序列 选自表11的序列。选择各间隔子序列的精确序列以可与表达载体中 用于特定CFXTEN构建体的克隆位点相容。在一个实施方案中，间 隔子序列具有可与XTEN相容的性质。在一个实施方案中，间隔子 序列是GAGSPGAETA(SEQ ID NO:178)。对于并入FVIII序列内部 的XTEN序列，各XTEN将通常由两个包含可与限制位点相容的氨 基酸的间隔子序列侧接，而连接于N末端或C末端的XTEN将仅需 要在两个组分的接合点处的单一间隔子序列和在相反末端处的另一 间隔子序列以并入载体中。如将为本领域普通技术人员显而易知，当 合成产生整个CFXTEN基因时，包含可与在FVIII内部的限制位点 相容的氨基酸的间隔子序列可自构建体忽略。
表11:可与限制位点相容的间隔子序列
间隔子序列 限制酶
GSPG(SEQ ID NO: 174) BsaI
ETET(SEQ ID NO: 175) BsaI
PGSSS(SEQ ID NO: 176) BbsI
GAP AscI
GPA FseI
GPSGP(SEQ ID NO: 177) SfiI
AAA SacII
TG AgeI
GT KpnI
GAGSPGAETA(SEQ ID NO: 178) SfiI
ASS XhoI
在另一方面，本发明提供具有并入间隔子序列中的裂解序列的 CFXTEN构型。在一些实施方案中，CFXTEN融合蛋白组合物中的 间隔子序列包含一个或多个相同或不同裂解序列，其中所述裂解序列 可由蛋白酶所作用(如图12中所示)以自融合蛋白释放FVIII、FVIII 组分(例如，B结构域)或XTEN序列。在一个实施方案中，将裂解序 列并入CFXTEN中被设计来允许释放FVIII组分，所述FVIII组分在 它自XTEN释放后变得具有活性或更具有活性(就它充当因子IXa和 X的膜结合位点的能力而言)。在前述实施方案中，相较于完整 CFXTEN，在裂解之后，CFXTEN的FVIII组分的促凝血活性增加至 少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或 至少80％、或至少90％。裂解序列足够靠近FVIII序列加以定位，通 常在FVIII序列的18、或12、或6、或2个氨基酸内，以使在裂解之 后，连接于FVIII的任何剩余残基都不明显地干扰FVIII的活性(例如， 像结合凝结蛋白)，但提供蛋白酶的足够通路以能够实现裂解序列的 裂解。在一些情况下，包含裂解序列的CFXTEN也将在FVIII与裂 解序列之间或XTEN与裂解序列之间具有一个或多个间隔子序列氨 基酸以有助于蛋白酶进入；间隔子氨基酸包括任何天然氨基酸，包括 作为优选氨基酸的甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。在一个实施方案中，裂 解位点是可由哺乳动物受试者内源性蛋白酶裂解以使CFXTEN在向 受试者施用之后可被裂解的序列。在所述情况下，CFXTEN可充当 FVIII的前药或循环储槽。在一前述特定构建体中，CFXTEN将具有 一个或两个通过可由活化的凝血因子所作用的裂解序列连接于 FVIII-BDD的N末端和/或C末端的XTEN，且将具有位于在位置R740 和R1689处的加工氨基酸之间的另一XTEN以使所述XTEN可被释 放，从而剩下与天然活化的FVIII类似的FVIII形式。在前述构建体 的一个实施方案中，相较于完整CFXTEN融合蛋白，通过裂解序列 的裂解自融合蛋白释放的FVIII展现活性增加至少约2倍、或至少约 3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、 或至少约10倍、或至少约20倍。
由本发明涵盖的裂解位点的实例包括但不限于可由选自FXIa、 FXIIa、激肽释放酶、FVIIIa、FVIIIa、FXa、FIIa(凝血酶)、弹性蛋白 酶-2、粒酶B(granzyme B)、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20 的哺乳动物内源性蛋白酶或由非哺乳动物蛋白酶(如TEV、肠激酶 (enterokinase)、PreScissionTM蛋白酶(鼻病毒3C蛋白酶)和分选酶 A(sortase A))裂解的多肽序列。已知由前述蛋白酶和其它蛋白酶裂解 的序列在本领域中是已知的。由本发明涵盖的示例性裂解序列和序列 内的相应切割位点呈现于表12中以及其序列变体。对于包含并入的 裂解序列的CFXTEN，通常优选的是一个或多个裂解序列是活化的凝 结蛋白的底物。举例来说，凝血酶(活化的凝结因子II)作用于序列 LTPRSLLV(SEQ ID NO:1618)[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]，其在序列中于位置4处的精氨酸之后被切割。活性 FIIa是通过在磷脂和钙存在下由FXa裂解FII来产生且在凝血路径中 处于因子VIII的下游。一旦活化，它在凝血中的天然作用将裂解纤 维蛋白原，所述纤维蛋白原接着又开始形成凝块。FIIa活性受严密控 制且仅在凝血为适当止血所必需时存在。通过向CFXTEN中并入在 FVIII与XTEN组分之间且连接FVIII和XTEN组分的LTPRSLLV序 列(SEQ ID NO:1618)，当生理需要凝血时，XTEN与外源性或内源性 凝血路径的活化同时自邻接FVIII移除，由此选择性释放FVIII。在 另一实施方案中，本发明提供其中FXIa裂解序列并入在仅通过启动 内源性凝血系统而被作用的FVIII与XTEN组分之间的CFXTEN，其 中促凝血形式的FVIII是由FXIa自XTEN释放以参与凝血级联。在 不意图受任何特定理论束缚下，据信前述实施方案的CFXTEN将使 FVIII与其它凝血因子隔离(在活性凝结部位处除外)，由此允许在最 小安全性顾虑下使用较大剂量(以及因此较长给药间隔)。
因此，裂解序列，特别是易受表12中所列的促凝血活化的凝结 蛋白影响的那些裂解序列将提供FVIII的持续释放，在CFXTEN的 某些实施方案中，此可提供自CFXTEN的完整形式释放的FVIII组 分的较高活性程度，以及向受试者施用高剂量CFXTEN的额外安全 界限。在一个实施方案中，本发明提供包含一个或多个被可操作地定 位来在裂解后自融合蛋白释放FVIII的裂解序列的CFXTEN，其中所 述一个或多个裂解序列与选自表12的序列具有至少约86％、或至少 约92％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，仅两个或三个侧接切割位点的两侧的氨基酸 (总计四至六个氨基酸)并入裂解序列中，所述裂解序列又并入实施方 案的CFXTEN中，从而提供例如XTEN释放位点。在其它实施方案 中，表12的并入的裂解序列可具有一个或多个缺失或插入或已知序 列中任何一个或两个或三个氨基酸的一个或两个或三个氨基酸取代， 其中所述缺失、插入或取代导致易感性降低或增强而非不存在对蛋白 酶的易感性，从而导致能够定制FVIII自XTEN的释放速率。用于本 发明的CFXTEN中的裂解序列内的示例性取代显示于表12中。
表12:蛋白酶裂解序列
↓指示裂解位点 NA：不适用
在斜线符号之前、之间或之后的多个氨基酸的清单指示可在所述 位置处被取代的替代性氨基酸；“-”指示任何氨基酸都可取代在中间 列中指示的相应氨基酸
6.示例性CFXTEN融合蛋白序列
含有连接于一个或多个XTEN的单一FVIII的融合蛋白的序列的 非限制性实例呈现于表21中。表21的示例性氨基酸序列(和编码它 们的DNA序列)出于纯化目的含有如将为本领域技术人员显而易知， 可自序列缺失而不对CFXTEN融合蛋白的促凝血活性具有影响的his 标签。在一个实施方案中，表21的CFXTEN进一步在N末端上包含 对应于天然人FVIII的氨基酸的氨基酸(即序列 MQIELSTCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO:1611))以有助于CFXTEN融 合蛋白的表达和分泌。在一个实施方案中，CFXTEN组合物包含当最 优比对时，相较于来自表21的CFXTEN具有至少约80％序列同一性， 或者相较于来自表21的CFXTEN具有至少约81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、或约100％序列同一性的融合蛋白。在另一 实施方案中，CFXTEN组合物包含来自表21的融合蛋白，其中C末 端his-his-his-his-his-his序列(SEQ ID NO:1700)被缺失。然而，本发 明也涵盖用表1的任何FVIII序列取代表21的CFXTEN的FVIII组 分，和/或用表3、4和13-17的任一者的任何序列取代表21的CFXTEN 的XTEN组分。通常，前述实例的所得CFXTEN保留未连接于XTEN 的相应FVIII的至少一部分促凝血活性。在上文于这个段落中所述的 前述融合蛋白中，CFXTEN融合蛋白可进一步包含一个或多个裂解序 列；例如来自表12的序列，所述裂解序列位于FVIII与XTEN序列 之间或由XTEN连接的邻近FVIII结构域之间。在包含裂解序列的一 些实施方案中，相较于未连接于XTEN的相应FVIII，完整CFXTEN 组合物以它的完整形式具有较小活性但较长半衰期，但被设计以使在 向受试者施用后，FVIII组分通过由内源性蛋白酶在裂解序列处裂解 而自融合蛋白逐渐释放，据此FVIII组分展现促凝血活性。
可使用如本文所述的测定或体内参数(例如体外凝血测定、表49 的测定、或在临床前血友病模型中或在人中进行的临床试验中的药效 学作用，使用如实施例中所述的方法或本领域中已知的用于评估 FVIII活性的其它方法)评估实施方案的CFXTEN组合物的活性以确 定相较于天然FVIII序列保留至少约30％、或约40％、或约50％、或 约55％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％或 更高活性的构型或FVIII序列变体和那些CFXTEN组合物(包括在裂 解任何并入的XTEN释放性裂解位点之后)被认为适用于治疗FVIII 相关病状的适合性。
V).本发明的CFXTEN组合物的性质
(a)CFXTEN的药代动力学性质
本发明的一目标在于提供相较于未连接于XTEN的FVIII具有增 强的药代动力学的CFXTEN融合蛋白和包含CFXTEN的药物组合 物。通过使给定XTEN连接于FVIII而增强的FVIII药代动力学性质 包括但不限于终末半衰期、曲线下面积(AUC)、Cmax、分布体积、相 较于未连接于XTEN的FVIII维持生物活性CFXTEN高于最小有效 血液单位浓度持续较长时期。性质增强允许相较于类似剂量的未连接 于XTEN的FVIII，给药频率较小和/或促凝血作用存在较长久。增强 这些性质中的一者或多者可产生治疗因子VIII相关病状的益处。
已报道当与正常血管性血友病因子蛋白复合时，外源施用的因子 VIII在人中的终末半衰期是约12-14小时，而在不存在血管性血友病 因子下，因子VIII的半衰期降低至2小时(Tuddenham EG等,Br J Haematol.(1982)52(2):259-267；Bjorkman,S.等Clin Pharmacokinet. (2001)40:815)。由于由XTEN赋予的性质增强，当在确定为适于受 试者和它的潜伏病状的剂量和剂量方案下使用时，CFXTEN可实现相 较于类似剂量的未连接于XTEN的相应FVIII，持续延长时期产生所 需促凝血或临床作用的循环浓度。如本文所用，“类似剂量”是指向受 试者施用的组合物的等效摩尔/kg或国际单位/kg(IU/kg)。在本领域中 应了解，未连接于XTEN的FVIII的“类似剂量”将表示较小药物重量 但就剂量而言将具有CFXTEN的基本上相同IU或摩尔当量。
1国际单位(“IU”)的因子VIII在本领域中定义为1ml正常人血浆 中存在的凝血活性。预期正常非血友病个别人具有约100IU/dL因子 VIII活性。在甲型血友病中，为治疗所需的剂量取决于病状。对于轻 微流血，必要时通常施用天然或重组因子VIII的剂量20至40IU/kg。 对于中度流血，必要时施用剂量30至60IU/kg，且对于重度流血， 可需要剂量80至100IU/kg，伴随每8至12小时给予重复剂量20至 25IU/kg直至流血得以解决。对于防治患有重度甲型血友病的患者的 流血，天然或重组FVIII制剂的常用剂量是在间隔约2至3天下20 至40lU/kg体重。用于估计包含FVIII的组合物的适当剂量的标准等 式是：
所需单位＝体重(kg)x所需因子VIII升高(IU/dL或正常值％)x 0.5(每IU/dL的IU/kg)。
在许多情况下，已确定FVIII在不同年龄或疾病程度的受试者中 的治疗水平且可在公开文献中获得或在含有FVIII的核准产品的药物 标签上加以陈述。举例来说，国际血栓形成和止血学会的科学和标准 化委员会的因子VIII和因子IX附属委员会(Subcommittee on Factor VIII and Factor IX of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis)于200 0年11月29日在ISTH网站上公布甲型血友病的最广泛使用的量度 标准是通过测定血浆FVIII促凝血水平的循环浓度来确定，其中因子 VIII<1％(<0.01IU/ml)的人士确定为重度；1-5％(0.01-0.05IU/ml) 确定为中等重度；且>5-40％(0.05-<0.40IU/ml)确定为轻度，其中正 常值是1IU/ml因子VIIIC(100％)。可使用标准方法确定新型组合物， 包括本公开的那些CFXTEN和包含CFXTEN的药物组合物的治疗水 平。在实施本发明时，应了解CFXTEN的任何有效剂量都可用于处 理流血事件或维持止血。用于确定给定组合物的治疗水平和给药时程 的方法为本领域技术人员所已知(参见例如Goodman&Gilman's Th e Pharmacological Basis of Therapeutics,第11版,McGraw-Hill(20 05))。举例来说，通过在患有靶标病状的受试者中使用剂量提高研究 以确定功效或合乎需要的药理学作用、不利事件的出现以及循环血液 水平的测定结果，可确定给定药物或生物制剂用于给定受试者或受试 者群体的治疗血液水平。剂量提高研究将通过在1名受试者或1组甲 型血友病受试者中进行研究来评估CFXTEN的活性。研究将监测促 凝血剂的血液水平以及如本领域中已知或如本文对于一个或多个与 因子VIII相关病状相关的参数所述的生理或临床参数、或与有益结 果相关的临床参数以及观察和/或测量参数以确定无作用剂量、不利 事件、最小有效剂量等、以及确定所测定或获得的循环血液水平的药 代动力学参数的测量结果。结果可接着与施用的剂量和治疗剂的与前 述测定参数或作用水平一致的血液浓度相关联。通过这些方法，一定 范围的剂量和血液浓度可与所需作用存在或得以维持所处的最小有 效剂量以及最大剂量和血液浓度、以及所需作用得以维持所可持续的 时期相关联，由此确定组合物的治疗血液水平和给药时程。因此，通 过前述方法，确定Cmin血液水平，在低于所述Cmin血液水平时，CF XTEN融合蛋白将不具有所需药理学作用；以及Cmax血液水平，在高 于所述Cmax血液水平时，如血栓形成的副作用可发生(Brobrow,RS, JABFP(2005)18(2):147-149)，从而确定组合物的治疗窗。
本领域技术人员可通过本文公开的手段或通过本领域中已知的 其它方法确认施用的CFXTEN保持在治疗血液水平下以维持止血持 续所需间隔或需要在剂量或XTEN的长度或序列方面进行调整。此 外，适于保持CFXTEN在治疗窗内的剂量和剂量频率的测定结果确 定治疗有效剂量方案；用于使用治疗有效剂量的融合蛋白向有需要的 受试者施用多个连续剂量，从而导致连续Cmax峰值和/或Cmin谷底值 保持在治疗有效浓度以上且导致靶标病状的至少一个相关测量参数 改进的时程。在一个实施方案中，相较于未连接于XTEN且在类似 剂量下施用的相应FVIII，在适当剂量下向受试者施用的CFXTEN或 包含CFXTEN的药物组合物导致CFXTEN融合蛋白的血液浓度保持 在用以维持止血的最小有效浓度以上持续的时期长至少约2倍；相较 于未连接于XTEN且在类似剂量下施用的相应FVIII，或者长至少约 3倍；或者长至少约4倍；或者长至少约5倍；或者长至少约6倍； 或者长至少约7倍；或者长至少约8倍；或者长至少约9倍；或者长 至少约10倍；或至少长约20倍或更长。如本文所用，“适当剂量” 是指药物或生物制剂当向受试者施用时将产生合乎需要的治疗或药 理学作用(例如止血)和/或在治疗窗内的血液浓度的剂量。
在实施本发明时，终末半衰期较长的CFXTEN通常是优选的， 以便改进患者便利性，增加剂量之间的间隔且降低为实现持续作用所 需的药物量。相较于未连接于XTEN的FVIII，增强的PK参数允许 主题组合物的给药降低，特别是对于接受常规防治的那些甲型血友病 受试者而言。
如在关于包含XTEN的融合蛋白的药代动力学特征的实施例中 更充分所述，观察到增加单一或组合XTEN的总长度会赋予包含 XTEN的融合蛋白的终末半衰期不成比例增加。因此，本发明提供 CFXTEN融合蛋白和包含CFXTEN的药物组合物，其中当向受试者 施用时，所述CFXTEN展现半衰期增强。在一些实施方案中，本发 明提供包含一个或多个XTEN的单体CFXTEN融合蛋白，其中选择 所述XTEN的数目和位置以赋予相较于未连接于XTEN且在类似剂 量下施用的相应FVIII，向受试者施用的CFXTEN的终末半衰期增加， 其中相较于未连接于XTEN的FVIII，增加是终末半衰期增加长至少 约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6 倍、或至少约7倍、或至少约8倍、或至少约9倍、或至少约10倍、 或至少约15倍、或至少20倍、或至少40倍或更长。在其它实施方 案中，本发明提供CXTEN组合物和包含CFXTEN的药物组合物， 其中相较于类似剂量的未连接于XTEN的FVIII，向有需要的受试者 施用组合物导致终末半衰期长至少12小时、或至少约24小时、或至 少约48小时、或至少约96小时、或至少约144小时、或至少约7天、 或至少约14天、或至少约21天。在另一实施方案中，相较于未连接 于XTEN且在类似剂量下施用的FVIII，向有需要的受试者施用凝血 有效剂量的CFXTEN融合蛋白可导致为维持血液水平约0.1IU/ml所 必需的连续剂量之间的时间增加至少48小时、或至少72小时、或至 少约96小时、或至少约120小时、或至少约7天、或至少约14天、 或至少约21天。
在一个实施方案中，本发明提供CFXTEN融合蛋白和包含 CFXTEN的药物组合物，其当向有需要的受试者施用时，相较于未连 接于XTEN且在类似剂量下向受试者施用的相应FVIII，展现AUC 增加至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、 或至少约90％、或至少约100％、或至少约150％、或至少约200％、 或至少约300％、或至少约500％、或至少约1000％、或至少约2000％。 可通过标准方法确定CFXTEN的药代动力学参数，所述方法涉及给 药，在定时间隔下获取血液样本，以及使用ELISA、HPLC、放射测 定、凝结测定、表49的测定、或本领域中已知或如本文所述的其它 方法测定蛋白质，随后对数据进行标准计算以获得半衰期和其它PK 参数。
在一个实施方案中，根据为维持止血所需的剂量方案，施用相较 于未连接于XTEN的相应FVIII，小约2倍、或小约3倍、或小约4 倍、或小约5倍、或小约6倍、或小约8倍、或小约10倍或更多的 较小IU量的融合蛋白，且所述融合蛋白实现与为维持止血所需的相 应IU量的未连接于XTEN的FVIII类似的曲线下面积。在另一实施 方案中，对于甲型血友病受试者的常规防治而言，CFXTEN融合蛋白 或包含CFXTEN的药物组合物需要的施用频率较小，其中约每4天、 约每7天、约每10天、约每14天、约每21天、或约每月向受试者 施用融合蛋白的剂量，且所述融合蛋白实现与未连接于XTEN且向 受试者施用的相应FVIII类似的曲线下面积。在其它实施方案中，根 据为维持血液浓度0.1IU/ml所需的剂量方案，向受试者施用相较于 相应IU量的未连接于XTEN的FVIII小约5％、或约10％、或约20％、 或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％ 的累积较小IU量的融合蛋白，然而所述融合蛋白实现至少与未连接 于XTEN的相应FVIII类似的曲线下面积。累积较小IU量持续至少 约1周、或约14天、或约21天、或约1个月的时期被测量到。
在一方面，本发明提供被设计来降低由FVIII结合剂结合，由此 增加向受试者施用的CFXTEN的终末半衰期，同时仍然保留促凝血 活性的CFXTEN组合物。据信本发明的CFXTEN具有相比较而言较 高和/或持续活性，所述活性是通过向FVIII凝血因子中添加非结构化 XTEN以降低分子的主动清除来实现。自循环移除FVIII的清除机制 尚待充分阐明。凝血蛋白的摄取、消除和失活可发生在循环系统中以 及血管外间隙中。凝血因子是与许多其它蛋白质、脂质和受体相互作 用的复合蛋白质，且这些相互作用中的许多可有助于CF自循环消除。 蛋白质血管性血友病因子是结合FVIII的FVIII结合剂的一个实例。 因子VIII和血管性血友病因子(VWF)以紧密非共价连接的复合物形 式在血液中循环，其中VWF充当可能有助于保护FVIII免遭主动裂 解机制的载体，但然而会对FVIII的终末半衰期产生限制。举例来说： (i)VWF使FVIII的异二聚结构稳定；(ii)VWF保护FVIII免遭由磷脂 结合蛋白酶(如活化的蛋白质C和活化的FX(FXa))的蛋白水解降解； (iii)VWF干扰FVIII结合在活化的血小板内暴露的带负电荷的磷脂表 面；(iv)VWF抑制FVIII结合活化的FIX(FIXa)，由此拒绝FVIII进 入FX活化复合物；以及(v)VWF阻止细胞摄取FVIII(Lenting,P.J.等, J Thrombosis and Haemostasis(2007)5(7):1353-1360)。此外，LDL受 体相关蛋白质(LRP1，也称为α2-巨球蛋白受体或CD91)已被鉴定为 FVIII的候选清除受体，其中LRP1结合位点鉴定于FVIII的异二聚体 形式的两条链上(Lenting PJ等,.J Biol Chem(1999)274: 23734–23739；Saenko EL等,J Biol Chem(1999)274:37685–37692)。 LRP涉及于包括蛋白酶、库尼茨(Kunitz)型抑制剂、蛋白酶丝氨酸蛋 白酶抑制蛋白(serpin)复合物、脂酶和脂蛋白的多种配体的清除中 (Narita等,Blood(1998)2:555-560)。已显示因子VIII的轻链而非重链 结合表面暴露的LRP1受体蛋白质(Lentig等(J Biol Chem(1999) 274(34):23734-23739；以及美国专利号6,919,311)，此表明LRP1可在 如FVIII的蛋白质的主动清除中起主要作用。尽管VWF–FVIII相互 作用具有高亲和力(<1nM)，但然而复合物是处于动态平衡中，以使 较小但显著部分的FVIII分子(5–8％)以游离蛋白质形式循环(Leyte A 等,Biochem J(1989)257:679–683；Noe DA.Haemostasis(1996)26: 289–303)。因此，一部分天然FVIII不受VWF保护，从而允许主动 清除机制自循环移除未保护的FVIII。
在一个实施方案中，本发明提供与VWF缔合但通过在FVIII分 子内的一个或多个位置(例如，选自表5、表6、表7、表8和表9或 图8-9的位置)处并入另外两个XTEN所赋予的免遭主动清除受体的 保护作用增强的CFXTEN，其中所述XTEN干扰所得CFXTEN与那 些清除受体的相互作用，从而相较于未连接于XTEN的相应FVIII， CFXTEN的药代动力学性质得以增强。在另一实施方案中，本发明提 供与VWF的结合亲和力降低至少5％、或约10％、或约20％、或约 40％、或约50％、或约60％、或约70％，但然而被构造来具有通过在 FVIII分子内的一个或多个位置处并入XTEN所赋予的增强的免遭主 动清除受体的保护作用的CFXTEN，其中所述XTEN干扰因子VIII 与那些受体的相互作用。在前述实施方案中，相较于未连接于XTEN 的FVIII，CFXTEN具有增加的终末半衰期至少约12小时、或24小 时、或48小时、或72小时、或96小时、或120小时、或144小时、 或7天、或10天、或14天、或21天。本发明提供一种产生清除率 降低的CFXTEN的方法，其中相较于未连接于XTEN的FVIII，使用 本文所述的体外结合测定或体内药代动力学模型或本领域中已知的 其它测定，以及选择显示结合降低但保留促凝血FVIII活性的那些 CFXTEN融合蛋白评估通过多个插入产生的CFXTEN融合蛋白与清 除受体的结合所受的抑制。此外，前述融合蛋白可被最优化来具有增 加的XTEN半径比率至少2.0-3.5以实现进一步增强的药代动力学性 质。表5、表6、表7、表8和表9以及图8-9提供因子VIII序列内 的XTEN插入点的非限制性实例。使用所述插入点，本发明涵盖具 有多个插入的XTEN的构型的CFXTEN组合物，其中约100、或约 200、或约300、或约400、或约500个氨基酸分隔至少三个XTEN 以进一步增加针对主动清除机制的保护作用，且因此增加CFXTEN 的终末半衰期。在不受特定理论束缚下，预期如上所述，CFXTEN组 合物(例如包含AE家族XTEN的CFXTEN)的具有高净电荷的XTEN 与如血管、组织或各种受体的各种带负电荷表面的非特异性相互作用 较小，此将进一步有助于降低主动清除。相反，预期CFXTEN组合 物(例如包含AG家族XTEN的CFXTEN)的具有低净电荷(或不具有 净电荷)的XTEN与表面具有较高程度的相互作用，此尽管有助于主 动清除，但鉴于细胞(例如，血小板)和血管表面对凝血过程和凝血因 子活化强度的已知作用，可加强相关凝血因子的活性(Zhou,R.等, Biomaterials(2005)26(16):2965-2973；London,F.等Biochemistry (2000)39(32):9850–9858)。本发明部分地利用以下事实：由于缔合速 率降低或解离速率增加而与清除受体的结合降低的某些配体可通过 用形成无规卷曲的插入XTEN阻塞受体位点，从而导致结合降低来 实现。对CFXTEN融合蛋白的特定构型的选择可通过本文公开的方 法加以测试以确认降低与清除受体的结合程度以使主动清除速率降 低得以实现的那些构型。在一个实施方案中，CFXTEN包含具有一个 或多个插入在选自表5、表6、表7、表8和表9或图8-9的位置处的 XTEN的FVIII-XTEN序列，其中相较于未连接于XTEN的FVIII， 所述CFXTEN的终末半衰期增加至少约2倍、或至少约3倍、或至 少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少约 10倍、或至少约20倍。在另一实施方案中，CFXTEN包含具有第一 和至少第二插入在选自表5、表6、表7、表8和表9或图8-9的第一 和第二位置处的XTEN的FVIII-XTEN序列，其中相较于未连接于 XTEN的FVIII，所述CFXTEN的终末半衰期增加至少约2倍、或至 少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约 8倍、或至少约10倍、或至少约20倍。在另一实施方案中，CFXTEN 包含使用三个或更多个选自表5、表6、表7、表8和表9或图8-9 的由约100、或约200、或约300、或约400、或约500个氨基酸分隔 的XTEN插入位置来并有多个XTEN序列的FVIII-XTEN序列，其中 相较于未连接于XTEN的FVIII，所述CFXTEN的终末半衰期增加至 少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约 6倍、或至少约8倍、或至少约10倍、或至少约20倍。在上文于这 个段落中所述的前述实施方案中，并入CFXTEN构型中的XTEN可 相同或它们可不同，且可与来自表3、4和13-17的任一者的序列具 有至少约80％、或90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、 或96％、或97％、或98％、或99％序列同一性，且可任选包括一个 或多个来自表12的裂解序列，从而有助于自CFXTEN融合蛋白释放 一个或多个XTEN。
在一个实施方案中，本发明提供通过使一个或多个XTEN连接 于融合蛋白的FVIII组分来增强融合蛋白的药代动力学的CFXTEN， 其中所述融合蛋白的表观分子量因子增加至少约2倍、或至少约3倍、 或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约7倍、或至 少约8倍、或至少约10倍、或至少约12倍、或至少约15倍，且其 中相较于未连接于XTEN的相应FVIII，当向受试者施用时，所述 CFXTEN的终末半衰期增加至少约2倍、或至少约4倍、或至少约8 倍、或至少约10倍或更多。在其中至少两个XTEN分子并入CFXTEN 中的前述实施方案中，XTEN可相同或它们可具有不同的序列组成、 净电荷或长度。XTEN可与来自表3、4和13-17的任一者的序列具 有至少约80％、或90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、 或96％、或97％、或98％、或99％序列同一性，且可任选包括一个 或多个来自表12的裂解序列，从而有助于自CFXTEN融合蛋白释放 一个或多个XTEN。
因此，本发明提供CFXTEN组合物，其中融合蛋白的活性程度、 生物可用度、半衰期或物理化学特征可通过选择CFXTEN组合物中 的XTEN的类型和长度和在CFXTEN组合物中放置XTEN来定制。 因此，本发明涵盖以下组合物：其中来自表1的FVIII和来自表3、4 或13-17的任一者的XTEN或XTEN片段是例如以选自式I-VIII的任 一者的构型产生或XTEN插入在选自表5、表6、表7、表8和表9 或图8-9的位置处以使构建体具有所需性质。
本发明提供用以产生CFXTEN组合物的方法，所述CFXTEN组 合物相较于类似剂量的未连接于XTEN的相应FVIII，可维持有需要 的受试者中的FVIII组分在治疗水平下持续的时期长至少2倍、或至 少3倍、或至少4倍、或至少5倍。在所述方法的一个实施方案中， 受试者正接受常规防治以预防流血事件。在所述方法的另一实施方案 中，受试者正接受针对流血事件的治疗。在所述方法的另一实施方案 中，受试者正接受治疗以相对于正常血浆中的FVIII浓度升高促凝血 FVIII的循环血液浓度超过1％、或超过1-5％、或超过5-40％。如本 文所用的“促凝血”具有它在本领域中的一般性含义且通常是指在体 外测定中或在体内促进凝块形成的活性。用以产生可维持FVIII组分 在治疗水平下的组合物的方法包括以下步骤：选择一个或多个适于缀 合于FVIII以鉴于给定剂量和剂量方案提供所需药代动力学性质的 XTEN，产生编码呈本文公开的构型中一种的CFXTEN的基因构建 体，用包含编码基因的表达载体转化适当宿主细胞，在适合培养条件 下表达融合蛋白，回收CFXTEN，向哺乳动物施用CFXTEN，随后 进行测定以验证CFXTEN融合蛋白的药代动力学性质和活性(例如， 维持止血或充当促凝血剂的能力)以及施用的组合物的安全性。选择 展现所需性质的那些组合物以供进一步使用。通过本文提供的方法产 生的CFXTEN可通过连同其它性质一起，维持促凝血FVIII组分的 循环浓度在治疗水平下持续增加的时期而导致施用的组合物的功效 增加。
本发明提供用以测定不同组成或构型的CFXTEN融合蛋白以提 供具有所需促凝血程度以及治疗活性和药代动力学性质、以及足够安 全性分布的CFXTEN的方法。特定体外和体内测定或动物模型用于 评估各构造的CFXTEN和/或待并入CFXTEN中的FVIII组分的活性 和功能特征，包括但不限于实施例的测定、表49的那些测定、以及 以下测定或本领域中已知的用于测定FVIII的性质和作用的其它所述 测定。可进行允许测定凝血活性的功能性测定，如尤其单级凝结测定 和两级凝结测定(Barrowcliffe TW,Semin Thromb Hemost.(2002) 28(3):247-256)、活化的部分凝血酶原(aPTT)测定(Belaaouaj AA等,J. Biol.Chem.(2000)275:27123-8；Diaz-Collier JA.Haemost(1994) 71:339-46)、显色FVIII测定(Lethagen,S.等,Scandinavian J Haematology(1986)37:448-453)、或动物模型药力学测定，包括流血 时间或血栓弹力描记术(TEG或ROTEM)。其它测定包括使用结合或 竞争性结合测定来测定CFXTEN对靶标底物的结合亲和力，所述测 定如用芯片结合的受体或结合蛋白的Biacore测定或ELISA测定(如 美国专利5,534,617中所述)、本文实施例中所述的测定、放射受体测 定或本领域中已知的其它测定。用以测定FVIII抑制剂与CFXTEN 的结合的其它测定包括毕提斯达测定或奈美根改进形式的毕提斯达 测定。前述测定也可用于评估FVIII序列变体(以单一组分形式或以 CFXTEN融合蛋白形式加以测定)且可与天然FVIII进行比较以确定 它们是否与天然CF或其某一部分具有相同促凝血活性程度以使它们 适于包括在CFXTEN中；例如相较于天然FVIII，活性是至少约10％、 或至少约20$、或约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约 60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％。
剂量最优化对于所有药物都是重要的。CFXTEN的治疗有效剂量 或量根据如个体的疾病病况、年龄、性别和重量、以及施用的融合蛋 白在个体中引发所需反应的能力的因素而变化。举例来说，FVIII用 于呈现有不同流血病状或异常临床参数(例如，中和抗体)的所有患者 的标准化单次剂量可能不总是有效的。已经历受手术或具有高效价的 FVIII抑制性抗体的具有创伤的甲型血友病患者通常将需要较高剂量 和更频繁给药。通常，在与各患者的流血事件的严重性和持续时间一 致下在频率、持续时间和单位方面调整剂量水平。因此，CFXTEN是 以足以向患者递送治疗有效量的融合蛋白以终止流血的量(如通过标 准凝结测定所测量)包括在药学上可接受的载体、递送载体或稳定剂 中。考虑这些因素完全属于普通熟练临床医师的知识范围以达成相对 于将导致不足效能以使流血的临床改进或遏止得不到实现的那个量， 确定CFXTEN的治疗或药理学有效量和适当给药时程的目的。
本发明提供用以确定本发明的CFXTEN药物组合物的剂量方案 的方法。所述方法包括使用剂量之间的可变时期施用连续多剂治疗有 效量的CFXTEN药物组合物以确定足以实现和/或维持所需参数、血 液水平或临床作用的给药间隔；在有效间隔下的所述连续多剂治疗有 效量确定CFXTEN用于因子VIII相关疾病病况或病状的治疗有效剂 量方案。防治有效量是指CFXTEN的为预防生理或临床结果或事件 所必需的时期所需的量；所述结果或事件例如流血事件延迟发作或维 持促凝血FVIII或等效物的血液浓度高于阈值水平(例如，正常值的 1-5％至5-40％)。在治疗方法中，向受试者施用的CFXTEN的剂量在 用于受试者的每剂约5至300IU/kg、或约10至100IU/kg、或约20 至约65IU/kg、或约20至约40IU/kg的范围内。适合剂量也可取决 于可影响对药物的反应的其它因素；例如，相较于防治，流血事件通 常需要在更频繁间隔下的较高剂量。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量 的包含CFXTEN融合蛋白组合物和至少一种药学上可接受的载体的 药物组合物，其中相较于通过施用包含未连接于XTEN的FVIII且在 类似剂量下施用的药物组合物介导的对参数、病状或临床结果的作 用，所述施用导致至少一个与FVIII缺乏或凝血病变相关的参数或生 理病状得以较大改进，或产生由CFXTEN的FVIII组分介导的更有 利临床结果。改进的参数的非限制性实例包括促凝血FVIII的血液浓 度、活化的部分凝血酶原(aPTT)测定时间减少、单级或两级凝结测定 时间减少、流血事件的发作延迟、显色FVIII测定时间减少、流血时 间减少、流血事件解决、或相对于天然FVIII，针对CFXTEN的毕提 斯达效价降低。在一个前述实施方案中，改进是通过在实现促凝血 FVIII(或等效物)的循环浓度高于阈值水平(例如，正常FVIII水平的 1-5％至5-40％)的剂量下施用CFXTEN药物组合物，由此产生治疗有 效剂量来实现。在另一前述实施方案中，改进是通过使用维持促凝血 FVIII(或等效物)的循环浓度高于阈值水平(例如，正常FVIII水平的 1-5％至5-40％)持续给药时期的时长的治疗有效剂量方案，施用连续 多剂CFXTEN药物组合物来实现。在所述方法的另一实施方案中， 使用维持促凝血FVIII(或等效物)的循环浓度高于正常FVIII水平的约 1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％或40％持续以下时 期的治疗有效剂量方案施用至少连续两剂CFXTEN药物组合物：相 较于未连接于XTEN且使用治疗有效剂量方案施用的FVIII，长至少 约3倍；或者长至少约4倍；或者长至少约5倍；或者长至少约6倍； 或者长至少约7倍；或者长至少约8倍；或者长至少约9倍或长至少 约10倍。
在一个实施方案中，相较于未连接于XTEN且在类似剂量方案 下向受试者施用的融合蛋白的相应生物活性蛋白质，在治疗有效剂量 方案下施用的CFXTEN或包含CFXTEN的药物组合物导致融合蛋白 的血液水平的至少两个连续Cmax峰值和/或Cmin谷底值之间的时间增 加长至少约3倍；或者长至少约4倍；或者长至少约5倍；或者长至 少约6倍；或者长至少约7倍；或者长至少约8倍；或者长至少约9 倍或长至少约10倍。在另一实施方案中，相较于未连接于XTEN且 使用FVIII的治疗有效剂量方案向受试者施用的相应生物活性蛋白质 组分，使用较小频率给药或以IU计的较低总剂量的药物组合物的融 合蛋白，在治疗有效剂量方案下施用的CFXTEN导致一个、或两个、 或三个或更多个测量参数类似改进。测量参数包括本文公开的临床、 生物化学或生理参数的任一者，或本领域中已知的用于评估患有因子 VIII相关病状的受试者的其它参数。
(b)CFXTEN的药理学和医药性质
