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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410609389.X(22)申请日 2014.11.04C12P 7/64(2006.01)C12R 1/245(2006.01)(71)申请人 南昌大学地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府大道 999 号(72)发明人 刘晓华 李海星(74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有限公司 36115代理人 施秀瑾(54) 发明名称一种共轭亚麻酸异构体的生物富集方法(57) 摘要一种共轭亚麻酸异构体的生物富集方法，包括生物富集培养基的制备、生产用菌种的制备、共轭亚麻酸异构体的生物富集等步骤，得到c9,t11,c15- 共轭。
2、亚麻酸异构体。本发明所得产品中 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的含量大于质量百分比 0.36%，底物的转化率大于 90%，通过生物富集培养，不仅得到富含 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的抗癌功能产品，脱脂大豆中的蛋白质和纤维素也被乳酸菌分解成多肽和可溶性膳食纤维等具有保健功能的活性因子，产物的保健功能显著增强，进一步拓宽了该产品的应用范围。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页 附图1页(10)申请公布号 CN 104480150 A(43)申请公布日 2015.04.01CN 104480150 A1/1 。
3、页21.一种共轭亚麻酸异构体的生物富集方法，其特征是包括以下步骤 ：（1）生物富集培养基的制备 ：将低温脱脂大豆浸泡，经磨浆机先粗磨后精磨，再经胶体磨处理得到混合乳浊液，煮沸，调整蛋白质含量为质量百分比 5-15%，得到基础培养基，经巴氏灭菌后得到用于生物富集的培养基 ；（2）生产用菌种的制备 ：将干酪乳杆菌 CGMCC 1.574 保藏菌种接入用于生物富集的培养基，37培养 24h，经三级扩大培养后，得到生产用菌种 ；（3）共轭亚麻酸异构体的生物富集 ：向生物富集培养基中接入质量百分比 5% 的步骤（2）的生产用菌种，同时加入基础培养基质量百分比 0.3-0.6% 的亚麻酸底物，混匀后于28。
4、-40，发酵培养 12-36h，得到 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体。2.根据权利要求 1 所述的共轭亚麻酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（1）中调整蛋白质含量为质量百分比 8%。3.根据权利要求 1 所述的共轭亚麻酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（1）中向基础培养基中加入质量百分比 0% 低聚糖 6%。4.根据权利要求 3 所述的共轭亚麻酸异构体的生物富集方法，其特征是向基础培养基中加入质量百分比 1% 的低聚果糖。5.根据权利要求 1 所述的共轭亚麻酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（1）中向基础培养基中加入质量百分比 1% 的低聚果糖。6.根据权利要。
5、求 1 所述的共轭亚麻酸异构体的生物富集方法，其特征是所述的步骤（3）中加入基础培养基质量百分比 0.4% 的亚麻酸底物，混匀后于 37，发酵培养 24h。权 利 要 求 书CN 104480150 A1/3 页3一种共轭亚麻酸异构体的生物富集方法技术领域0001 本发明属于生物医药技术领域。背景技术0002 共轭亚麻酸是亚麻酸的共轭异构体，是一组十八碳共轭三烯酸的统称，有多种位置异构和几何异构体，如 ： c9,t11,c15- 共轭亚麻酸和 t10,c12,c15- 共轭亚麻酸异构体等。研究表明共轭亚麻酸具有抗癌、预防动脉粥样硬化、减肥等生理功能，且其生理活性具有异构体特异性，如 ： c9,。
6、t11,c15- 共轭亚麻酸异构体具有抗癌和预防动脉粥样硬化的作用。在自然界中，共轭亚麻酸主要存在于反刍动物的奶和肉中的脂肪中，主要由 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸和少量 t9,t11,c15- 共轭亚麻酸等异构体构成，但其含量通常十分低，无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。0003 为实现共轭亚麻酸的大量制备，人们已对生物合成共轭亚麻酸进行了一些研究。但文献报道的共轭亚麻酸产量通常均小于 1mg/mL，且存在发酵周期长的缺点。发明专利CN200410060670.9报道了通过干酪乳杆菌CGMCC 1.574来特异性生物合成 c9,t11,c15-共轭亚麻酸异构体的方法，虽然产物纯度高。
7、，但是在乳酸菌常用培养基 MRS 和脱脂奶中的产量约为1mg/mL。在生物合成过程中，只有增加底物亚麻酸的量，产物 c9,t11,c15-共轭亚麻酸异构体的量才能增加，而当底物的含量超过 1mg/mL 时，乳酸菌在常用培养基 MRS 和脱脂奶中的生长就会收到抑制，从而限制了 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的合成。发明内容0004 本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种共轭亚麻酸异构体的高效生物富集方法，显著提高共轭亚麻酸异构体的生物合成量。0005 本发明包括以下步骤。0006 （1）生物富集培养基的制备 ：将低温脱脂大豆浸泡，经磨浆机先粗磨后精磨，再经胶体磨处理得到混合乳浊液，。
