修饰肽的制造方法.pdf

本发明是制造含有侧链被修饰的氨基酸残基的肽和蛋白质的方法，其特征是以化学方法用弱酸性脱离树脂制造含有侧链被修饰的氨基酸残基的肽片段，以基因重组方法和酶学方法制造不含侧链被修饰的氨基酸残基的肽片段，再将上述两种肽片段加以缩合而成。采用本发明，可以高效获得优质的含有经过酰化、糖基化或磷酸化修饰之肽或蛋白质。

1.  一种含有至少一个受到修饰的氨基酸或非氨基酸分子保护的肽片段的制造方法，其特征在于：有由氨基酸或/和非氨基酸组成的特定序列，其中至少有一个氨基酸或非氨基酸分子是用式1：-A(R)-(式中A表示氨基酸或非氨基酸，R表示结合在A的侧链上的为进行修饰而导入的的取代基)表示的被修饰的氨基酸或非氨基酸；同时在弱酸性脱离树脂上制备受保护的肽片段，组成该肽片段的氨基酸或非氨基酸的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中选择出一种以上可能在制备肽片段时引起不利副反应的反应性功能基被保护性基团保护，然后在弱酸性条件下保护性基团不脱离地将上述肽片段从弱酸性树脂上脱离。

2.  权利要求1所述的肽片段的制造方法，其特征在于：(a)有由氨基酸或/和非氨基酸组成的特定序列，而且在弱酸性脱离树脂上制备受保护的肽片段，组成该肽片段的氨基酸或非氨基酸的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中选择出一种以上可能在制备肽片段时引起不利副反应的反应性功能基被保护性基团保护；(b)用取代基向受到修饰的氨基酸或非氨基酸的侧链上的功能基导入保护性基团的情况下，当要脱去该保护性基团时，上述肽片段不会从弱酸性树脂上脱离；(c)用取代基R修饰上述脱去保护性基团的侧链；(d)在弱酸性条件下不使上述肽片段中的保护性基团脱离地将上述肽片段从弱酸性脱离树脂脱离。

3.  权利要求2所述的肽片段的制造方法，其中包括：被取代基R修饰的氨基酸或非氨基酸A的侧链上的反应性功能基的保护性基团，是甲硅烷系保护性基团，该保护性基团的脱保护使用氟代季铵盐。

4.  权利要求3记载的肽片段的制造方法，其中甲硅烷系保护性基团是叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、三异丁基甲硅烷基(TIBS)、叔己基二甲基甲硅烷基(ThxDMS)或三苯基甲硅烷基(TPS)；氟代季铵盐是氟化四丁铵(TBAF)、氟化四乙铵(TEF)或氟化铵。

5.  权利要求1至4记载的肽片段的制造方法，其中A是丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天门冬氨酸、酪氨酸或天门冬酰胺；R通过酯键、醚键、硫醚键、二硫键、酰胺键、O-糖苷键或N-糖苷键等与A的侧链的反应性取代基结合。

6.  权利要求5记载的肽片段的制造方法，其中A为丝氨酸或苏氨酸，R通过酯键与A的侧链羟基结合。

7.  权利要求6记载的肽片段的制造方法，其中肽片段是促成长素或它的衍生物，或是含有上述促成长素或它的衍生物中被修饰氨基酸的肽片段。

8.  修饰性肽或蛋白质的制造方法，其特征在于：(a)利用权利要求1至7记载的方法制造含有一个以上经修饰的氨基酸或非氨基酸的受保护的肽片段；不同于上述(a)中的肽片段，(b)制造另外的被保护的肽片段，该片段不含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸，同时氨基酸或非氨基酸的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中选择出一种以上可能在制备肽片段时引起不利副反应的反应性功能基被保护性基团保护；将上述(a)及(b)中所述的肽片段进行缩合。

9.  权利要求8记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中肽片段的缩合采用缩合剂进行。

10.  权利要求9记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中缩合剂是2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)。

11.  权利要求9记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中缩合剂是二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，使用上述缩合剂的肽片段的缩合是在1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)或者3，4-二氢-3-羟基-4-氧基-苯并三嗪(HOOBt)的存在下进行。

12.  权利要求8至11记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中不含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段是借助酶法和/或基因重组法制造的。

13.  权利要求12记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中包括用下列方法制造不含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段：
工序(1)：培养由表达载体转化的细胞，并从其培养物中提取有上述肽片段的氨基酸序列的肽(以下简称目的肽)或蛋白质。该表达载体含有编码目的肽的碱基序列，或编码根据要求通过接头在目的肽上附加了保护性肽的融合蛋白的碱基序列。
工序(2)：当工序(1)中提取出融合蛋白时，从得到的融合蛋白中切断分离出保护性肽和根据需要特定的接头序列，以及目的肽，根据需要进一步纯化目的肽。
工序(3)：在由工序(1)和工序(2)得到的目的肽的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中选出一种以上可能在制备肽片段时引起不利副反应的反应性功能基用保护性基团保护。