本发明提供包含共价连接于XTEN的FVIII的CFXTEN组合物， 其相较于未连接于XTEN的FVIII具有增强的医药和药理学性质，以 及提供用以增强组合物的FVIII组分的治疗和/或促凝血作用的方法。 此外，本发明提供相较于含有白蛋白、免疫球蛋白多肽配偶体、长度 较短的多肽和/或具有重复序列的多肽配偶体的因子VIII的那些本领 域已知融合蛋白，具有增强的性质的CFXTEN组合物。此外，CFXTEN 融合蛋白提供超过化学缀合物(如FVIII的聚乙二醇化构建体)的显著 优势，值得注意的是以下事实：重组CFXTEN融合蛋白可在宿主细 胞表达系统中制备，相较于聚乙二醇化缀合物，此可降低在产物的研 究和开发阶段与制造阶段两者的时间和成本，以及产生来自CFXTEN 的产物与代谢物两者的毒性较小的更均质确定产物。
作为治疗剂，CFXTEN具有超过不包含XTEN的治疗剂的许多 优势，包括一种或多种以下非限制性性质：溶解度增加、热稳定性增 加、免疫原性降低、表观分子量增加、肾清除率降低、蛋白水解降低、 代谢降低、治疗效率增强、随着能够维持患有甲型血友病的受试者的 止血的剂量之间的时间增加而使剂量方案的频率较小、能够皮下或肌 肉内施用CFXTEN组合物、当皮下或肌肉内施用时“定制”的吸收速 率、冻干稳定性增强、血清/血浆稳定性增强、终末半衰期增加、在 血流中的溶解度增加、由中和抗体的结合降低、主动清除降低、定制 的底物结合亲和力、对降解稳定、对冷冻-融化稳定性、对蛋白酶稳 定、对泛素化稳定、施用简易、可与其它医药赋形剂或载体相容、在 受试者中持久、储存稳定性增加(例如，保存期限增加)等。性质增强 的净作用是相较于未连接于XTEN的FVIII，使用CFXTEN组合物可 导致治疗作用总体增强，产生与给药频率较小相关的经济效益，和/ 或当向患有因子VIII相关病状的受试者施用时导致患者顺应性改善。
本发明提供CFXTEN组合物和包含CFXTEN的药物组合物，其 中施用组合物导致本文公开为适用于评估受试者疾病、病状或病症的 临床或生物化学参数的至少一者改进。改进的参数的非限制性实例包 括促凝血FVIII的血液浓度、活化的部分凝血酶原(aPTT)测定时间减 少、单级或两级凝结测定时间减少、流血事件的发作延迟、显色FVIII 测定时间减少、流血时间减少、流血事件解决、或相对于天然FVIII， 针对CFXTEN的毕提斯达效价降低。主题CFXTEN的药代动力学性 质增强允许相较于未连接于XTEN的相应FVIII组分，使用累积较低 IU剂量的融合蛋白来维持参数。在一个实施方案中，相较于未连接 于XTEN的相应FVIII组分，实施方案的CFXTEN的以IU计的为实 现和维持至少一个参数持续约2-7天改进所需的总剂量低至少约3 倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、 或低至少约10倍。在另一实施方案中，相较于未连接于XTEN的相 应FVIII组分，主题CFXTEN的以IU计的为历经连续两剂、三剂或 四剂实现和维持至少一个参数改进所需的总剂量低至少约3倍、或至 少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或低至少 约10倍。或者，本发明提供CFXTEN的某些实施方案，其中相较于 未连接于XTEN且在类似IU剂量下施用的相应FVIII组分，导致实 现和维持至少一个参数改进的连续使用之间的时期长至少约3倍、或 至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍、或至少约8倍、或至少 约10倍。或者，本发明提供CFXTEN的某些实施方案，其中当在施 用之后约2-7天测定时，相较于25IU/kg未连接于XTEN的相应 FVIII，施用25IU/kg导致甲型血友病受试者中的aPTT测定(或类似 凝血测定)时间改进30％。在另一实施方案中，本发明提供CFXTEN， 其中当在施用之后约2-7天测定时，相较于25IU/kg未连接于XTEN 的相应FVIII，施用25IU/kg导致甲型血友病受试者中的流血时间测 定时间改进30％。
在一个实施方案中，作为融合配偶体的XTEN增加FVIII有效负 载的溶解度。因此，当增强FVIII的医药或物理化学性质(如水溶性或 稳定性程度)合乎需要时，可各自选择并入融合蛋白中的XTEN序列 的长度和/或基序家族组成以对相应融合蛋白赋予不同溶解性和/或稳 定性程度以使CFXTEN组合物的总体医药性质得以增强。可使用本 文所述的方法构建和测定CFXTEN融合蛋白以确认XTEN长度序列 的物理化学性质和选择或视需要调整的位置以产生所需性质。在一个 实施方案中，相较于未连接于XTEN的FVIII，CFXTEN的水溶性大 至少约25％，或大于未连接于XTEN的相应FVIII至少约30％、或至 少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约100％、或至少 约200％、或至少约300％、或至少约400％、或至少约500％、或至 少约1000％。
本发明提供用以自宿主细胞产生和回收表达的CFXTEN的方法， 所述CFXTEN相较于未连接于XTEN的FVIII具有增强的溶解度和 回收简易性。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：用编码具 有一个或多个累积序列长度大于约100、或大于约200、或大于约400、 或大于约600、或大于约800、或大于约1000、或大于约2000、或大 于约3000个氨基酸残基的XTEN组分的CFXTEN的多核苷酸转化真 核宿主细胞，在适合培养和诱导条件下在所述宿主细胞中表达 CFXTEN融合蛋白，以及以可溶性形式回收表达的融合蛋白。在一个 实施方案中，相较于一个或多个选自表4和13-17的任一者的XTEN 或其片段，CFXTEN融合蛋白的一个或多个XTEN各自具有至少约 80％序列同一性、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或 约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％或约99％至约 100％序列同一性，且相较于选自表1的FVIII，FVIII具有至少约80％ 序列同一性、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、 或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％、或100％序 列同一性，且CFXTEN组分是呈选自本文公开的任一构型实施方案 的N末端至C末端构型。
VI).CFXTEN组合物的用途
本发明提供用于通过施用包含CFXTEN的组合物来在因子VIII 相关病状中实现有益作用的方法和方案。如本文所用，“因子VIII相 关病状”意图包括但不限于因子VIII缺乏症、与因子VIII缺乏相关的 流血病症、甲型血友病、由抗FVIII抗体或其它因子VIII抑制剂中和 因子VIII、以及由创伤或手术或血管损伤引起的流血事件和可通过向 受试者施用FVIII来改善或纠正的其它此类病状。本发明方法在解决 使用具有相对短暂终末半衰期，需要频繁施用，由抑制剂中和或具有 不利药物经济学的因子VIII制剂的其它治疗方法的缺点和/或限制时 实现有益作用。
止血由多个蛋白质因子调控，且已发现所述蛋白质以及其类似物 在治疗因子VIII相关病状方面具有效用。然而，在管理为所述病状 所烦扰的受试者方面，可商购获得的FVIII的使用已遭遇未达到最优 的成功。具体来说，给药的剂量最优化和频率对于FVIII用于为止血 所需的维持循环FVIII浓度高于阈值水平以及治疗或预防甲型血友病 受试者的流血事件而言是重要的。可商购获得的FVIII产品具有短暂 半衰期的事实使得必须频繁给药以实现临床益处，此导致难以管理所 述患者。
如由国际血栓形成和止血学会的科学和标准化委员会的因子 VIII和因子IX附属委员会所确定(于2000年11月29日在ISTH网站 上公布)，甲型血友病的最广泛使用的严重性量度标准是通过测定血 浆FVIII促凝血水平的循环浓度来确定，其中因子VIII<1％(<0.01 IU/ml)的人士确定为重度；1-5％(0.01-0.05IU/ml)确定为中等重度； 且>5-40％(0.05-<0.40IU/ml)确定为轻度，其中正常值是1IU/ml因子 VIIIC(100％)。
本发明提供治疗罹患因子VIII相关病状或处于发展因子VIII相 关病状的风险下的受试者的方法。更具体来说，本发明提供用于治疗 或预防控制受试者的流血的方法。受试者可为任何动物，但优选是人。 在一个实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用凝血有效量 的CFXTEN组合物。在另一实施方案中，所述方法包括以下步骤： 向流血的受试者施用凝血有效量的包含CFXTEN的药物组合物，其 中所述施用导致流血遏止或减弱。如本文所用，“凝血有效量”是当向 受试者施用时，FVIII组合物足以实现止血或其它有益或所需治疗(包 括预防)结果的量。在实施本发明时，应了解凝血有效量可以一次或 多次施用加以施用。待施用的药物组合物的准确凝血有效量将由从业 者的判断来指导，然而，单位剂量将通常取决于流血的严重性或原因 以及受试者中预先存在的FVIII的量。在治疗流血的方法的一特定实 施方案中，向遭受流血事件的受试者施用凝血有效量的包含CFXTEN 的药物组合物，其中相较于未连接于XTEN且在类似剂量下向具有 类似流血的类似受试者施用的FVIII，所述施用导致流血解决的持续 时间长至少2倍、或至少3倍、或至少4倍。
在另一实施方案中，当在施用之后2天与7天之间测量时，相较 于未连接于XTEN的FVIII，向患有因子VIII相关病状的受试者施用 凝血有效量的CFXTEN组合物导致一个或多个与所述FVIII病状相 关的生物化学、生理或临床参数改进10％、或20％、或30％、或40％、 或50％、或60％、或70％或更多。在另一实施方案中，相较于由未 连接于XTEN且在类似剂量下施用的FVIII实现的时期，向有需要的 受试者施用凝血有效量的CFXTEN组合物导致一个或多个与所述 FVIII病状相关的生物化学、生理或临床参数改进持续的时期长至少 2倍、或长至少4倍、或长至少5倍、或长至少6倍。持续较长持续 时间改进的参数的非限制性实例包括促凝血FVIII的血液浓度、活化 的部分凝血酶原(aPTT)测定时间减少、单级或两级凝结测定时间减 少、流血事件的发作延迟、显色FVIII测定时间减少、流血时间减少 以及本领域中已知的其它FVIII相关参数。在段落的前述实施方案中， 施用的CFXTEN包含与表1的因子VIII具有至少约80％、或至少约 90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性的 FVIII以及一个或多个与表4的XTEN具有至少约80％、或至少约 90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性的 XTEN序列，所述XTEN序列在一个或多个选自表5、表6、表7、 表8和表9或如图8-9中所描绘的位置处插入所述FVIII中。在某些 实施方案中，CFXTEN的至少一个XTEN插入位点选自氨基酸32、 220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905 和1910(相对于成熟天然人FVIII加以编号)。
在治疗方法的一特定实施方案中，向罹患甲型血友病的受试者施 用的CFXTEN融合蛋白的凝血有效量足以使循环FVIII促凝血浓度 增加至大于0.05IU/ml且维持止血持续至少约24小时、或至少约48 小时、或至少约72小时、或至少约96小时、或至少约120小时、或 至少约144小时、或至少约168小时或更长。在另一实施方案中，相 较于在施用类似量的未连接于XTEN的相应FVIII之后于受试者中的 测定时间，向有需要的受试者施用凝血有效量的包含CFXTEN的药 物组合物导致在施用之后2-7天，来自所述受试者的血液样本的单级 凝结测定时间较大降低至少约5％、或约10％、或约20％、或约30％、 或约40％、或约50％、或约60％、或约70％或更多。在另一实施方 案中，相较于在施用类似量的未连接于XTEN的相应FVIII之后于受 试者中的活化的部分凝血酶原时间，向有需要的受试者施用治疗有效 量的CFXTEN或包含CFXTEN的药物组合物导致在施用之后2-7天， 来自所述受试者的血液样本的活化的部分凝血酶原时间较大降低至 少约5％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、 或约60％、或约70％或更多。在另一实施方案中，相较于未连接于 XTEN且使用类似剂量向受试者施用的FVIII的时期，使用治疗有效 量向有需要的受试者施用CFXTEN或包含CFXTEN的药物组合物导 致维持来自所述受试者的血液样本的活化的部分凝血酶原时间在正 常值的30％内持续的时期长至少2倍、或至少约3倍、或至少约4 倍。
在治疗方法的一个实施方案中，CFXTEN融合蛋白是以包含 CFXTEN与药学上可接受的赋形剂的混合物的药物组合物形式配制 和施用。用于制备医药制剂的方法在本领域中是熟知的。技术和制剂 通常可见于Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.1990中(也参见Wang和Hanson,Parenteral Formulations of Proteins and Peptides:Stability and Stabilizers,Journal of Parenteral Science and Technology,Technical Report第10期,增刊 42-2S(1988))。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗甲型血友病患者的方案， 所述方案包括包含CFXTEN融合蛋白的组合物。在用于治疗甲型血 友病患者的方案的一个实施方案中，所述方案进一步包括确定为在患 者中实现止血所需的包含CFXTEN的药物组合物的量的步骤。在方 案的一些实施方案中，相较于在另外相同剂量方案下的未连接于 XTEN的相应凝血因子，向有需要的受试者施用小约2倍、或小约3 倍、或小约4倍、或小约5倍、或小约6倍、或小约8倍、或小约 10倍的较小IU量的包含CFXTEN的药物组合物，且融合蛋白实现 与未连接于XTEN的相应FVIII类似的曲线下面积(以IU/ml计)和/或 类似的治疗作用；(ii)相较于在另外相同剂量量下的未连接于XTEN 的相应FVIII，药物组合物是以较小频率(例如每3天、约每7天、约 每10天、约每14天、约每21天、或约每月)施用，且融合蛋白实现 与未连接于XTEN的相应凝血因子类似的曲线下面积和/或类似的治 疗作用；或(iii)相较于在另外相同剂量时程下的未连接于XTEN的相 应FVIII，施用小于至少约20％、或约30％、或约40％、或约50％、 或约60％、或约70％、或约80％、或约90％的累积较小IU量的药物 组合物且CFXTEN融合蛋白实现与未连接于XTEN的相应FVIII类 似的治疗作用。累积较小IU量持续至少约1周、或约14天、或约 21天、或约1个月的时期被测量到。在前述实施方案中，治疗作用 可由本文所述的任何测量参数来确定，所述参数包括但不限于促凝血 FVIII的血液浓度、活化的部分凝血酶原(aPTT)测定时间减少、单级 或两级凝结测定时间减少、流血事件的发作延迟、显色FVIII测定时 间减少、流血时间减少、流血事件解决、或相对于天然FVIII，针对 CFXTEN的毕提斯达效价降低、纤维蛋白原水平、或本领域中已知的 用于评估FVIII的凝血病变的其它测定值。在另一实施方案中，本发 明提供用于治疗甲型血友病受试者的方案中的CFXTEN，所述方案包 括在有效量下以连续两剂或更多剂向受试者施用CFXTEN组合物， 其中相较于未连接于XTEN且使用类似剂量施用的FVIII，所述施用 导致至少一个、两个或三个与疾病相关的参数较大改进至少10％、或 20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％。
在一方面，本发明涉及一种预防或治疗具有预先存在的针对 FVIII的抑制剂的患者，任选甲型血友病患者的流血的方法。针对 FVIII的抑制性抗体通常在血友病患者中产生，其中产生抑制剂的总 体发生率是15-30％，特别是在大量暴露于FVIII浓缩物的血友病患 者中(Algiman等Natural antibodies to factor VIII(anti-hemophilic factor)in healthy individuals.PNAS USA(1992)89:3795-3799)。然而， 抑制性抗体也存在于患有自体免疫病症、恶性肿瘤(如淋巴组织增生 病症、淋巴瘤和实体肿瘤)、处于妊娠期间以及处于分娩后状态下的 患者中。抑制也可发生在抗体干扰FVIII结合FIX和FX时。同时或 或者，抗FVIII抗体可干扰血管性血友病因子和/或磷脂结合FVIII， 从而影响FVIII的凝血作用和/或半衰期。常首先与如容易瘀血和流血 不受控制的症状一起检测到抑制性抗体的存在，且通常称为获得性血 友病。可通过包括在凝血测定中定量抗FVIII活性、针对FVIII抑制 剂的ELISA以及使用色谱和免疫吸附进行纯化的不同方法测定抗 FVIII抗体(Algiman等,1992)。因此，本发明方法用于治疗或预防与 存在针对FVIII的抑制性抗体相关或特征在于存在针对FVIII的抑制 性抗体的任何病状。在一个实施方案中，本发明提供一种治疗具有预 先存在的针对FVIII的抑制剂的患者的方法，所述方法包括向患者施 用必须施用以实现止血的凝血有效量的CFXTEN融合蛋白的步骤， 其中相较于未连接于XTEN的FVIII(或天然FVIII)的必须施用以实现 止血的量，施用的融合蛋白的所述凝血有效量降低。在所述方法中， 相较于未连接于XTEN的相应FVIII，以IU/kg计，CFXTEN的降低 的量是小约2倍、或3倍、或4倍、或5倍。在所述方法的另一实施 方案中，相较于为实现止血所需的未连接于XTEN的相应FVIII或天 然FVIII，CFXTEN的以用以实现止血的剂量施用的量小至少20至 40IU/kg、或30至60IU/kg、或40至80IU/kg、或60至100IU/kg、 或100至140IU/kg、或120至180IU/kg、或140至200IU/kg。在另 一实施方案中，本发明提供一种处理针对未连接于XTEN的FVIII的 效价是至少10、或20、或30、或40、或50、或75、或100、或150、 或200个或200个以上毕提斯达单位的甲型血友病受试者的流血事件 的方法，其中相较于未连接于XTEN的FVIII(或天然FVIII)的必须施 用以在类似受试者中实现止血的量，CFXTEN融合蛋白的为遏止所述 流血事件所需的剂量小至少2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍、 或7倍、或8倍、或9倍、或10倍。本领域技术人员将了解，施用 以维持止血的促凝血剂的量将取决于FVIII缺乏的严重性和/或流血 的频率或持续时间。
本发明的一特定目标涉及由结合因子VIII的A2和/或C2结构域 的FVIII抑制剂的结合降低的CFXTEN作为药物的用途。所述药物 有利地用于在罹患血友病的患者中维持止血，其中所述患者具有针对 因子VIII的A2结构域和/或C2结构域的循环FVIII抑制剂。在一个 实施方案中，本发明提供一种治疗方法，所述方法包括向具有A2结 构域结合抑制剂的患者施用凝血有效量的CFXTEN融合蛋白的步骤， 其中相较于未连接于XTEN的FVIII或天然FVIII，CFXTEN展现至 少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或 80％或更低与结合FVIII的A2结构域的抑制剂的结合，且其中所述 施用导致止血。在另一实施方案中，本发明提供一种治疗方法，所述 方法包括向具有C2结构域结合抑制剂的患者施用凝血有效量的 CFXTEN融合蛋白的步骤，其中相较于未连接于XTEN的FVIII或天 然FVIII，CFXTEN展现至少10％、或20％、或30％、或40％、或 50％、或60％、或70％、或80％或更低与结合FVIII的C2结构域的 抑制剂的结合，且其中所述施用导致止血。可通过检测FVIII抑制剂 的ELISA直接测定主题CFXTEN的结合降低，或通过证明在如通过 如本文所述的因子VIII显色测试或一步测定或本领域中已知的其它 适合凝血方法测量的抑制剂存在下，相较于天然FVIII，对CFXTEN 的FVIII活性的抑制降低来间接测量主题CFXTEN的结合降低。或 者，可通过使用改进毕提斯达测定，在已知抑制剂存在下测量对主题 CFXTEN的抑制降低(或不存在抑制)。根据本发明的一特定方面，适 用于方法中的CFXTEN与来自表10的一种或多种抗体以及见于血友 病患者中的天然存在的抗体的反应性降低。出于测试目的，所述抑制 性抗体和其它抑制性抗体可自人(即自具有抑制性抗体的患者的血清) 获得或可通过用FVIII或其片段，更具体来说用包含全部或部分A2 或C2结构域的片段(无论呈多克隆或单克隆形式)免疫来自小鼠、天 竺鼠、马、山羊、非人灵长类动物和其它哺乳动物获得。
本发明进一步涵盖根据本文提供的方法使用的CFXTEN可连同 适用于治疗因子VIII相关病状或凝血因子是其辅助疗法的病状；例 如归因于损伤或手术的流血事件的其它治疗方法和组合物(例如，其 它凝血蛋白质)一起施用。
在另一方面，本发明提供制备用于因子VIII相关病状的药物的 方法，其包括组合选自表1的因子VIII序列与一个或多个选自表4 的插入一个或多个选自表5、表6、表7、表8和表9的插入位点中 的XTEN以产生保留天然FVIII的至少一部分活性的药物。本发明提 供一种制备药物组合物的方法，其包括组合前述实施方案的药物与至 少一种药学上可接受的载体的步骤。在制备用于因子VIII相关病状 的药物的方法的一个实施方案中，因子VIII具有相较于选自表1的 序列，具有至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约 97％、或至少约99％序列同一性的序列，且一个或多个XTEN具有相 较于选自表3、4和13-17的任一者的序列或其片段，具有至少约80％、 或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约99％序列 同一性的序列，其中所述一个或多个XTEN插入一个或多个选自表5、 表6、表7、表8和表9的位置中。在一特定前述实施方案中，至少 一个XTEN插入位点选自氨基酸32、220、224、336、339、390、399、 416、603、1656、1711、1725、1905和1910(相对于成熟天然人FVIII 加以编号)。在所述方法的另一实施方案中，CFXTEN包含相较于选 自表21的任一者的序列具有至少约80％、或至少约90％、或至少约 95％、或至少约97％、或至少约99％序列同一性的序列。
在另一方面，本发明提供一种用以实现所需药代动力学、药理学 或医药性质的制备CFXTEN组合物的方法。一般来说，如图11-13 中所说明，设计和产生本发明融合蛋白组合物的步骤包括：(1)选择 用以治疗特定病状的FVIII(例如。天然蛋白质、表1的序列、具有活 性的类似物或衍生物)；(2)选择一个或多个将对所得CFXTEN赋予所 需药代动力学和物理化学特征的XTEN(例如，与表4中阐述的序列 具有至少80％一致性的序列)(例如，相较于未连接于XTEN的FVIII， 向受试者施用CFXTEN组合物导致融合蛋白维持在0.05-0.4IU/ml以 上持续较长时期)；(3)确定CFXTEN的所需N末端至C末端构型以 实现所需功效或PK参数(例如，选择一个或多个来自表5、表6、表 7、表8和表9的插入位点)；(4)确定编码构造的CFXTEN的表达载 体的设计；(5)用所述表达载体转化适合宿主；以及(6)表达和回收所 得分离的CFXTEN融合蛋白。在制备CFXTEN的方法的一个实施方 案中，通过应用等式IV评估用于插入的XTEN以使融合蛋白构建体 的XTEN半径比率最大，其中产生大于2.0、或2.1、或2.2、或2.3、 或2.4、或2.5、或2.6、或2.7、或2.8、或2.9、或3.0的值的XTEN 是优选的。对于需要半衰期增加或在最小凝血有效浓度以上花费的时 期增加的那些CFXTEN，选择用于并入的XTEN通常具有至少约144、 或约288、或约432、或约576、或约864、或约875、或约912、或 约923个氨基酸残基，其中单一XTEN将并入CFXTEN中。在另一 实施方案中，CFXTEN包含前述长度的第一XTEN，以及约36、或 约42、或约72、或约144、或约288、或约576、或约864、或约875、 或约912、或约923、或约1000个或更多个氨基酸残基的至少第二 XTEN。XTEN在融合蛋白内的位置可包括一个、两个、三个、四个、 五个或更多个选自表5、表6、表7、表8和表9或图8-9的位置。在 一个实施方案中，设计方法包括将XTEN插入FVIII中的至少一个选 自氨基酸32、220、224、336、339、390、399、416、603、1656、 1711、1725、1905和1910(相对于成熟天然人FVIII加以编号)的位点。
在另一方面，本发明提供用以相较于天然FVIII，改进制造简易 性，导致稳定性增加、水溶性增加和/或容易配制的制备CFXTEN组 合物的方法。在一个实施方案中，本发明包括一种增加FVIII的水溶 性的方法，其包括在一个、两个、三个、四个、五个或更多个选自表 5、表6、表7、表8和表9或图8-9的位置处使与来自表1的序列具 有至少约80％、或约90％、或约95％同一性的所述FVIII连接于一个 或多个XTEN的步骤，其中所述XTEN是相较于来自表3、4和13-17 的任一者的序列具有至少约80％、或约90％、或约95％序列同一性 的序列以使相较于处于未融合状态的FVIII，可在生理条件下实现呈 可溶性形式的所得CFXTEN的较高浓度。在一特定实施方案中， CFXTEN包含连接于两个、三个、四个或五个具有至少约24、或约 36、或约48、或约60、或约72、或约84、或约96、或约144、或约 288个氨基酸残基的插入在选自表5、表6、表7、表8和表9或图 8-9的位点处的XTEN的FVIII，其中在生理条件下，融合蛋白的溶 解度比未连接于XTEN的相应FVIII大至少3倍，或者比未连接于 XTEN的FVIII大至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或 9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少50倍、或 至少60倍或更大。当并入融合蛋白中时，有助于XTEN赋予CF的 水溶性增加的性质的因素包括XTEN融合配偶体的溶解度较高和在 溶液中在XTEN的分子之间的自聚集的程度较低，以及使其中插有 XTEN的FVIII外部环的亲水性扩大。在一些实施方案中，所述方法 产生一种CFXTEN融合蛋白，其中相较于未融合FVIII，在生理条件 下，水溶性大至少约20％、或至少约30％、或至少约50％、或至少 约75％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约150％、或至少 约200％、或至少约400％、或至少约600％、或至少约800％、或至 少约1000％、或至少约2000％。在一个实施方案中，CFXTEN融合 蛋白的XTEN是相较于来自表3、4和13-17的任一者的序列具有至 少约80％、或约90％、或约95％序列同一性的序列。在另一实施方 案中，本发明包括一种增加FVIII的保存期限的方法，其包括在一个 或多个选自表5、表6、表7、表8和表9的位点处使所述FVIII与一 个或多个XTEN连接的步骤，其中相较于处于未融合状态的FVIII， 所得CFXTEN的保存期限得以延长。如本文所用，保存期限是指呈 溶液、冻干、或某一其它储存制剂形式的FVIII或CFXTEN的促凝 血活性保持稳定而不过度损失活性或保持在对于药物组合物确定的 发布规格内所历经的时期。相较于保持溶解的FVIII，降解或聚集的 FVIII通常具有降低的功能活性或降低的生物可用度。当并入融合蛋 白中时，有助于所述方法延长FVIII的储存期限的能力的因素包括水 溶性增加、在溶液中的自聚集降低、以及XTEN融合配偶体的热稳 定性增加。具体来说，XTEN聚集的倾向较低有助于配制含有较高药 物浓度的CF的药物制剂的方法，且XTEN的热稳定性有助于 CFXTEN融合蛋白持续延长时期保持可溶和功能活性的性质。所述方 法产生具有伸长或延长的保存期限的CFXTEN融合蛋白，其相对于 已经受相同储存和处理条件的FVIII标准物展现较大活性。标准物可 为未融合全长FVIII或可商购获得的FVIII药物组合物。在一个实施 方案中，所述方法包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起配制 分离的CFXTEN的步骤，所述赋形剂增强XTEN保留它的非结构化 构象的能力以及对于CFXTEN而言，增强CFXTEN在制剂中保持可 溶持续的时间大于相应未融合FVIII的时间的能力。在一个实施方案 中，所述方法包括使选自表1的FVIII连接于一个或多个选自表3、4 和13-17的任一者的插入在一个或多个选自表5、表6、表7、表8 和表9的位点处的XTEN以及与至少一种药学上可接受的赋形剂混 合以产生药物组合物，当在至少90天、或至少6个月、或至少12个 月的时间点下比较时，所述药物组合物保留经受相同储存和处理条件 的FVIII标准物的大于约100％促凝血活性、或大于约105％、110％、 120％、130％、150％或200％促凝血活性。也可关于在储存之后剩余 的相对于储存开始时的功能活性标准化的功能活性评估保存期限。在 一些实施方案中，当在各种温度条件下持续多达2周、或4周、或6 周、或6周以上的相同时期经受相同条件时，本发明的CFXTEN药 物组合物保留FVIII标准物的多约50％促凝血活性、或多约60％、 70％、80％或90％促凝血活性。在一个实施方案中，当在80℃下加热 10分钟时，CFXTEN药物组合物保留至少约50％、或约60％、或至 少约70％、或至少约80％、且最优选至少约90％或更高它在溶液中 的原始活性。在另一实施方案中，当在37℃下加热或维持约7天时， CFXTEN药物组合物保留至少约50％、优选至少约60％、或至少约 70％、或至少约80％、或者至少约90％或更高它在溶液中的原始活性。 在另一实施方案中，在历经约1小时至约18小时的时期暴露于约30℃ 至约70℃的温度之后，CFXTEN药物组合物保留至少约80％或更高 它的功能活性。在上文于这个段落中所述的前述实施方案中，在给定 时间点下，CFXTEN药物组合物的保留活性比包含未连接于XTEN 的FVIII的相应药物组合物的保留活性大至少约2倍、或至少约3倍、 或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约6倍。
VII).本发明的核酸序列
本发明提供编码CFXTEN嵌合融合蛋白的分离的聚核酸和互补 于编码CFXTEN嵌合融合蛋白的聚核酸分子的序列，包括其同源变 体。在另一方面，本发明涵盖用以产生编码CFXTEN嵌合融合蛋白 的聚核酸和互补于编码CFXTEN嵌合融合蛋白的聚核酸分子的序列， 包括其同源变体的方法。一般来说且如图11-13中所说明，产生编码 CFXTEN融合蛋白的多核苷酸序列以及表达所得基因产物的方法包 括装配编码FVIII和XTEN的核苷酸，同框连接组分，将编码基因并 入适于宿主细胞的表达载体中，用所述表达载体转化所述适当宿主细 胞，以及在导致或允许所述融合蛋白在转化的宿主细胞中表达的条件 下培养所述宿主细胞，由此产生生物活性CFXTEN多肽，其是通过 本领域中已知的标准蛋白质纯化方法以分离的融合蛋白形式加以回 收。分子生物学中的标准重组技术用于制备本发明的多核苷酸和表达 载体。
根据本发明，编码CFXTEN的核酸序列(或它的互补序列)用于产 生指导在适当宿主细胞中表达CFXTEN融合蛋白的重组DNA分子。 出于本发明的目的，编码对应于天然人FVIII的信号肽的信号肽(编码 MQIELSTCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO:1611))的核酸可添加至本 文所述的任何编码构建体中以有助于CFXTEN融合蛋白的表达和分 泌。在一个实施方案中，核酸添加物是ATGCAAATAGAGCTCTCCA CCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID N O:1613)或其互补序列。
若干克隆策略适于执行本发明，其中许多策略用于产生包含编码 本发明的CFXTEN组合物的融合蛋白的基因或它的互补序列的构建 体。在一些实施方案中，克隆策略用于产生编码包含至少第一FVIII 和至少第一XTEN多肽的单体CFXTEN的基因或它们的互补序列。 在一个前述实施方案中，基因包含编码FVIII的序列或序列变体。在 其它实施方案中，克隆策略用于产生编码单体CFXTEN的基因，其 包含编码至少第一FVIII分子的核苷酸或它的互补序列以及编码第一 和至少第二XTEN的核苷酸或它们的互补序列，所述核苷酸或互补 序列用于转化宿主细胞以表达CFXTEN组合物的融合蛋白。在上文 于这个段落中所述的前述实施方案中，基因可进一步包含编码间隔子 序列的也编码裂解序列的核苷酸。
在设计所需XTEN序列时，发现尽管在产生XTEN编码序列时 使用“构筑嵌段”分子方法，但本发明组合物的XTEN的非重复性质也 得以实现。这是通过使用编码上述肽序列基序的多核苷酸的文库来实 现，所述多核苷酸接着加以连接和/或多聚化以产生编码XTEN序列 的基因(参见图11和12以及实施例)。因此，尽管表达的融合蛋白的 XTEN可由少至四种不同序列基序的多个单元组成，因为所述基序自 身由非重复氨基酸序列组成，所以致使总体XTEN序列是非重复的。 因此，在一个实施方案中，XTEN编码多核苷酸包含编码非重复序列 或基序的多个多核苷酸，所述多核苷酸被可操作地同框连接且其中所 得表达的XTEN氨基酸序列是非重复的。
在一种方法中，首先制备含有对应于CFXTEN融合蛋白的DNA 序列的构建体。编码组合物的FVIII的DNA是合成获得，自商业来 源获得或自使用标准方法自据信具有FVIII mRNA且在可检测水平 下表达所述FVIII mRNA的组织或分离的细胞制备的cDNA文库获 得。必要时，可使用如Sambrook等(上文)中所述的常规引物延伸程 序获得编码序列以检测mRNA的可能尚未逆转录成cDNA的前体和 加工中间体。可接着使用聚合酶链反应(PCR)方法来扩增靶标DNA 或RNA编码序列以获得足以制备含有FVIII基因的CFXTEN构建体 的材料。可接着进行测定以确认杂交全长基因是所需FVIII基因。通 过这些常规方法，DNA可自由所述来源制备的cDNA文库方便地获 得。FVIII编码基因也可使用自公开可用的数据库、专利或参考文献 获得的DNA序列，通过本领域中已知的标准合成程序(例如，使用例 如Engels等(Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-7341989))中所述的 一种方法进行的自动化核酸合成)来产生。所述程序在本领域中是熟 知的且充分描述于科学和专利文献中。举例来说，序列可根据化学文 摘服务(CAS)登记号(由美国化学学会(American Chemical Society)公 布)和/或可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网页(可在万维网上在 ncbi.nlm.nih.gov处获得)获得的GenBank登录号(例如基因座ID、 NP_XXXXX和XP_XXXXX)模型蛋白质标识符获得，所述标识符对 应于CAS登记或GenBank数据库中的含有目标蛋白质或蛋白质的片 段或变体的氨基酸序列的条目。在一个实施方案中，FVIII编码基因 编码来自表1的蛋白质序列或其片段或变体。
在表达的融合蛋白包含单一FVIII的情况下，接着将编码主题 CFXTEN蛋白的FVIII部分的基因或多核苷酸克隆至在适当转录和翻 译序列控制下的是质粒或其它载体的构建体中以在生物系统中达成 高水平蛋白质表达。在随后步骤中，通过将编码XTEN的第二基因 或多核苷酸邻近编码FVIII的基因且与编码FVIII的基因同框克隆至 构建体中来使它遗传融合于编码FVIII基因的N末端和/或C末端的 核苷酸。这个第二步骤通过连接或多聚化步骤来发生。在上文于这个 段落中所述的前述实施方案中，应了解产生的基因构建体可或者为编 码相应融合蛋白的相应基因的互补序列。
可在一个或多个步骤中以完全合成方式或通过合成与酶促组合 方法(如限制酶介导的克隆、PCR和重叠延伸，包括更充分描述于实 施例中的方法)制备编码XTEN的基因。本文公开的方法可例如用于 将编码XTEN的多核苷酸的短序列连接至具有所需长度和序列的较 长XTEN基因中。在一个实施方案中，方法连接两个或更多个编码 约9至14个氨基酸、或约12至20个氨基酸、或约18至42个氨基 酸、或约42至约144个氨基酸、或约144至约288个氨基酸、或288 至约864个氨基酸或更长、或前述基序或区段长度范围的任何组合的 XTEN基序或区段序列的密码子优化寡核苷酸。
或者，公开的方法用于使XTEN编码序列多聚化成具有所需长 度的较长序列，例如编码XTEN的36个氨基酸的基因可二聚化成编 码72个氨基酸的基因，接着144，接着288等。即使在多聚化下， 也可通过设计被选择用于所用最短单元的基序的密码子来构建 XTEN多肽以使XTEN编码基因具有低重复性或实际上不具有重复 性，此可降低重组且增加编码基因在转化的宿主中的稳定性。
使用标准基因合成技术自寡核苷酸装配编码具有非重复序列的 XTEN的基因。可使用使密码子使用和氨基酸组成最优化的算法进行 基因设计。在本发明的一种方法中，产生且接着如上所述装配相对较 短XTEN编码多核苷酸构建体的文库。接着将所得基因与编码FVIII 或FVIII的区域的基因一起装配，如图11和12中所说明，且所得基 因用于转化宿主细胞且产生并回收CFXTEN以评估它的如本文所述 的性质。
在另一方面，本发明提供包含编码本文所述的CFXTEN融合蛋 白实施方案的多核苷酸序列的分离的核酸。在一个实施方案中，分离 的核酸包含选自以下的多核苷酸序列：(a)当最优比对时，相较于选自 表21的具有类似长度的序列具有至少约80％序列同一性、或约90％、 或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、 或约97％、或约98％或约99％至约100％序列同一性的序列，或(b)(a) 的多核苷酸的互补序列。在另一实施方案中，分离的核酸包含连接于 (a)的核酸的5’末端的序列ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTC TTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGT(SEQ ID NO:1613)或 所述序列的连接于(b)的3’末端的互补序列。