8、煮沸，调整蛋白质含量为质量百分比 5-15%，优选 8%，经巴氏灭菌后得到基础培养基。0007 （2）生产用菌种的制备 ：将干酪乳杆菌 CGMCC 1.574 保藏菌种接入用于生物富集的培养基，37培养 24h，经三级扩大培养后，得到生产用菌种。0008 （3）共轭亚麻酸异构体的生物富集 ：向生物富集培养基中接入质量百分比 5% 的步骤（2）的生产用菌种，同时加入基础培养基质量百分比 0.3-0.6% 的亚麻酸底物，优选 0.4%，混匀后于 28-40，优选 37，发酵培养 12-36h，优选 24h，得到 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体。0009 本发明所述的步骤（1）也可以再向基。
9、础培养基中加入质量百分比0%低聚糖 6%，优选 1% 的低聚果糖，经巴氏灭菌后得到用于生物富集的培养基。0010 在优化条件下，通过该方法富集后，发酵物中 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的含量为质量百分比 0.37%，亚麻酸的转化率为 92.5%。说 明 书CN 104480150 A2/3 页40011 本发明所用的乳酸菌是干酪乳杆菌（ Lactobacillus casei），保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为 CGMCC 1.574，该菌能产生特异性的异构酶，通过生物异构化将亚麻酸转化成 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体。0012 本发明针对生物合成共轭亚麻酸。
10、时存在产量低和发酵周期长的缺点，通过优化发酵培养基和条件，有效克服了高浓度亚麻酸底物对乳酸菌生长和合成共轭亚麻酸的影响，大大提高了发酵产品中共轭亚麻酸异构体的富集水平。本发明以脱脂大豆为基本培养基原料，将脱脂大豆用水浸泡后，经粗磨、精磨和胶体磨处理后得到的混合乳浊液，再通过添加低聚糖得到乳酸菌生物富集共轭亚麻酸异构体的培养基。该培养基中高浓度蛋白质、纤维素能有效降低亚麻酸对乳酸菌生长的抑制作用，亚麻酸的添加量可以达到培养基的质量百分比 0.6%。0013 本发明与现有技术相比具有如下优点 ：在本发明优选条件下，产品中 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的含量大于质量百分比0.36%，底物。
11、的转化率大于 90%。与该菌株在 MRS 和脱脂奶培养基中共轭亚麻酸异构体的富集水平低于质量百分比 0.1% 相比，产品中 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的含量显著增加，可以满足保健品和医药产品的进一步开发应用。0014 本发明通过生物富集培养，不仅得到富含 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的抗癌功能产品，脱脂大豆中的蛋白质和纤维素也被乳酸菌分解成多肽和可溶性膳食纤维等具有保健功能的活性因子。所得产物的保健功能显著增强，进一步拓宽了该产品的应用范围。附图说明0015 图 1 为本发明所制备 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体的毛细管电泳图。0016 图 2 为亚麻酸浓度。
12、与 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体合成的关系。具体实施方式0017 本发明通过以下实施例作进一步地说明。0018 实施例 1。0019 将 1 份低温脱脂大豆用 4 份水浸泡 6h 后，经磨浆机先粗磨后精磨 1 次，再经胶体磨处理 2 次后得到的混合乳浊液，煮沸后调整其中的蛋白质含量为质量百分比 8%，得到基础培养基。向基础培养基中加入质量百分比 1% 的低聚果糖，经巴氏灭菌后得到生物富集的培养基。向生物富集培养基中接入质量百分比 5% 的干酪乳杆菌（ Lactobacillus casei）CGMCC 1.574 生产用菌种，同时加入质量百分比 0.4% 的亚麻酸底物，混匀后于 3。
13、7培养24h。通过该方法富集后，产物在 268nm 处有特征吸收峰，表明产物是共轭亚麻酸，并通过毛细管电泳分析进一步确认该异构体是 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体。底物亚麻酸的浓度对产物共轭亚麻酸的合成有显著影响，在优化条件下，亚麻酸的添加量是基础培养基的质量百分比0.4%，发酵物中 c9,t11,c15-共轭亚麻酸异构体的含量为质量百分比0.37%，亚麻酸的转化率为92.5%。通过该方法，大大提高了产品中 c9,t11,c15-共轭亚麻酸异构体的含量，能满足抗癌、防治心脑血管疾病产品开发的需要。此外，在生物发酵过程中，脱脂大豆中的蛋白质和膳食纤维被水解成多肽和可溶性膳食纤维，这些保。
14、健功能因子进一步增加产品的保健功能和应用前景。说 明 书CN 104480150 A3/3 页50020 实施例 2。0021 将 1 份低温脱脂大豆用 4 份水浸泡过夜后，经磨浆机先粗磨后精磨 1 次，再经胶体磨处理 2 次后得到的混合乳浊液，煮沸后调整其中的蛋白质含量为质量百分比 5%，加入质量百分比 3% 的脱脂奶粉，得到基础培养基。向基础培养基中加入质量百分比 1% 的低聚果糖，经巴氏灭菌后得到生物富集的培养基。向生物富集培养基中接入质量百分比 5% 的干酪乳杆菌（ Lactobacillus casei）CGMCC 1.574 生产用菌种，同时加入质量百分比 0.4% 的亚麻酸底物，混匀后于37培养24h，产物中 c9,t11,c15-共轭亚麻酸异构体的含量为质量百分比0.38%。将发酵产物低温喷雾干燥或冷冻干燥后，经压片、涂膜加工成片剂，可以有效防止 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体在存放过程中发生氧化反应，得到富含 c9,t11,c15- 共轭亚麻酸异构体、多肽和可溶性膳食纤维的保健功能产品，产品保质期长达 12 个月。说 明 书CN 104480150 A1/1 页6图1图2说 明 书 附 图CN 104480150 A。