14.  权利要求13记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中工序(2)切断分离出保护性肽和根据需要特定的接头序列，以及目的肽，用OmpT蛋白酶或其衍生物和Kex2蛋白酶或其衍生物分两步进行。

15.  权利要求13或14记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中接头的序列是以序列编号27记载的序列。

16.  权利要求12至15记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其特征是肽片段为不含有促成长素或其衍生物中受到修饰的氨基酸或非氨基酸的肽片段。

17.  权利要求12至16记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其特征是不含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段在pH4～8的溶液中纯化和保存。

18.  权利要求12至17记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其中保护性基团是Boc基。

19.  不含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法，其特征是包含以下方法的制造方法：
工序(1)：培养由表达载体转化的细胞，并从其培养物中提取有特定氨基酸序列的肽(以下简称目的肽)或下述融合蛋白，该表达载体含有编码目的肽的碱基序列，或编码根据要求通过接头在目的肽上附加了保护性肽的融合蛋白的碱基序列；
工序(2)：当工序(1)中提取融合蛋白时，从得到的融合蛋白中切断分离出保护性肽和根据需要特定的接头序列，以及目的肽，根据需要进一步纯化目的肽；
工序(3)：在由工序(1)和工序(2)得到的目的肽的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中选出一种以上可能在制备肽片段时引起不利副反应的反应性功能基用保护性基团保护；
工序(4)：在pH4～8的溶液中纯化和保存由工序(3)得到的被保护的目的肽。

20.  权利要求19记载的受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法，其中保护基是Boc基。

21.  权利要求19或20记载的不含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法，其中工序(2)切断分离出保护性肽和根据需要特定的接头序列，以及目的肽，用OmpT蛋白酶或其衍生物和Kex2蛋白酶或其衍生物分两步进行。

22.  权利要求19至21记载的受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法，其中接头序列是序列号27记载的序列。

23.  权利要求19至22记载的修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是肽片段是不含有促成长素或其衍生物中的受到修饰的氨基酸或非氨基酸的肽片段。