多核苷酸文库
在另一方面，本发明提供编码XTEN序列的用于装配编码具有 所需长度和序列的XTEN的基因的多核苷酸的文库。
在某些实施方案中，XTEN编码文库构建体包含编码固定长度的 多肽区段的多核苷酸。作为初始步骤，可装配编码9-14个氨基酸残 基的基序的寡核苷酸的文库。在一优选实施方案中，装配编码12个 氨基酸的基序的寡核苷酸的文库。
XTEN编码序列区段可二聚化或多聚化成较长编码序列，如图 13中所示意性描绘。可通过连接、重叠延伸、PCR装配或本领域中 已知的类似克隆技术来进行二聚化或多聚化。这个方法可重复多次直 至所得XTEN编码序列已达到序列和所需长度的组构，从而提供 XTEN编码基因。如将了解，编码例如12个氨基酸的基序的多核苷 酸的文库可二聚化和/或连接成编码36个氨基酸的多核苷酸的文库。 本发明涵盖编码不同长度的基序的文库；所述基序例如是产生编码 27至42个氨基酸的文库的9-14个氨基酸的基序。反过来，编码27 至42个氨基酸，且优选36个氨基酸(如实施例中所述)的多核苷酸的 文库可连续二聚化成含有连续较长长度的编码具有所需长度的 XTEN序列的多核苷酸的文库，所述XTEN序列用于并入编码如本文 公开的CFXTEN融合蛋白的基因中。
一种用以使编码XTEN的DNA序列最优化的更高效方式是基于 组合文库。编码XTEN的基因可以区段形式设计和合成以获得各区 段的多个密码子形式。这些区段可随机装配成基因的文库以使各文库 成员编码相同氨基酸序列，但文库成员包含许多密码子形式。可筛选 所述文库中的导致截短产物的高水平表达和/或低丰度的基因。组合 基因装配的方法说明于图18中。图18中的基因是自6个碱基片段装 配且各片段可以4种不同密码子形式获得。这允许实现理论多样性数 值4096。
在一些实施方案中，文库是由编码限于特定序列XTEN家族； 例如表4的AD、AE、AF、AG、AM或AQ序列的氨基酸的多核苷 酸所装配。在其它实施方案中，文库包含编码两个或更多个来自表3 的基序家族序列的序列。文库的编码36mer的代表性非限制性多核苷 酸序列的名称和序列呈现于表13-17中，且用于产生它们的方法更充 分描述于相应实施例中。在其它实施方案中，编码XTEN的文库是 由连接在随机化序列中的编码氨基酸的多核苷酸密码子的区段构建， 其中至少约80％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、 或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约97％、或 至少约98％、或至少约99％密码子选自由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝 氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)氨基酸的密码子组成的组。 文库可反过来用于连续二聚化或连接以获得编码XTEN序列的多核 苷酸序列文库，所述XTEN序列例如具有42、48、72、144、288、 576、864、875、912、923、1318个氨基酸，或多达总长度约3000 个氨基酸以及中间长度，其中当作为CFXTEN融合蛋白的组分表达 时，编码的XTEN可具有一种或多种本文公开的性质。在一些情况 下，多核苷酸文库序列也可包括用作以下更充分描述的“测序岛”的其 它碱基。
图14是在装配本发明的实施方案中的XTEN多核苷酸构建体和 CFXTEN多核苷酸构建体时的代表性非限制性步骤的示意流程图。个 别寡核苷酸501退火成序列基序502(如含12个氨基酸的基序 (“12-mer”))，502被连接于来自文库的其它序列基序以产生涵盖所需 长度的XTEN 504的集合(pool)，且502连接于较小浓度的含有BbsI 和KpnI限制位点的寡聚物503。将连接产物的所得集合进行凝胶纯 化且切割具有所需长度的XTEN的条带，从而产生具有封堵序列 (stopper sequence)505的分离的XTEN基因。将XTEN基因克隆至填 充载体(stuffer vector)中。在这个情况下，载体编码任选CBD序列506 和GFP基因508。接着用BbsI/HindIII进行消化以移除507和508且 放置终止密码子。接着将所得产物克隆至BsaI/HindIII消化的含有编 码FVIII的基因的载体中，从而产生编码FVIII-XTEN融合蛋白的基 因500。
可将XTEN编码基因的文库克隆至一种或多种本领域中已知的 表达载体中。为有助于鉴定良好表达性文库成员，可将文库构建成与 报道体蛋白质的融合物。适合报道体基因的非限制性实例是绿色荧光 蛋白、荧光素酶(luciferace)、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。通过筛选， 可鉴定可以高浓度在所选宿主生物体中表达的短XTEN序列。随后， 可产生随机XTEN二聚体的文库且重复针对高水平表达的筛选。随 后，可针对许多性质，如表达水平、蛋白酶稳定性或与抗血清的结合 来筛选所得构建体。
本发明的一个方面在于提供编码融合蛋白的组分的多核苷酸序 列，其中序列的产生已经受密码子优化。特别感兴趣的是目标在于改 进多肽组合物的表达的密码子优化以及改进编码基因在产生宿主中 的遗传稳定性。举例来说，密码子优化对于富含甘氨酸或具有极度重 复氨基酸序列的XTEN序列特别重要。密码子优化是使用计算机程 序(Gustafsson,C.等(2004)Trends Biotechnol,22:346-53)来进行，其中 一些计算机程序使核糖体暂停最小(Coda Genomics Inc.)。在一个实施 方案中，可通过构建密码子文库来进行密码子优化，其中文库的所有 成员都编码相同氨基酸序列，但其中密码子使用不同。可筛选所述文 库中的特别适于大规模产生含有XTEN的产物的高度表达且遗传稳 定的成员。当设计XTEN序列时，可考虑许多性质。可使编码DNA 序列中的重复性最小。此外，可避免使用或最小化使用产生宿主很少 使用的密码子(例如在大肠杆菌中，AGG和AGA精氨酸密码子和一 个亮氨酸密码子)。在大肠杆菌的情况下，两个甘氨酸密码子GGA和 GGG很少用于高度表达的蛋白质中。因此，编码XTEN序列的基因 的密码子优化可极其合乎需要。具有高水平的甘氨酸的DNA序列倾 向于具有可导致不稳定性或低表达水平的高GC含量。因此，当可能 时，优选的是选择密码子以使XTEN编码序列的GC含量适于将用于 制造XTEN的产生生物体。
在一个实施方案中，多核苷酸文库是使用公开的方法构建，其中 文库的所有成员都编码相同氨基酸序列，但其中序列中相应氨基酸的 密码子使用针对预定宿主细胞而不同或加以优化。可筛选所述文库中 的特别适于大规模产生含有XTEN的产物的高度表达且遗传稳定的 成员。在一个实施方案中，文库是针对在真核宿主细胞中的表达来加 以最优化。
任选地，可对文库中的克隆进行测序以消除含有不合需要序列的 分离物。短XTEN序列的初始文库允许氨基酸序列有某一变化。举 例来说，可使一些密码子随机化以使许多亲水性氨基酸可存在于特定 位置中。在迭代多聚化的过程期间，除针对高水平表达进行筛选之外， 也可筛选所得文库成员的如溶解性或蛋白酶抗性的其它特征。
一旦选择编码具有所需长度和性质的XTEN的基因，即通过以 下手段使它在所需位置处基因融合于编码FVIII基因的核苷酸：将它 邻近编码FVIII的基因且与编码FVIII的基因同框、或者在编码FVIII 的邻近结构域的核苷酸之间、或者在编码给定FVIII结构域的序列内、 或者与编码连接于末端XTEN的间隔子/裂解序列的核苷酸同框克隆 至构建体中。视待编码的CFXTEN而定，本发明提供前述事项的各 种排列。举例来说，就编码如由如上描绘的式VI体现的包含FVIII 和两个XTEN的CFXTEN融合蛋白的基因而言，所述基因将具有编 码FVIII、编码两个在组成和序列长度方面可相同或不同的XTEN的 多核苷酸。在一个非限制性前述实施方案中，FVIII多核苷酸将编码 因子VIII且编码C末端XTEN的多核苷酸将编码288个氨基酸的 XTEN且编码邻近于A2结构域的C末端的内部XTEN的多核苷酸将 编码144个氨基酸的XTEN。将FVIII基因克隆至XTEN构建体中的 步骤可通过如图14中所示的连接或多聚化步骤来发生。编码 CFXTEN融合蛋白的构建体可设计成组分XTEN、CF和间隔子序列 的不同构型，如式I-VIII的构型。在一个实施方案中，构建体包含互 补于编码各组分按以下顺序(5’至3’)FVIII、在B结构域内部的XTEN、 和C末端XTEN的单体多肽的多核苷酸序列的多核苷酸序列，或编 码各组分按以下顺序(5’至3’)FVIII、在B结构域内部的XTEN、和C 末端XTEN的单体多肽的多核苷酸序列。在另一实施方案中，构建 体包含互补于编码各组分按以下顺序(5’至3’)FVIII、连接于C末端的 间隔子序列、和XTEN的单体多肽的多核苷酸序列的多核苷酸序列， 或编码各组分按以下顺序(5’至3’)FVIII、连接于C末端的间隔子序列、 和XTEN的单体多肽的多核苷酸序列。间隔子多核苷酸可任选地包 含编码裂解序列的序列。如将为本领域技术人员显而易知，FVIII结 构域和插入的XTEN的多种排列是可能的。
核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列相似性或序列同一性也可通 过使用已知软件或计算机程序(如BestFit或Gap成对比较程序)常规 确定(GCG Wisconsin Package,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.53711)。BestFit使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics.1981.2:482-489)的局部同源性算法来得到在 两个序列之间具有同一性或相似性的最佳区段。Gap进行整体比对： 使用Needleman和Wunsch(Journal of Molecular Biology.1970. 48:443-453)的方法比对一个序列的全部与另一类似序列的全部。当使 用如BestFit的序列比对程序来确定序列同源性、相似性或同一性的 程度时，可使用缺省设置，或可选择适当计分矩阵来使同一性、相似 性或同源性计分最优化。
“互补”的核酸序列是能够根据标准Watson-Crick互补性规则进 行碱基配对的核酸序列。如本文所用，术语“互补序列”是指大致上互 补的核酸序列，如可通过上述相同核苷酸比较所评估，或如定义为能 够在严格条件(如本文所述的那些)下与编码CFXTEN序列的多核苷 酸杂交。
编码CFXTEN嵌合融合蛋白的所得多核苷酸可接着个别地克隆 至表达载体中。核酸序列是通过多种程序插入载体中。一般来说， DNA是使用本领域中已知的技术插入适当的限制核酸内切酶位点 中。载体组分通常包括但不限于以下一或多者：信号序列、复制起点、 一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。构建含 有这些组分的一者或多者的适合载体采用为熟练技术人员所知的标 准连接技术。所述技术在本领域中是熟知的且充分描述于科学和专利 文献中。
各种载体是公开可得的。载体可例如呈可方便地经受重组DNA 程序的质粒、粘粒、病毒粒子或噬菌体形式，且对载体的选择将常取 决于它将引入其中的宿主细胞。因此，载体可为自主复制载体，即以 染色体外实体形式存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质 粒。或者，载体可为当引入宿主细胞中时，整合至宿主细胞基因组中 且连同它已整合至其中的染色体一起复制的载体。代表性质粒说明于 图17中，其中描绘FVIII和XTEN组分的不同构型的编码区域。
本发明提供含有可与宿主细胞相容并由宿主细胞识别，且可操作 地连接于CFXTEN基因以控制CFXTEN融合蛋白的表达的复制和控 制序列的质粒载体的使用。载体通常携带复制位点以及编码能够提供 在转化的细胞中进行表型选择的蛋白质的序列。熟知用于多种细菌、 酵母和病毒的所述载体序列。可使用的适用表达载体包括例如染色 体、非染色体和合成DNA序列的区段。“表达载体”是指含有可操作 地连接于能够实现在适合宿主中表达编码融合蛋白的DNA的适合控 制序列的DNA序列的DNA构建体。要求是载体在所选宿主细胞中 可复制且可有活力。低或高拷贝数载体可根据需要加以使用。
其它适合载体包括但不限于SV40和pcDNA的衍生物以及如由 Smith等,Gene 57:31-40(1988)所述的已知细菌质粒(如col EI、pCRl、 pBR322、pMal-C2、pET、pGEX)、pMB9及其衍生物、质粒(如RP4)、 噬菌体DNA(如噬菌体I的众多衍生物，如NM989)、以及其它噬菌 体DNA(如M13和丝状单链噬菌体DNA)；酵母质粒(如2微米质粒 或2m质粒的衍生物)以及着丝粒型和整合型酵母穿梭载体；适用于真 核细胞中的载体，如适用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；源于质粒 和噬菌体DNA的组合的载体，如已被修饰来采用噬菌体DNA或表 达控制序列的质粒；等。也可用于本发明中的酵母表达系统包括但不 限于非融合pYES2载体(Invitrogen)、融合pYESHisA、pYESHisB、 pYESHisC(Invitrogen)、pRS载体等。
载体的控制序列包括用以实现转录的启动子、用以控制所述转录 的任选操纵子序列、编码适合mRNA核糖体结合位点的序列、以及 控制转录和翻译的终止的序列。启动子可为在所选宿主细胞中显示转 录活性的任何DNA序列且可源于编码宿主细胞同源或异源蛋白质的 基因。
适用于在哺乳动物细胞中指导编码FVIII多肽变体的DNA转录 的启动子的实例是SV40启动子(Subramani等,Mol.Cell.Biol.1 (1981),854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等,Science 222(1983),809-814)、CMV启动子(Boshart等,Cell 41:521-530,1985) 或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp,Mol.Cell.Biol, 2:1304-1319,1982)。载体也可携带如UCOE(遍在染色质开放元件)的 序列。
适用于丝状真菌宿主细胞中的启动子的实例是例如ADH3启动 子或tpiA启动子。其它适用启动子的实例是源于编码以下的基因的 启动子：米曲菌(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳 定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米 黑根毛霉脂酶、米曲菌碱性蛋白酶、米曲菌磷酸丙糖异构酶或构巢曲 霉(A.nidulans)乙酰胺酶。优选的是TAKA-淀粉酶和gluA启动子。
适用于关于原核宿主的表达载体中的启动子包括β-内酰胺酶和 乳糖启动子系统[Chang等,Nature,275:615(1978)；Goeddel等,Nature, 281:544(1979)]、碱性磷酸酶色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)；EP 36,776]、和杂交启动子，如tac启动子 [deBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]，其全部是可 操作地连接于编码CFXTEN多肽的DNA。用于细菌系统中的启动子 也可含有可操作地连接于编码CFXTEN多肽的DNA的 Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
本发明涵盖使用其它表达系统，包括例如杆状病毒表达系统，所 述表达系统与非融合转移载体(如但不限于pVL941(Summers等,Viro logy 84:390-402(1978))、pVL1393(Invitrogen)、pVL1392(Summers 等,Virology 84:390-402(1978)以及Invitrogen)和pBlueBacIII(Invitro gen))与融合转移载体(如但不限于pAc700(Summers等,Virology 84: 390-402(1978))、pAc701和pAc70-2(与pAc700相同，具有不同阅读 框)、pAc360(Invitrogen))两者一起使用，且可使用pBlueBacHisA、p BlueBacHisB、pBlueBacHisC(；Invitrogen)。
适用于在哺乳动物细胞中指导编码FVIII多肽变体的DNA转录 的启动子的实例是CMV启动子(Boshart等,Cell 41:521-530,1985)、 SV40启动子(Subramani等,Mol.Cell.Biol.1(1981),854-864)、 MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等,Science 222(1983), 809-814)、腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp,Mol.Cell.Biol, 2:1304-1319,1982)。载体也可携带如UCOE(遍在染色质开放元件)的 序列。
必要时，编码CFXTEN的DNA序列也可可操作地连接于适合终 止子，如hGH终止子(Palmiter等,Science 222,1983,第809-814页) 或TPI1终止子(Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1,1982,第 419-434页)或ADH3(McKnight等,The EMBO J.4,1985,第2093-2099 页)。表达载体也可含有一组位于启动子下游以及CFXTEN序列自身 的插入位点上游的RNA剪接位点，包括自腺病毒获得的剪接位点。 表达载体中也含有位于插入位点下游的聚腺苷酸化信号。特别优选的 聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号 (Kaufman和Sharp(同上))、来自腺病毒5Elb区域的聚腺苷酸化信号， 即hGH终止子(DeNoto等Nucl.Acids Res.9:3719-3730,1981)。表达 载体也可包括位于启动子与RNA剪接位点之间的非编码性病毒前导 序列，如腺病毒2三联前导物；和增强子序列，如SV40增强子。
为将本发明的CFXTEN引导至宿主细胞的分泌路径中，分泌信 号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)可包括在重组载体中。 分泌信号序列可操作地连接于编码CFXTEN的DNA序列，通常位于 编码CFXTEN融合蛋白的DNA序列的5′。分泌信号序列可通常与天 然FVIII蛋白相关或可来自编码另一分泌蛋白的基因。非限制性实例 包括用于大肠杆菌表达的OmpA、PhoA和DsbA；用于酵母表达的 ppL-α、DEX4、转化酶信号肽、酸性磷酸酶信号肽、CPY或INU1； 以及用于哺乳动物表达的IL2L、SV40、IgGκ和IgGλ。信号序列通 常在易位和分泌过程期间自蛋白质以蛋白水解方式移除，从而产生确 定的N末端。方法公开于Arnau等,Protein Expression and Purification 48:1-13(2006)中。
用于连接分别编码CFXTEN、启动子和任选终止子和/或分泌信 号序列的DNA序列以及将它们插入含有为复制所必需的信息的适合 载体中的程序为本领域技术人员所熟知(参见例如Sambrook,J.等, “Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。以此方式，在构建体内产生编码单体CFXTEN 融合蛋白的嵌合DNA分子。任选地，这个嵌合DNA分子可转移或 克隆至作为更适当表达载体的另一构建体中。此时，能够表达嵌合 DNA分子的宿主细胞可用嵌合DNA分子转化。
用于本发明中的哺乳动物细胞系的非限制性实例是 COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、BHK-21(ATCC CCL 10))和BHK-293(ATCC CRL 1573；Graham等,J.Gen.Virol. 36:59-72,1977)、BHK-570细胞(ATCC CRL 10314)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、CHO-S(Invitrogen 11619-012)和293-F(Invitrogen R790-7)以 及本领域中已知的适用于表达FVIII的亲本和衍生细胞系。tk-ts13 BHK细胞系也可根据登录号CRL 1632自ATCC获得。此外，许多其 它细胞系可用于本发明内，包括大鼠Hep I(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、 CHO(ATCC CCL 61)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad. Sci.USA 77:4216-4220,1980)。
适合的酵母细胞的实例包括酵母属某种(Saccharomyces spp.)或 裂殖酵母属某种(Schizosaccharomyces spp.)，特别是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株或克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri) 菌株的细胞。用于用异源DNA转化酵母细胞以及自其产生异源多肽 的方法例如描述于美国专利号4,599,311、美国专利号4,931,373、美 国专利号4,870,008、5,037,743和美国专利号4,845,075中，所述专利 全部据此以引用的方式并入本文。转化的细胞是根据由可选择标记物 确定的表型、通常抗药性或在不存在特定营养物(例如亮氨酸)下成长 的能力来选择。用于酵母中的一优选载体是美国专利号4,931,373中 公开的POT1载体。编码CFXTEN的DNA序列之前可为信号序列和 任选例如如上所述的前导序列。适合的酵母细胞的其它实例是克鲁维 酵母属(Kluyveromyces)菌株(如乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、汉逊酵母 属(Hansenula)菌株(例如多形汉逊酵母(H.polymorpha))或毕赤酵母属 (Pichia)菌株(例如毕赤酵母(P.pastoris))(参见Gleeson等,J.Gen. Microbiol.132,1986,第3459-3465页；美国专利号4,882,279)。其它 真菌细胞的实例是丝状真菌，例如曲霉属某种(Aspergillus spp.)、链孢 霉属某种(Neurospora spp.)、镰刀菌属某种(Fusarium spp.)或木霉属某 种(Trichoderma spp.)，特别是米曲菌菌株、构巢曲霉菌株或黑曲霉菌 株的细胞。使用曲霉属某种表达蛋白质描述于例如EP 272 277、EP 238 023、EP 184 438中。尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的转化可例如如由 Malardier等,1989,Gene 78:147-156所述来进行。木霉属某种的转化 可例如如EP 244234中所述来进行。
可用于本发明中的其它适合细胞包括但不限于原核宿主细胞菌 株，如大肠杆菌,(例如菌株DH5-α)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或假单胞菌属(Pseudomonas) 菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株和葡萄球菌属(Staphylococcus)菌 株。适合的原核生物的非限制性实例包括来自以下属的那些：游动放 线菌属(Actinoplanes)；古球状菌属(Archaeoglobus)；蛭弧菌属 (Bdellovibrio)；包柔螺旋体属(Borrelia)；绿屈挠菌属(Chloroflexus)； 肠球菌属(Enterococcus)；埃希氏菌属(Escherichia)；乳酸杆菌属 (Lactobacillus)；李斯特菌属(Listeria)；海洋芽胞杆菌属 (Oceanobacillus)；副球菌属(Paracoccus)；假单胞菌属(Pseudomonas)； 葡萄球菌属(Staphylococcus)；链球菌属(Streptococcus)；链霉菌属 (Streptomyces)；热原体属(Thermoplasma)；和弧菌属(Vibrio)。
转染哺乳动物细胞以及表达引入细胞中的DNA序列的方法例如 描述于Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159(1982),601-621；Southern 和Berg,J.Mol.Appl.Genet.1(1982),327-341；Loyter等,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 79(1982),422-426；Wigler等,Cell 14(1978),725； Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7(1981),603；Graham和van der Eb,Virology 52(1973),456；以及Neumann等,EMBO J.1(1982), 841-845中。
克隆的DNA序列是通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等,Cell 14:725-732,1978；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981；Graham和Van der Eb,Virology 52d:456-467,1973)、用如 FuGENEG Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)或转脂胺 (lipofectamine)(Invitrogen)的许多可商购获得的试剂进行转染或通过 电穿孔(Neumann等,EMBO J.1:841-845,1982)来引入培养的哺乳动 物细胞中。为鉴定和选择表达外源性DNA的细胞，通常将赋予可选 择表型的基因(可选择标记物)连同目标基因或cDNA一起引入细胞 中。优选的可选择标记物包括赋予对如新霉素(neomycin)、潮霉素 (hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、博莱霉素(zeocin)和甲氨蝶呤 (methotrexate)的药物的抗性的基因。可选择标记物可为可扩增可选择 标记物。一优选可扩增可选择标记物是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。 可选择标记物的其它实例为本领域技术人员所熟知且包括报道体，如 增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移 酶(CAT)。可选择标记物由Thilly(Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.，以引用的方式并入本文)加以 综述。本领域技术人员将易于能够选择适合的可选择标记物。任何已 知的可选择标记物都可加以采用，只要它能够与编码基因产物的核酸 同时表达即可。
可选择标记物可与目标基因同时于单独质粒上引入细胞中，或它 们可于同一质粒上引入。如果于同一质粒上，那么可选择标记物和目 标基因可在不同启动子或相同启动子控制下，后述排列产生双顺反子 信息。这个类型的构建体在本领域中是已知的(例如Levinson和 Simonsen,美国专利号4,713,339)。也可有利的是向引入细胞中的混 合物中添加称为“载体DNA”的其它DNA。
在细胞已摄取DNA之后，使它们在适当生长培养基中生长通常 1-2天以开始表达目标基因。如本文所用，术语“适当生长培养基”是 指含有为细胞生长和目标CFXTEN表达所需的营养物和其它组分的 培养基。培养基通常包含碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、维生素、 盐、磷脂、蛋白质和生长因子。对于产生γ-羧化蛋白质，培养基将含 有优选浓度为约0.1μg/ml至约5μg/ml的维生素K。接着应用药物选 择以针对以稳定方式表达可选择标记物的细胞的生长进行选择。对于 已用可扩增可选择标记物转染的细胞，可增加药物浓度以针对克隆的 序列的拷贝数增加进行选择，由此增加表达水平。接着筛选表达目标 FVIII多肽变体的稳定转染的细胞的克隆。
接着在允许表达CFXTEN多肽的条件下，在适合营养培养基中 培养转化或转染的宿主细胞，此后可自培养物以分离的融合蛋白形式 回收所得肽。用于培养细胞的培养基可为适于使宿主细胞生长的任何 常规培养基，如含有适当补充物的最小或复合培养基。适合培养基可 自商业供应商获得或可根据公开的配方(例如在美国典型培养物保藏 中心(American Type Culture Collection)的目录中)进行制备。如温度、 pH等的培养条件是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些 条件，且将为普通熟练技术人员显而易知。
可例如通过常规DNA印迹、用以定量mRNA的转录的RNA印 迹[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980)]、点印迹 (DNA分析)、或使用基于本文提供的序列的适当标记的探针进行原位 杂交来直接测量样本中的基因表达。或者，可采用可识别特定双链体， 包括DNA双链体、RNA双链体以及DNA-RNA杂交双链体或DNA- 蛋白质双链体的抗体。抗体反过来可被标记且可进行测定，其中双链 体结合于表面，以致在表面上形成双链体后，可检测到存在结合于双 链体的抗体。
或者，基因表达可通过免疫荧光方法来测量，所述方法如细胞或 组织切片的免疫组织化学染色以及细胞培养物或体液的测定或可选 择标记物的检测以直接定量基因产物的表达。适用于免疫组织化学染 色和/或测定样本流体的抗体可为单克隆或多克隆的，且可在任何哺 乳动物中制备。合宜的是，抗体可针对天然序列FVIII多肽，或针对 基于本文提供的DNA序列的合成肽，或针对融合于FVIII且编码特 定抗体表位的外源性序列进行制备。可选择标记物的实例为本领域技 术人员所熟知且包括报道体，如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、β-半乳 糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
表达的CFXTEN多肽产物可通过本领域中已知的方法或通过本 文公开的方法加以纯化。可使用如凝胶过滤、亲和纯化(例如使用抗 FVIII抗体柱)、盐分级分离、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、羟磷灰 石吸附色谱、疏水性相互作用色谱和凝胶电泳的程序；各程序被定制 来回收和纯化由相应宿主细胞产生的融合蛋白。额外纯化可通过常规 化学纯化手段，如高效液相色谱实现。一些表达的CFXTEN可能需 要在分离和纯化期间再折叠。纯化方法描述于Robert K.Scopes, Protein Purification:Principles and Practice,Charles R.Castor(编), Springer-Verlag 1994以及Sambrook等(上文)中。多步纯化分离也描述 于Baron等,Crit.Rev.Biotechnol.10:179-90(1990)以及Below等,J. Chromatogr.A.679:67-83(1994)中。出于治疗目的，优选的是本发明 的CFXTEN融合蛋白大致上是纯净的。因此，在本发明的一优选实 施方案中，将本发明的CFXTEN纯化至至少约90至95％均质性，优 选纯化至至少约98％均质性。纯度可通过例如凝胶电泳、HPLC和氨 基末端氨基酸测序来评估。
VIII).药物组合物
本发明提供包含CFXTEN的药物组合物。在一个实施方案中， 药物组合物包含本文公开的CFXTEN融合蛋白与至少一种药学上可 接受的载体的混合物。本发明的CFXTEN多肽可根据已知用以制备 医药适用组合物的方法来配制，借此多肽与药学上可接受的载体媒介 物以混合物形式组合，所述媒介物如水溶液、缓冲剂、溶剂和/或药 学上可接受的混悬液、乳剂、稳定剂或赋形剂。非水性溶剂的实例包 括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。通过如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中所述，混合具有所需纯度的活 性CFXTEN成分与任选生理可接受的载体、赋形剂(例如，氯化钠、 钙盐、蔗糖或聚山梨醇酯)或稳定剂(例如，蔗糖、海藻糖、棉子糖、 精氨酸、钙盐、甘氨酸或组氨酸)来以冻干制剂或水溶液形式制备药 物组合物的制剂以供储存。
药物组合物可以待在施用之前复水的冻干粉末形式供应。在另一 实施方案中，药物组合物可以液体形式供应于小瓶中，所述小瓶的内 含物可直接向患者施用。或者，组合物是以液体形式供应于用于施用 组合物的预填充注射器中。在另一实施方案中，组合物是以液体形式 供应于可并入泵中的预填充小瓶中。
药物组合物可通过任何适合手段或途径加以施用，包括皮下、通 过输注泵皮下、肌肉内和静脉内。应了解优选途径将随接受者的疾病 和年龄以及所治疗病状的严重性而变化。
在一个实施方案中，呈液体形式或在复水(当以冻干粉末形式供 应时)之后的CFXTEN药物组合物包含活性是至少50IU/ml、或至少 100IU/ml、或至少200IU/ml、或至少300IU/ml、或至少400IU/ml、 或活性是至少500IU/ml或活性是至少600IU/ml的凝血因子VIII， 在向需要常规防治的受试者施用因子VIII药物组合物之后，所述组 合物能够使因子VIII活性增加至血液中正常血浆水平的至少1.5％持 续至少约12小时、或至少约24小时、或至少约48小时、或至少约 72小时、或至少约96小时、或至少约120小时。在另一实施方案中， 呈液体形式或在复水(当以冻干粉末形式供应时)之后的CFXTEN药 物组合物包含活性是至少50IU/ml、或至少100IU/ml、或至少200 IU/ml、或至少300IU/ml、或至少400IU/ml、或至少500IU/ml，或 活性是至少600IU/ml的凝血因子VIII，在向需要常规防治的受试者 施用之后，所述组合物能够使因子VIII活性增加至血液中正常血浆 水平的至少2.5％持续至少约12小时、或至少约24小时、或至少约 48小时、或至少约72小时、或至少约96小时、或至少约120小时。 明确涵盖的是前述药物组合物可被配制来包括一种或多种赋形剂、缓 冲剂或本领域中已知的可与通过静脉内途径或皮下途径或肌肉内途 径施用相容的其它成分。因此，在上文于这个段落中所述的实施方案 中，药物组合物是皮下、肌肉内或静脉内施用。
本发明的组合物可使用多种赋形剂来配制。适合的赋形剂包括微 晶纤维素(例如Avicel PH102、Avicel PH101)、聚甲基丙烯酸酯、聚(丙 烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、氯化甲基丙烯酸三甲基铵基乙酯)(如 Eudragit RS-30D)、羟丙基甲基纤维素(Methocel K100M、Premium CR Methocel K100M、Methocel E5、)、硬脂酸镁、滑石、柠檬 酸三乙酯、水性乙基纤维素分散液()和硫酸鱼精蛋白 (protamine sulfate)。缓慢释放剂也可包含载体，其可包括例如溶剂、 分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂。药 学上可接受的盐也可用于这些缓慢释放剂中，例如矿物盐，如盐酸盐、 氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙 二酸盐或苯甲酸盐。组合物也可含有液体，如水、生理盐水、甘油和 乙醇；以及如湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂的物质。脂质体也可用作 载体。
在另一实施方案中，本发明的组合物被囊封在脂质体中，所述脂 质体已显示在以控制方式历经延长时期递送有益活性剂方面具有效 用。脂质体是含有包埋水性体积的闭合双层膜。脂质体也可是具有单 一膜双层的单层囊泡或具有多个膜双层的多层囊泡，所述膜双层各自 由水层与下一膜双层分开。所得膜双层的结构是如此以致脂质的疏水 性(非极性)尾部朝向双层的中心定向而亲水性(极性)头部朝向水相定 向。在一个实施方案中，脂质体可用避免由单核吞噬细胞系统的器官 (主要是肝脏和脾脏)摄取的可挠性水溶性聚合物涂布。适用于围绕脂 质体的亲水性聚合物包括但不限于PEG、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲 醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基噁唑啉、聚羟基丙基 甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸 羟丙酯、聚丙烯酸羟乙酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、 聚天冬酰胺和亲水性肽序列，如美国专利号6,316,024；6,126,966； 6,056,973；6,043,094中所述，所述专利的内容以引用的方式整体并 入本文。其它脂质体技术描述于美国专利号6,759,057；6,406,713； 6,352,716；6,316,024；6,294,191；6,126,966；6,056,973；6,043,094； 5,965,156；5,916,588；5,874,104；5,215,680；和4,684,479中，所述 专利的内容以引用的方式并入本文。这些专利描述脂质体和脂质涂布 的微泡以及它们的制造方法。因此，本领域技术人员在考虑本发明的 公开内容与这些其它专利的公开内容两者下可产生用于延长释放本 发明的多肽的脂质体。
对于液体制剂，所需性质是制剂是以可穿过25、28、30、31、 32号针的形式供应以达成静脉内、肌肉内、关节内或皮下施用。
注射器泵也可用作缓慢释放工具。所述装置描述于美国专利号 4,976,696；4,933,185；5,017,378；6,309,370；6,254,573；4,435,173； 4,398,908；6,572,585；5,298,022；5,176,502；5,492,534；5,318,540； 和4,988,337中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。本领域技 术人员在考虑本发明的公开内容与这些其它专利的公开内容两者下 可产生用于延长释放本发明的组合物的注射器泵。
IX).药物试剂盒
在另一方面，本发明提供一种有助于CFXTEN多肽的使用的试 剂盒。所述试剂盒包括本文提供的药物组合物、容器和在所述容器上 或与所述容器相伴的标签或药品说明书。适合的容器包括例如由多种 材料(如玻璃或塑料)形成的瓶、小瓶、注射器等。容器容纳呈有效治 疗FVIII相关病状的制剂形式的药物组合物且可具有无菌入口(例如 容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。 药品说明书可列出核准的药物适应症、用于复水和/或施用药物以用 于核准的适应症的说明书、适当剂量和安全性信息、以及标识药物的 批号和失效期的信息。在另一前述实施方案中，试剂盒可包括可携带 药物组合物的适合稀释剂的第二容器，使用所述稀释剂将向使用者提 供待向受试者递送的适当浓度。
实施例
实施例1：XTEN_AD36基序区段的构建
以下实施例描述构建一批编码36个氨基酸的基序序列的密码子 优化基因。作为第一步，基于pET载体构建填充载体pCW0359且其 包括T7启动子。pCW0359编码纤维素结合结构域(CBD)和TEV蛋白 酶识别位点，继之以由BsaI、BbsI和KpnI位点侧接的填充序列。插 入BsaI和BbsI位点以使在消化之后它们产生可相容的突出。填充序 列继之以截短形式的GFP基因和His标签。填充序列含有终止密码 子且因此携带填充质粒pCW0359的大肠杆菌细胞形成非荧光菌落。 填充载体pCW0359用BsaI和KpnI消化以移除填充区段且所得载体 片段通过琼脂糖凝胶纯化加以分离。序列被指定为反映AD基序家族 的XTEN_AD36。它的区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下 序列的12mer肽：GESPGGSSGSES(SEQ ID NO：19)、GSEGSSGP GESS(SEQ ID NO：20)、GSSESGSSEGGP(SEQ ID NO：21)或GSG GEPSESGSS(SEQ ID NO：22)。插入物是通过使以下数对磷酸化合 成寡核苷酸对退火来获得：
AD1for：AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC(SEQ ID NO：1619)
AD1rev：ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC(SEQ ID NO：1620)
AD2for：AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC(SEQ ID NO：1621)
AD2rev：ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT(SEQ ID NO：1622)
AD3for：AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC(SEQ ID NO：1623)
AD3rev：ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA(SEQ ID NO：1624)
AD4for：AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC(SEQ ID NO：1625)
我们也使磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCA CTCGAGGGTAC(SEQ ID NO:1626)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnI stopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO:1627)退火。连 接退火的寡核苷酸对，此产生具有表示不同数目的连接于一个BbsI/ KpnI区段的12mer重复序列的不同长度的产物的混合物。通过制备 型琼脂糖凝胶电泳自混合物分离对应于36个氨基酸的长度的产物且 连接至BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。指定为LCW0401的 所得文库中的大多数克隆在诱导之后显示绿色荧光，此显示XTEN_ AD36的序列已与GFP基因同框连接且XTEN_AD36的大多数序列具 有良好表达水平。
我们通过将分离物压印于含有IPTG的琼脂板上来筛选96个来 自文库LCW0401的分离物中具有高荧光水平的分离物。通过PCR评 估相同分离物且48个分离物被鉴定含有具有36个氨基酸的区段以及 强烈荧光。对这些分离物进行测序且39个克隆被鉴定含有正确 XTEN_AD36区段。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名称和 序列列于表13中。
表13:AD 36-mer基序的DNA和氨基酸序列(按照出现顺序分别 是SEQ ID NO 203-278)
实施例2：XTEN_AE36区段的构建
构建编码36个氨基酸长度的XTEN序列的密码子文库。XTEN 序列被指定为XTEN_AE36。它的区段具有氨基酸序列[X]3，其中X 是具有以下序列的12mer肽：GSPAGSPTSTEE(SEQ ID NO：23)、 GSEPATSGSETP(SEQ ID NO：24)、GTSESATPESGP(SEQ ID NO：25) 或GTSTEPSEGSAP(SEQ ID NO：26)。插入物是通过使以下数对磷酸 化合成寡核苷酸对退火来获得：
AE1for：AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA(SEQ ID NO：1628)
AE1rev：ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT(SEQ IDNO：1629)
AE2for：AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC(SEQ ID NO：1630)
AE2rev：ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT(SEQ ID NO：1631)
AE3for：AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC(SEQ ID NO：1632)
AE3rev：ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT(SEQ ID NO：1633)
AE4for：AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC(SEQ ID NO：1634)
AE4rev：ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT(SEQ ID NO：1635)
我们也使磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCA CTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：1626)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnI stopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO:1627)退火。连 接退火的寡核苷酸对，此产生具有表示不同数目的连接于一个BbsI/ KpnI区段的12mer重复序列的不同长度的产物的混合物。通过制备 型琼脂糖凝胶电泳自混合物分离对应于36个氨基酸的长度的产物且 连接至BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。指定为LCW0402的 所得文库中的大多数克隆在诱导之后显示绿色荧光，此显示XTEN_ AE36的序列已与GFP基因同框连接且XTEN_AE36的大多数序列显 示良好表达。
我们通过将分离物压印于含有IPTG的琼脂板上来筛选96个来 自文库LCW0402的分离物中具有高荧光水平的分离物。通过PCR评 估相同分离物且48个分离物被鉴定含有具有36个氨基酸的区段以及 强烈荧光。对这些分离物进行测序且37个克隆被鉴定含有正确 XTEN_AE36区段。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名称和 序列列于表14中。
表14：AE 36-mer基序的DNA和氨基酸序列(按照出现顺序分 别是SEQ ID NO 279-352)
实施例3：XTEN_AF36区段的构建
构建编码36个氨基酸长度的序列的密码子文库。序列被指定为 XTEN_AF36。它的区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序 列的12mer肽：GSTSESPSGTAP(SEQ ID NO：27)、GTSTPESGSAS P(SEQ ID NO：28)、GTSPSGESSTAP(SEQ ID NO：29)或GSTSST AESPGP(SEQ ID NO：30)。插入物是通过使以下数对磷酸化合成寡 核苷酸对退火来获得：
AF1for：AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC(SEQ ID NO：1636)
AF1rev：ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA(SEQ ID NO：1637)
AF2for：AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC(SEQ ID NO：1638)
AF2rev：ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT(SEQ ID NO：1639)
AF3for：AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC(SEQ ID NO：1640)
AF3rev：ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT(SEQ ID NO：1641)
AF4for：AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC(SEQ ID NO：1642)
AF4rev：ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA(SEQ ID NO：1643)
我们也使磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCA CTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：1626)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnI stopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO：1627)退火。连 接退火的寡核苷酸对，此产生具有表示不同数目的连接于一个BbsI/ KpnI区段的12mer重复序列的不同长度的产物的混合物。通过制备 型琼脂糖凝胶电泳自混合物分离对应于36个氨基酸的长度的产物且 连接至BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。指定为LCW0403的 所得文库中的大多数克隆在诱导之后显示绿色荧光，此显示XTEN_ AF36的序列已与GFP基因同框连接且XTEN_AF36的大多数序列显 示良好表达。
我们通过将分离物压印于含有IPTG的琼脂板上来筛选96个来 自文库LCW0403的分离物中具有高荧光水平的分离物。通过PCR评 估相同分离物且48个分离物被鉴定含有具有36个氨基酸的区段以及 强烈荧光。对这些分离物进行测序且44个克隆被鉴定含有正确 XTEN_AF36区段。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名称和 序列列于表15中。
表15：AF 36-mer基序的DNA和氨基酸序列(按照出现顺序分别 是SEQ ID NO 353-440)
实施例4：XTEN_AG36区段的构建
构建编码36个氨基酸长度的序列的密码子文库。序列被指定为 XTEN_AG36。它的区段具有氨基酸序列[X]3，其中X是具有以下序 列的12mer肽：GTPGSGTASSSP(SEQ ID NO：31)、GSSTPSGATG SP(SEQ ID NO：32)、GSSPSASTGTGP(SEQ ID NO：33)或GASPG TSSTGSP(SEQ ID NO：34)。插入物是通过使以下数对磷酸化合成寡 核苷酸对退火来获得：
AG1for：AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC(SEQ ID NO：1644)
AG1rev：ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT(SEQ ID NO：1645)
AG2for：AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC(SEQ ID NO：1646)
AG2rev：ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT(SEQ ID NO：1647)
AG3for：AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC(SEQ ID NO：1648)
AG3rev：ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA(SEQ ID NO：1649)
AG4for：AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC(SEQ 1D NO：1650)
AG4rev：ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC(SEQ ID NO：1651)
我们也使磷酸化寡核苷酸3KpnIstopperFor：AGGTTCGTCTTCA CTCGAGGGTAC(SEQ ID NO：1626)和非磷酸化寡核苷酸pr_3KpnI stopperRev：CCTCGAGTGAAGACGA(SEQ ID NO：1627)退火。连 接退火的寡核苷酸对，此产生具有表示不同数目的连接于一个BbsI/ KpnI区段的12聚体重复序列的不同长度的产物的混合物。通过制备 型琼脂糖凝胶电泳自混合物分离对应于36个氨基酸的长度的产物且 连接至BsaI/KpnI消化的填充载体pCW0359中。指定为LCW0404的 所得文库中的大多数克隆在诱导之后显示绿色荧光，此显示XTEN_ AG36的序列已与GFP基因同框连接且XTEN_AG36的大多数序列显 示良好表达。
我们通过将分离物压印于含有IPTG的琼脂板上来筛选96个来 自文库LCW0404的分离物中具有高荧光水平的分离物。通过PCR评 估相同分离物且48个分离物被鉴定含有具有36个氨基酸的区段以及 强烈荧光。对这些分离物进行测序且44个克隆被鉴定含有正确 XTEN_AG36区段。这些区段的核苷酸和氨基酸构建体的文件名称和 序列列于表16中。
表16：AG 36-mer基序的DNA和氨基酸序列(按照出现顺序分 别是SEQ ID NO 441-528)
实施例5：XTEN_AE864的构建
由XTEN_AE36连续二聚化成AE72、144、288、576和864来 构建XTEN_AE864。由XTEN_AE36的37个不同区段构建一批XTE N_AE72区段。混合具有全部37个不同的36个氨基酸的区段的大肠 杆菌的培养物且分离质粒。这个质粒集合用BsaI/NcoI消化以产生小 片段作为插入物。相同质粒集合用BbsI/NcoI消化以产生大片段作为 载体。连接插入物和载体片段，从而产生加倍长度且将连接混合物转 化至BL21Gold(DE3)中细胞以获得具有XTEN_AE72的菌落。
XTEN_AE72区段的这个文库被指定为LCW0406。组合来自LC W0406的所有克隆且使用与以上所述相同的方法再次二聚化，从而 产生XTEN_AE144的文库LCW0410。组合来自LCW0410的所有克 隆且使用与以上所述相同的方法再次二聚化，从而产生XTEN_AE28 8的文库LCW0414。自文库随机挑选两个分离物LCW0414.001和L CW0414.002且测序以验证身份。组合来自LCW0414的所有克隆且 使用与以上所述相同的方法再次二聚化，从而产生XTEN_AE576的 文库LCW0418。我们筛选96个来自文库LCW0418的分离物中具有 高GFP荧光水平的分离物。对8个根据PCR具有正确插入物尺寸以 及强烈荧光的分离物进行测序且基于测序和表达数据选择2个分离 物(LCW0418.018和LCW0418.052)供未来使用。
通过使用与以上所述相同的二聚化方法组合XTEN_AE576的 LCW0418.018和XTEN_AE288的LCW0414.002来构建 XTEN_AE864的特定克隆pCW0432。
实施例6：XTEN_AM144的构建
自37个不同XTEN_AE36区段、44个XTEN_AF36区段和44 个XTEN_AG36区段起始构建一批XTEN_AM144区段。
混合具有全部125个不同的36个氨基酸的区段的大肠杆菌的培 养物且分离质粒。这个质粒集合用BsaI/NcoI消化以产生小片段作为 插入物。相同质粒集合用BbsI/NcoI消化以产生大片段作为载体。连 接插入物和载体片段，从而产生加倍长度且将连接混合物转化至 BL21Gold(DE3)中细胞以获得具有XTEN_AM72的菌落。
XTEN_AM72区段的这个文库被指定为LCW0461。组合来自 LCW0461的所有克隆且使用与以上所述相同的方法再次二聚化，从 而产生文库LCW0462。针对蛋白质表达筛选1512个来自文库 LCW0462的分离物。将个别菌落转移至96孔板中且作为起始培养物 (starter culture)培养过夜。将这些起始培养物稀释至新鲜自身诱导培 养基中且培养20-30小时。使用荧光板读取器在395nm激发和510nm 发射下测量表达。192个分离物显示高水平表达且提交供DNA测序。 文库LCW0462中的大多数克隆显示良好表达和类似物理化学性质， 从而表明XTEN_AM36区段的大多数组合产生适用的XTEN序列。 来自LCW0462的30个分离物被选作XTEN_AM144区段的优选集合 以构建含有多个XTEN区段的多官能蛋白质。这些区段的核苷酸和 氨基酸构建体的文件名称和序列列于表17中。
表17：AM144区段的DNA和氨基酸序列(按照出现顺序分别是 SEQ ID NO 529-594)
实施例7：XTEN_AM288的构建
如实施例6中所述使整个文库LCW0462二聚化，从而产生 XTEN_AM288克隆的文库，指定为LCW0463。使用实施例6中所述 的方案筛选来自文库LCW0463的1512个分离物。对176个高度表 达性克隆进行测序且选择40个优选XTEN_AM288区段用于构建含 有多个具有288个氨基酸残基的XTEN区段的多官能蛋白质。
实施例8：XTEN_AM432的构建
我们通过重组来自XTEN_AM144区段的文库LCW0462的区段 和来自XTEN_AM288区段的文库LCW0463的区段来产生 XTEN_AM432区段的文库。XTEN_AM432区段的这个新文库被指定 为LCW0464。自分别具有LCW0462和LCW0463的大肠杆菌的培养 物分离质粒。使用实施例6中所述的方案筛选来自文库LCW0464的 1512个分离物。对176个高度表达性克隆进行测序且选择39个优选 XTEN_AM432区段用于构建较长XTEN以及用于构建含有多个具有 432个氨基酸残基的XTEN区段的多官能蛋白质。
同时，我们使用XTEN_AM144和XTEN_AM288的优选区段构 建XTEN_AM432区段的文库LMS0100。筛选这个文库产生4个选择 用于进一步构建的分离物。
实施例9：XTEN_AM875的构建
填充载体pCW0359用BsaI和KpnI消化以移除填充区段且所得 载体片段通过琼脂糖凝胶纯化加以分离。
我们使磷酸化寡核苷酸BsaI-AscI-KpnIforP：AGGTGCAAGCGC AAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGT AC(SEQ ID NO:1652)和非磷酸化寡核苷酸BsaI-AscI-KpnIrev：CC TCGAGTGAAGACGAACCTCCCGTGCTTGGCGCGCCGCTTGCGC TTGC(SEQ ID NO:1653)退火以引入测序岛A(SI-A)，其编码氨基酸 GASASGAPSTG(SEQ ID NO:1654)且在内部具有限制酶AscI识别 核苷酸序列GGCGCGCC。使退火的寡核苷酸对与以上制备的BsaI 和KpnI消化的填充载体pCW0359连接以产生含有SI-A的pCW046 6。我们接着通过使用实施例5中所述的相同二聚化方法，重组来自 实施例8的43个优选XTEN_AM432区段和来自pCW0466的在C末 端处的SI-A区段来产生XTEN_AM443区段的文库。XTEN_AM443 区段的这个新文库被指定为LCW0479。
我们通过使用实施例5中所述的相同二聚化方法，重组来自 XTEN_AM443区段的文库LCW0479的区段和来自实施例8的43个 优选XTEN_AM432区段来产生XTEN_AM875区段的文库。 XTEN_AM875区段的这个新文库被指定为LCW0481。
实施例10：XTEN_AM1318的构建
我们使磷酸化寡核苷酸BsaI-FseI-KpnIforP：AGGTCCAGAACC AACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGT AC(SEQ ID NO:1655)和非磷酸化寡核苷酸BsaI-FseI-KpnIrev：CCT CGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTC TGG(SEQ ID NO:1656)退火以引入测序岛B(SI-B)，其编码氨基酸 GPEPTGPAPSG(SEQ ID NO:1657)且在内部具有限制酶FseI识别核 苷酸序列GGCCGGCC。使退火的寡核苷酸对与如实施例9中使用的 BsBI和KpnI消化的填充载体pCW0359连接以产生含有SI-B的pC W0467。我们接着通过使用实施例5中所述的相同二聚化方法，重组 来自实施例8的43个优选XTEN_AM432区段和来自pCW0467的在 C末端处的SI-B区段来产生XTEN_AM443区段的文库。XTEN_AM 443区段的这个新文库被指定为LCW0480。
我们通过使用与实施例5中相同的二聚化方法，重组来自 XTEN_AM443区段的文库LCW0480的区段和来自XTEN_AM875区 段的文库LCW0481的区段来产生XTEN_AM1318区段的文库。 XTEN_AM1318区段的这个新文库被指定为LCW0487。
实施例11：XTEN_AD864的构建
使用连续数轮二聚化，我们自实施例1中所列的XTEN_AD36 的区段起始装配一批XTEN_AD864序列。如实施例5中所述装配这 些序列。评估来自XTEN_AD864的若干分离物且发现其在生理条件 下显示良好表达和极好的溶解度。对XTEN_AD576的一个中间构建 体进行测序。在食蟹猕猴中进行的PK实验中评估这个克隆且测量到 半衰期约20小时。
实施例12：XTEN_AF864的构建
使用连续数轮二聚化，我们自实施例3中所列的XTEN_AF36的 区段起始装配一批XTEN_AF864序列。如实施例5中所述装配这些 序列。评估来自XTEN_AF864的若干分离物且发现其在生理条件下 显示良好表达和极好的溶解度。对XTEN_AF540的一个中间构建体 进行测序。在食蟹猕猴中进行的PK实验中评估这个克隆且测量到半 衰期约20小时。XTEN_AF864的一全长克隆具有极好的溶解度且显 示在食蟹猕猴中的半衰期超过60小时。装配包括如实施例9中所述 的测序岛的第二组XTEN_AF序列。
实施例13：XTEN_AG864的构建
使用连续数轮二聚化，我们自实施例1中所列的XTEN_AD36 的区段起始装配一批XTEN_AG864序列。如实施例5中所述装配这 些序列。评估来自XTEN_AG864的若干分离物且发现其在生理条件 下显示良好表达和极好的溶解度。XTEN_AG864的一全长克隆具有 极好的溶解度且显示在食蟹猕猴中的半衰期超过60小时。
实施例14：产生和评估具有内部和末端XTEN的CFXTEN的方 法
设计、构建和评估包含FVIII和一个或多个XTEN的CFXTEN 是使用系统化方法来达成。适于XTEN插入位点的区域包括但不限 于在或邻近于FVIII的已知结构域边界、外显子边界、已知表面环处 的区域；具有低有序度的区域；和亲水性区域。通过前述分析，跨越 FVIII B结构域缺失的(BDD)序列的不同区域已被鉴定为XTEN的插 入位点，其非限制性实例列于表5-8中，且示意性显示于图8和9中。 最初，产生(使用下述方法)个别构建体，其中将编码长度在6至2004 个氨基酸残基的范围内的单一XTEN或XTEN片段的DNA插入对应 于或接近(例如，在6个氨基酸内)表5、表6、表7、表8和表9中鉴 定的各单一插入位点的FVIII序列中，且表达所得构建体并接着例如 使用表49的一种体外测定评估回收的蛋白质对促凝血活性的保持的 影响。举例来说，使用下述方法，制备构建体，其中XTEN序列插 入在FVIII的A1、A2、B、A3、C1和C2结构域序列内以及连接于 C末端，且在表49的显色测定中相较于未连接于XTEN的FVIII评 估所得表达的融合蛋白。CFXTEN融合蛋白可基于它们展现的活性进 一步分类成高作用、中等作用和低作用种类。在相较于FVIII， CFXTEN展现类似或适度降低的活性的那些情况下，插入位点被视为 是有利的。在活性是中等的那些情况下，插入位点可朝向插入位点的 N末端或C末端调整1-6个氨基酸和/或可改变XTEN的长度或净电 荷且再评估所得构建体以确定活性是否得以改进。或者，将XTEN 与侧接裂解位点一起插入构建体中；优选的是位点易经受见于凝结测 定中的蛋白酶裂解，以使XTEN在FVIII组分的活化期间被释放，由 此提供关于融合蛋白中的XTEN插入位点的适合性的额外信息。
一旦评估所有个别插入位点且鉴定有利插入位点，即产生两个、 三个、四个、五个或更多个XTEN插入呈各种排列的有利位点中的 构建体的文库。改变XTEN(例如，AE家族的XTEN相对于AG家族 的XTEN)的长度和净电荷以确定这些变量对融合蛋白的FVIII活性和 物理化学性质的影响。接着使用如以下实施例中所述的小鼠和/或狗 甲型血友病模型或本领域中已知的其它模型在体内评估保留所需程 度的体外促凝血FVIII活性的CFXTEN构建体。此外，在FVIII抑制 剂和其它抗FVIII抗体存在下测定构建体以确定保留活性的构建体。 此外，制备在或接近FVIII和XTEN的接合点(例如，来自表8的序 列)处并有被设计来释放XTEN的裂解序列的CFXTEN构建体，且评 估FVIII活性增强和对终末半衰期的影响。通过在组合不同插入位点， 改变XTEN(例如，不同XTEN家族)的长度和组成特性，以及进行评 估下制备构建体的迭代方法，熟练技术人员通过前述方法获得具有所 需性质的CFXTEN，所述性质如但不限于促凝血FVIII活性、与FVIII 抑制剂的结合降低、药代动力学性质增强、能够通过不同途径向受试 者施用、和/或医药性质增强。
实施例15：产生和评估含有FVIII和AE_XTEN的CFXTEN的 方法
一种用于产生和评估CFXTEN组合物的一般性流程呈现于图15 中，且形成用于一般性描述这个实施例的基础。使用公开的方法和为 本领域普通技术人员所知的方法以及在说明性实例中提供的指导，熟 练技术人员可产生和评估包含XTEN和FVIII或FVIII的本领域中已 知的变体的CFXTEN融合蛋白。因此，所述实施例将被解释为仅说 明而非以无论什么任何方式限制方法；众多变化形式将为普通熟练技 术人员显而易知。在这个实施例中，产生因子VIII BDD连接于AE 基序家族的XTEN的CFXTEN。
用于产生编码XTEN的多核苷酸的一般性流程呈现于图11和12 中。图14是在装配本发明的一个实施方案中的XTEN多核苷酸构建 体时的代表性步骤的示意流程图。个别寡核苷酸501退火成序列基序 502(如含12个氨基酸的基序(“12-mer”))，502被连接于来自文库的其 它序列基序，其可多聚化以产生涵盖所需长度的XTEN 504的集合， 且502连接于较小浓度的含有BbsI和KpnI限制位点的寡聚物503。 基序文库包括特定序列XTEN家族；例如，表3的AD、AE、AF、 AG、AM或AQ序列。如图14中所说明，在这个情况下，XTEN长 度是36个氨基酸残基，但也通过这个一般性方法获得较长长度。举 例来说，通过连接、重叠延伸、PCR装配或本领域中已知的类似克隆 技术进行多聚化，在这个情况下，所述多聚化产生具有288个氨基酸 残基的构建体。将连接产物的所得集合进行凝胶纯化且切割具有所需 长度的XTEN的条带，从而产生具有封堵序列505的分离的XTEN 基因。XTEN基因可克隆至填充载体中。在这个情况下，载体编码任 选CBD序列506和GFP基因508。接着用BbsI/HindIII进行消化以 移除507和508且放置终止密码子。接着将所得产物克隆至 BsaI/HindIII消化的含有编码FVIII的基因的载体中，从而产生编码具 有连接于因子VIII的C末端的含288个氨基酸的XTEN的CFXTEN 融合蛋白的基因500。如将为本领域普通技术人员显而易知，方法被 应用于产生呈替代性构型且具有不同XTEN长度或XTEN在多个位 置中的构建体。
编码FVIII的DNA序列是通过本领域中已知的标准程序自由适 当细胞来源制备cDNA文库、自基因组文库方便地获得，或可使用自 公开可用的数据库、专利或参考文献获得的DNA序列合成(例如，自 动核酸合成)产生。在本实施例中，FVIII B结构域缺失的(BDD)变体 是如实施例17中所述制备。接着将编码蛋白质的FVIII部分的基因 或多核苷酸或它的互补序列克隆至构建体(如本文所述的那些)中，所 述构建体可为在适当转录和翻译序列控制下以在生物系统中达成高 水平蛋白质表达的质粒或其它载体。通过将编码XTEN部分的第二 基因或多核苷酸或它的互补序列通过连接或多聚化步骤，邻近编码 CF的基因且与编码CF的基因同框克隆至构建体中来使它基因融合 于编码FVIII基因的末端的核苷酸。以此方式，在构建体内产生编码 (或互补于)CFXTEN融合蛋白的嵌合DNA分子。任选地，插入编码 第二XTEN的基因且在内部同框连接于编码FVIII编码区域的核苷 酸。设计呈不同构型的构建体以编码XTEN在FVIII序列中的各种插 入位点，包括表5、表6、表7、表8和表9的那些或图8-9中说明的 那些。任选地，将这个嵌合DNA分子转移或克隆至作为更适当表达 载体的另一构建体中；例如，适于哺乳动物宿主细胞(如CHO、BHK 等)的载体。此时，视如上文所述的细胞宿主的类型而定，如下更完 全所述或通过熟知方法，用嵌合DNA分子转化能够表达嵌合DNA 分子的宿主细胞。
在如适于使启动子活化而加以改进的常规营养培养基中培养含 有XTEN-FVIII表达载体的宿主细胞。如温度、pH等的培养条件是 先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，且将为普通熟 练技术人员显而易知。在表达融合蛋白之后，收集培养肉汤且与细胞 团块分离并保留所得粗提取物以纯化融合蛋白。
例如通过常规DNA印迹、用以定量mRNA的转录的RNA印迹 [Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201-5205(1980)]、点印迹 (DNA分析)、或使用基于本文提供的序列的适当标记的探针进行原位 杂交来直接测量样本中的基因表达。或者，通过免疫荧光方法测量基 因表达，所述方法如细胞的免疫组织化学染色以直接定量基因产物的 表达。适用于免疫组织化学染色和/或测定样本流体的抗体可为单克 隆或多克隆的，且可在任何哺乳动物中制备。合宜的是，抗体可针对 FVIII序列多肽，使用基于本文提供的序列的合成肽，或针对融合于 FVIII且编码特定抗体表位的外源性序列加以制备。可选择标记物的 实例为本领域技术人员所熟知且包括报道体，如增强的绿色荧光蛋白 (EGFP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
通过本领域中已知的方法纯化CFXTEN多肽产物。如凝胶过滤、 亲和纯化、盐分级分离、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、羟磷灰石吸 附色谱、疏水性相互作用色谱或凝胶电泳的程序是可用于纯化中的全 部技术。特定纯化方法描述于Robert K.Scopes,Protein Purification: Principles and Practice,Charles R.Castor编,Springer-Verlag 1994以及 Sambrook等(上文)中。多步纯化分离也描述于Baron等,Crit.Rev. Biotechnol.10:179-90(1990)以及Below等,J.Chromatogr.A. 679:67-83(1994)中。
如图15中所说明，表征分离的CFXTEN融合蛋白的化学和活性 性质。使用本领域中已知的标准方法表征分离的融合蛋白的例如序 列、纯度、表观分子量、溶解度和稳定性。评估满足预期标准的融合 蛋白的活性，其可通过使用一种或多种本文公开的测定，或使用实施 例或表49的测定测量本文所述的一个因子VIII相关参数来在体外或 在体内测量。
此外，向一个或多个动物物种施用CFXTEN FVIII融合蛋白以测 定标准药代动力学参数和药力学性质，如实施例25和26中所述。
通过产生、表达和回收CFXTEN构建体的迭代方法，随后使用 本文公开的方法或本领域中已知的其它方法对它们进行表征，产生并 评估包含CF和XTEN的CFXTEN组合物以确认预期性质，如溶解 度增强、稳定性增强、药代动力学改进和免疫原性降低，从而导致相 较于相应未融合的FVIII，治疗活性总体增强。对于不具有所需性质 的那些融合蛋白，通过这些方法构建、表达、分离和评估不同序列或 构型以获得具有所述性质的组合物。
实施例16：BDD FVIII的表达质粒的构建
I.B结构域缺失的FVIII(BDD FVIII)表达载体的构建
通过将BDD FVIII开放阅读框克隆至含有多聚腺苷酸以允许达 成FVIII基因的最优哺乳动物表达的pcDNA4载体(Invitrogen,CA) 中，从而产生指定为pBC0100的构建体来产生编码BDD FVIII的表 达载体。在这个构建体内鉴定供克隆使用的若干天然位点，包括Bsi WI 48、AflII 381、PshAI 1098、KpnI 1873、BamHI 1931、PflMI 3094、ApaI 3574、XbaI 4325、NotI 4437、XhoI 4444、BstEII 444 9、AgeI 4500、PmeI 4527。为有助于测定开发，将编码Myc和His 标签的核苷酸引入FVIII开放阅读框中。使用以下引物PCR扩增pB C0100以在适当位置中引入BsiWI和XhoI：1)F8-BsiWI-F：tattccC GTACGgccgccaccATGCAAATAGAGCTCTCCACCT(SEQ ID NO:16 58)；2)F8-nostop-XhoI-R1:GGTGACCTCGAGcgtagaggtcctgtgcctcg(S EQ ID NO:1659)。PCR产物用BsiWI和XhoI消化。PcDNA4-Myc -His/C用Acc65I和XhoI消化，此产生5003bp和68bp的两种产物。 使5003bp产物与消化的PCR FVIII片段连接且用于DH5α转化。酶 Acc65I和BsiWI产生可相容末端，但这个连接会破坏用于未来消化 的位点。所得构建体指定为pBC0102(pcDNA4-FVIII_3-Myc-His)。为 有助于设计和执行未来克隆策略，尤其是涉及产生含有多个XTEN 插入物的BDD FVIII表达构建体的策略，我们选择用以并入的其它 独特限制酶位点，包括BsiWI 908、NheI 1829和ClaI 3281。通过Q uikChange方法(Agilent,CA)个别地进行这些位点的引入。所得构建 体指定为pBC0112(pcDNA4-FVIII_4-Myc-His)。为避免可由于连接在 Myc/His和FVIII/Myc之间的接头肽而产生的问题，且为移除优选用 于未来XTEN插入的限制酶位点，我们通过QuikChange方法使编码 肽序列发生以下序列突变：自ARGHPF(SEQ ID NO:1660)至GAGS PGAETA(SEQ ID NO:178)(在FVIII与Myc之间)、自NMHTG(SE Q ID NO:1661)至SPATG(SEQ ID NO:1662)(在Myc与His之间)。 构建体指定为pBC0114(pcDNA4-FVIII_4-GAGSPGAETA-Myc-SPAT G-His('GAGSPGAETA'和'SPATG'，分别公开为SEQ ID NO 178和 1662))(表21中的序列)，其用作用于设计和产生并有XTEN序列的其 它表达载体的基础载体。呈现这个构建体的表达和FVIII活性数据
II.B结构域缺失的FVIII(BDD FVIII)表达载体的构建