修饰肽的制造方法
技术领域
本发明涉及修饰肽或蛋白质的制造方法，以及含有一个以上适当采用上述方法修饰过的氨基酸或非氨基酸的被保护的肽片段的制造方法。
背景技术
1999年，从大鼠胃中分离纯化了内源性生长激素分泌促进因子(GHS)，它作用于作为孤独受体之一的生长激素分泌促进因子受体(GHS-R)，被命名为促成长素(ghrelin)[Kojima等，Nature，402卷p.656-660，1999年]。已知这种肽化合物具有特征性结构，即丝氨酸的羟基被脂肪酸酰化。进一步又从非大鼠的脊椎动物，例如人类、小鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙和鲑鱼，以及犬中分离到促成长素，该分子在第3位的丝氨酸或苏氨酸残基含有被脂肪酸修饰的结构，或者通过cDNA推定了它们的氨基酸序列(见表1)。例如人促成长素由28个氨基酸组成，其第3位的丝氨酸侧链被脂肪酸(正辛酸)酰化。已知这种新发现的肽化合物有很强的促进生长激素分泌活性，并且第3位的丝氨酸或苏氨酸被脂肪酸修饰是其表现活性的必要条件[Kojima等，Nature，402卷p.656-660，1999年]。同时，还阐明了由胃中分泌的促成长素作为血液中激素有调节生长激素分泌的功能，因而促成长素的生理功能和在医药业中的应用受到人们关注。
表1
人类(Human)：    GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
                 GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR
大鼠(Rat)：      GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
                 GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR
小鼠(Mouse)：    GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
猪(Porcine)：    GSS(正辛酰基)FLSPEHQKVQQRKESKKPPAKLKPR
牛(Bovine)：     GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR
绵羊(Ovine)：    GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR
犬(Canine)：     GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR
鳗鱼(Eel)：      GSS(正辛酰基)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH₂
鲑鱼(Trout)：    GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH₂
                 GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH₂
鸡(Chicken)：    GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR
                 GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR
                 GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH
牛蛙(Bullfrog)： GSS(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
                 GSS(正癸酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
                 GSS(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN
罗非鱼(Tilapia)：GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH₂
鲶鱼(Catfish)：  GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH₂
                 GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG
马(Equine)：     GSS(正丁酰基)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR
除辛酰基(C8)外，还有丁酰基(C4)、己酰基(C6)、癸酰基(C10)、十二烷酰基(C12)等的修饰体。另外还有不饱和脂肪酸形成的修饰体。
也像促成长素和缩胆囊素一样，在肽或蛋白质中的氨基酸序列里的某个特定氨基酸残基受到氨酰化、磺酰化、糖基化或磷酸化等化学修饰，因而表现出它的生理学功能。在生物体内，这些修饰过程是由精确的酶反应来完成的。迄今尚未报告过高效大量生产优质的经修饰的肽或蛋白质的一般方法。由于已经证明促成长素是由于其特定的氨基酸侧链受到长链脂肪酸修饰而表现出促进生长激素分泌的作用，所以脂肪酸修饰是其必要的结构因素，但是现在还不清楚在生物体内是由怎样的酶来催化，使脂肪酸在特定的氨基酸侧链的羟基上形成酯键？以及脂肪酸分子是否会伸长？我们刚刚了解到促成长素是具有氨基酸侧链的羟基被脂肪酸修饰这种结构的特别的生理活性肽，因此，这种肽化合物是可以利用的肽激素，可望作为成长障碍的治疗药物和促进分泌生长激素的药物，而且尚未出现可用的制造方法来生产这种含有在特定羟基的氨基酸侧链上被脂肪酸修饰的肽化合物，即现在还没有建立适合大量工业生产的方法。