编码BDD FVIII的基因是由GeneArts(Regensburg,Germany)合 成在克隆载体pMK(pMK-BDD FVIII)中。BDD FVIII蛋白含有1457 个氨基酸，总分子量是167539.66。在野生型FVIII蛋白内存在6个 结构域，即A1、A2、B、A3、C1和C2结构域。在BDD FVIII蛋白 中，大多数B结构域已被缺失，因为显示它是非结构化结构域且移 除结构域不改变这个蛋白质的关键功能。由GeneArts使用的pMK载 体不含有启动子，且不能用作表达载体。引入在5’末端的限制酶位点 NheI以及在3’末端的限制酶位点SfiI、SalI和XhoI以有助于将编码 BDD FVIII的DNA序列亚克隆至表达载体，如CET1019-HS(Millipo re)中。也将若干独特限制酶位点引入FVIII序列中以允许进一步操作 (例如，插入、突变诱发)DNA序列。与它们的切割位点一起列出的独 特位点包括但不限于：SacI 391、AfiII 700、SpeI 966、PshAI 1417、 Acc65I 2192、KpnI 2192、BamHI 2250、HindIII 2658、PfoI 2960、 PflMI 3413、ApaI 3893、Bsp12013893、SwaI 4265、OliI 4626、X baI 4644和BstBI 4673。。HindIII位点存在于A2结构域的极末端处 且可潜在用于修饰B结构域。由GeneArts合成的pMK-BDD FVIII 不含有终止密码子。终止密码子是通过使用以下引物扩增FVIII的1 27bp片段来引入：5’-GTGAACTCTCTAGACCCACCG-3’(SEQ ID NO:1663)；5’-CTCCTCGAGGTCGACTCAGTAGAGGTCCTGTGCC TCG-3’(SEQ ID NO:1664)。片段用XbaI和SalI消化，且连接于X baI/SalI消化的pMK-BDD FVIII。连接的DNA混合物用于转化DH5 a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体且通过DNA测序确认所 需构建体。名为pBC0027(pMK-BDD FVIII-终止)的构建体含有编码 BDD FVIII蛋白的编码序列。pBC0027构建体接着用NheI/SalI消化， 且与NheI/SalI消化的CET1019-HS载体(Millipore)连接。CET1019-H S载体含有人CMV启动子和UCOE序列以有助于基因表达。连接的 DNA混合物用于转化DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化 体且通过DNA测序确认所需构建体。最终构建体指定为pBC0025(C ET1019-HS-BDD FVIII-终止)，其在人CMV启动子的控制下编码B DD FVIII蛋白。预期将pBC0025构建体引入哺乳动物细胞中会允许 具有促凝血活性的BDD FVIII蛋白的表达。
实施例17：含有XTEN的BDD FVIII的表达质粒的构建
1.B结构域AE42插入
并行操作两个PCR反应以将XTEN_AE42插入BDD FVIII构建 体的剩余B结构域区域中。PCR反应涉及以下引物：cgaaagcgctacgc ctgagaGTGGCCCTGGCTCTGAGCCAGCCACCTCCGGCTCTGAAA CCCCTGCCTCGAGCccaccagtcttgaaacgcc(SEQ ID NO:1665)；TGAT ATGGTATCATCATAATCGATTTCCTCTTGATCTGACTG(SEQ ID N O:1666)；agcttgaggatccagagttc(SEQ ID NO:1667)；tctcaggcgtagcgct ttcgCTTGTCCCCTCTTCTGTTGAGGTGGGGGAGCCAGCAGGAGA ACCTGGCGCGCCgttttgagagaagcttcttggt(SEQ ID NO:1668)。PCR产 物接着充当模板，且进行第二次PCR以将XTEN_AE42引入由Bam HI和ClaI侧接的FVIII编码核苷酸序列中。这个PCR产物用BamHI 和ClaI消化，同时用相同的两种酶消化PBC0114。使PCR产物连接 于消化的载体。将这个构建体指定为pBC0135(pcDNA4-FVIII_4XTE N_AE42-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His)('GAGSPGAETA'和'SPATG '，分别公开为SEQ ID NO 178和1662)，且编码AE42XTEN并入 在残余B结构域内的BDD FVIII。
2.AE42插入和R1648A突变
QuikChange方法(Agilent,CA)用于将R1648A突变引入PBC013 5中。这个构建体指定为pBC0149(pcDNA4-FVIII_4XTEN_AE42-GA GSPGAETA-Myc-SPATG-His_R1648A)('GAGSPGAETA'和'SPATG'，分 别公开为SEQ ID NO 178和1662)，从而消除那个FVIII加工位点。
3.B结构域AE288插入
使用以下引物对XTEN_AE288进行PCR扩增：tctcaaaacGGCG CGCCAggtacctcagagtctgctacc(SEQ ID NO:1669)和tggtggGCTCGAG GCtggcgcactgccttc(SEQ ID NO:1670)。PBC0075用作这个PCR反应 的模板。PCR产物用AscI和XhoI消化，且PBC0135用相同酶消化。 使PCR产物连接于PBC0135片段。将这个构建体指定为pBC0136(p cDNA4-FVIII_4XTEN_AE288-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His)('GA GSPGAETA'和'SPATG'，分别公开为SEQ ID NO 178和1662)，且编 码AE288XTEN并入在残余B结构域内的BDD FVIII。
4.AE288插入和R1648A突变
使用以下引物对XTEN_AE288进行PCR扩增：tctcaaaacGGCG CGCCAggtacctcagagtctgctacc(SEQ ID NO:1671)和tggtggGCTCGAG GCtggcgcactgccttc(SEQ ID NO:1672)。构建体pBC0075用作这个P CR反应的模板。PCR产物用AscI和XhoI消化，且pBC0149用相同 酶消化。使PCR产物连接于pBC0149片段。将这个构建体指定为p BC0137(pcDNA4-FVIII_4XTEN_AE288-GAGSPGAETA-Myc-SPATG- His R1648A)('GAGSPGAETA'和'SPATG'，分别公开为SEQ ID NO 1 78和1662)，且含有在B结构域内部的AE288XTEN序列，其中R1 648A突变消除那个FVIII加工位点。
3.伴有和不伴有R1648A突变的B结构域AE144、AG144、AG288 插入
对所选XTEN片段进行PCR扩增以将AscI和XhoI位点分别引 至5’末端和3’末端。PCR产物用AscI和XhoI消化，且pBC0135(针 对R1648)或pBC0149(针对A1648)用相同酶消化。使PCR产物连接 于pBC0135或pBC0149载体。将这些构建体指定为pSD0005、6、7、 8、17和18。
XTEN插入在C末端处的BDD FVIII的表达质粒的构建
1.C末端AE288插入
使用以下引物对XTEN_AE288进行PCR扩增：ggggccgaaacggc cggtacctcagagtctgctacc(SEQ ID NO:1673)和tgttcggccgtttcggcccctggcg cactgccttc(SEQ ID NO:1674)。构建体pBC0075用作这个PCR反应 的模板。PCR产物用SfiI消化，且pBC0114用相同酶消化。使PCR 产物连接于消化的pBC0114片段。将这个构建体指定为pBC0145(pc DNA4-FVIII_4-XTEN_AE288-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His)('GA GSPGAETA'和'SPATG'，分别公开为SEQ ID NO 178和1662)，且编 码在BDD FVIII的C末端处的AE288序列。
2.C末端AG288插入
通过DNA2.0(Menlo Park,CA)设计和合成XTEN_AG288。使 用以下引物对合成的基因进行PCR扩增：ggggccgaaacggccccgggagcg tcacc(SEQ ID NO:1675)和tgttcggccgtttcggcccctgacccggttgcccc(SEQ ID NO:1676)。PCR产物用SfiI消化，且PBC0114基载体用相同酶 消化。使PCR产物连接于消化的pBC0114片段。将这个构建体指定 为pBC0146(pcDNA4-FVIII_4-XTEN_AG288-GAGSPGAETA-Myc-SP ATG-His)('GAGSPGAETA'和'SPATG'，分别公开为SEQ ID NO 178 和1662)，且编码在BDD FVIII的C末端处的AG288序列。
3.C末端AE/AG144、288、864插入
使用以下引物通过QuikChange方法将AscI和XhoI位点引入P BC0114基载体中：5O37-PBC0114-AscI-XhoI-F:CAGGACCTCTAC GGCGCgccagcctcgaGCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGG(SEQ ID NO:1677)；5O38-PBC0114-AscI-XhoI-R:CCTCTTCTGAGATG AGTTTTTGTTCGCtcgaggctggcGCGCCGTAGAGGTCCTG(SEQ ID NO:1678)。将AscI和XhoI分别引入5’末端和3’末端中的各种XTE N片段进行PCR扩增。使PCR产物连接于消化的PBC0114载体。将 这些构建体指定为pSD0013、pSD0014、pSD0015、pSD0016、pSD0 019和pSD0020。
具有结构域间和结构域内XTEN插入物的BDD FVIII的表达质 粒的构建
1.AE7、AE42和AE144插入
四种不同策略用于将AE42插入BDD FVIII编码序列内的各自有 助于产生若干构建体的指定位点(例如，天然或引入的限制位点BsiWI 48、AflII 381、PshAI 1098、KpnI 1873、BamHI 1931、PflMI 3094、 ApaI 3574、XbaI 4325、NotI 4437、XhoI 4444、BstEII 4449、AgeI 4500、 PmeI 4527、BsiWI 908、NheI 1829和ClaI 3281)中。通过设计，AE42 的这些插入物产生侧接在插入物的任一侧上的AscI和XhoI位点，从 而允许引入/取代较长XTEN以及具有不同序列或需要时并入的裂解 序列的XTEN。具体来说，含有XTEN_144插入物的构建体列于表 21中。这些插入是通过用由AscI和XhoI位点侧接的PCR XTEN_144 片段置换AE7或AE42来产生。
2.双重PCR介导的方法
并行操作两个PCR反应以将XTEN_AE42插入指定位点中。两 个PCR反应通过使用含有部分XTEN的长引物来在3’末端或5’末端 上引入XTEN。PCR产物接着充当模板，且进行第二次PCR以将 XTEN_AE42引入由所选限制酶位点侧接的FVIII编码核苷酸序列中。 这个PCR产物用适当酶消化，同时使用相同的两种酶消化PBC0114。 使PCR产物连接于消化的载体。使用这个方法，产生指定为pBC0126、 pBC0127、pBC0128和pBC0129的构建体，从而导致AE42分别插入 在R3、R3、P130、L216位置处。序列列于表21中。所选XTEN_144 序列可接着进行PCR以在片段的任一末端上引入AscI和XhoI位点， 且连接于消化的FVIII-XTEN_AE42构建体。举例来说，pSD0053是 通过用XTEN_AE144置换pBC0129的AE42来产生。通过相同策略 产生其它XTEN_144构建体且列于表21中。
3.QuikChange介导的两步克隆方法
QuikChange方法用于将由AscI和XhoI侧接的XTEN_AE7编码 序列引入指定位点中。所得中间构建体接着用AscI和XhoI消化。对 XTEN_AE42或XTEN_AE144进行PCR扩增以引入两个位点且相应 地加以消化。接着连接载体和插入物以产生最终构建体。序列列于表 21中。
4.三PCR II型限制酶介导的连接方法
进行三个PCR反应以产生两段由一种与FVIII_4基因内的独特 位点相关联的I型限制酶和一种II型酶(例如BsaI、BbsI、BfuAI)侧 接的FVIII编码片段，第三PCR反应产生由两个II型限制酶位点侧 接的XTEN_AE42。三个PCR片段用适当酶消化且连接至一个在 FVIII编码序列的片段内含有XTEN_AE42插入物的线性段中。这个 产物接着用适当独特酶在FVIII编码序列内消化且连接于用相同酶消 化的PBC0114构建体，且产生指定为pBC0130(XTEN插入在残基 P333处)、pBC0132(XTEN插入在残基D403处)、pBC0133(XTEN插 入在残基R490处)的构建体。序列列于表21中。所选XTEN_144序 列可接着进行PCR以在片段的任一末端上引入AscI和XhoI位点， 且连接于消化的FVIII-XTEN_AE42构建体。举例来说，通过分别用 XTEN_AE144和XTEN_AG144置换pBC0132的AE42来产生 pSD0001和pSD0003。通过相同策略产生表21中所列的其它 XTEN_144构建体。
5.定制基因合成
定制基因合成是由GeneArt(Regensburg,Germany)所进行。设计 基因以使它们包括编码插入指定位点中的XTEN_AE42的核苷酸且 基因由在FVIII_4基因内选择的两个独特限制酶位点侧接。合成的基 因和PBC0114用适当酶消化且连接以产生最终产物，其中BDD FVIII 在限制位点之间并有XTEN_AE42。所选XTEN_144序列可接着进行 PCR以在片段的任一末端上引入AscI和XhoI位点，且连接于消化的 FVIII-XTEN_AE42构建体。
双重XTEN插入在B结构域中和C末端处的表达质粒的构建
编码在残余B结构域内并有AE288XTEN的BDD FVIII的构建 体pBC0136用BamHI和ClaI消化，且自这个消化获得的1372bp片 段是插入物。构建体pBC0146用BamHI和ClaI消化，且来自这个消 化的9791bp段是载体。将载体和插入物连接在一起以产生pBC0209， 其含有在B结构域内的AE288插入物和在C末端上的AG288。使用 PBC0145作为载体，相同策略用于产生含有两个分别在B结构域中 和C末端处的AE288插入物的构建体。
具有多个XTEN插入物的表达质粒的构建
编码在FVIII的R3位置处的AE42XTEN的构建体pBC0127用 BsiWI和AflII消化，且由这个消化获得的所得468bp片段是插入物。 构建体pBC0209用BsiWI和AflII消化，来自这个消化的10830bp 段是载体。将载体和插入物连接在一起以产生指定为pBC0210的构 建体，其含有在A1结构域中的AE42插入物、用以恢复信号裂解序 列的额外三个ATR氨基酸、在B结构域内的AE288XTEN插入物和 在C末端上的AG288。相同方法用于产生编码在天然和引入的限制 位点处的多个XTEN的构建体；所述限制位点例如BsiWI 48、AflII 381、PshAI 1098、KpnI 1873、BamHI 1931、PflMI 3094、ApaI 3574、 XbaI 4325、NotI 4437、XhoI 4444、BstEII 4449、AgeI 4500、PmeI 4527、 BsiWI 908、NheI 1829和ClaI 3281。
BDD FVIII-内部XTEN_AE288表达载体的构建
遵循制造商方案(Agilent Technologies,CA)，使用QuikChange 方法将两个BsaI限制酶位点引入PBC0027pMK-BDD FVIII构建体 中的碱基对2673与2674之间。插入的DNA序列是gggtctcccgcgcca gggtctccc，且所得构建体指定为pBC0205(序列在表21中)。接着用在 5’与3’两者上引入BsaI位点的引物使编码AE288(或其它变化形式和 长度的XTEN；例如AE42、AG42、AG288、AM288)的DNA序列进 行PCR。pBC0205载体和插入物(XTEN_288)接着用BsaI消化且连接 以产生pBC0206，其编码XTEN_AE288插入在B结构域内的FVIII 基因(序列在表21中)。pBC0206构建体接着用NheI/SalI消化，且与 NheI/SalI消化的CET1019-HS载体(Millipore)连接。CET1019-HS载 体含有人CMV启动子和UCOE序列以有助于基因表达。连接的DN A混合物用于转化DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体 且通过DNA测序确认所需构建体。最终构建体指定为pBC0207(CE T1019-HS-BDD FVIII-终止)，其在人CMV启动子的控制下编码BD D FVIII蛋白(序列在表21中)。预期将pBC0207构建体引入哺乳动 物细胞中会允许具有内部XTEN_AE288的BDD FVIII蛋白的表达。 相同方案用于引入、转化和表达含有其它变化形式和长度的XTEN 的构建体；所述XTEN例如AE42、AG42、AG288、AM288、AE86 4、AG864或表4的其它XTEN。
BDD FVIII-/-XTEN_AE864表达载体的构建
通过消化pBC0025构建体来产生NheI和SfiI侧接5’和3’末端的 BDD FVIII片段。接着使这个消化的片段连接于编码继之以 XTEN_AE864序列的FVIII的NheI/SfiI消化的pSecTag载体(pBC0048 pSecTag-FVIII-/-XTEN_AE864)。连接的DNA混合物用于转化DH5a 细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体且通过DNA测序确认所 需构建体。最终构建体是pBC0060，其在人CMV启动子的控制下编 码BDD FVIII-/-XTEN_AE864蛋白。预期将pBC0060构建体引入哺 乳动物细胞中会表达具有促凝血活性的具有C末端XTEN融合物的 FVIII蛋白(BDD FVIII-/-XTEN_AE864)。
BDD FVIII-/FXI/-XTEN_AE864表达载体的构建
通过消化pBC0025构建体来产生NheI和SfiI侧接5’和3’末端的 BDD FVIII片段。接着使这个消化的片段连接于编码继之以FXI裂解 序列(/FXI/)和XTEN_AE864的NheI/SfiI消化的pSecTag载体 (pBC0047pSecTag-FVIII-/FXI/-XTEN_AE864)。连接的DNA混合物 用于转化DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体且通过 DNA测序确认所需构建体。最终构建体是pBC0051，其在人CMV 启动子的控制下编码BDD FVIII-/FXI/-XTEN_AE864蛋白。预期将 pBC0051构建体引入哺乳动物细胞中会表达具有C末端XTEN融合 物的FVIII蛋白(BDD FVIII-/FXI/-XTEN_AE864)，其可随后由FXI 裂解，因此释放具有促凝血活性的BDD FVIII蛋白。
包含AE288或AG288的BDD FVIII-/FXI/-XTEN表达载体的构 建
通过用BsaI和HindIII消化XTEN序列AE288和AG288来置换 pBC0060中的融合AE864XTEN序列。使用相应AE288或AG288 XTEN片段和BsaI/HindIII消化的pBC0051进行的随后连接步骤允许 AE288或AG288序列交换至BDD FVIII表达载体中。所得最终构建 体是pBC0061(针对BDD FVIII-AE288)和pBC0062(针对BDD FVIII-AG288)。预期将pBC0061构建体引入哺乳动物细胞中会表达 具有促凝血活性的具有C末端AE288XTEN融合物的FVIII蛋白 (BDD FVIII-/-XTEN_AE288)。预期将pBC0062构建体引入哺乳动物 细胞中会表达具有促凝血活性的具有C末端AG288XTEN融合物的 FVIII蛋白(BDD FVIII-/-XTEN_AG288)。
具有替代性XTEN的BDD FVIII-/FXI/-XTEN表达载体的构建
通过用BsaI和HindIII消化编码其它XTEN序列(例如其它变化 形式和长度的XTEN；例如AE42、AG42、AG288、AM288)的DNA 来置换pBC0051中的融合XTEN序列。使用XTEN片段和BsaI/HindIII 消化的pBC0051进行的连接允许各种XTEN编码序列交换至BDD FVIII表达载体中，从而提供替代性构建体。预期将替代性构建体引 入哺乳动物细胞中会表达具有C-末端XTEN的FVIII蛋白(BDD FVIII-/FXI/-XTEN)，其可随后由FXI裂解，从而释放FVIII，从而产 生具有促凝血活性的促凝血FVIII融合物。
实施例18：FVIII信号肽-XTEN-/FXI/-BDD FVIII的表达质粒 的构建
FVIII信号肽-XTEN_AE864的表达载体的构建
FVIII信号肽的编码序列是通过使以下两个寡聚物退火来产生： 5’-CTAGCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCT TTTGCGATTCTGCTTTAGTGGGTCTCC-3’(SEQ ID NO:1679)； 5’-ACCTGGAGACCCACTAAAGCAGAATCGCAAAAGGCACAGAA AGAAGCAGGTGGAGAGCTCTATTTGCATG-3’(SEQ ID NO:1680)。 退火的寡聚物由NheI和BsaI限制酶位点侧接在任一末端上，且连接 于编码FVII-XTEN_AE864的NheI/BsaI消化的pCW0645载体。连接 的DNA混合物用于转化DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选 转化体且通过DNA测序确认所需构建体。将最终构建体指定为 pBC0029，其在人CMV启动子的控制下编码信号肽-XTEN_AE864 蛋白。这个构建体用作用于产生XTEN融合在FVIII蛋白的N末端 上的表达构建体的中间构建体，且也可用作用于产生允许XTEN融 合在分泌的蛋白质的N末端上的表达构建体的主质粒。
信号肽-XTEN_AE864-/FXI/-BDD FVIII表达载体的构建
使用在5’上引入NheI-BbsI-/FXI/-AgeI位点且在3’末端上引入内 源性KpnI限制酶的引物扩增在FVIII编码区域内的1800bp片段。使 NheI/KpnI消化的FVIII片段与NheI/KpnI消化的pBC0027载体连接。 连接的DNA混合物用于转化DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备 筛选转化体且通过DNA测序确认所需构建体。将所得构建体指定为 pBC0052，其含有编码无FVIII信号肽的/FXI/-FVIII蛋白的序列。这 个构建体用作用于产生XTEN融合在FVIII蛋白的N末端上的表达 构建体的中间构建体。
pBC0052载体用BbsI/XhoI酶消化，且用于与Bbsi/XhoI消化的 pBC0029连接。连接的DNA混合物用于转化DH5a细菌细胞。通过 DNA小型制备筛选转化体且通过DNA测序确认所需构建体。将最终 构建体指定为pBC0053，其在人CMV启动子的控制下编码信号肽 -XTEN_AE864-/FXI/-BDD FVIII蛋白。预期将pBC0053构建体引入 哺乳动物细胞中会表达具有N末端XTEN融合物的FVIII蛋白(信号 肽-XTEN_AE864-/FXI/-BDD FVIII)，其可随后由FXI裂解，因此释 放BDD FVIII蛋白。
信号肽-XTEN-/FXI/-BDD FVIII表达载体的构建
可通过用BsaI和BbsI消化其它XTEN片段(例如AM、AF、AG) 来置换pBC0053中的融合XTEN序列。使用XTEN片段和BsaI/BbsI 消化的pBC0053进行的连接允许各种XTEN段(例如AM、AF、AG) 交换至BDD FVIII表达载体中。各种XTEN融合物可不同地增加这 些蛋白质的半衰期，从而允许改进这些蛋白质的性质(例如功效、效 能)。预期将任何这些融合构建体引入哺乳动物细胞中会表达具有N 末端XTEN融合物的FVIII蛋白(信号肽-XTEN-/FXI/-BDD FVIII)，其 中融合的XTEN肽可随后由FXI裂解，从而产生BDD FVIII蛋白。
实施例19：具有结构域间XTEN插入物的BDD FVIII的构建
XTEN插入在A2-B结构域边界处的BDD FVIII表达载体的构建
pBC0027构建体(pMK-BDD FVIII-终止)是被设计来含有BDD FVIII蛋白编码序列，但不含有被定位来启始BDD FVIII的表达的启 动子的克隆载体。这个构建体用于操作BDD FVIII的编码序列，因为 载体骨架含有极少数限制酶位点，因此允许进行容易的克隆策略。 BDD FVIII蛋白含有1457个氨基酸，总分子量是167539.66。在野生 型FVIII蛋白内存在6个结构域，即A1、A2、B、A3、C1和C2结 构域。在BDD FVIII蛋白中，大多数B结构域已被缺失，因为据信 它是非结构化结构域且移除结构域不改变这个蛋白质的关键功能。然 而，B结构域边界似乎是用于产生XTEN融合物以允许延长蛋白质半 衰期的极好位置。
在pBC0027构建体内，在A2-B接合点的边界处存在独特HindI II限制酶位点。使用在XTEN编码序列的任一末端上引入HindIII和 FXI裂解位点的引物扩增XTEN(例如，表4或13-17的序列)。可通 过扩增各种XTEN片段来改变融合的XTEN序列。各种XTEN融合 物可不同地增加这些蛋白质的半衰期，从而允许改进这些蛋白质的性 质(例如功效、效能)。HindIII-/FXI/-XTEN-/FXI/-HindIII片段用HindI II消化且与HindIII消化的pBC0027连接。连接的DNA混合物用于 转化DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体且通过DNA 测序确认所需构建体。将最终构建体指定为pBC0054，其编码具有结 构域间XTEN融合物的BDD FVIII蛋白(FVIII(A1-A2)-/FXI/-XTEN-/ FXI/-FVIII(C1-C2))，但不具有用以启始基因表达的启动子。
pBC0054构建体用NheI/SalI消化，且与NheI/SalI消化的CET1 019-HS载体(Millipore)连接。CET1019-HS载体含有人CMV启动子 和UCOE序列以有助于基因表达。连接的DNA混合物用于转化DH 5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体且通过DNA测序确认 所需构建体。将最终构建体指定为pBC0055(CET1019-HS-FVIII(A1 -A2)-/FXI/-XTEN-/FXI/-FVIII(C1-C2))，其在人CMV启动子的控制下 编码具有结构域间(A2/B结构域间)XTEN融合物的BDD FVIII蛋白 (FVIII(A1-A2)-/FXI/-XTEN-/FXI/-FVIII(C1-C2))。预期将pBC0055构 建体引入哺乳动物细胞中会表达具有结构域间XTEN融合物的BDD FVIII蛋白(FVIII(A1-A2)-/FXI/-XTEN-/FXI/-FVIII(C1-C2))，其可随后 由FXI裂解，因此释放BDD FVIII蛋白。
XTEN插入在A1-A2结构域边界处的BDD FVIII表达载体的构 建
将pBC0027构建体设计成用于使用以下四种引物进行两个PCR 反应的模板：
(反应I)5’-ATGATGGCATGGAAGCCTAT-3’(sEQ ID NO：1681)：5’- ATCCCTCACCTTCGCCAGAACCTTCAGAACCCTCACCTTCAGAACCTTCACCAGAACCTTCA CCATCTTCCGCTTCTTCATTATTTTTCAT-3’(SEQ ID NO：1682)。
(反应II)5’- TTCTGGCGAAGGTGAGGGATCTGAAGGCGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGCTCTGAGGGTTCC GAATATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAAT-3’(SEQ ID NO：1683)；5’- TATTCTCTGTGAGGTACCAGC-3’(SEQ ID NO：1684)。
产生的PCR产物分别是150bp和800bp。800bp产物用作用150 bp产物作为一种引物且5’-TATTCTCTGTGAGGTACCAGC-3’(SEQ ID NO：1685)作为另一引物的下一轮PCR反应的模板。第二轮PCR 的产物是930bp且用PshAI和ACC65I限制酶消化。使这个 PshAI/Acc65I侧接的DNA片段与PshAI/Acc65I消化的pBC0027连 接。连接的DNA混合物用于转化DH5a细菌细胞。通过DNA小型 制备筛选转化体且通过DNA测序确认所需构建体。将最终构建体指 定为pBC0058(pMK-BDD FVIII-D345-XTEN_Y36)，其编码在D345 残基之后具有结构域间(A1/A2结构域间)XTEN融合物的BDD FVIII 蛋白。
pBC0058构建体用NheI/SalI消化，且与NheI/SalI消化的 CET1019-HS载体(Millipore)连接。CET1019-HS载体含有人CMV启 动子和UCOE序列以有助于基因表达。连接的DNA混合物用于转化 DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体且通过DNA测序确 认所需构建体。将最终构建体指定为pBC0059(CET1019-HS-BDD FVIII D345-XTEN_Y36)，其在人CMV启动子的控制下编码在D345 残基之后具有结构域间(A1/A2结构域间)XTEN融合物的BDD FVIII 蛋白。预期将pBC0059构建体引入哺乳动物细胞中会表达具有结构 域间XTEN融合物的BDD FVIII蛋白(BDD FVIII D345-XTEN_Y36)。
实施例20：具有结构域内XTEN插入物的FVIII的构建
XTEN插入在P598(在A2结构域内)之后的BDD FVIII表达载体 的构建
使用PCR技术，用以下引物扩增XTEN_Y36的编码序列：
5’-GAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGGTGAAGGTTCTGGT GAAGG-3’(SEQ ID NO：1686)
5’-AACTCTGGATCCTCAAGCTGCACTCCAGCTTCGGAACCCTCAGAGCC-3)(SEQ ID NO：1687).
184bp PCR产物由KpnI和BamHI限制酶位点侧接在任一末端 上，且连接于编码BDD FVIII基因的KpnII/BamHI消化的pBC0027 载体。连接的DNA混合物用于转化DH5a细菌细胞。通过DNA小 型制备筛选转化体且通过DNA测序确认所需构建体。将最终构建体 指定为pBC0056，其含有编码在P598残基之后具有XTEN_Y36融合 物的FVIII蛋白的DNA序列。这个克隆策略用于通过改变PCR反应 的模板以及相应地改变引物来将各种形式的XTEN引入BDD FVIII 蛋白中。
pBC0056构建体用NheI/SalI消化，且与NheI/SalI消化的 CET1019-HS载体(Millipore)连接。CET1019-HS载体含有人CMV启 动子和UCOE序列以有助于基因表达。连接的DNA混合物用于转化 DH5a细菌细胞。通过DNA小型制备筛选转化体且通过DNA测序确 认所需构建体。将最终构建体指定为pBC0057(CET1019-HS-FVIII P598-XTEN_Y32)，其在人CMV启动子的控制下编码具有结构域内 (A2结构域内)XTEN融合物的BDD FVIII蛋白。预期将pBC0057构 建体引入哺乳动物细胞中会表达具有结构域内XTEN融合物的BDD FVIII蛋白(FVIII P598-XTEN_Y32)。
具有其它结构域内XTEN插入物的BDD FVIII表达载体的构建
为将各种XTEN区段引入BDD FVIII内的其它结构域内位点中 (例如，表4或13-17的XTEN)，设计扩增具有可与BDD FVIII退火 的突出的XTEN的引物。设计具有用以允许进行这些特定插入的各 种独特限制酶位点的FVIII编码序列(pMK-BDD FVIII)。独特限制酶 是与它们的切割位点一起在以下列出：NheI 376、SacI 391、AfiII 700、 SpeI 966、PshAI 1417、Acc65I 2192、KpnI 2192、BamHI 2250、HindIII 2658、PfoI 2960、PflMI 3413、ApaI 3893、Bsp12013893、SwaI 4265、 OliI 4626、XbaI 4644、BstBI 4673、SalI4756和XhoI 4762。在编码 序列的任一末端上的NheI和SalI位点用于将DNA片段插入人CMV 启动子驱动的载体CET1019-HS(Millipore)中以在哺乳动物细胞中进 行表达。这些构建体表达具有表21中所列的序列的具有XTEN融合 物的BDD FVIII蛋白。
实施例21：具有XTEN插入物的FVIII的构建
具有两个XTEN的CFXTEN：
为获得在各种区域(自N末端至C末端：A1-R1、A1-R2、A2-R1、 A2-R2、B结构域、a3、A3-R1、A3-R2、C末端)中具有两个XTEN 插入物的CFXTEN，利用表达保留FVIII活性的具有单一XTEN插入 物的融合物的构建体。设计具有各种独特限制酶位点以允许达成这些 特定组合的FVIII编码序列(pBC0114pcDNA4-FVIII_4-X10-Myc-SPA TG-His额外RE)('SPATG'，公开为SEQ ID NO:1662)。独特限制酶 是与它们的在不同区域之间的相对位点一起列于下表18中：BsiWI (在N末端与A1-R1之间)、AflII(在A1-R1与A1-R2之间)、NheI(在 A1-R2与A2-R1之间)、KpnI(在A2-R1与A2-R2之间)、BamHI(在A 2-R2与B结构域之间)、ClaI(在a3与A3-R1之间)、PflMI(在A3-R1 与A3-R2之间)、XbaI(在A3-R2与C末端之间)、AgeI(在FVIII C末 端与终止密码子之间)。选择用于克隆文库的构筑嵌段和限制酶，如 下表中所列。在摩尔比1:1下混合各区域中的所选组分，且两组DN A混合物用独特限制酶消化。用1％琼脂糖凝胶分离DNA片段且通 过Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。在第一所需区域中具有XTEN插入 物的DNA被视为插入物(琼脂糖凝胶中的较小DNA片段)，而在第二 所需区域中具有XTEN插入物的DNA被视为载体(琼脂糖凝胶中的 较大DNA片段)。连接插入物和载体以重构质粒。连接的DNA混合 物用于转化DH5α大肠杆菌感受态宿主细胞。通过滚环扩增(RCA)和 Sanger测序以涵盖潜在文库大小的约3-4倍来筛选转化体。鉴定且小 型制备独特克隆。两个不同限制消化反应接着用于进一步确认各区域 中的XTEN的完整性。所得CFXTEN融合蛋白的氨基酸和编码DNA 序列列于表21中。
一个或两个XTEN插入在B/a3结构域内和C末端的CFXTEN：
FVIII的B/a3结构域和C末端是良好耐受XTEN插入物的非结 构化区域。B/a3结构域进一步介导与其它辅因子，包括血管性血友病 因子的相互作用。为研究在B/a3结构域处的最优XTEN插入物，通 过PCR基突变诱发方法对区域进行所选缺失和突变。选择PCR反应 且载体用如表18中所列的独特限制酶消化。用1％琼脂糖凝胶分离 DNA片段且通过Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。在第一所需区域中具 有XTEN插入物的DNA被视为插入物(琼脂糖凝胶中的较小DNA片 段)，而在第二所需区域中具有XTEN插入物的DNA被视为载体(琼 脂糖凝胶中的较大DNA片段)。连接插入物和载体以重构质粒。连接 的DNA混合物用于转化DH5α大肠杆菌感受态宿主细胞。通过菌落 PCR和Sanger测序以涵盖潜在文库大小的约8X来筛选转化体。鉴定 且小型制备独特克隆。一个三酶限制消化反应接着用于进一步确认各 区域中的XTEN的完整性。所得CFXTEN融合蛋白的氨基酸和编码 DNA序列列于表21中。
表18.用于具有两个XTEN插入物的FVIII文库的克隆设计
实施例22：3-5个XTEN插入在位点18/26、403、745/1656、1720、 1900或2332处的BDD FVIII表达载体的构建
选择XTEN插入在位点18/26、403、745/1656、1720、1900或 2332处的FVIII融合构建体以重组且产生具有3、4、5或6个XTEN 插入物的构建体。
3-5个XTEN插入在位点26、403、1656、1720或1900处的BDD FVIII表达载体的构建
在所需位点处具有单一XTEN的所选构建体是：pSD0050、 pSD0001、pSD0039、pSD0010和pSD0062。在所需位点处具有双重 XTEN的构建体包括LSD0005.002、LSD0038.001、LSD0040.002、 LSD0042.013、LSD0039.010、LSD0041.008、LSD0043.008、 LSD0045.002、LSD0046.002和LSD0044.002。选择用于克隆构建体 的构筑嵌段和限制酶，如下表19中所列。所选组分用独特限制酶消 化。插入物和载体的DNA用1％琼脂糖凝胶分离且通过Qiagen凝胶 提取试剂盒纯化。连接插入物和载体，且接着转化至DH5α大肠杆菌 感受态宿主细胞中。通过RCA和DNA测序分析各构建体的四个菌 落。小型制备具有所需XTEN插入物的克隆。限制消化反应接着用 于进一步确认各区域中的XTEN的完整性。所得CFXTEN融合蛋白 的氨基酸和编码DNA序列列于表21中。对所得构建体编号为 pSD0077至pSD0092。
4-6个XTEN插入在位点18、403、1656、1720、1900或2332 处的BDD FVIII表达载体的构建
构建体pSD0077至pSD0092充当构筑嵌段以产生在18、403、 1656、1720、1900和2332处具有插入物的含4至6个XTEN的构建 体。选择用于克隆构建体的构筑嵌段构建体和限制酶，如下表19中 所列。所选组分用独特限制酶消化。插入物和载体的DNA用1％琼 脂糖凝胶分离且通过Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。连接插入物和载 体，且接着转化至DH5α大肠杆菌感受态宿主细胞中。通过菌落PCR 和DNA测序分析各构建体的八个菌落。小型制备具有所需XTEN插 入物的克隆。限制消化反应接着用于进一步确认各区域中的XTEN 的完整性。所得CFXTEN融合蛋白的氨基酸和编码DNA序列列于表 21中。对所得构建体编号为pBC0247至pBC0257、pNL0022、23、 24、25和30。
4-6个XTEN插入在位点18、403、745、1720、1900或2332处 的BDD FVIII表达载体的构建
构建体pBC0247至pBC0252、pBC0255、pNL0022至pNL0025 充当构筑嵌段以产生在18、403、745、1720、1900和2332处具有插 入物的含4至6个XTEN的构建体。选择用于克隆构建体的构筑嵌 段构建体和限制酶，如下表19中所列。所选组分用独特限制酶消化。 插入物和载体的DNA用1％琼脂糖凝胶分离且通过Qiagen凝胶提取 试剂盒纯化。连接插入物和载体，且接着转化至DH5α大肠杆菌感受 态宿主细胞中。通过菌落PCR和DNA测序分析各构建体的八个菌落。 小型制备具有所需XTEN插入物的克隆。限制消化反应接着用于进 一步确认各区域中的XTEN的完整性。所得CFXTEN融合蛋白的氨 基酸和编码DNA序列列于表21中。对所得构建体编号为pBC0258 至pBC0268。
表19：用于3-5个XTEN插入在位点26、403、1656、1720或 1900处的FVIII文库的克隆设计
实施例23：具有三个或四个XTEN的CFXTEN表达载体的构建： 第一XTEN在B结构域中，第二XTEN在C末端处，且第三或第四 XTEN插入在A1或A2或A3结构域内
通过组合XTEN插入在A1、A2或A3结构域中的凝血活性克隆 和XTEN插入在B结构域内和C末端处的克隆来构建具有三个XTEN 插入物的CFXTEN融合蛋白的文库。构建第四XTEN添加在A1、 A2或A3结构域中的其它文库以选择3个XTEN文库的成员。克隆 流程的设计概述于下表中。通过限制酶消化和琼脂糖凝胶纯化来制备 插入物和载体的DNA。在连接插入物与相应载体之后，连接的DNA 混合物用于转化DH5α感受态大肠杆菌宿主细胞。通过RCA和测序 以涵盖潜在文库大小的约3-4倍来筛选转化体。鉴定且小型制备独特 克隆。三个不同限制消化反应接着用于进一步确认各XTEN的完整 性。所得CFXTEN融合蛋白的氨基酸和编码DNA序列列于表21中。
表20：用于3个XTEN插入在位点B结构域、C末端和A1/A2/A3 结构域处的FVIII文库的克隆设计
表21：FVIII-XTEN构建体的DNA和氨基酸序列
实施例24：哺乳动物细胞的转染、FVIII-XTEN的表达和FVIII 活性的评估
包括但不限于CHO、BHK、COS和HEK293的哺乳动物细胞适 于用以上实施例的载体转化以表达和回收FVIII-XTEN融合蛋白。以 下是用于通过短暂转染来表达BDD FVIII和FVIII-XTEN融合蛋白构 建体pBC0114、pBC0135、pBC0136、pBC0137、pBC0145、pBC0146 和pBC0149的方法的细节，所述短暂转染包括电穿孔和化学(PEI)转 染方法。
使自ATCC购买的粘着HEK293细胞在供应商推荐的培养基中复 苏且传代数代，随后冷冻含具有5％DMSO的培养基的多个小瓶。在 转染之前使一个小瓶复苏且再次传代。在转染之前1-2天，每次转染 使用35ml培养基在每毫升约7x105的密度下将HEK293细胞接种在 一个T175中。在转染当天，用胰蛋白酶处理细胞，分离且计数，接 着于培养基中冲洗直至获得均匀细胞混悬液。对细胞计数且将适当体 积的细胞(基于以上细胞计数)转移至50mL离心管中，以使每次转染 存在约4x106个细胞。在500RCF下对细胞进行离心5分钟，丢弃 上清液，且将细胞再混悬于10ml D-PBS中。
电穿孔：对于电穿孔，使用微量吸液管(供应于NeonTM转染系统 100μL试剂盒中)添加适当体积的再混悬缓冲液，以使110μl缓冲液 可用于每次转染。添加110μl单独体积的细胞混悬液至各Eppendorf 管中，所述各Eppendorf管含有11μl各个别FVIII-XTEN构建体的质 粒DNA，总计6μg(DNA的体积可较小，用无菌H2O足量至11μl)。 NeonTM转染装置用于转染。程序设置成在1100v下电穿孔持续脉冲 宽度20ms，总计两个脉冲。将NeonTM管(供应于NeonTM转染系统100 μL试剂盒中)置放入NeonTM吸移站中。添加3mL体积的电解缓冲液 E2(供应于NeonTM转染系统100μL试剂盒中)至NeonTM管中。NeonTM吸移管和100μl NeonTM尖端用于使用NeonTM吸移站将100μl细胞- 质粒DNA混合物电穿孔。执行电穿孔且当完成时，自站移除NeonTM吸移管且具有转染的细胞的吸移管用于以圆周运动将细胞转移至含 有10ml Opti-MEM I减血清培养基(1X，Invitrogen)的100mmx20 mm陪替氏平皿(petri plate)中，以使转染的细胞均匀分布在平皿上。 在37℃下孵育用于各转染的细胞以进行表达。在转染后第3天，添 加10％体积的10mM Hepes、5mM CaCl2和4M NaCl的盐溶液至各 细胞培养物中且温和混合30分钟。将各细胞培养物转移至50ml锥 形离心管中且在4℃下在3000rpm下离心10分钟。将各培养物的上 清液置放入50ml新锥形管中且接着分成5x1ml等分试样于 Eppendorf管中以及2x15ml等分试样于锥形管中以进行测定或快速 冷冻，随后在ELISA中测试FVIII-XTEN的表达以及在如本文所述的 FVIII活性测定中测试性能。
化学转染：化学转染可使用本领域中已知的标准方法来达成。在 本实施例中，如所述利用PEI。
在转染前1天将混悬293细胞于足以提供至少30ml工作体积的 Freestyle 293(Invitrogen)培养基中以7x105个细胞/毫升接种，且在 37℃下孵育。在转染当天，在室温下保持1.5ml转染培养基等分试样， 向其中添加90μL 1mg/ml PEI且短暂涡旋。添加30μl体积的编码 FVIII-XTEN_AE288构建体的DNA(浓度1mg/ml)至PEI溶液中，将 所述溶液涡旋30秒。在室温下保持混合物5-15分钟。添加DNA/PEI 混合物至HEK293细胞中且使用预先确定的振荡烧瓶条件在37℃下 孵育混悬液。在添加DNA/PEI混合物之后约4小时，添加1x体积的 扩增培养基且在37℃下孵育细胞5天。在收集当天，添加10％体积 的10mM Hepes、5mM CaCl2和4M NaCl的盐溶液至细胞培养物中 且温和混合30分钟。将细胞培养物转移至50ml锥形离心管中且在 4℃下在4000rpm下离心10分钟。将上清液置放入50ml新锥形管 中且接着分成5x1ml等分试样于Eppendorf管中以及2x15ml等分 试样于锥形管中以进行测定或快速冷冻，随后在ELISA中测试 FVIII-XTEN的表达和/或在如本文所述的FVIII活性测定中测试性 能。
产生FVIII-XTEN的稳定集合和细胞系的产生
通过在含有如嘌呤霉素的选择抗生素的培养基中培养转染的细 胞3-5周来产生稳定集合，其中每2-3天更换培养基。稳定细胞可用 于产生稳定克隆。对于在初级筛选期间的稳定细胞系选择，将来自稳 定集合的正在进行传代或自冷冻小瓶复苏的细胞以0.5个细胞/孔的 靶标密度接种于96孔板中。在接种之后约1周，通过活性测定或抗 原测量来测试来自各孔的具有如在显微镜下观察的单细胞群集的消 耗培养基中的FVIII的表达。
对于其它轮筛选，将标准化数目的细胞接种于多孔板中。收集消 耗培养基且通过ELISA和FVIII活性测定来测试FVIII浓度。也将自 各板收集细胞且使用Vi-Cell进行计数。通过以下对克隆分级：(1)根 据ELISA和活性的FVIII效价；(2)ELISA效价/细胞计数和活性效价/ 细胞计数的比率；和(3)如通过蛋白质印迹测量的由克隆产生的产物 的完整性和均质性。自初级筛选选择各构建体的许多克隆以进行其它 轮筛选。
对于第二轮筛选，首先在T25烧瓶中扩增选自初级筛选的顶级克 隆的于96孔板中的细胞且接着接种于双重24孔板中。自各板收集消 耗培养基以进行FVIII活性和抗原定量且收集细胞并通过Vi-Cell进 行计数。根据通过ELISA和活性测定获得的效价、ELISA效价/细胞 和活性效价/细胞计数比率对克隆分级且接着加以选择。制备至少 5-10个克隆的冷冻小瓶且再次筛选这些克隆并根据按照ELISA和活 性的效价、以及ELISA效价/细胞计数的比率和活性效价/细胞计数的 比率、以及根据蛋白质印迹的产物完整性和均质性进行筛选和分级， 并选择2-3个克隆以在振荡烧瓶中进行生产力评估。基于比生产力和 产物质量选择最终克隆。
由混悬293稳定克隆产生分泌在细胞培养基中的FVIII-XTEN
将通过前述方法选择的HEK293稳定细胞克隆于表达培养基中 以1-2X105个细胞/毫升接种于振荡烧瓶中。每日监测细胞计数、细 胞活力、FVIII活性和抗原表达效价。在FVIII活性和抗原效价以及 产物质量是最优的当天，通过离心/无菌过滤或深度过滤/无菌过滤收 集培养物。滤液立刻用于切向流过滤(TFF)处理和纯化或储存在-80℃ 冷冻箱中以随后进行TFF处理和纯化。
实施例25：CFXTEN构建体的纯化和表征
以下是用于纯化和表征具有一个或多个XTEN的CFXTEN构建 体的示例性方法。
通过FVIII亲和色谱纯化FVII-XTEN_AE864
使用Cuno ZetaPlus Biocap过滤器和Cuno BioAssure胶囊式滤心 过滤含有CFXTEN的上清液且随后使用具有30,000Da MWCO的 Millipore Pellicon 2小型滤筒通过切向流过滤加以浓缩。使用相同切 向流过滤滤筒，将样本渗滤至10mM组氨酸、20mM氯化钙、300mM 氯化钠和0.02％吐温80(pH 7.0)中。FVIIISelect树脂(GE 17-5450-01) 使用偶联于色谱树脂的13kDa重组蛋白配体选择性结合FVIII或B 结构域缺失的FVIII。树脂用10mM组氨酸、20mM氯化钙、300mM 氯化钠和0.02％吐温80(pH 7.0)平衡且装载上清液。柱用20mM组氨 酸、20mM氯化钙、300mM氯化钠和0.02％吐温80(pH 7.0)洗涤， 接着用20mM组氨酸、20mM氯化钙、1.0M氯化钠和0.02％吐温 80(pH 7.0)洗涤，且用溶解于50％乙二醇中的20mM组氨酸、20mM 氯化钙、1.5M氯化钠和0.02％吐温80(pH 7.0)洗脱。
通过切向流过滤和渗滤进行浓缩和缓冲液交换
使用Cuno ZetaPlus Biocap过滤器和Cuno BioAssure胶囊式滤心 过滤来自表达CFXTEN的稳定CHO细胞系的以体积计总计至少10L 的上清液批料。随后使用具有30,000Da MWCO的Millipore Pellicon 2小型滤筒，通过切向流过滤将它们浓缩约20倍。使用相同切向流 过滤滤筒，样本用10mM组氨酸、20mM氯化钙、300mM氯化钠 和0.02％吐温80(pH 7.0)、10mM tris(pH 7.5)、1mM EDTA以足以进 行缓冲液交换的5体积加以渗滤。将样本分成50ml等分试样且冷冻 在-80℃下。
通过阴离子交换色谱纯化CFXTEN
使用Akta FPLC系统，利用SuperQ-650M柱纯化样本。柱于缓 冲液A(0.02mol/L咪唑、0.02mol/L甘氨酸乙酯盐酸盐、0.15mol/L NaCl、2.5％甘油，pH 6.9)中平衡且装载样本。使用缓冲液B(5mmol/L 组氨酸HCl(His/HCI)、1.15mol/L NaCl，pH 7.0)洗脱样本。215nm色 谱图用于监测洗脱分布图。通过ELISA、SDS-PAGE或活性测定来测 定洗脱份的FVIII。汇合峰值洗脱份且储存或立刻经受凝血酶活化 (O’Brien等,Blood(1990)75:1664-1672)。使用aPTT基因子测定来测 定洗脱份的FVIII活性。进行Bradford测定以测定装载物和洗脱份中 的蛋白质总量。
通过疏水性相互作用色谱纯化CFXTEN
将含CFXTEN样本的缓冲液A(50mmol/l组氨酸、1mmol/l CaCl2、1M NaCl和0.2g/l Tween，pH 7.0)装载于在缓冲液A中 平衡的toyopearl醚650M树脂上。柱用10柱体积的缓冲液A洗涤以 移除DNA、不正确折叠形式和FVIII、以及其它污染蛋白质。CFXTEN 用缓冲液B(25mmol/l组氨酸、0.5mmol/l CaCl2和0.4mol/l NaCl， pH 7.0)以单步洗脱形式(美国专利6005082)洗脱。使用aPTT基因子 测定来测定洗脱份的FVIII活性。进行Bradford测定以测定装载物和 洗脱份中的蛋白质总量。
用阴离子交换色谱自单体CFXTEN移除聚集蛋白质
使用Akta FPLC系统，利用macrocap Q柱纯化样本。柱于缓冲 液A(20mM MES、1mM CaCl2，pH 7.0)中平衡且装载样本。使用30％ 至80％线性梯度的缓冲液B(20mM MES、1mM CaCl2，pH 7.0+500 mM NaCl)历经20个柱体积洗脱样本。215nm色谱图用于监测洗脱分 布图。对应于早期洗脱部分的洗脱份主要含有单体蛋白质，而晚期洗 脱部分主要含有聚集物质。通过尺寸排阻色谱用60cm BioSep G4000 柱分析来自macrocapQ柱的洗脱份以确定汇合哪些洗脱份以产生无 聚集体样本。
由凝血酶活化FVIII
在人凝血酶单位与FVIII单位的比率1:4下用凝血酶处理于5 mmol/L组氨酸HCl(His/HCI)、1.15mol/L NaCl(pH 7.0)中的纯化 FVIII，且在37℃下孵育样本多达2小时。为监测活化过程，接着取 出这个样本的等分试样，且通过添加4.5体积冰冷丙酮进行丙酮沉淀。 在冰上孵育样本10分钟，且通过在微量离心机中在13,000g下离心 3分钟来收集沉淀。移除丙酮，且将沉淀再混悬于30μL SDS-PAGE 还原性样本缓冲液中并煮沸2分钟。接着通过SDS-PAGE或蛋白质 印迹测定样本。通过寻找转化成40和50kDa片段的重链以及转化成 70kDa片段的轻链来检查FVIII向FVIIIa的转化(O’Brien等,Blood (1990)75:1664-1672)。
CFXTEN的SEC分析
通过用60cm BioSep G4000柱进行尺寸排阻色谱来分析通过亲 和色谱和阴离子交换色谱纯化的FVII-XTEN。流体动力学半径约10 nm/表观MW约1.7MDa(XTEN-288融合物)或流体动力学半径约12 nm/表观MW 5.3MDa(XTEN-864融合物)的单分散群体指示无聚集样 本。预期CFXTEN具有表观分子量因子多达或约8(针对XTEN-288 与FVIII融合)或多达或约15(针对XTEN-864与FVIII融合)。
CFXTEN的ELISA基浓度测定
使用证实的抗体配对(VisuLizeTMFVIII抗原试剂盒，Affinity Biologicals,Ontario Canada)，利用双抗体酶联免疫吸附测定(ELISA) 对因子VIII/CFXTEN抗原浓度进行定量测定。片孔用针对人FVIII 的绵羊多克隆抗体预涂布。稀释血浆样本且施加至各孔。存在的FVIII 抗原结合涂布的抗体。在洗除未结合物质之后，施加过氧化物酶标记 的绵羊检测抗体且使其结合捕获的FVIII。再次洗涤各孔且施加 TMB(过氧化物酶底物四甲基联苯胺)的溶液并使其反应固定时期。显 现蓝色，其在用酸淬灭反应后变为黄色。在微板读取器中在450nm 下以分光光度方式测量形成的颜色。在450nm下的吸光度与捕获于 孔上的FVIII抗原的量成正比。使用试剂盒中提供的校正血浆或通过 替代适当基质中的CFXTEN标准物来校正测定。
通过FXa偶联的显色底物测定评估CFXTEN活性
使用Chromogenix Coamatic因子VIII(Chromogenix，目录号 82258563)，如下评估FVIII或包含FVIII的CFXTEN的活性。在钙 离子和磷脂存在下，因子X由因子IXa活化成因子Xa。这个活化由 在这个反应中充当辅因子的因子VIII极大刺激。通过使用最优量的 Ca2+、磷脂和因子IXa、以及过量因子X，因子X的活化速率与因子 VIII的量线性相关。因子Xa水解显色底物S-2765，因此释放发色基 团pNA。接着在405nm下以分光光度方式读取颜色。产生的因子 Xa以及因此颜色强度与样本中的因子VIII活性成比例。通过连同底 物一起添加合成凝血酶抑制剂I-2581来防止由形成的凝血酶水解 S-2765。未知样本的活性是通过比较那个样本的最终A405与来自由 已知FVIII量构建的标准曲线的那些A405来确定。通过也测定样本 中存在的FVIII抗原的量(通过A280或ELISA)，确定样本的比活性 以了解特定FVIII制剂的相对效能。这使得能够关于活性评估用于 CFXTEN融合物的不同分离策略或构建体设计的相对效率且进行分 级。
用于CFXTEN活性测定的aPTT基测定
CFXTEN起替换内源性或接触活化的凝血路径中的FVIII的作 用。使用活化的部分凝血激素时间测定(aPTT)评估这个凝血路径的活 性。具体来说，如下测量FVIII活性：通过用FVIII缺乏的血浆(目录 号100800)2倍稀释正常对照血浆(Pacific Hemostasis目录号100595)， 且接着再次用因子VIII缺乏的血浆进行6、4倍连续稀释来制备标准 曲线。这产生具有在500、130、31、7.8、2.0、0.5和0.1IU/ml活性 下的各点的标准曲线，其中1个活性单位定义为1ml正常人血浆中 的FVIIIC活性的量。也包括FVIII缺乏的血浆来测定空白血浆中的 背景活性水平。通过在按体积1:10比率下添加CFXTEN至FVIII缺 乏的血浆中来制备样本。使用aPTT测定如下测试样本。在分子装置 板读取器分光光度计(molecular devices plate reader spectrophotometer) 中在37C下孵育样本2分钟，此时添加相等体积的aPTT试剂(Pacific Hemostasis目录号100402)且再进行3分钟37C孵育。在孵育之后， 通过添加1体积的氯化钙(Pacific Hemostasis目录号100304)来活化测 定。在450nm下监测混浊度5分钟以产生反应分布图。aPTT时间或 达到凝结活性起始的时间定义为OD405nm超过基线增加0.06所处 的第一时间。对数线性标准曲线是用与aPTT时间线性相关的活性对 数产生。由此，确定板孔中的样本的活性且接着通过乘以11以虑及 于FVIII缺乏的血浆中的稀释度来确定样本中的活性。通过也测定样 本中存在的FVIII抗原的量(通过A280或ELISA)，可确定样本的比 活性以了解特定FVIII制剂的相对效能。这使得能够对用于CFXTEN 融合物的不同分离策略或构建体设计的相对效率进行分级。
FVIII/FVIII-XTEN表达的蛋白质的蛋白质印迹分析
在8％均质SDS凝胶上操作样本且随后转移至PVDF膜中。泳道 1-15中的样本分别是：MW标准物、FVIII(42.5ng)、pBC0100B、 pBC0114A、pBC0100、pBC0114、pBC0126、pBC0127(8/5/11；#9)、 pBC0128、pBC0135、pBC0136、pBC0137、pBC0145、pBC0149和 pBC0146。膜最初用5％奶阻断，接着用对重链的A2结构域具有特异 性的抗FVIII单克隆抗体GMA-012探测(Ansong C,Miles SM,Fay PJ.J Thromb Haemost.2006年4月；4(4):842-7)。对于pBC0136(泳道8，图 22)和pBC0137(泳道9，图22)，观察到XTEN288插入B结构域中， 而对于pBC0146(泳道12，图22)，观察到XTEN288插入在C末端处。 所有测定的FVIII-XTEN蛋白都揭示存在分子量高于pBC0114基础构 建体或FVIII标准物的分子量至少21kDa的单链蛋白质。此外，对 于pBC0135(泳道7，图22)和pBC0149(泳道11，图22)，观察到AE42 插入物，其中单链的运动比pBC0114基础蛋白质的运动高约5kDa， 且重链的运动比基础蛋白质的90kDa条带高约5kDa。
通过ELISA测定表达的FVIII
为验证和定量由细胞培养物对构建体的FVIII-XTEN融合蛋白的 表达，建立ELISA测定。将用于FVIII-LC ELISA)的捕获抗体 SAF8C-AP(Affinity Biologicals)或GMA-8002(Green Mountain Antibodies)或GMA011抗体(Green Mountain Antibodies)、或GMA016 抗体固定于ELISA板的孔上。接着使各孔与阻断缓冲液(1x PBS/3％ BSA)一起孵育以防止其它蛋白质非特异性结合抗FVIII抗体。接着在 各孔中孵育FVIII标准物稀释液(约50ng-0.024ng范围)、质量对照和 细胞培养基样本1.5小时以使表达的FVIII蛋白结合涂布的抗体。接 着充分洗涤各孔，且使结合的蛋白质与SAF8C-生物素化抗FVIII检 测抗体(Affinity Biologicals)一起孵育。接着添加结合缀合于FVIII检 测抗体的生物素的抗生蛋白链菌素-HRP至孔中且孵育1小时。最后， 添加OPD底物至各孔中且用板读取器在490nm波长下监测由HRP 酶对它的水解。接着通过将在各培养物稀释度下的比色反应与标准曲 线比较来计算含有FVIII的样本的浓度。下表22中的结果显示各种 构建体的FVIII-XTEN在细胞培养基中以0.4-1μg/ml表达。通过 ELISA获得的结果和活性数据指示使用所述转染方法，FVIII-XTEN 融合蛋白得以极其良好表达。此外，在实验条件下，结果证明 FVIII-XTEN蛋白的比活性值类似或大于pBC0114基础构建体(表达 BDD FVIII)的比活性值且支持将XTEN插入FVIII的C末端或B结 构域中导致FVIII蛋白功能得以维持。
用于CFXTEN融合蛋白的显色活性测定
如上所述在短暂转染的Freestyle 293细胞中表达呈包括XTEN AE288和AG288插入在FVIII BDD序列的C末端处的各种构型的 BDD FVIII和CFXTEN融合蛋白构建体pBC0114、pBC0135、 pBC0136、pBC0137、pBC0145、pBC0146和pBC0149以及AE42和 AE288插入在B结构域的残基745(或残基743)之后和残基1640(或残 基1638)之前的FVIII-XTEN融合蛋白(包括P1648加工位点突变成丙 氨酸的构建体)，且测试促凝血活性。使用Chromogenix因 子VIII测定评估细胞培养基中存在的各FVIII-XTEN蛋白的促凝血活 性，所述测定是其中因子X的活化与样本中的因子VIII的量线性相 关的测定。根据制造商说明书使用在OD405nm下以分光光度方式测 量的终点法进行测定。使用纯化FVIII蛋白，在浓度250、200、150、 100、75、50、37.5、25、12.5、6.25、3.125和1.56mU/ml下产生标 准曲线。用测定缓冲液和PEI培养基制备因子VIII标准物的稀释液、 质量对照和样本以虑及培养基在测定性能方面的影响。阳性对照由在 20、40和80mU/ml浓度下的纯化因子VIII蛋白和缺乏XTEN插入 物的pBC0114FVIII基础构建体的细胞培养基组成。阴性对照由单独 测定缓冲液或PEI培养基组成。如上所述获得FVIII-XTEN构建体的 细胞培养基，且在1:50、1:150和1:450稀释度下以重复测试且各自 的活性是以U/ml加以计算。各FVIII-XTEN构建体展现至少类似的 促凝血活性，且在一些情况下大于基础构建体阳性对照的促凝血活 性，并支持在实验条件下在FVIII的C末端处连接XTEN(包括AE288 或AG288)或在B结构域内插入XTEN(包括AE42或AE288)导致 FVIII促凝血活性得以保持或甚至增强。
表22：ELISA和显色FVIII活性测定的结果
用于含有CFXTEN融合蛋白的细胞培养物样本活性测定的 Coatest测定
使用Coatest测定，如下评估FVIII或包含FVIII的CFXTEN的 活性。
测定基质：相同板中的所有孔都调整成相同百分比的培养基以控 制基质影响。稀释测试样本以使OD405读数将落于标准物的线性范 围内。FVIII标准物的浓度范围是100mU/mL至0.78mU/mL，通过 于1X Coatest缓冲液(DiaPharma)加预定百分比的培养基中4倍连续稀 释FVIII标准物制备。
Coatest SP FVIII(DiaPharma)试剂包装包括10x Coatest缓冲液储 备溶液、因子IXa+因子X、磷脂、CaCl2和底物。通过添加9X体积 的冷ddH2O至1X体积的储备物中制备1x Coatest溶液。接着以预定 比率添加细胞培养基至制备的1X溶液中以使所有测试孔中的基质的 百分比标准化。根据制造商推荐复原因子IXa+因子X、磷脂和底物。
Coatest测定程序：
制备测定试剂且保持在冰上直至需要。一式两份添加25μl稀释 的测试样本和标准物至96孔板中。添加50μl磷脂/因子IXa/因子X 至各孔中且通过温和轻叩板的侧面来加以混合。在37℃板加热器上 在37℃下孵育各板5分钟。添加25μl CaCl2至各孔中且加以混合。 在板加热器上在37℃下孵育各板5分钟。接着添加50μl底物至各孔 中，混合，且在37℃下再孵育各板另外5-10分钟直至顶部标准物显 现OD405读数约1.5。在混合下添加25μl 20％乙酸至各孔中以终止 反应且使用plus(Molecular Devices)分光光度计在 OD405下读取各孔。使用SoftMax程序(5.2版)进行数据分析。LLOQ 根据测定加以变化，但通常是0.0039IU/ml。
结果：数据呈现于表23-26中。表23呈现XTEN插入基于本文 所述的准则(包括实施例34)选择的单一位点中的CFXTEN融合蛋白 的结果。pBC00114FVIII阳性对照显示良好表达和FVIII活性。在106 个测定的单XTEN融合蛋白中，68％保留可测量FVIII活性，其中30％ 在凝血测定中展现3+至4+活性。31％的测定的融合蛋白具有低于定 量限度的结果(此可归因于反映在相应表达ELISA结果中的不良表 达)。所有四个B结构域插入构建体都展现良好活性，C末端连接的 构建体也是这样，从而指示这些是可能有利的插入位点。
单一插入位点数据的结果指导具有2个XTEN插入物的XTEN 构建体的产生，其结果呈现于表24中。总之，阳性率是67％，其中 31％的融合蛋白在凝血测定中展现3+至4+活性。
前述数据的结果指导具有3个XTEN插入物的XTEN构建体的 产生，其结果呈现于表25中。总之，92％的样本具有可测量FVIII 活性，其中足足79％在凝血测定中展现3+至4+活性。
产生并测定有限数目的4个XTEN插入A1、A2和A3结构域中 的构建体，其中5个构建体中的4个展现FVIII活性(表26)，从而表 明插入多个XTEN不损害所得融合蛋白保留FVIII活性的能力。
结论：在实验条件下，结果支持用于选择XTEN插入位点的准 则是有效的，将一个或多个XTEN插入FVIII的所选位点中比不插入 一个或多个XTEN更可能导致所得CFXTEN分子的促凝血活性得以 保持，且相较于单一或双重XTEN插入构建体，插入三个XTEN似 乎产生更大比例的保留高水平的FVIII促凝血活性的融合蛋白。
表23：用于包含一个XTEN的CFXTEN的凝血活性测定的结果
*LLOQ：低于定量限度
**pNL009包括745-1656的缺失
表24：用于包含两个XTEN的CFXTEN的凝血活性测定的结果
表25：用于包含三个XTEN的CFXTEN的凝血活性测定的结果
*具有R1648A突变的构建体
表26：用于包含四个XTEN的CFXTEN的凝血活性测定的结果
*具有R1648A突变的构建体
实施例26：XTEN半径和相关参数的测定
为定量CFXTEN融合蛋白的XTEN组分的流体动力学半径以及 多个XTEN相对于单一XTEN的变化值如何，基于由对包含一个或 多个XTEN的各种融合蛋白的尺寸排阻色谱测定凭经验获得的数据 产生一系列结构式。据信相较于具有较少XTEN，但具有近似相同总 XTEN氨基酸数的CFXTEN，将多个XTEN并入CFXTEN中会提供 XTEN组分的较高总流体动力学半径。根据由等式II给出的公式计算 单一XTEN多肽的最大半径(在下文中称为“XTEN半径”)：
XTEN半径＝(√XTEN长度0.2037)+3.4627 II
根据由等式III给出的公式计算CFXTEN中所有XTEN区段的最 大XTEN半径的总和：
其中：n＝XTEN区段的数目
且i是迭代子
根据由等式IV给出的公式计算包含多个XTEN的CFXTEN的 XTEN半径总和与相等长度(总氨基酸残基数与CFXTEN的总氨基酸 残基数相等)的单一XTEN的XTEN半径的比率：
其中：n＝XTEN区段的数目
且i是迭代子
结果：等式II应用于长度144、288、576和864的XTEN。结果 呈现于表27中。等式IV应用于本文所述的具有两个、三个或四个 XTEN的各种CFXTEN融合蛋白。对于所有含有单一XTEN的 CFXTEN，XTEN半径比率具有值1。XTEN半径比率呈现于表28中。 含有5个XTEN插入物的pSD0092的XTEN半径比率具有值3.31。 总之，结果指示包括多个XTEN使XTEN半径比率增加至大于2的 值，其中四个插入物导致值高于三个插入物。
表27：包含XTEN的CFXTEN的半径计算结果
XEN长度 XTEN半径
42 4.8
144 5.9
288 6.9
576 8.4
864 9.5
表28：包含XTEN的CFXTEN的半径计算结果
实施例27：FVIII-XTEN与抗FVIII抗体的结合干扰
通过夹心式ELISA测定来测定插入CFXTEN融合蛋白的不同位 置中的XTEN影响抗FVIII抗体的结合的能力。分别结合A2和C2 结构域的两种抗FVIII抗体；即GMA-8021(Green Mountain Antibodies, Burlington,VT)和ESH8(American Diagnostica Inc.,Stamford,CT)用作 捕获抗体。不含有XTEN的FVIII-His-Myc蛋白用作所有ELISA的 校正标准物和阳性对照。产生单一XTEN插入A1、A2或A3结构域 中的另外含有His和Myc亲和标签的10个CFXTEN融合蛋白。基于 抗His捕获-抗Myc检测ELISA使各测试样本的蛋白质浓度标准化为 100％，所述ELISA是与抗FVIII抗体捕获-抗Myc检测ELISA同时 在同一板上操作。
简而言之，96孔板上的适当孔用GMA-8021、ESH8或抗His抗 体在4℃下涂布过夜，接着洗涤并用BSA阻断。将相等体积的相应 对照或融合蛋白引入双重孔中且使其与涂布的GMA-8021、ESH8或 抗His抗体在室温下相互作用2小时。在孵育之后，洗除未结合的物 质且添加兔抗Myc检测抗体并在室温下再孵育1小时。接着将板洗 涤且引入过氧化物酶缀合的驴抗兔二抗并在室温下孵育1小时。再次 将板洗涤，随后添加TMB底物且使反应进行5-20分钟。引入H2SO4 以终止反应且通过分光光度计在450nm下读取吸光度。
结果：结果呈现于表29中。总之，结果证明当抗FVIII捕获抗 体是GMA-8021(与A2结构域具有结合亲和力)时，相较于XTEN插 入A1或A3结构域中的CFXTEN，针对XTEN插入A2结构域中的 CFXTEN融合蛋白的两种抗体展现与FVIII的结合降低。相反，当抗 FVIII捕获抗体是与C2结构域具有结合亲和力的ESH8时，由任何 CFXTEN进行的结合不存在可辨别抑制或增强样式。
表29：FVIII-XTEN与抗FVIII抗体的结合干扰
aFVIII/Myc＝GMA-8021/Myc或ESH8/Myc抗体条件；aHis/Myc ＝抗His/Myc抗体条件
实施例28：CFXTEN融合蛋白在FVIII抑制剂存在下的活性测 定
抑制剂测试滴定程序：
抑制FVIII促凝血活性的所选抗体是自商业来源购买。抗体靶向 FVIII的所选结构域(例如A2、A3、C1、C2)且抑制FVIII依赖性促凝 血活性。为确定待在测定中利用的FVIII抑制剂的最优浓度，使用不 同量的在37℃下与表达具有His/Myc双重标签的野生型FVIII的基础 载体一起孵育2小时的各抑制性抗体，以及使用具有抗体和至少一种 CFXTEN融合蛋白的第二样本来进行初始滴定实验。样本接着在凝血 测定中用于测定FVIII活性。通过本文所述的Coatest测定程序测量 活性。个别地确定各抗体导致对FVIII活性的最优抑制的浓度。
抑制剂测试程序：
接着在FVIII抑制剂抗体的最优浓度下使用它们来测定测试样 本。个别地使CFXTEN和阳性对照样本与各抗体一起在37℃下孵育 2小时且接着收集样本并连同CFXTEN的未处理等分试样和阳性对 照一起用于Coatest活性测定中。在一些情况下，测试具有R1648A 突变的CFXTEN构建体以确定这种突变对如通过FVIII活性的保持 所量度的抑制剂抗性的影响(如果有的话)。
结果：
滴定实验的结果显示于图26中。数据指示相较于FVIII阳性对 照，为在50％程度上抑制CFXTEN LSD0049.002的促凝血活性所需 的抗体量右移约0.7数量级，从而指示相较于FVIII，具有三个XTEN 插入物(在对应于BDD-FVIII的氨基酸残基18、745和2332的插入点 处)的CFXTEN与抗体的结合性较低，反映在凝血活性的保持方面。
FVIII抑制剂抗体GMA8008和GMA8021的Coatest测定的结果 分别呈现于表30和31中。测试的所有未处理CFXTEN融合蛋白构 建体都展现促凝血活性，pBC00114FVIII阳性对照也是这样。相对于 未处理样本，阳性对照样本与FVIII抑制剂抗体一起预孵育导致测量 的凝血活性急剧降低至0.05-0.15(5-15％)，用针对C2结构域的 GMA8008抗体处理的大多数CFXTEN构建体也是这样。然而，相较 于FVIII对照，三个CFXTEN融合蛋白保留相对剩余活性的至少两 倍；LSD0049.020、LSD0053.024和LSD0056.025，各自具有三个XTEN 插入物。
CFXTEN样本显示相较于未处理样本，用针对A2结构域的 GMA8021抗体的抑制程度较低，所述抑制程度由额外数目的XTEN 插入物进一步降低(表列数据显示于表30中)。图29显示保留活性的 与对照的比率中值的图，其显示在插入的XTEN的数目与相对于对 FVIII对照的抑制，GMA8021抗体的抑制降低之间存在线性关系。类 似地，与对照值的比率的平均值±S.E.是2.26±0.12(对于1个XTEN)、 3.48+0.26(对于2个XTEN)和5.70±0.29(对于3个XTEN插入物)。相 较于FVIII对照，用GMA8021抗体处理的具有至少三个XTEN插入 物的CFTXEN的FVIII活性保持大至少4.5至9.2倍。此外，在具有 三个XTEN插入物的那些CFXTEN中，相较于更紧密群集的插入物 (例如在B结构域的C末端侧上)，任何两个插入物之间的分隔程度(以 氨基酸残基的数目计)较高的构建体似乎产生较高程度的促凝血活 性，且因此，由FVIII抑制剂抗体的结合较小。具有R1648A突变的 构建体的测定结果似乎与无所述突变的那些构建体类似。
结论：结果支持在实验条件下，将XTEN插入FVIII中产生针对 由FVIII抑制剂的结合的保护作用，其中促凝血活性得以保持，且包 括多个XTEN插入物使对特别是A2结构域抑制剂抗体的抗性增加。 最后，通过在XTEN插入物之间具有空间分隔，似乎存在影响。
表30：用针对C2结构域的抗体GMA8008处理的CFXTEN的 凝血测定的结果
相对于相应未处理样本的剩余活性的比例
相较于FVIII pBC0114阳性对照的相对剩余活性(相对于它自身 对照)的比率
表31：用针对A2结构域的抗体GMA8021处理的CFXTEN的 凝血测定的结果
相对于相应未处理样本的剩余活性的比例
相较于FVIII pBC0114阳性对照的相对剩余活性(相对于它自身 对照)的比率
实施例29：CFXTEN融合蛋白pBC0145和pBC0146的蛋白质 纯化
两个具有C末端XTEN的CFXTEN构建体用于建立纯化方法。 对于具有AE家族的含288个氨基酸的C末端XTEN的pBC0145(参 见表21中的序列)与具有AG家族的含288个氨基酸的C末端XTEN 的pBC0146(参见表21中的序列)两者，切向流过滤(TFF)步骤用于缓 冲液交换来自细胞培养物的澄清条件培养基。接着使用强阴离子交换 色谱树脂捕获产物，并接着使用VIIISelect亲和色谱(GE Healthcare) 进一步纯化。另一尺寸排阻色谱(GE Healthcare)作为第三精制步骤应 用于FVIII-pBC0146以移除高分子量物质。根据HPLC-SEC，两种融 合蛋白的纯度被视为可接受，且通过对两个CFXTEN构建体的显示 CFXTEN产物处于预期大小下的SDS-PAGE分析加以进一步确认。 两个分子的比活性与B结构域缺失的FVIII类似，如通过aPTT凝血 测定和FVIII浓度的ELISA测定所测量。
实施例30：CFXTEN融合蛋白pBC0145和pBC0146在HemA 和FVIII/VWF DKO小鼠中的药代动力学
8-12周龄的雄性FVIII敲除(HemA)小鼠或FVIII/VWF双重敲除 (DKO)小鼠用单次静脉内施用重组BDD-FVIII、CFXTEN pBC0145或 pBC0146融合纯化蛋白(来自实施例23)在200IU/kg剂量下治疗(n＝ 4/时间点)。在所选时间点，通过腔静脉取样收集血液样本。在HemA 小鼠中，在给药后5分钟、1、4、8、16、20、24、32和48小时(针 对rBDD-FVIII)，以及在给药后5分钟、8、16、24、32、48、55和 72小时(针对pBC0145和pBC0146融合蛋白)收集血液样本。在 FVIII/VWF DKO小鼠中，在给药后5分钟、30分钟和1小时(针对 rBDD-FVIII)，以及在给药后5分钟、4、8、16和24小时(针对pBC0145 和pBC0146融合蛋白)收集血液样本。通过FVIII显色测定测量血浆 FVIII活性且通过WinNonlin程序分析PK分布。