当前，胰岛素、生长激素、降钙素、心房性钠利尿肽、LH-RH衍生物、副肾上腺皮质激素衍生物等多种肽或蛋白质制剂已经作为药物使用。已知这些肽或蛋白质的制造方法有化学合成法、酶法和基因重组法等。随不同要求而选择不同方法，一般残基少的选用化学合成法，残基多的选用酶法和基因重组法。
例如化学合成法是最可靠的制造诸如具有促成长素等经修饰的生理活性肽或蛋白质的方法。制造经修饰的肽或蛋白质的方法中，化学合成法已有许多报道。以促成长素为例，有Bednarek等(J.Med.Chem.，43卷p.4370-4376，2000年)、Matsumoto等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，284卷p.655-659，2001年)的报告。同时，在国际公开专利中，编号为WO01/07475的公报中，记载了用化学合成法制造促成长素及其衍生物肽或它的盐类的方法。然而，在化学合成方法中，为确保品质(纯度)，合成的肽链长度将受到限制。虽然通过液相化学合成可以合成高纯度的肽，但是要合成长链的肽，一般在溶解度、长度和反应控制等方面都缺少专门技术，因此要高效大量制造，用液相化学合成方法难以实现。另一方面，在树脂上进行肽链延长的固相化学合成，工序简单，有利于实现大量生产，但是要得到一定纯度的目的产物又构建足够的链长，则受到限制。此外，由于试剂过量使用，要制造特定长度肽，在经济上也因为不合算而成为问题。
同时，用酶将肽片段通过酶法加以结合的方法，虽然有可以精确保护氨基酸侧链的优点，但是这种方法由于通常使用逆向水解反应，所以难以从理论上设定反应条件，因而没有采用。
另一方面，用基因重组法制造生理活性肽或蛋白质是适用于大量生产的方法。然而采用最适宜用于生产地大肠杆菌等原核生物，由于它们不具备翻译后修饰的机制，难以用于直接制造具有修饰部位的肽化合物。采用酵母菌或各种卵细胞等真核细胞进行基因重组，可以进行糖修饰、酰化、磺化或磷酸化等修饰，但是要仅仅导入一定长度的脂肪酸是困难的。被分离的促成长素中，不仅有辛酸(C8)，还发现有丁酸(C8)、癸酸(C10)或不饱和脂肪酸，显然要控制特定链长的脂肪酸向肽分子中导入是很困难的。再者，一般用真核细胞都不宜用于生产，因此将具有修饰系统的酵母菌或各种卵细胞的生产株系用来大量生产促成长素等受到修饰的肽或蛋白质，改进的余地还很大。
如上所述，合成经修饰肽或蛋白质的化学合成方法已经有多种报道，但用于大量生产，在收率、成本等方面还有改进的余地。而用大肠杆菌等原核细胞通过基因重组直接生产受到修饰的肽或蛋白质是困难的。同时，用酵母菌等真核细胞通过基因重组来制造，在纯度和生产性能方面又存在问题，要克服这些困难，也有改良的余地。通过酶水解反应的逆反应进行酶法合成，也难以设定各种缩合反应的条件，不能说是有利于大量生产的方法。
因此，单独采用已知的化学合成法、酶法或基因重组法高效制造在纯度和数量上满足要求的经过糖基化、酰化、磺酰化或磷酸化修饰的肽或蛋白质，在技术上有进一步改良的余地。
发扬上述方法之优点，弥补缺点的途径之一是将化学合成法和基因重组法加以组合的半合成方法。本发明的要点是高效制造具有适宜缩合形态的肽化合物片段。含有被修饰氨基酸残基的肽片段(以下简称修饰成分)和不含有被修饰氨基酸残基的肽片段(以下简称非修饰成分)，氨基末端或羧基末端均可，修饰成分为多数也可以。将目的肽或蛋白质加以适当组合，可以设计出制造方法。现举一例，详细说明与存在氨基末端的修饰成分的肽片段发生缩合的另一肽片段是非修饰成分的情况。
近来受到关注的天然化学连接法(Native chemical ligation)[Dawson等，Science，266卷p.776-779，1994年]有在连接部位残留半胱氨酸残基的缺点，最近提出了该方法的改良方法硫酯法。例如Kawakami等报告了用硫酯法合成磷酸化肽(Tetrahedron Letter，41卷，p.2625-2628，2000年)。
以下用具体例子说明上述硫酯法。在合成p21Max蛋白质的实例中(Kawakami等，Tetrahedron Letter，39卷，p.7901-7904，1998年)，用固相化学合成法以硫酯的形态制造出含有磷酸修饰部位的肽片段(修饰部分)(13聚体)。另一方面，以大肠杆菌制造含有在非修饰成分的氨基末端附加上氨基酸残基序列的肽片段，这种化合物在二价铜离子或镍离子存在的条件下，用乙醛酸作用，则在氨基末端附加的氨基酸残基变成α酮酯酰基，侧链氨基便被Boc基保护。然后用苯二胺除去α酮酯酰基，制备成在氨基末端只游离出氨基酸残基的氨基的肽片段(非修饰成分)。最后加入银盐和过量的HOOBt等活性酯化剂，将这两种片段加以缩合。
然而，上述方法还存在以下问题。在制造肽片段(修饰成分)时，该硫酯的稳定性还有问题，报道的收率为11％。此外，在制造肽片段(非修饰成分)时，本方法所用的α酮酯酰基使氨基末端氨基游离的化学方法有很高的选择性，但α酮酯酰基不稳定，而且是用苯二胺等诱变剂除去α酮酯酰基，在制造作为医药品的生理活性肽化合物方面还存在安全性的问题。另外，在两种片段进行缩合反应时，由于使用了银盐和过量的HOOBt等活性酯化剂，在外消旋化、毒性和成本等方面也存在问题。
将化学合成与基因重组法相结合的半合成法，在编号为WO01/07475的国际公开专利公报中，记载了制造促成长素及其衍生物肽或它的盐类的方法。具体来说，是将化学合成的大鼠促成长素(1-5)和以基因重组法制造的大鼠促成长素(6-28)加以缩合，制成大鼠促成长素的方法。但是这种方法还存在以下问题，要成为高效的可应用工业生产方法还有许多地方需要改良。这些问题包括：为了用TFA从树脂上脱离出肽链而得到大鼠促成长素(1-5)，并同时除去Boc基和t-Bu基，必须在氨基末端再度导入Boc基，同时，为了使丝氨酸侧链变成不受保护，在与大鼠促成长素(6-28)缩合时，不能使用强活化剂，因而在提高生产实用性方面还有工作要做。同时，将保护的大鼠促成长素(1-5)和保护的大鼠促成长素(6-28)加以缩合的过程中，酰化的肽片段的羧基末端氨基酸发生外消旋化，也需要做工作以便阻止这种变化。再者，促成长素(m-n)表示从促成长素的氨基末端开始有第m到第n个氨基酸序列的肽片段。下同。