结果：如表32和图24中所示，相较于rBDD FVIII，具有AE C 末端XTEN插入物的CFXTEN(pBC0145)在HemA小鼠和FVIII/VWF DKO小鼠中分别展现FVIII半衰期(T1/2)延长1.6倍和14.1倍。相较 于rBDD-FVIII，具有AG C末端XTEN插入物的CFXTEN(pBC0146) 在HemA小鼠和FVIII/VWF DKO小鼠中的半衰期分别延长1.4倍和 14.4倍。相较于HemA小鼠，由XTEN插入物赋予的FVIII半衰期延 长幅度在FVIII/VWF DKO小鼠中显著得多，由相较于rBDD-FVIII， FVIII-AE-XTEN与FVIII-AG-XTEN两者的FVIII半衰期均长14倍所 证明。此外，相较于rBDD-FVIII，在DKO小鼠中，具有C末端AE 或AG-XTEN插入物的FVIII也具有在5分钟间隔下显著改进的FVIII 回收率、降低的清除率和分布体积、以及增加的AUC。在实验条件 下，具有C末端XTEN插入物的CFXTEN显示关于FVIII半衰期延 长的巨大潜力，且当与其它FVIII结构域内插入物组合时可潜在进一 步延长FVIII半衰期。
表32：CFXTEN在HemA和FVIII/VWF DKO小鼠中的药代动 力学参数
相较于rBDD-FVIII
实施例31：CFXTEN融合蛋白pSD0050和pSD0062的细胞培 养物和细胞培养基的浓缩
使用聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences Inc.Warrington,PA)将 CFXTEN构建体变体：144个氨基酸的结构域内AG XTEN插入在 BDD FVIII的氨基酸残基26之后的pSD0050、144个氨基酸的结构 域内AE XTEN插入在BDD FVIII的残基1900(注意：氨基酸编号是 基于全长FVIII)之后的pSD0062、以及编码rBDD-FVIII的构建体转 染至HEK293F细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。使短暂转染的细胞 在293Free Style培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生长4天且接着通 过Centricon旋转柱(100kDa MW截断值)将50-100ml细胞培养基浓 缩10至20倍以达到10-30IU/ml FVIII活性。接着快速冷冻浓缩物质 且储存在-80℃下以用于未来体外分析和体内药代动力学研究。
实施例32：CFXTEN融合蛋白pSD0050和pSD0062在HemA 和FVIII/VWF DKO小鼠中的药代动力学
8-12周龄的雄性HemA或FVIII/VWF双重敲除(DKO)小鼠用单 次静脉内施用来自实施例31的含有重组BDD-FVIII、CFXTEN pBD0050或pBD062的细胞培养浓缩物以100-300IU/kg治疗(n＝3/ 组)。在所选时间点，通过眶后放血自同一组小鼠收集血液样本。在 HemA小鼠中，在给药后5分钟、24小时和48小时收集血液样本， 而在FVIII/VWF DKO小鼠中，在5分钟、8小时和16小时收集血液 样本。通过FVIII显色测定分析血浆样本和细胞培养浓缩物的FVIII 活性，且使用WinNonlin程序分析rBDD FVIII和FVIII-XTEN变体 的PK分布。
结果：两个CFXTEN结构域内插入变体pSD0050和pSD0062以 及rBDD-FVIII在HemA小鼠和FVIII/VWF DKO小鼠中的PK分布 显示于图25和表33中。在HemA小鼠中，观察到三个测试FVIII分 子在5分钟间隔下的初始回收率类似。相较于野生型BDD-FVIII，两 种CFXTEN融合蛋白均显示半衰期长2倍。在FVIII-VWF DKO小鼠 中，由于VWF保护作用丧失，rBDD-FVIII仅具有15分钟的血浆半 衰期。然而，在两个CFXTEN的情况下，半衰期分别延长至3.15小 时和3.83小时；所述数值与具有288C末端XTEN插入物的 CFXTEN(实施例24)类似，从而表明在给定插入点处进一步延长 XTEN长度可能不是必需的。在实验条件下，研究结果明确证明具有 144个氨基酸残基的XTEN的结构域内插入不仅使FVIII活性保持， 而且也提供与C末端288氨基酸XTEN插入变体类似的FVIII半衰期 益处，从而表明FVIII结构域内插入物和C末端插入物的组合可使 FVIII半衰期进一步延长。
表33：CFXTEN在HemA和FVIII/VWF DKO小鼠中的药代动 力学参数
相较于rBDD-FVIII
实施例33：CFXTEN融合多肽在大鼠中的药代动力学分析
相较于单独FVIII在Sprague-Dawley大鼠中测试各种CFXTEN 融合蛋白的药代动力学。通过颈静脉导管以3-10μg/大鼠向雌性 Sprague-Dawley大鼠(n＝3)施用CFXTEN和FVIII。在给药前、0.08、 0.5、1、2、4、8、24、48、72小时时间点将血液样本(0.2mL)收集至 预冷冻的肝素化管中，且处理成血浆。使用用于捕获与检测两者的抗 FVIII抗体，通过ELISA测定对测试物品进行定量。在WinNonLin 中进行非区室分析，其中在拟合中包括所有时间点以确定PK参数。 预期结果显示相较于单独FVIII，CFXEN的终末半衰期和曲线下面积 增加，且分布体积降低，且结果连同来自凝血和药效学测定的结果一 起用于选择具有所需性质的那些融合蛋白构型。
实施例34：分析FVIII的XTEN插入位点
通过预测容许位点在环结构或另外可挠性表面暴露的结构元件 内的位置来对因子VIII分子内的XTEN插入位点进行选择。对于这 些分析，使用FVIII的两个独立测定的X射线晶体结构的原子坐标 (Shen BW等The tertiary structure and domain organization of coagulation factor VIII.Blood.(2008)2月1日；111(3):1240-1247；Ngo JC等Crystal structure of human factor VIII:implications for the formation of the factor IXa-factor VIIIa complex.Structure (2008)16(4):597-606)，以及因子VIII和因子VIIIa的由分子动态模拟 (MDS)获得的那些原子坐标(Venkateswarlu,D.Structural investigation of zymogenic and activated forms of human blood coagulation factor VIII: a computational molecular dynamics study.BMC Struct Biol.(2010) 10:7)。分析呈蛋白质数据库(PDB)格式的原子坐标以使用算法 ASAView(Ahmad S等ASAView:database and tool for solvent accessibility representation in proteins.BMC Bioinformatics(2004)5:51) 和GetArea(Rychkov G,Petukhov M.Joint neighbors approximation of macromolecular solvent accessible surface area.J Comput Chem(2007) 28(12):1974-1989)鉴定FVIII/FVIIIa的预测具有高度溶剂可及表面积 的区域。接着根据基于MDS研究的公开结果预测的高原子位置波动 进一步优先考虑所得位点组。去除对侧接A1、A2和A3结构域的酸 性肽区域内的位点以及根据目视检查似乎在除表面暴露的环以外的 区域中的那些位点的优先考虑。基于物种间序列保守性评估所得潜在 位点组，其中在20个脊椎动物物种之中在序列高度保守的区域中的 那些位点被分级为更有利。另外，也在融合位点选择中考虑推定清除 受体结合位点、FVIII与其它分子(如vWF、FIX)的相互作用位点、结 构域和外显子边界。最后，去除紧密邻近于牵涉于甲型血友病中的在 甲型血友病突变、搜寻、测试和资源中心(Haemophilia A Mutation, Search,Test and Resource Site，HAMSTeRS)数据库中所列的突变内的 位点(Kemball-Cook G等The factor VIII Structure and Mutation Resource Site:HAMSTeRS第4版.Nucleic Acids Res.(1998) 26(1):216-219)。基于这些准则，提出42个供XTEN插入的 FVIII-XTEN变体的构造。在这些构造中，3个代表XTEN插入在残 余B结构域序列内，2个代表延伸至因子VIII分子的C末端，且37 个代表XTEN插入在结构确定的结构域间和结构域内结构元件内； 所述结构元件即残基3、18、22、26、40、60、116、130、188、216、 230、333、375、403、442、490、518、599、713、745、1720、1796、 1802、1827、1861、1896、1900、1904、1937、2019、2068、2111、 2120、2171、2188、2227、2277和2332。
实施例35：对FVIII-XTEN构建体的功能性分析
两个FVIII-XTEN融合蛋白FVIII-AE288(F8X-40)和FVIII-AG28 8(F8X-41)分别含有融合在FVIII C2结构域的C末端处的AE288_1 XTEN或AG288_1XTEN。为确定在XTEN融合之后，FVIII活性是 否得以保留，通过使用聚乙烯亚胺(PEI)在无血清培养基中用这两个F VIII-XTEN融合构建体分别转染HEK293细胞。在转染后3或5天， 通过两级显色测定测试细胞培养上清液的FVIII活性。相对于WHO 国际标准物校准的纯化重组FVIII用于建立显色测定中的标准曲线。 F8X-40构建体与F8X-41构建体两者的融合蛋白产物均在与野生型B DD-FVIII构建体的水平类似的水平下表达。(表34)。
表34.短暂转染细胞培养物中的FVIII-XTEN融合蛋白的FVIII 效价
a.FVIII 066与pBC 0114两者均含有无XTEN融合物的B结构域 缺失的FVIII。
b.F8X-41样本来自3天转染而其它样本来自5天短暂转染。
实施例36：对FVIII-XTEN构建体的功能性分析：FVIII活性和 PK性质
通过流体动力学质粒DNA注射来评估F8X-40和F8X-41构建体 在FVIII和血管性血友病因子双重敲除小鼠中的半衰期延长潜力，其 中FVIIIFc DNA构建体充当阳性对照。将小鼠随机分成3组，其中 每组4只小鼠。向相应组中的小鼠施用编码BDD FVIIIFc融合蛋白、 F8X-40或F8X-41的都共有相同DNA载体骨架的质粒DNA。通过流 体动力学注射将约100微克适当质粒DNA注射至各小鼠中，且在注 射后24小时和48小时收集血液血浆样本。使用校正的重组FVIII作 为标准物，通过两级显色测定测量血浆FVIII活性。如图23中所示， 来自F8X-40和F8X-41组的样本显示血浆FVIII效价高于由BDD FVIIIFc获得的效价，从而表明FVIII与XTEN融合使FVIII体内半 衰期延长。总之，这些数据支持以下结论：FVIII-XTEN融合蛋白在 短暂转染中保留FVIII活性且展现在动物模型中的循环半衰期延长。
实施例37：对CFXTEN在动物模型中的药效学评估
使用多种临床前流血模型评估CFXTEN融合蛋白的体内药理学 活性，所述模型包括但不限于血友病、手术、创伤、血小板减少/血 小板功能障碍、氯吡格雷/肝素诱发的流血和流体动力学注射的模型。 使用等效于针对其它FVIII方案使用和公开的方法的方法，在包括小 鼠、大鼠、兔和狗的多个物种中开发这些模型。CFXTEN组合物是提 供于可与体内施用相容的水性缓冲液(例如：磷酸盐缓冲生理盐水或 Tris缓冲生理盐水)中。以针对特定模型而加以最优化的适当剂量、给 药频率、给药时程和施用途径施用组合物。功效测定包括尤其FVIII 活性、单级凝结测定、FVIII显色测定、活化的部分凝血酶原时间 (aPTT)、流血时间、全血凝结时间(WBCT)、血栓弹力描记(TEG或 ROTEM)的测量结果。
在PD模型的一个实例中，向遗传缺陷性或实验诱发性HemA小 鼠施用CFXTEN和FVIII。在施用后各种时间点，通过ELISA测量 FVIII和CFXTEN的水平，通过可商购获得的FVIII活性试剂盒测量 FVIII和CFXTEN的活性且通过aPTT测定测量凝结时间。总之，结 果可指示相较于FVIII，CFXTEN构建体在频率较小或更适宜的给药 间隔下可更有效抑制流血，和/或效能等效于类似剂量的FVIII。
在一小鼠流血激发PD模型中，向遗传缺陷性或实验诱发性 HemA小鼠施用CFXTEN和FVIII且测量对止血激发的作用。止血激 发可尤其包括尾部横切激发、血液关节病变关节病变激发、关节流血 或隐静脉激发。在施用后各种时间点，通过ELISA测量FVIII和 CFXTEN的水平，通过可商购获得的FVIII活性试剂盒测量FVIII和 CFXTEN的活性，测量流血时间，且通过aPTT测定测量凝结时间。 总之，预期结果指示相较于FVIII，CFXTEN构建体在频率较小或更 适宜的给药间隔下更有效抑制流血，和/或效能等效于类似剂量的 FVIII，且结果连同来自凝血和其它测定的结果一起用于选择具有所 需性质的那些融合蛋白构型。
在狗PD模型中，向遗传缺陷性血友病狗施用CFXTEN和FVIII。 在施用后各种时间点，通过ELISA测量FVIII和CFXTEN的水平， 通过可商购获得的FVIII活性试剂盒测量FVIII和CFXTEN的活性且 通过aPTT测定测量凝结时间。总之，结果指示相较于FVIII，CFXTEN 构建体在频率较小或更适宜的给药下可更有效抑制流血，和/或效能 等效于类似剂量的FVIII，且结果连同来自凝血和其它测定的结果一 起用于选择具有所需性质的那些融合蛋白构型。
在一狗流血激发PD模型中，向遗传缺陷性血友病狗施用 CFXTEN和FVIII且测量对止血激发的作用。止血激发尤其包括角质 层流血时间。在施用后各种时间点，通过ELISA测量FVIII和CFXTEN 的水平，通过可商购获得的FVIII活性试剂盒测量FVIII和CFXTEN 的活性，测量流血时间，且通过aPTT测定测量凝结时间。总之，结 果指示相较于FVIII，CFXTEN构建体在频率较小或更适宜的给药间 隔下可更有效抑制流血，和/或效能等效于类似剂量的FVIII，且结果 连同来自凝血和其它测定的结果一起用于选择具有所需性质的那些 融合蛋白构型。
其它临床前流血模型包括但不限于血友病、手术、创伤、血小板 减少/血小板功能障碍、氯吡格雷/肝素诱发的流血和流体动力学注射 的模型。可使用等效于针对其它FVIII方案使用和公开的方法的方法， 在包括小鼠、大鼠、兔和狗的多个物种中开发这些模型。总之，结果 指示相较于FVIII，CFXTEN构建体在频率较小或更适宜的给药间隔 下可更有效抑制流血，和/或效能等效于类似剂量的FVIII，且结果连 同来自凝血和其它测定的结果一起用于选择具有所需性质的那些融 合蛋白构型。
实施例38：具有裂解序列的CFXTEN
可由FXIa释放的C末端XTEN
产生由XTEN蛋白融合于FVIII的C末端所组成的CFXTEN融 合蛋白，其具有置放在FVIII与XTEN组分之间的XTEN释放位点裂 解序列，如图12中所描绘。示例性序列提供于表51中。在这个情况 下，将含有由FXIa蛋白酶(EC 3.4.21.27，Uniprot P03951)识别并裂解 的氨基酸序列的释放位点裂解序列并入CFXTEN中。具体来说，氨 基酸序列KLTRAET(SEQ ID NO:1688)是在序列的精氨酸之后由 FXIa蛋白酶切割。FXI是在内源性或接触活化的凝血路径中紧靠 FVIII之前定位的促凝血蛋白酶。活性FXIa是通过由FXIIa蛋白水解 裂解酶原来自FXI产生。FXIa的产生受严密控制且仅在凝血为适当 止血所必需时发生。因此，通过并入KLTRAET裂解序列(SEQ ID NO: 1688)，XTEN结构域仅与内源性凝血路径的活化同时且当凝血为生 理所需时自FVIII移除。这产生在内源性路径的活化期间，CFXTEN 融合蛋白是以另一方式处理的情况。
可由FIIa(凝血酶)释放的C末端XTEN
产生由XTEN蛋白融合于FVIII的C末端所组成的CFXTEN融 合蛋白，其具有置放在FVIII与XTEN组分之间的XTEN释放位点裂 解序列，如图12中所描绘。在这个情况下，释放位点含有由FIIa蛋 白酶(EC 3.4.21.5，Uniprot P00734)识别并裂解的氨基酸序列。具体来 说，序列LTPRSLLV(SEQ ID NO:1618)[Rawlings N.D.等(2008) Nucleic Acids Res.,36:D320]是在序列中的位置4处的精氨酸之后被 切割。活性FIIa是通过在磷脂和钙存在下由FXa裂解FII来产生且在 凝血路径中处于因子IX的下游。一旦活化，它在凝血中的天然作用 将裂解纤维蛋白原(图2)，所述纤维蛋白原接着又开始形成凝块。FIIa 活性受严密控制且仅在凝血为适当止血所必需时存在。因此，通过并 入LTPRSLLV序列(SEQ ID NO:1618)，XTEN结构域仅与外源性或 内源性凝血路径的活化同时，且当凝血为生理所需时自FVIII移除。 这产生在凝血的活化期间，CFXTEN融合物是以另一方式处理的情 况。
可由弹性蛋白酶-2释放的C末端XTEN
产生由XTEN蛋白融合于FVIII的C末端所组成的CFXTEN融 合蛋白，其具有置放在FVIII与XTEN组分之间的XTEN释放位点裂 解序列，如图12中所描绘。示例性序列提供于表51中。在这个情况 下，释放位点含有由弹性蛋白酶-2蛋白酶(EC 3.4.21.37，Uniprot P08246)识别并裂解的氨基酸序列。具体来说，序列LGPVSGVP(SEQ ID NO:1689)[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]是 在序列中的位置4之后被切割。弹性蛋白酶由嗜中性白细胞组成性表 达且一直存在于循环中。它的活性受丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin) 严密控制且因此在大多数时间具有最小活性。因此，当长寿命的 CFXTEN循环时，它的一部分被裂解，从而产生待用于凝血中的较短 寿命的FVIII集合。在本发明组合物的一合乎需要的特征中，这产生 恒定释放防治性量的FVIII的循环前药储槽。
可由MMP-12释放的C末端XTEN
产生由XTEN蛋白融合于FVIII的C末端所组成的CFXTEN融 合蛋白，其具有置放在FVIII与XTEN组分之间的XTEN释放位点裂 解序列，如图12中所描绘。示例性序列提供于表51中。在这个情况 下，释放位点含有由MMP-12蛋白酶(EC 3.4.24.65，Uniprot P39900) 识别并裂解的氨基酸序列。具体来说，序列GPAGLGGA(SEQ ID NO: 1690)[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]是在序列 的位置4之后被切割。MMP-12组成性表达于全血中。因此，当长寿 命的CFXTEN循环时，它的一部分被裂解，从而产生待用于凝血中 的较短寿命的FVIII集合。在本发明组合物的一合乎需要的特征中， 这产生恒定释放防治性量的FVIII的循环前药储槽。
可由MMP-13释放的C末端XTEN
产生由XTEN蛋白融合于FVIII的C末端所组成的CFXTEN融 合蛋白，其具有置放在FVIII与XTEN组分之间的XTEN释放位点裂 解序列，如图12中所描绘。示例性序列提供于表51中。在这个情况 下，释放位点含有由MMP-13蛋白酶(EC 3.4.24.-，Uniprot P45452) 识别并裂解的氨基酸序列。具体来说，序列GPAGLRGA(SEQ ID NO: 1691)[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]是在位置 4之后被切割。MMP-13组成性表达于全血中。因此，当长寿命的 CFXTEN循环时，它的一部分被裂解，从而产生待用于凝血中的较短 寿命的FVIII集合。在本发明组合物的一合乎需要的特征中，这产生 恒定释放防治性量的FVIII的循环前药储槽。
可由MMP-17释放的C末端XTEN
产生由XTEN蛋白融合于FVIII的C末端所组成的CFXTEN融 合蛋白，其具有置放在FVIII与XTEN组分之间的XTEN释放位点裂 解序列，如图12中所描绘。示例性序列提供于表51中。在这个情况 下，释放位点含有由MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-，Uniprot Q9ULZ9) 识别并裂解的氨基酸序列。具体来说，序列APLGLRLR(SEQ ID NO: 1692)[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]是在序列 中的位置4之后被切割。MMP-17组成性表达于全血中。因此，当长 寿命的CFXTEN循环时，它的一部分被裂解，从而产生待用于凝血 中的较短寿命的FVIII集合。在本发明组合物的一合乎需要的特征中， 这产生恒定释放防治性量的FVIII的循环前药储槽。
可由MMP-20释放的C末端XTEN
产生由XTEN蛋白融合于FVIII的C末端所组成的CFXTEN融 合蛋白，其具有置放在FVIII与XTEN组分之间的XTEN释放位点裂 解序列，如图12中所描绘。示例性序列提供于表51中。在这个情况 下，释放位点含有由MMP-20蛋白酶(EC.3.4.24.-，Uniprot O60882) 识别并裂解的氨基酸序列。具体来说，序列PALPLVAQ(SEQ ID NO: 1693)[Rawlings N.D.等(2008)Nucleic Acids Res.,36:D320]是在位置 4(用箭头描绘)之后被切割。MMP-20组成性表达于全血中。因此，当 长寿命的CFXTEN循环时，它的一部分被裂解，从而产生待用于凝 血中的较短寿命的FVIII集合。在本发明组合物的一合乎需要的特征 中，这产生恒定释放防治性量的FVIII的循环前药储槽。
XTEN的释放速率的优化
可产生前述实施例的变体，其中改变并入在C末端、N末端处的 XTEN或内部XTEN的释放速率。因为由XTEN释放蛋白酶达成的 XTEN释放速率取决于XTEN释放位点的序列，所以通过改变XTEN 释放位点中的氨基酸序列，可控制XTEN释放速率。许多蛋白酶的 序列特异性在本领域中是熟知的，且记载在若干数据库中。在这个情 况下，使用底物的组合文库[Harris,J.L.等(2000)Proc Natl Acad Sci U SA,97:7754]或通过追踪如[Schellenberger,V.等(1993)Biochemistry, 32:4344]中所说明的对底物混合物的裂解来测绘蛋白酶的氨基酸特 异性。一替代方案是通过噬菌体展示来鉴定最优蛋白酶裂解序列 [Matthews,D.等(1993)Science,260:1113]。制备具有变异序列的构建 体且使用用于检测XTEN多肽的标准测定来测定XTEN释放。
实施例39：用于评估包含FVIII的CFXTEN的人临床试验设计
FS是意图用于促进甲型血友病受试者的止血的重组 人凝血因子VIII。由于它的半衰期较短，Kogenate是每隔一天进行静 脉内给药以进行防治且在治疗流血时是8至每12小时进行静脉内给 药直至实现止血。据信使一个或多个XTEN融合于FVIII会改善蛋白 质的半衰期，从而使得使用所述含有CFXTEN的融合蛋白组合物能 够降低给药频率。
设计临床试验以使CFXTEN相对于Kogenate或其它可商购获得 的FVIII制剂的功效和优势可在人中得以验证。所述研究包含三期。 首先，在成年患者中进行I期安全性和药代动力学研究以确定在人(正 常受试者或患有血友病的患者)中的最大耐受剂量以及药代动力学和 药效学，以及确定待在未来研究中追踪的潜在毒性和不利事件。进行 I期研究，其中通过所述途径(例如，皮下、肌肉内或静脉内)施用单 次升高剂量的CFXTEN组合物，且以确定间隔测量生物化学、PK和 临床参数。这允许确定最小有效剂量和最大耐受剂量且确定剂量和循 环药物的构成相应组分的治疗窗的阈值浓度和最大浓度，以及当通过 肌肉内或皮下途径施用时的生物可用度。根据这个信息，获得允许以 较小频率施用CFXTEN组合物，但保留药理学反应的剂量和给药时 程。此后，在患有病状的患者中进行临床试验，从而验证CFXTEN 组合物在各剂量条件下的有效性，所述临床试验可相较于如Kogenate 的阳性对照来进行以确定CFXTEN组合物的性质增强。
II期和III期临床试验是在罹患因子VIII可被预期来提供临床益 处的任何疾病的患者中进行。举例来说，CFXTEN在临床试验中用于 治疗核准使用因子VIII的适应症；所述适应症包括甲型血友病中的 流血事件，患者具有针对因子VIII的抑制剂，在手术介入或侵袭性 程序中防止具有针对因子VIII的抑制剂的甲型血友病患者的流血， 处理先天性缺乏因子VIII的患者的流血事件，以及在手术介入或侵 袭性程序中防止先天性缺乏因子VIII的患者的流血。CFXTEN也可 被指示在其它患者群体中使用。在甲型血友病患者中进行II期给药 研究，其中测量随融合蛋白组合物的给药而变的适于试验的药效学、 凝血、流血和其它生理、PK、安全性和临床参数以及临床终点，从 而除收集与不利事件相关的安全性数据之外也产生适于随后III期试 验的关于剂量的剂量范围信息。使PK参数与生理、临床和安全性参 数数据相关联以确定CFXTEN组合物的治疗窗和治疗剂量方案，从 而允许临床医师确定组合物的适当剂量范围。在一个试验中，将评估 具有因子VIII抑制剂的甲型血友病患者以确定CFXTEN药物组合物 的导致实现和维持止血以及防止或减弱流血事件的剂量和剂量方案。 最后，进行III期功效研究，其中使用鉴于相应组合物的由II期研究 结果获得的药代动力学和药效学性质而视为适当的给药时程向患者 施用CFXTEN药物组合物和阳性对照(如可商购获得的Kogenate)，其 中所有药剂都持续适当延长的时期施用以完成研究。监测的参数包括 aPTT测定、单级或两级凝结测定、流血事件的控制或自发性流血事 件的出现；所述参数是相对于安慰剂或阳性对照组加以追踪。使用标 准统计方法确定功效结果。在这个研究中也追踪毒性和不利事件指标 以验证化合物在以所述方式使用时是安全的。在另一III期试验中， 将评估具有因子VIII抑制剂的甲型血友病患者以确定CFXTEN药物 组合物实现和维持止血以及防止或减弱流血事件的有效性。
实施例40：具有不同有效负载的XTEN融合蛋白的分析型尺寸 排阻色谱
对含有各种治疗性蛋白质和长度递增的非结构化重组蛋白的融 合蛋白进行尺寸排阻色谱分析。一示例性测定使用TSKGel-G4000 SWXL(7.8mmx30cm)柱，其中用20mM磷酸盐(pH 6.8)、114mM NaCl以流速0.6ml/min分离浓度是1mg/ml的40μg纯化胰高血糖素 (glucagon)融合蛋白。使用OD214nm和OD280nm监测色谱分布图。 所有测定的柱校准都是使用来自BioRad的尺寸排阻校准标准物来进 行；标示物包括甲状腺球蛋白(670kDa)、牛γ-球蛋白(158kDa)、鸡 卵清蛋白(44kDa)、马肌红蛋白(17kDa)和维生素B12(1.35kDa)。胰 高血糖素-Y288、胰高血糖素-Y144、胰高血糖素-Y72、胰高血糖素 -Y36的代表性色谱分布图以上覆形式显示于图21中。数据显示各化 合物的表观分子量与连接的XTEN序列的长度成比例。然而，数据 也显示各构建体的表观分子量显著大于对于球状蛋白质所预期的表 观分子量(如通过与在相同测定中操作的标准蛋白质进行比较所示)。 基于对评估的所有构建体(包括CFXTEN组合物)的SEC分析，表观 分子量、表观分子量因子(表示为表观分子量与计算分子量的比率)和 流体动力学半径(RH，以nm计)显示于表35中。结果指示并入576 个氨基酸或更多个氨基酸的不同XTEN赋予融合蛋白的表观分子量 约339kDa至760，且864个氨基酸或或更多个氨基酸的XTEN赋予 表观分子量大于约800kDA。表观分子量与实际分子量成比例增加的 结果对于用来自若干不同基序家族的XTEN产生的融合蛋白而言是 一致的；所述基序家族即AD、AE、AF、AG和AM，其中增加至少 4倍且比率高达约17倍。另外，将具有576个氨基酸或更多个氨基 酸的XTEN融合配偶体并入具有各种有效负载(且在胰高血糖素融合 于Y288的情况下是288个残基)的融合蛋白中产生流体动力学半径7 nm或更大，完全超出约3-5nm的肾小球孔尺寸。因此，预期包含生 长因子和XTEN的融合蛋白相对于相应未融合生物有效负载蛋白质 具有降低的肾清除率，从而有助于增加终末半衰期以及改进治疗或生 物作用。
表35：对各种多肽的SEC分析
实施例41：融合于GFP的延伸多肽在食蟹猕猴中的药代动力学
测试GFP-L288、GFP-L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTEN_ Y576和XTEN_AD836-GFP在食蟹猕猴中的药代动力学以确定非结 构化多肽的组成和长度对PK参数的影响。在注射之后各时间分析血 液样本且使用用于捕获的针对GFP的多克隆抗体和相同多克隆抗体 的用于检测的生物素化制剂，通过ELISA测量血浆中的GFP的浓度。 结果概述于图19中。它们显示半衰期随XTEN序列的长度增加而惊 人增加。举例来说，测定GFP-XTEN_L288(在XTEN中具有288个 氨基酸残基)的半衰期是10小时。使非结构化多肽融合配偶体的长度 倍增至576个氨基酸使多个融合蛋白构建体的半衰期增加至20-22小 时；所述构建体即GFP-XTEN_L576、GFP-XTEN_AF576、GFP-XTE N_Y576。使非结构化多肽融合配偶体长度进一步增加至836个残基 导致XTEN_AD836-GFP的半衰期是72-75小时。因此，使聚合物长 度自288个残基至576个残基增加288个残基使体内半衰期增加约1 0小时。然而，使多肽长度自576个残基至836个残基增加260个残 基使半衰期增加超过50小时。这些结果显示存在非结构化多肽长度 的导致体内半衰期大于成比例增加的惊人阈值。因此，预期包含延伸 非结构化多肽的融合蛋白相较于长度较短的多肽具有药代动力学增 强的性质。
实施例42：XTEN的血清稳定性
在37℃下在猴血浆和大鼠肾溶解产物中孵育含有融合于GFP的 N末端的XTEN_AE864的融合蛋白多达7天。在时间0、第1天和 第7天取样且依次通过SDS PAGE以及使用蛋白质印迹分析进行检测 和用针对GFP的抗体进行检测加以分析，如图20中所示。 XTEN_AE864的序列显示历经7天在血浆中的降解征象可忽略。然 而，历经3天，XTEN_AE864在大鼠肾溶解产物中快速降解。测试 融合蛋白在血浆样本中的体内稳定性，其中使GFP_AE864免疫沉淀 且如上所述通过SDS PAGE进行分析。在注射之后多达7天取出的样 本显示极少降解征象。结果证明CFXTEN对归因于血清蛋白酶的降 解具有抗性；所述抗性是CFXTEN融合蛋白的药代动力学性质增强 的因素。
实施例43：通过连接于XTEN来增加肽有效负载的溶解度和稳 定性
为评估XTEN增强物理化学性质溶解度和稳定性的能力，制备 且评估胰高血糖素加较短长度XTEN的融合蛋白。在Tris-缓冲生理 盐水中在中性pH下制备测试物品且通过反相HPLC和尺寸排阻色谱 表征Gcg-XTEN溶液以确认蛋白质在溶液中是均质和非聚集的。数 据呈现于表36中。出于比较目的，在60μM(0.2mg/mL)下测量未修 饰胰高血糖素在相同缓冲液中的溶解度限度，且结果证明对于添加的 所有XTEN长度，都实现溶解度的实质性增加。重要的是，在大多 数情况下，制备胰高血糖素-XTEN融合蛋白以实现靶标浓度且不评 估来确定给定构建体的最大溶解度限度。然而，在胰高血糖素连接于 AF-144XTEN的情况下，测定溶解度限度，结果是相较于未连接于 XTEN的胰高血糖素，溶解度实现增加60倍。此外，评估胰高血糖 素-AF144CFXTEN的稳定性，且发现在冷藏条件下以液体制剂形式 稳定至少6个月且在37℃下稳定约1个月(数据未显示)。
数据支持以下结论：使短长度XTEN多肽连接于如胰高血糖素 的生物活性蛋白质可显著增强就所得融合蛋白而言的蛋白质的溶解 度性质，以及赋予在较高蛋白质浓度下的稳定性。
表36：胰高血糖素-XTEN构建体的溶解度
测试物品 溶解度
胰高血糖素 60μM
胰高血糖素-Y36 >370μM
胰高血糖素-Y72 >293μM
胰高血糖素-AF108 >145μM
胰高血糖素-AF120 >160μM
胰高血糖素-Y144 >497μM
胰高血糖素-AE144 >467μM
胰高血糖素-AF144 >3600μM
胰高血糖素-Y288 >163μM
实施例44：通过预测算法对二级结构的序列的分析
可通过某些计算机程序或算法，如熟知的Chou-Fasman算法(Ch ou,P.Y.等(1974)Biochemistry,13:222-45)和Garnier-Osguthorpe-R obson或“GOR”方法(Garnier J,Gibrat JF,Robson B.(1996).GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence.Methods Enzymol 266:540-553)评估二级结构的氨基酸序 列。对于给定序列，算法可预测是否存在一些或完全不存在二级结构， 表示为序列中形成例如α螺旋或β折叠的总残基数和/或残基的百分 比或序列中预测会导致形成无规卷曲的残基的百分比。
已使用Chou-Fasman和GOR方法的两种算法工具评估来自XTE N“家族”的若干代表性序列以评估这些序列中的二级结构的程度。Ch ou-Fasman工具由William R.Pearson和弗吉尼亚大学(University of Virginia)在“Biosupport”因特网站提供，所述站点的URL在万维网上 位于.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝misc1(如 它在2009年6月19日所存在)处。GOR工具由Pole Informatique L yonnais在网络蛋白质序列分析(Network Protein Sequence Analysis) 因特网站提供，所述站点的URL在万维网上位于.npsa-pbil.ibcp.fr/cgi -bin/secpred_gor4.pl(如它在2008年6月19日所存在)处。
作为分析中的第一步，通过两种算法分析单一XTEN序列。 AE864组合物是具有自四个含12个氨基酸的序列基序的多个拷贝产 生的864个氨基酸残基的XTEN，所述基序由氨基酸G、S、T、E、 P和A组成。序列基序的特征在于以下事实：在基序内和在总体序列 内存在有限重复性，因为任何两个连续氨基酸的序列在任一含12个 氨基酸的基序中不重复超过两次，且全长XTEN中没有三个连续氨 基酸是相同的。通过Chou-Fasman和GOR算法(后者需要17个氨基 酸的最小长度)分析来自N末端的AF 864序列的连续较长部分。通过 将FASTA格式序列输入预测工具中且运行分析来分析序列。来自分 析的结果呈现于表37中。
结果指示，根据Chou-Fasman计算结果，AE和AG家族的多达 至少288个氨基酸残基的短XTEN不具有α螺旋或β折叠，但通过 GOR算法预测的无规卷曲百分比的量自78％至99％变化。随着504 个残基的XTEN长度增加至大于1300，通过Chou-Fasman算法分析 的XTEN的预测α螺旋或β折叠百分比是0至约2％，而计算的无规 卷曲百分比增加至94％-99％。具有α螺旋或β折叠的那些XTEN是 具有一个或多个导致形成预测β折叠的三个连续丝氨酸残基的情况 的那些序列。然而，即使这些序列也仍然具有约99％无规卷曲形成率。
本文提供的数据表明1)预测自G、S、T、E、P和A的关于连续 氨基酸具有有限重复性的多个序列基序产生的XTEN具有极低量的α 螺旋和β折叠；2)增加XTEN的长度不可观地增加α螺旋或β折叠形 成概率；以及3)通过添加由氨基酸G、S、T、E、P和A组成的非重 复12-mer来渐进增加XTEN序列的长度导致无规卷曲形成的百分比 增加。结果进一步指示预期本文定义的具有有限重复性(包括在任一 基序中具有至多两个相同连续氨基酸的XTEN序列)的XTEN序列(包 括例如自G、S、T、E、P和A的序列基序产生的XTEN)具有极有限 的二级结构。来自表3的序列基序的任何顺序或组合都可用于产生将 导致XTEN序列大致上缺乏二级结构的XTEN多肽，但三个连续丝 氨酸不是优选的。然而，三个连续丝氨酸的不利性质可通过增加 XTEN的长度来改善。预期所述序列具有本文公开的本发明的 CFXTEN实施方案中所述的特征。
表37：多肽序列的CHOU-FASMAN和GOR预测计算结果
H：α螺旋E：β折叠
实施例45：对多肽序列的重复性的分析
在这个实施例中，评估包括若干XTEN序列的不同多肽在氨基 酸序列方面的重复性。可通过定量较短子序列在总体多肽内出现的次 数来评估多肽氨基酸序列的重复性。举例来说，200个氨基酸残基长 度的多肽具有总计165个重叠36氨基酸“嵌段”(或“36-mer”)和198个 3-mer“子序列”，但独特3-mer子序列的数目将取决于序列内重复的 量。对于分析，通过确定通过应用以下等式获得的子序列计分来评估 不同多肽序列的重复性：
其中：m＝(多肽的氨基酸长度)–(子序列的氨基酸长度)+1；且 计数i＝序列i内各独特子序列的累积出现次数
在本实施例的分析中，在使用图27中描绘的算法的计算机程序 中使用前述等式确定表38的多肽的子序列计分，其中子序列长度设 置在3个氨基酸下。所得子序列计分是对多肽内重复性程度的反映。
表38中所示的结果指示由2或3个氨基酸类型组成的非结构化 多肽具有高子序列计分，而由六种氨基酸G、S、T、E、P和A的含 12个氨基酸的具有低程度的内部重复性的基序组成的那些多肽具有 小于10，且在一些情况下小于5的子序列计分。举例来说，L288序 列具有两种氨基酸类型且具有短高度重复序列，从而产生子序列计分 50.0。多肽J288具有三种氨基酸类型，但也具有短重复序列，从而产 生子序列计分33.3。Y576也具有三种氨基酸类型，但不由内部重复 序列构成，反映在历经前200个氨基酸的子序列计分是15.7。W576 由四种类型的氨基酸组成，但具有较高程度的内部重复性，例如 “GGSG”(SEQ ID NO:1694)，从而产生子序列计分23.4。AD576由四 种类型的含12个氨基酸的基序组成，各基序由四种类型的氨基酸组 成。由于个别基序的内部重复性的程度较低，历经前200个氨基酸的 总体子序列计分是13.6。相反，由含有六种类型的氨基酸的四个各自 具有低程度的内部重复性的基序组成的XTEN具有较低子序列计分； 即AE864(6.1)、AF864(7.5)和AM875(4.5)，而由含有五种类型的氨基 酸的四个基序组成的XTEN处于中等；即AE864具有计分7.2。