在制备保护性肽片段(非修饰成分)时，也有若干课题需要进行。在编号为WO01/07475的国际公开专利公报中，记载了保护性大鼠促成长素(6-28)的制造方法。该方法基本上采用两步酶法处理法(国际公开号WO099/38984)，该工序使用的两种酶是重组V8蛋白酶衍生物(rV8D5)(日本公开专利平成9年-47291号公报)和Kex2蛋白酶(日本公开专利平成10年-229884号公报)。可是，表达含有保护性大鼠促成长素(6-28)的融合蛋白的质粒(Pg97s rGR)是以高表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶衍生物和副甲状腺激素融合蛋白的质粒(日本公开专利平成9年-296000号公报)为基础构建的，因此在制备保护性肽片段(非修饰成分)时便会遇到必须选择适合其氨基酸序列的接头序列的问题。
保护性大鼠促成长素(6-28)在水溶液中会出现保护基团脱离的现象，在纯化时回收率非常低，只有10％，从大量稳定提供促成长素的角度也还存在问题。
通过组合化学合成法和基因重组法高效率制造，而且得到可以用于医药的安全性高的产品，为了实现该目的，从以上叙述中，提出了一个制造被修饰的生理活性肽或蛋白质的新课题。
发明内容
本发明以提供高效工业生产被修饰肽或蛋白质方法为目的。具体而言，本发明的目的是通过用化学合成法制造含有修饰部位的肽片段(修饰成分)，用基因重组的方法制造不含修饰部位的肽片段(非修饰成分)，然后将两者加以缩合，从而提供一种优质的经过修饰的生理活性肽或蛋白质的高效生产方法。如前所述，这两种肽片段(修饰成分和非修饰成分)，无论氨基末端或羧基末端均可，修饰成分为多数亦可。可以将所需要的肽片段或蛋白质加以适当组合来设计制造方法。同时本发明的目的是提供适合缩合反应而不影响被修饰部位结构的温和条件下制造保护性肽片段(修饰成分)的方法，以及适合与被保护的肽片段(非修饰成分)发生缩合反应的保护性肽片段(修饰成分)的制造方法。而且本发明的目的还是，提供一种使得到的产品能够用做医药品，因而是高度安全的被修饰的生理活性肽或蛋白质的制造方法。本发明尤其是以提供一种工业生产方法制备促成长素及其衍生物的简便而高效方法为目的。
本发明人等建立了一种大幅度简化了生产工序且高效的方法，即改良了以促成长素为原料，合成含有促成长素及其衍生物中的被酰化基团修饰的氨基酸的肽片段(修饰成分)的方法。发现在2-氯代三甲苯基树脂等弱酸性脱离树脂上结合肽片段(修饰成分)的主肽链，连续对残基进行修饰后，用醋酸等弱酸处理，可以使受到保护性修饰的肽从固相树脂上脱离下来。已知过去的方法是用三溴醋酸等从树脂脱离，在Wang树脂等类树脂上导入修饰基团，然后从树脂上脱离下来并同时使保护基团脱离。可是在本方法中，因为要把洗脱出来的肽片段(修饰成分)接着提供给与另一条肽片段(非修饰成分)进行缩合反应，又因为从树脂上脱离下来的同时保护性基团也完全脱离了，必须再度导入保护性基团，因此从简化工序和效率的角度来看并不理想。本发明人经过精心探讨，发现了进行选择性修饰的方法。即在从树脂上脱离出肽片段(修饰成分)时采用弱酸(包括稀释的强酸)不易使氨基酸侧链上的保护性基团脱离；又发现采用氟化季胺盐可以使肽不从树脂上脱离，而使在树脂上的特定氨基酸侧链的保护性基团脱离。在氟化季胺盐中，已经应用过氟化四丁胺(TBAF)作为把肽化合物从固相树脂上脱离下来的试剂(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，p.414-415，1988年；Tetrahedron Letter，34卷，p.7599-7602，1993年)，本发明人发现在弱酸性树脂上结合的肽经TBAF处理时并不能从树脂上脱离下来。由于用TBAF不会使肽化合物从树脂上脱离下来，所以可以在树脂上使特定氨基酸侧链的保护性基团脱离而选择性地修饰氨基酸残基，然后采用不易使氨基酸侧链保护性基团脱离的弱酸(包括稀释的强酸)把肽片段(修饰成分)从树脂上脱离下来，这样在随后与重组工序肽片段(非修饰成分)进行缩合反应时，就无须在事前采取保护肽片段(修饰成分)的工序，这样便在很大程度上简化了生产工序，提高了效率。
本发明人进而改良了制备促成长素的保护性肽片段(非修饰成分)的制备方法，发现用二步酶处理法大量制备保护性促成长素(8-28)片段的最佳接头序列。本发明人还建立了在很大程度上简化了工序从而提高了效率的方法，该方法在不使保护性基团脱离的pH条件提纯保护性肽片段(非修饰成分)。这是由于发现制备保护性肽时保护性基团脱离的现象与水溶液的pH及温度有关，将水溶液的pH调节到4-8，即可阻止保护性基团脱离，从而得以高收率地制备保护性肽片段(非修饰成分)。
此外，还改良了各种肽片段的缩合方法，阻止了氨基酸活化时及缩合反应时发生的外消旋化作用，发现了获得质优高效制备促成长素或它们的衍生物的方法。特别是采用弱酸性脱离树脂制造促成长素的方法，优点是阻止了由副反应而来的二酮基哌嗪的形成。由于羧基末端第7个氨基酸残基是脯氨酸，在将第3个氨基酸(Leu)缩合到二肽(-Ser-Pro-)上时，可以使二酮基哌嗪被缠裹而从树脂上脱离下来，从而可以将其控制到最小限度。
根据这个发现，不仅是烷基，而且还可以把酰基、磷酸基或硫酸基，通过糖苷键、二硫键、醚键、硫醚键或酰胺键等结合到氨基酸或非氨基酸侧链上，开发出能够容易制造具有各种修饰结构的生理活性肽或蛋白质的技术，从而完成了本发明。
本发明如下：
(1)以采用弱酸性脱离树脂为特征，制造含有一个以上用式1：-A(R)-表示的经修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性肽片段的方法。(式1中A表示氨基酸或非氨基酸，R表示结合在A的侧链上的取代基)。
(2)(a)在弱酸性脱离树脂上，制备具有预定序列的肽片段，该片段由侧链被保护的氨基酸或/和非氨基酸组成；(b)不使上述肽片段从弱酸性树脂上脱离，而使受取代基修饰的氨基酸或非氨基酸A的侧链上的保护性基团脱保护；(c)用取代基R修饰上述脱保护的侧链；(d)以从弱酸性脱离树脂上将肽片段脱离为特征的上述第(1)项记载的制造方法。
(3)上述第(1)和(2)项记载的肽片段制造方法，其特征是以甲硅烷基系化合物为氨基酸或非氨基酸A侧链的保护基，在上述保护基团脱保护中采用氟化季胺盐。
(4)上述第(3)项记载的肽片段制造方法，其特征是：甲硅烷基系保护基为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二辛基甲硅烷基(TBDPS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、三异丁基甲硅烷基(TIBS)、叔己基二甲基甲硅烷基(ThxDMS)或三苯基甲硅烷基(TPS)，氟化季胺盐为氟化四丁基铵(TBAF)、氟化四己基铵(TEF)或氟化铵。
(5)上述第(1)-(4)项记载的肽片段制造方法，其特征是：A为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天门冬氨酸、酪氨酸或天门冬酰胺；R通过酯键、醚键、硫醚键、二硫键、酰胺键、O-糖苷键或N-糖苷键等与A的侧链结合
(6)上述第(5)项记载的肽片段制造方法，其特征是：A为丝氨酸或苏氨酸，R通过酯键与A的侧链结合。
(7)上述第(6)项记载的肽片段制造方法，其特征是：肽片段是促成长素或它的衍生物，或是含有上述促成长素或它的衍生物中被修饰氨基酸的部分。
(8)修饰肽片段或蛋白质的制造方法，其特征是：(a)用弱酸性脱离树脂制备被保护的肽片段，该片段含有一个以上以式1：-A(R)-表示的经修饰的氨基酸或非氨基酸(式1中A表示氨基酸或非氨基酸，R表示结合在A的侧链上的取代基)；(b)制造与上述(a)中的肽片段不同的另一个的肽，即不含有被修饰氨基酸或非氨基酸保护的肽片段；将(a)及(b)所制造的肽片段加以缩合。
(9)上述第(8)项记载的修饰肽或蛋白质的制造方法。其特征是按上述第(2)-(4)项记载方法制造含有一个以上被修饰氨基酸或非氨基酸的肽片段。
(10)上述第(8)和(9)项记载的修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是：A为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天门冬氨酸、酪氨酸或天门冬酰胺；R通过酯键、醚键、硫醚键、二硫键、酰胺键、O-糖苷键或N-糖苷键等与A的侧链结合。
(11)上述第(10)项记载的修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是：A为丝氨酸或苏氨酸，R通过酯键与A的侧链结合。
(12)上述第(11)项记载的修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是：修饰肽或蛋白质是促成长素或它的衍生物。
(13)上述第(8)-(12)项记载的修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是：肽片段的缩合采用缩合剂进行。
(14)上述第(13)项记载的修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是：缩合剂为2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)。
(15)上述第(13)项记载的修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是：缩合剂为二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，使用上述缩合剂的肽片段的缩合是在1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)或者3，4-二氢-3-羟基-4-氧基-苯并三嗪(HOOBt)的存在下进行。
更具体而言，本发明在通过肽片段缩合制造修饰肽或蛋白质的过程中，包括(a)被修饰的生理活性肽或蛋白质的制造方法，其特征是制造含有修饰基团的肽片段时2-氯代三苯甲基树脂等弱酸性树脂进行合成；(b)被修饰的生理活性肽或蛋白质，特别是促成长素或它的衍生物的制造方法，其特征是在合成含有酰基、硫酸基等容易被酸洗脱的肽片段时，采用2-氯代三苯甲基树脂等弱酸性树脂；(c)促成长素或它的衍生物的制造方法，其特征是在将含被修饰成分的肽片段(修饰成分)和不含修饰成分的肽片段(非修饰成分)进行缩合时，在被活化的氨基末端一侧肽片段的羧基末端残基上插入脯氨酸，从而阻止了组成氨基酸的外消旋化；(d)在制造促成长素或它的衍生物时采用效果显著的良好缩合剂。
而且，本发明还包括：
(1)含有一个以上被修饰氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法，其特征是具有由氨基酸和/或非氨基酸组成的所需要的序列，其中至少有一个氨基酸或非氨基酸是受到按式1：-A(R)-表示的经修饰的氨基酸或非氨基酸(式1中A表示氨基酸或非氨基酸，R表示结合在A的侧链上的为进行修饰而导入的取代基)，而且要从氨基酸或非氨基酸的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、二氢吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上可能在制造肽片段时引起不利副反应的反应性取代基用保护性基团给予保护，在弱酸性脱离树脂上制备这种被保护的肽片段，然后在弱酸性条件下将上述肽片段从弱酸性树脂上脱离下来而不会使该片段上的保护性基团脱离下来。