结论：结果指示将各自由四至六种非重复氨基酸类型组成的含 12个氨基酸子序列基序组合成较长XTEN多肽导致总体序列大致上 是非重复的，如通过总体子序列计分小于10，且在许多情况下小于5 所指示。这不考虑各子序列基序可跨越序列使用多次的事实。相反， 自较小数目的氨基酸类型产生的聚合物产生较高子序列计分，其中由 两种氨基酸类型组成的多肽具有的计分高于由三种氨基酸类型组成 的那些多肽。
表38：多肽序列的子序列计分计算结果
序列名称 SEQ ID NO: 计分
J288 1515 33.3
K288 1516 46.9
L288 1517 50.0
Y288 1518 26.8
Q576 1519 18.5
U576 1520 18.1
W576 1521 23.4
Y576 1522 15.7
AE288 1523 6.0
AG288_1 1524 6.9
AD576 1525 13.6
AE576 1526 6.1
AF540 1527 8.8
AF504 1528 7.0
AE864 1529 6.1
AF864 1530 7.5
AG864 1531 7.2
AG868 1532 7.5
AM875 1533 4.5
AE912 1534 4.5
AM923 1535 4.5
AM1296 1536 4.5
实施例46：计算TEPITOPE计分
9mer肽序列的TEPITOPE计分可通过如由Sturniolo[Sturniolo,T. 等(1999)Nat Biotechnol,17:555]所述添加口袋潜能(pocket potential) 来计算。在本实施例中，计算个别HLA等位基因的单独Tepitope计 分。表39显示以高频率存在于高加索人群体中的HLA0101B的口袋 潜能作为一实例。为计算具有序列P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9的肽 的TEPITOPE计分，添加表39中的相应个别口袋潜能。具有序列 FDKLPRTSG(SEQ ID NO:1695)的9mer肽的HLA0101B计分是0、 -1.3、0、0.9、0、-1.8、0.09、0、0的总和。
为评估长肽的TEPITOPE计分，可对序列的所有9mer子序列重 复所述过程。可对由其它HLA等位基因编码的蛋白质重复这个过程。 表40-43给出以高频率存在于高加索人群体中的HLA等位基因的蛋 白质产物的口袋潜能。
通过这个方法计算的TEPITOPE计分在约-10至+10的范围内。 然而，在P1位置中缺乏疏水性氨基酸的9mer肽(FKLMVWY(SEQ ID NO:1696))的计算TEPITOPE计分在-1009至-989的范围内。这个值 在生物学上无意义并反映疏水性氨基酸充当HLA结合的锚定残基的 事实且在P1中缺乏疏水性残基的肽被视为HLA的非结合剂。因为大 多数XTEN序列缺乏疏水性残基，所以9mer子序列的所有组合将具 有在-1009至-989的范围内的TEPITOPE。这个方法确认XTEN多肽 可具有少数或不具有预测T细胞表位。
表39：HLA0101B等位基因的口袋潜能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 -2.4 - -2.7 -2 - -1.9
E -999 0.1 -1.2 -0.4 - -2.4 -0.6 - -1.9
F 0 0.8 0.8 0.08 - -2.1 0.3 - -0.4
G -999 0.5 0.2 -0.7 - -0.3 -1.1 - -0.8
H -999 0.8 0.2 -0.7 - -2.2 0.1 - -1.1
I -1 1.1 1.5 0.5 - -1.9 0.6 - 0.7
K -999 1.1 0 -2.1 - -2 -0.2 - -1.7
L -1 1 1 0.9 - -2 0.3 - 0.5
M -1 1.1 1.4 0.8 - -1.8 0.09 - 0.08
N -999 0.8 0.5 0.04 - -1.1 0.1 - -1.2
P -999 -0.5 0.3 -1.9 - -0.2 0.07 - -1.1
Q -999 1.2 0 0.1 - -1.8 0.2 - -1.6
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
R -999 2.2 0.7 -2.1 - -1.8 0.09 - -1
S -999 -0.3 0.2 -0.7 - -0.6 -0.2 - -0.3
T -999 0 0 -1 - -1.2 0.09 - -0.2
V -1 2.1 0.5 -0.1 - -1.1 0.7 - 0.3
W 0 -0.1 0 -1.8 - -2.4 -0.1 - -1.4
Y 0 0.9 0.8 -1.1 - -2 0.5 - -0.9
表40：HLA0301B等位基因的口袋潜能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 2.3 - -2.4 -0.6 - -0.6
E -999 0.1 -1.2 -1 - -1.4 -0.2 - -0.3
F -1 0.8 0.8 -1 - -1.4 0.5 - 0.9
G -999 0.5 0.2 0.5 - -0.7 0.1 - 0.4
H -999 0.8 0.2 0 - -0.1 -0.8 - -0.5
I 0 1.1 1.5 0.5 - 0.7 0.4 - 0.6
K -999 1.1 0 -1 - 1.3 -0.9 - -0.2
L 0 1 1 0 - 0.2 0.2 - -0
M 0 1.1 1.4 0 - -0.9 1.1 - 1.1
N -999 0.8 0.5 0.2 - -0.6 -0.1 - -0.6
P -999 -0.5 0.3 -1 - 0.5 0.7 - -0.3
Q -999 1.2 0 0 - -0.3 -0.1 - -0.2
R -999 2.2 0.7 -1 - 1 -0.9 - 0.5
S -999 -0.3 0.2 0.7 - -0.1 0.07 - 1.1
T -999 0 0 -1 - 0.8 -0.1 - -0.5
V 0 2.1 0.5 0 - 1.2 0.2 - 0.3
W -1 -0.1 0 -1 - -1.4 -0.6 - -1
Y -1 0.9 0.8 -1 - -1.4 -0.1 - 0.3
表41：HLA0401B等位基因的口袋潜能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 1.4 - -1.1 -0.3 - -1.7
E -999 0.1 -1.2 1.5 - -2.4 0.2 - -1.7
F 0 0.8 0.8 -0.9 - -1.1 -1 - -1
G -999 0.5 0.2 -1.6 - -1.5 -1.3 - -1
H -999 0.8 0.2 1.1 - -1.4 0 - 0.08
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
I -1 1.1 1.5 0.8 - -0.1 0.08 - -0.3
K -999 1.1 0 -1.7 - -2.4 -0.3 - -0.3
L -1 1 1 0.8 - -1.1 0.7 - -1
M -1 1.1 1.4 0.9 - -1.1 0.8 - -0.4
N -999 0.8 0.5 0.9 - 1.3 0.6 - -1.4
P -999 -0.5 0.3 -1.6 - 0 -0.7 - -1.3
Q -999 1.2 0 0.8 - -1.5 0 - 0.5
R -999 2.2 0.7 -1.9 - -2.4 -1.2 - -1
S -999 -0.3 0.2 0.8 - 1 -0.2 - 0.7
T -999 0 0 0.7 - 1.9 -0.1 - -1.2
V -1 2.1 0.5 -0.9 - 0.9 0.08 - -0.7
W 0 -0.1 0 -1.2 - -1 -1.4 - -1
Y 0 0.9 0.8 -1.6 - -1.5 -1.2 - -1
表42：HLA0701B等位基因的口袋潜能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 -1.6 - -2.5 -1.3 - -1.2
E -999 0.1 -1.2 -1.4 - -2.5 0.9 - -0.3
F 0 0.8 0.8 0.2 - -0.8 2.1 - 2.1
G -999 0.5 0.2 -1.1 - -0.6 0 - -0.6
H -999 0.8 0.2 0.1 - -0.8 0.9 - -0.2
I -1 1.1 1.5 1.1 - -0.5 2.4 - 3.4
K -999 1.1 0 -1.3 - -1.1 0.5 - -1.1
L -1 1 1 -0.8 - -0.9 2.2 - 3.4
M -1 1.1 1.4 -0.4 - -0.8 1.8 - 2
N -999 0.8 0.5 -1.1 - -0.6 1.4 - -0.5
P -999 -0.5 0.3 -1.2 - -0.5 -0.2 - -0.6
Q -999 1.2 0 -1.5 - -1.1 1.1 - -0.9
R -999 2.2 0.7 -1.1 - -1.1 0.7 - -0.8
S -999 -0.3 0.2 1.5 - 0.6 0.4 - -0.3
T -999 0 0 1.4 - -0.1 0.9 - 0.4
V -1 2.1 0.5 0.9 - 0.1 1.6 - 2
W 0 -0.1 0 -1.1 - -0.9 1.4 - 0.8
Y 0 0.9 0.8 -0.9 - -1 1.7 - 1.1
表43：HLA1501B等位基因的口袋潜能。
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
A -999 0 0 0 - 0 0 - 0
C -999 0 0 0 - 0 0 - 0
D -999 -1.3 -1.3 -0.4 - -0.4 -0.7 - -1.9
E -999 0.1 -1.2 -0.6 - -1 -0.7 - -1.9
F -1 0.8 0.8 2.4 - -0.3 1.4 - -0.4
G -999 0.5 0.2 0 - 0.5 0 - -0.8
H -999 0.8 0.2 1.1 - -0.5 0.6 - -1.1
I 0 1.1 1.5 0.6 - 0.05 1.5 - 0.7
K -999 1.1 0 -0.7 - -0.3 -0.3 - -1.7
L 0 1 1 0.5 - 0.2 1.9 - 0.5
M 0 1.1 1.4 1 - 0.1 1.7 - 0.08
N -999 0.8 0.5 -0.2 - 0.7 0.7 - -1.2
P -999 -0.5 0.3 -0.3 - -0.2 0.3 - -1.1
Q -999 1.2 0 -0.8 - -0.8 -0.3 - -1.6
氨基酸 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9
R -999 2.2 0.7 0.2 - 1 -0.5 - -1
S -999 -0.3 0.2 -0.3 - 0.6 0.3 - -0.3
T -999 0 0 -0.3 - -0 0.2 - -0.2
V 0 2.1 0.5 0.2 - -0.3 0.3 - 0.3
W -1 -0.1 0 0.4 - -0.4 0.6 - -1.4
Y -1 0.9 0.8 2.5 - 0.4 0.7 - -0.9
实施例46：XTEN插入容许环中的评估。
XTEN AE42-4插入
具有XTEN AE42插入物的FVIII的构建和表达描述于实施例17 和24中。因此，当残基X表示插入位点且残基Z表示天然FVIII多 肽序列中的下一残基时，由插入XTEN AE42产生的多肽将含有序列：
X-GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASS-Z(SEQ ID NO：1697)
选择FVIII序列中的16个不同位点供XTEN AE42插入，且这些 位点是设计批次1。选择供XTEN AE42插入的额外21个位点是设计 批次2。总之，批次1和批次2位点代表A1结构域中的12个位点、 A2结构域中的7个位点、A3结构域中的10个位点、C1结构域中的 4个位点和C2结构域中的3个位点。批次1和2位点在FVIII的3D 结构中的位置描绘于图32中。
这些批次1和批次2插入位点的定位产生37个指定为pSD0001- pSD0004、pSD0009-pSD0012、pSD0023-pSD0032、pSD0034-pSD00 63[前述范围也包括所有中间编号]的构建体，其序列阐述于表21中 且其插入位点阐述于表23中。
体外测定
为评估FVIII对XTEN AE42-4插入物的耐受性，使用FVIII显色 测定分析来自FVIII-XTEN细胞培养物的培养基样本中的FVIII活性。 通过FVIII-HC(FVIII重链)和FVIII-LC(FVIII轻链)ELISA分析抗原表 达水平。
通过显色测定测量FVIII活性
使用来自DiaPharma的SP FVIII试剂盒(批号 N089019)测量FVIII活性，且所有孵育都在37℃板加热器上在振荡下 进行。使用1x FVIII缓冲液将来自6孔板的FVIII-XTEN AE42-4变体的短暂转染培养基的细胞培养收集物稀释至所需FVIII 活性范围。于含有模拟转染培养基的1x FVIII缓冲液中 制备FVIII标准物，所述缓冲液具有与测试样本匹配的培养基浓度。 重组因子VIII(rFVIII)标准物的范围是100mIU/mL至0.78mIU/mL。 一式两份添加标准物、稀释的细胞培养物样本和汇合的正常人血浆测 定对照至2HB 96孔板中(25μL/孔)。
依序添加新鲜制备的IXa/FX/磷脂混合物(50μL)、25μL 25mM CaCl2和50μL FXa底物至各孔中，其中在各次添加之间孵育5分钟。 在与底物一起孵育之后，添加25μL 20％乙酸以终止显色反应，且用 plus(Molecular Devices)仪器测量在405nm下的吸光 度。
使用SoftMax Pro软件(5.2版)进行数据分析。最低定量水平 (LLOQ)是39mIU/mL。结果呈现于表22中。
通过FVIII-HC和FVIII-LC ELISA测量表达
使用ELISA来定量变体的表达。通过FVIII-LC ELISA分析对应 于XTEN插入FVIII的A1和A2结构域中的DNA构建体的FVIII抗 原表达水平。通过FVIII-HC ELISA分析对应于XTEN插入FVIII的 A3、C1和C2结构域中的DNA构建体的FVIII抗原表达水平。结果 呈现于表22中。
通过用于FVIII-LC ELISA)的GMA011抗体(Green Mountain Antibodies)或通过用于FVIII-HC ELISA的GMA016抗体(Green Mountain Antibodies)捕获在收集之后细胞培养基中的FVIII-XTEN抗 原。通过在4℃下过夜孵育，用100μl/孔的抗FVIII抗体(2μg/ml)涂 布2HB 96孔板。各板接着用具有吐温-20的磷酸盐缓冲生 理盐水(PBST)洗涤四次且在室温下用阻断缓冲液(具有10％热失活马 血清的PBST)阻断1小时。
使用1x阻断缓冲液将来自6孔板的FVIII-XTEN变体的短暂转 染培养基的细胞培养收集物稀释至所需FVIII抗原范围。于含有模拟 转染培养基的1x FVIII阻断缓冲液中制备FVIII标准物，所述缓冲液 具有与测试样本匹配的培养基浓度。rFVIII标准物的范围是50ng/mL 至0.39ng/mL。
一式两份添加标准物、稀释的细胞培养物样本、和汇合的正常人 血浆测定对照至2HB 96孔板中(100μL/孔)且在37℃下孵 育2小时。在用PBST洗涤四次之后，添加100μl HRP-绵羊抗hFVIII 抗体(Affinity Biologicals，F8C-EIC-D)至各孔中且在37℃下孵育各板 1小时。在又用PBST洗涤四次之后，添加100μl TMB超灵敏底物 (Super Sensitive Substrate)(BioFX)至各孔中，随后显色5-10分钟。为 终止显色反应，添加50μL H2SO4至各孔中，且用SpectraMAX plus(Molecular Devices)仪器测量在450nm下的吸光度。
使用SoftMax Pro软件(5.4版)进行数据分析。最低定量水平 (LLOQ)是0.0039μg/mL。结果呈现于表22中。
将插入XTEN序列而不消除重组蛋白的促凝血活性或重组蛋白 在宿主细胞中表达的能力的容许位点群集在FVIII的三个A结构域的 各者中的环内。图36显示在显示FVIII活性的重组FVIII蛋白中的结 构域A1、A2和A3上的插入位点的位置。图33显示描绘显示FVIII 活性的重组FVIII蛋白中的插入位点的位置的结构示意图。
容许位点群集在溶剂暴露的高度可挠性表面环(XTEN容许环) 中。在成熟人FVIII的序列中，A1结构域环分别位于大致对应于氨 基酸位置15至45以及201至232的区域中(图30)。在成熟人FVIII 的序列中，A2结构域环分别位于大致对应于氨基酸位置395至421 以及577至635的区域中(图30)。在成熟人FVIII的序列中，A3结 构域环分别位于大致对应于氨基酸位置1705至1732以及1884至 1917的区域中(图30)。图37A和37B显示在FVIII的三维结构中， XTEN容许环相对于二级结构元件的位置。
实施例47：插入有具有144个氨基酸的XTEN的CFXTEN
对以上呈现的初步数据(实施例46)的分析表明在FVIII A结构域 的线性多肽序列和3D结构内存在可容纳XTEN序列的插入的确定区 域。为测试这个假设且进一步确定可容纳XTEN序列的插入而不损 失FVIII活性的推定区域的边界，选择23个不存在于批次1或2中 的额外插入位点且指定为批次3。
通过插入包含氨基酸残基Gly(G)、Ala(A)、Pro(P)、Ser(S)、Thr (T)和Glu(E)的含144个残基的XTEN AE多肽、或包含氨基酸残基G ly(G)、Ala(A)、Pro(P)、Ser(S)和Thr(T)的含144个残基的XTEN AG 多肽来产生批次3构建体。产生五种不同形式的含144个残基的AE 多肽且指定为XTEN-AE144-2A、XTEN-AE144-3B、XTEN-AE144-4 A、XTEN-AE144-5A、XTEN-AE144-6B。氨基酸序列如表4中所阐 述。产生五种不同形式的含144个残基的多肽且指定为XTEN-AG14 4-1、XTEN-AG144-A、XTEN-AG144-B、XTEN-AG144-C和XTEN- AG144-F。氨基酸序列如表4中所阐述。
通过化学合成跨越基础载体内最近独特限制位点的DNA区段 (DNA 2.0,Redwood City,CA)来在插入位点的任一侧上引入含144个 残基的XTEN的编码DNA序列。
插入对应于XTEN 144肽的DNA序列以使所得DNA构建体将 编码FVIII蛋白，其中XTEN 144蛋白序列紧靠在位点选择中指示的 残基之后插入，且由AscI和XhoI位点侧接。
除这些位点之外，通过用限制酶AscI及XhoI切除AE42多肽编 码DNA区段，且在相同位点处引入XTEN AE144和XTEN AG144 编码序列来修饰插入XTEN AE42多肽不消除FVIII促凝血活性所处 的来自批次1和2的那些位点。这些批次1，批次2和批次插入位点 的位置概述于表III中。图34呈现显示XTEN 144插入位点的位置的 FVIII结构示意图。
产生总计48个具有144XTEN插入物的构建体。构建体是 pSD0001-pSD0004、pSD0009-pSD0012、pSD0023-63[前述范围也包 括所有中间编号]，其序列阐述于表21中且其插入位点详述于表22 中。
FVIII-XTEN 144变体的表达
使用聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences Inc.Warrington,PA)或 Lipofectamine转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，将具有XTEN 144 插入物的FVIII变体转染至HEK293F细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA) 中。使短暂转染的细胞在293Free Style培养基或293Free Style与CD Opti CHO培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)的混合物中生长。在转染 之后3-5天收集细胞培养基且通过如本文所述进行的显色FVIII活性 测定和FVIII ELISA分析FVIII表达。
将来自短暂转染的细胞培养基在旋转柱(100kd截断 值)中浓缩10倍。接着快速冷冻浓缩物质且储存在-80℃下以用于未 来体外分析和体内PK研究。
体外测定
为评估FVIII对插入物的耐受性，使用FVIII显色测定分析来自 细胞培养物的培养基样本中的FVIII活性。通过FVIII-HC(FVIII重链) 和FVIII-LC(FVIII轻链)ELISA分析抗原表达水平。
通过显色测定测量FVIII活性以及通过FVIII-HC和FVIII-LC ELISA测量表达
如所述执行显色和ELISA测定方法。所得结果概述于表23中。
将插入XTEN序列而不消除重组蛋白的促凝血活性或重组蛋白 在宿主细胞中表达的能力的容许位点群集在FVIII的三个A结构域的 各者中的环内。发现耐受较短插入的XTEN序列的相同XTEN容许 环区域耐受较长XTEN序列的插入物。图38显示在显示FVIII活性 的重组FVIII蛋白中的结构域A1、A2和A3上的XTEN 144插入位 点的位置。图35显示描绘显示FVIII活性的重组FVIII蛋白中的插入 位点的位置的结构示意图。
这些观察结果指示FVIII的各A结构域内的两个区域能够容纳 XTEN序列的插入物而不损失FVIII辅因子活性。这些所谓XTEN容 许环的结构描绘(图40和41)证明它们在各A结构域中占据结构类似 位置且自FVIII分子的一面突出。鉴定的XTEN容许环对应于位于 A1、A2和A3结构域的三维结构中的β链之间的高度可挠性环，如 图37A和37B中所示。
实施例32中描述关于FVIII半衰期延长而对XTEN 144插入物 的体内评估，如通过药代动力学所确定。
实施例48：通过在FVIII的a3酸性肽区域内插入XTEN序列来 挽救或增强FVIII表达。
用FVIII-XTEN DNA构建体转染(如实施例24中所述)粘着 HEK293细胞，在所述构建体中，B结构域缺失的因子VIII的编码序 列含有2至4个各自具有144个氨基酸残基的XTEN插入物，组成 和插入位置如下表44中所指示。在转染后5天，通过显色测定(如实 施例25中所述)测定细胞培养上清液的FVIII活性。结果显示于表44 中。
表44.就在位置1720处含有XTEN以及一个、两个或三个额外 XTEN插入物的CFXTEN变体而言的FVIII活性的表达水平。
出于比较的目的，所有FVIII-XTEN构建体都在A3结构域内的 氨基酸位置1720(相对于全长因子VIII加以编号)处具有AG144 XTEN插入物。通过显色测定来测定FVIII-XTEN变体的表达水平且 用单位mIU/mL表示。在A1结构域中的位置26(LSD0040.002)或A2 结构域中的位置403(LSD0041.008)处具有单一额外XTEN插入物的 构建体分别产生表达水平175和279mIU/mL。相反，在a3酸性肽内 的位置1656处具有单一额外XTEN插入物的构建体产生表达水平 2598mIU/mL，从而证明相对于A1和A2插入构建体，a3XTEN插 入构建体的表达水平增强。此外，相较于在A1结构域中的位置26 和A3结构域中的位置1720处具有XTEN插入物的FVIII-XTEN构 建体(LSD0040.002)，在a3酸性肽区域内的位置1656处具有额外 XTEN插入物的构建体(PSD080.002)产生显著较高表达(分别是175和 1081mIU/mL)。与这些研究结果一致，在A2结构域中的位置403和 A3结构域中的位置1720处具有XTEN插入物的构建体(LSD0041.008) 产生表达水平279mIU/mL，而在a3酸性肽区域内的位置1656处的 额外XTEN插入物(PSD083.001)导致表达水平增加至789mIU/mL。 最后，具有在A1结构域内的位置26处的XTEN插入物和在A3结构 域内的位置1720和1900处的两个XTEN插入物的FVIII-XTEN构建 体(PSD082.001)不产生高于定量下限的活性。然而，在a3酸性肽区 域内具有额外XTEN插入物的FVIII-XTEN构建体(PSD090.003)产生 可检测活性，从而证明在a3结构域内包括XTEN序列可导致否则在 低于定量下限的水平下表达的FVIII-XTEN构建体的表达恢复(如通 过活性所量度)。在实验条件下，结果支持以下结论：在1656位置处 且推而广之在a3区域内插入XTEN会导致促凝血FVIII-XTEN组合 物的表达增强。
实施例49：XTEN插入物对通过aPTT测量的FVIII活性的影 响
除显色测定(如实施例25中所述)之外，单级活化的部分凝血酶 原(aPTT)凝血测定也用于测定各种FVIII-XTEN融合蛋白的FVIII活 性。
方法：使用Sysmex CA-1500仪器(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.,Tarrytown,NY)测量FVIII-XTEN aPTT活性。为产生用于测定的 标准曲线，WHO因子VIII标准物用2％模拟转染培养基稀释至100 mU/mL且接着进行2倍连续稀释，其中末个标准物是0.78mU/mL。 FVIII-XTEN细胞培养样本首先在1:50下用aPTT测定缓冲液稀释， 必要时用2％模拟转染培养基进行进一步稀释。
在稀释之后，如下使用Sysmex仪器进行aPTT测定：使50μl 稀释的标准物和样本与50μl人FVIII缺乏的血浆混合且接着与50μl aPTT试剂混合。在37℃下孵育混合物4分钟，且在孵育之后，添加 50μl CaCl2至混合物中，且立刻测量凝结时间。
为测定测试样本FVIII活性，使用半对数尺度(凝结时间：线性； 标准浓度：对数)绘制标准物的凝结时间以外推凝结时间与FVIII活性 之间的等式，且接着相对于标准曲线计算FVIII-XTEN活性。测定灵 敏度是40mU/mL因子VIII。
结果：结果概述于图44-46中。当将144或288个氨基酸的单一 XTEN插入FVIII中时，在显色测定中展现活性的所有FVIII-XTEN 融合蛋白也在aPTT测定中具有活性。aPTT活性遵循显色测定的趋 势，举例来说，在显色测定中显示低FVIII活性的那些分子也具有低 aPTT值。通常，融合蛋白的aPTT结果低于通过显色测定获得的结 果，其中显色与aPTT比率是1.1直至2.2，如图44中对于单一XTEN 插入物所说明。一般来说，具有多个XTEN插入物的FVIII-XTEN融 合蛋白显示aPTT活性相较于显色测定进一步降低。对具有两个 XTEN插入物的FVIII-XTEN的测定显示所有构建体都具有活性，但 其中在一些情况下，显色/aPTT比率接近4(图45)。对具有一些三个 XTEN插入物的FVIII-XTEN的测定也显示在两种测定中均具有活 性，其中在一些情况下，显色/aPTT比率接近5(图46)，而BDD FVIII 对照的比率更类似(图46的右侧)。另外，XTEN插入位点似乎促成在 aPTT活性与显色活性之间所见的差异。举例来说，尽管具有2个 XTEN插入物的一些分子产生的活性低于显色值多达4倍，但具有2 个XTEN的其它FVIII分子的aPTT活性与显色活性相当类似(图45)。 具有3个XTEN插入物的一些分子显示低于显色活性多达5倍，具 有3个XTEN的其它FVIII分子具有的aPTT活性低于显色活性小于 2倍(图45)。在实验条件下，结果支持以下结论：FVIII-XTEN融合 蛋白构建体保留促凝血活性，但显色分析通常提供的活性水平高于在 用于研究中的aPTT测定系统中的活性水平。
实施例50：评估XTEN插入位点对FVIII半衰期延长的影响
方法：在FVIII/VWF DKO小鼠中测试六个在确定位置处具有单 一XTEN AG-144插入物的FVIII-XTEN融合蛋白(大体上如实施例32 中所述)以评估XTEN插入位点对FVIII半衰期的影响。选择六个在 A1、A2、a3、A3-区域1(A3-R1)、A3-区域2(A3-R2)内或在C末端处 具有XTEN插入物的代表性XTEN变体(列于表1中)用于这个研究， 且自基础载体产生的BDD-FVIII用作对照。FVIII/VWF DKO小鼠用 单次静脉内施用来自六个FVIII-XTEN构建体的短暂转染细胞培养基 浓缩物(或阳性对照培养基)以100-200IU/kg治疗，且随后在给药后5 分钟、7小时及16小时收集血浆样本。使用FVIII显色测定测试血浆 FVIII活性且使用WinNonlin程序估计FVIII-XTEN半衰期。研究数 据概述于表45和图47中。
结果：相较于BDD-FVIII对照，观察到所有测试FVIII-XTEN变 体的半衰期都显著较长，但半衰期增加程度不同，其中在403插入位 点处具有XTEN的变体以10倍赋予最小半衰期延长(相较于对照)， 而1900插入变体以18倍赋予最大半衰期延长。XTEN插入位点关于 FVIII半衰期延长的差异可反映不同FVIII结构域在FVIII体内清除中 的作用。
表45：FVIII-XTEN单一AG-144插入变体在FVIII/VWF DKO 小鼠中的PK
实施例51：评估XTEN插入物对FVIII半衰期延长的累加作用。
方法：为评估多个XTEN插入物对FVIII-XTEN融合蛋白半衰期 的影响，使用来自五个构建体的细胞培养浓缩物测定具有1-3个 XTEN插入物的FVIII-XTEN变体在FVIII-XTEN DKO小鼠中的半衰 期(大体上如实施例32中所述)。在研究中测试五个FVIII-XTEN变体： 在位置1900(相对于全长因子VIII加以编号)处具有AE144插入物的 pSD-062；在FVIII B结构域(B结构域氨基酸位置745)中具有AE144 的pSD-0005；在FVIII C末端(CT)处具有AE288的pSD-0019；AE144 插入B结构域中且AE288插入在C末端处的LSD0003.006；以及具 有三个XTEN，其中AE144、AE144和AE288插入在位置1900处、 B结构域内和C末端处的LSD0055.021。使用WinNonlin程序估计 FVIII-XTEN半衰期值。
结果：研究结果概述于表46中，且PK曲线显示于图48中。研 究结果明确证明多个XTEN插入物对FVIII半衰期延长具有累加作 用。就单一XTEN插入物而言，FVIII的半衰期自0.25小时延长至 3.2-4.0小时，即增加13至16倍。当B及CT XTEN插入物组合在一 起时，FVIII半衰期进一步延长至10.6小时，即延长42倍。最后， 在于位置1900处向B/CT构建体中添加第三XTEN插入物的情况下， 在FVIII-VWF DKO小鼠中的半衰期达到16小时，即增加64倍。
表46：XTEN插入物对FVIII/VWF DKO小鼠中的FVIII t 1/2 的 累加作用
实施例52：使用毕提斯达测定评估FVIII-XTEN对抗FVIII抗 体的结合的干扰
评估FVIII分子中的XTEN插入物干扰由预先存在的抗FVIII抗 体结合FVIII-XTEN融合蛋白的能力以确定它们在治疗具有抗FVIII 抑制性抗体的患者方面具有效用。
方法：为评估抗FVIII抗体的结合，相较于Refacto(一种销售的 rFVIII)，针对来自3名具有因子VIII抑制剂的甲型血友病患者的血 浆样本(指定为04-483、05-505和GK1838-2079)以及来自Affinity Bi ologicals Inc的绵羊抗FVIII多克隆抗体(F8C-EIA-C)测试两个FVIII- XTEN变体(PSD088，其中144XTEN插入在位置26/403/1656/1900 处；和PSD-090，其中144XTEN插入在位置26/1656/1720/1900处)。 使用如下详述的改进毕提斯达测定方法测定四个抗FVIII抗体针对两 个FVIII-XTEN变体(pSD-088和pSD-090)和Refacto对照的毕提斯达 效价。以1:1比率使在各种稀释度下的热失活的抗FVIII抗体样本与 1IU/mL各FVIII变体(以1X于FVIII显色测定缓冲液中稀释)一起孵 育。接着在37℃孵育器中孵育FVIII/抗体混合物2小时。在孵育之后， 用1x FVIII显色测定缓冲液将样本稀释10倍，且25μL稀释混合 物接着用于FVIII显色测定。相对于已知非中和性样本的孵育后活性 计算剩余FVIII活性的百分比，使用下式计算毕提斯达单位：BU＝稀 释因子X(LN(剩余活性百分比)+6.6438)。
结果：结果列于表47中。当针对两个FVIII-XTEN变体测试时， 相较于Refacto，观察到所有四种抗体的毕提斯达单位(BU)效价降低。 分别获得针对PSD-088降低5至8倍以及针对pSD-090降低3至5 倍。绘制各抗体的针对FVIII变体的抑制曲线(图49)并与Refacto进 行比较，且显示两个FVIII-XTEN分子的抑制曲线明确左移，其中 pSD-088FVIII-XTEN变体相较于pSD-090导致进一步左移。这些结 果明确证明：1)两种FVIII-XTEN变异融合蛋白均比Refacto对预先 存在的抗FVIII抑制性抗体具有更大抗性；以及2)PSD-088比PSD-090 对抗FVIII抗体具有更大抗性，此可提供适用于确定XTEN插入位点 在干扰抗FVIII抗体的结合方面的差异的信息。在实验条件下，结果 提供对FVIII-XTEN组合物潜在用于治疗具有因子VIII抑制剂的甲型 血友病患者的一定支持。
表47：抗FVIII抗体针对FVIII-XTEN变体的毕提斯达效价
实施例53：含有四个XTEN插入物的FVIII XTEN融合分子在 甲型血友病小鼠中的半衰期评估
方法：在FVIII/VWF DKO小鼠中测试八个各自在确定位置处具 有四个XTEN插入物的FVIII-XTEN融合蛋白以评估XTEN插入物对 FVIII半衰期延长的影响：LSD0071.001，含有403-AG144、 1900-AE144、745(B)-AE144、2332(CT)-AE288XTEN插入物(指定为 FVIII氨基酸编号和插入的XTEN)；LSD0071.002，含有403-AE144、 1900-AE144、745(B)-AE144、2332(CT)-AE288XTEN插入物； LSD0072.001，含有403-AG144、1900-AG144、745(B)-AE144、 2332(CT)-AE288XTEN插入物；LSD0072.002，含有403-AE144、 1900-AG144、745(B)-AE144、2332(CT)-AE288XTEN插入物； pBC0247.004，含有18-AG144、403-AE144、1656-AG144、 2332(CT)-AE288XTEN插入物；pBC0251.002，含有18-AG144、 1656-AG144、1900-AE144、2332(CT)-AE288XTEN插入物；pSD088， 含有26-AG144、403-AE144、1656)-AG144、1900-AE144XTEN插入 物以及pSD090，含有26-AG144、1656-Ag144、1720-AG144、 1900-AE144XTEN插入物。大体上如实施例32中所述以100-200 IU/kg用单次静脉内施用八个构建体的FVIII-XTEN转染细胞培养基 浓缩物来治疗FVIII/VWF DKO小鼠，且随后在给药后5分钟、8小 时、24小时、48小时、72小时和96小时收集血浆样本。使用FVIII 显色测定测试血浆FVIII活性且使用WinNonlin程序估计FVIII-XTEN 半衰期。
结果：八个含有四个XTEN插入物的FVIII XTEN融合分子都展 现半衰期长于未修饰FVIII(结果在表48中)。XTEN插入在位置403、 1900、B结构域和C末端处的三个分子达成半衰期多达16.3小时， 此相较于未修饰BDD FVIII改进65倍。然而，用XTEN插入在 26/403/1656/1900处(pSD088)或在26/1656/1720/1900处(pSD090)测试 的分子分别显示半衰期9.1小时和9.5小时，此相较于BDD FVIII表 示分别增加36倍和38倍。pBC247.004(XTEN插入在18/403/1656/CT 处)和pBC251.002(XTEN插入在18/1900/1656/CT处)分别达成半衰期 值14.1小时和13小时。结果证明多个XTEN插入物(在这个情况下 是各FVIII分子具有四个XTEN插入物)可显著改进FVIII半衰期。进 一步显示XTEN对FVIII半衰期的影响具有插入位点依赖性，即使在 多个XTEN插入物的情况下也是这样。
表48：具有四个XTEN插入物的FVIII-XTEN变体在 FVIII/VWF DKO小鼠中的PK
治疗剂 XTEN插入物 t 1/2(小时) t1/2增加(倍数)
BDD-FVIII 无 0.25 NA
LSD0071.001 403AG/1900AE/B/CT 16.2 64.8
LSD0071.002 403AE/1900AE/B/CT 16.3 65.2
LSD0072.001 403AG/1900AG/B/CT 11.8 47.2
LSD0072.002 403AE/1900AG/B/CT 16.1 64.4
pBC247.004 18/403/1656/CT 14.1 56.4
pBC251.002 18/1900/1656/CT 13.0 52
pSD088 26/403/1656/1900 9.1 36.4
pSD090 26/1656/1720/1900 9.5 38
表49：示例性生物活性、示例性测定和优选适应症
表50：包含FVIII和内部/外部XTEN序列的示例性CFXTEN(按 照出现顺序分别是SEQ ID NO 1537-1554)
序列名称反映FVIII区段(氨基酸跨越编号是相对于成熟序列)和 XTEN组分的N末端至C末端构型
表51：包含FVIII、裂解序列和XTEN序列的示例性CFXTEN(按 照出现顺序分别是SEQ ID NO 1555-1590)
序列名称反映FVIII变体和XTEN组分的N末端至C末端构型： 信号肽(SP)；接头(L)；裂解序列(CS)可由对序列具有活性的蛋白酶名 称表示，且XTEN组分由家族名称和长度表示，其中组分的插入点 由邻近于插入序列的FVIII氨基酸和编号位置表示或A1是N末端且 Y2332是FVIII的C末端。