(2)上述第(1)项记载的肽片段制造方法，其特征是：(a)在弱酸性脱离树脂上制备被保护的具有由氨基酸或非氨基酸组成的特定序列肽片段，这种保护是从它们的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中选择出一种以上的在制造肽片段时引起不会引起副反应的反应性取代基用保护性基团给予保护，(b)当上述肽片段在弱酸性脱离树脂上不会脱离，受取代基R修饰的氨基酸或非氨基酸A的侧链上的反应性功能基被导入着保护基时，将该保护性基团脱保护；(c)用取代基R修饰上述脱保护的侧链；(d)在弱酸性条件下将上述肽片段从弱酸性树脂上脱离下来而不会使该片段上的保护性基团脱离。
(3)含有一个以上式1：-A(R)-(式中A表示氨基酸或非氨基酸，R表示结合在A的侧链上的的取代基)所表示的经修饰的氨基酸或非氨基酸保护的多肽片段的制造方法，其特征是：(a)在弱酸性脱离树脂上制备被保护的具有由氨基酸或非氨基酸组成的特定序列肽片段，这种保护是从它们的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上反应性取代基用保护性基团给予保护，(b)在弱酸性条件下将上述肽片段从弱酸性脱离树脂上脱离下来，而不使该肽片段中的保护性基团脱离；(c)将已脱离的肽片段上至少一个氨基酸或非氨基酸A的侧链上的对反应性取代基的保护基脱保护；(d)用取代基R修饰上述已脱保护的侧链。
(4)上述第(2)和(3)项记载的肽片段制造方法中，被取代基R修饰的氨基酸或非氨基酸A的侧链上反应性取代基的保护性基团是甲硅烷基系保护基，该保护基的脱保护则采用氟化季铵盐。
(5)上述第(4)项记载的肽片段制造方法中，甲硅烷基系保护基是叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、三异丁基甲硅烷基(TIBS)、叔己基二甲基甲硅烷基(ThxDMS)或三苯基甲硅烷基(TPS)、氟化季铵是氟化四丁基铵(TBAF)、氟化四乙基铵(TEF)或者氟化铵。
(6)上述第(1)至(5)项记载的肽片段制造方法中，A为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天门冬氨酸、酪氨酸或天门冬酰胺；R通过酯键、醚键、硫醚键、二硫键、酰胺键、O-糖苷键或N-糖苷键等与A的侧链上反应性基团结合。
(7)上述第(6)项记载的肽片段制造方法中，A为丝氨酸或苏氨酸，R通过酯键与A的侧链上羟基结合。
(8)上述第(7)项记载的肽片段制造方法中，肽片段是促成长素或它的衍生物，或是含有上述促成长素或它的衍生物中被修饰氨基酸的肽片段。
(9)修饰性类或蛋白质的制造方法，其特征是：(a)用上述第(1)至(8)项记载的方法制造含有一个以上被修饰氨基酸或非氨基酸保护的肽片段；(b)制造与(a)所述肽片段不同的另一条肽片段，该片段不含被修饰被修饰氨基酸或非氨基酸，并从它们的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、二氢吲哚基、巯基和羧基等基团中选择出一种以上可能引起不利副反应的反应性功能基加以保护，再将由(a)和(b)制造的肽片段加以缩合。
(10)上述第(9)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法中，肽片段的缩合采用缩合剂。
(11)上述第(10)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法中，缩合剂为2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)。
(12)上述第(10)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法中，缩合剂为二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，使用上述缩合剂的肽片段的缩合是在1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)或者3，4-二氢-3-羟基-4-氧基-苯并三嗪(HOOBt)的存在下进行。
(13)上述第(9)至(12)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法中，不含有被修饰的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段借助酶法或/和基因重组法制造。
(14)上述第(13)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法中，采取包括以下工序进行制造：
工序(1)：将编码具有上述肽片段的氨基酸序列的肽化合物(在本项中，以下称为目的肽)的碱基序列，或编码依目的肽的要求通过接头序列附加了保护性肽的融合蛋白的碱基序列，借助表达载体转化细胞，培养该细胞，从该细胞的培养物中提取目的肽或上述融合蛋白；
工序(2)：在按工序(1)提取融合蛋白时，从得到的融合蛋白中切割分离保护性肽和所要求的接头序列，根据需要，进一步纯化目的肽；
工序(3)：从在工序(1)和(2)中得到的目的肽侧链上的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上可能引起不利副反应的反应性取代基用保护性基团加以保护。
(15)上述第(14)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法中，工序(2)中保护性肽以及所要求的接头序列，和目的肽的切割分离，采用OmpT蛋白酶及其衍生物和Kex2蛋白酶及其衍生物分两步进行。
(16)上述第(14)或(15)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法中，接头序列是以编号27记载的序列。
(17)上述第(13)～(16)项记载的修饰性肽或蛋白质的制造方法，其特征是：肽片段是不含有促成长素或它的衍生物中受到修饰的的氨基酸或非氨基酸的肽片段。
(18)上述第(13)～(17)项记载的修饰性肽肽或蛋白质的制造方法，其特征是：不含有受到修饰的的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段在pH4-8的溶液中纯化和保存。
(19)上述第(13)～(18)项记载的修饰性肽肽或蛋白质的制造方法中，保护基是Boc。
(20)不含有受到修饰的的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法，其特征是包含以下工序：
工序(1)：将编码具有所要求的氨基酸序列的肽化合物(在本项中，以下称为目的肽)的碱基序列，或编码依目的肽的要求通过接头序列附加了保护性肽的融合蛋白的碱基序列，借助表达载体转化细胞，培养该细胞，从该细胞的培养物中提取目的肽或上述融合蛋白；
工序(2)：在按工序(1)提取融合蛋白时，从得到的融合蛋白中切割分离保护性肽和所要求的接头序列，以及目的肽，进一步按要求进行纯化；
工序(3)：从在工序(1)或(2)中得到的目的肽侧链上的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上可能引起不利副反应的反应性取代基用保护性基团加以保护；
工序(4)：把从工序(3)中得到的被保护的目的肽在pH4-8的溶液中纯化和保存。
(21)上述第(20)项记载的不含有受到修饰的的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法中，保护基为Boc。
(22)上述第(20)或(21)项记载的不含有受到修饰的的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法中，工序(2)中的保护性肽和所要求的接头序列和目的肽的切割分离，采用OmpT蛋白酶及其衍生物和Kex2蛋白酶及其衍生物分两步进行。
(23)上述第(20)～(22)项记载的不含有受到修饰的的氨基酸或非氨基酸保护的肽片段的制造方法中，接头序列是以编号27记载的序列。
(24)上述第(20)～(23)项记载的被修饰肽或蛋白质的制造方法，其特征是：肽片段是不含促成长素及其衍生物中被修饰氨基酸或非氨基酸的肽片段。
附图的简单说明
图1A表示全合成的人类促成长素[hGhrelin(8-28)]的寡聚DNA和氨基酸序列表；图1B表示用质粒p117-8-28oRR表达的hGhrelin(8-28)融合蛋白的氨基酸序列。
图2表示纯化的[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)的HPLC分析结果。ア箭头所指为[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)的洗脱峰。
图3表示肽片段的缩合反应。A峰为[N^α-Boc，Ser^2，6(tBu)]hGhrelin(1-7)峰；B峰为[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)峰；C峰为[N^α-Boc，Ser^2，6(tBu)，Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin峰；D峰为hGhrelin峰。
图4表示纯化的人类促成长素的HPLC测定结果
图5表示Kex2蛋白酶不同切断识别部位的融合蛋白的氨基酸序列
图6表示用HPLC测定第5图中用Kex2蛋白酶切断融合蛋白效率的结果。图6A表示PR-hGhrelin(8-28)用Kex2蛋白酶作用后的HPLC分析结果；图6B表示RR-hGhrelin(8-28)用Kex2蛋白酶作用后的HPLC分析结果；图6C表示KR-hGhrelin(8-28)用Kex2蛋白酶作用后的HPLC分析结果。峰ア)是含有接头序列的[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)峰；峰イ)是[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)峰；峰ウ)是[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(16-28)峰。
图7表示为确定培养物中最适融合蛋白而制备的各种hGhrelin(8-28)融合蛋白的氨基酸序列。
图8A表示不同融合蛋白引起的培养物的差异；图8B表示产生各种融合蛋白的培养物中菌体破碎前后浊度(由于融合蛋白不同引起的差异)。
图9表示[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)稳定性的评价结果。
图10表示[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)稳定性的评价结果。
实施发明的最佳方式
说明本发明时，以下所用名词作下述定义。
[氨基酸]是指同一分子内含有氨基和羧基的化合物，例如L-氨基酸、D-氨基酸、α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸等全部氨基酸。
[天然氨基酸]是指由基因编码的20种氨基酸。
[非天然氨基酸]指α-氨基酸的α碳原子被不存在于天然氨基酸或与其相对应的D-氨基酸中的任何取代基修饰的化合物。α-氨基酸可用以下结构式表示：

作为以R’和R”表示的取代基，具有不存在于天然氨基酸或与其相对应的D-氨基酸中的任何取代基或氢原子(R’和R”都代表氢原子的情况除外)。
[非氨基酸]指由C、H、O、N和S五种元素中1种以上的任何元素原子组成的氨基酸结构类似物，是不包括在天然或非天然氨基酸中的化合物。其分子链的长度多半与肽或二肽相当。例如NH₂-CH(CH₂OH)-CH₃、CH₃-CH(R₁₁)-COOH、CH₃-CH(R₁₁)-CH₃(分子链的长度与肽相当)，再如NH₂-(CH₂)₃-CH(CH₂OH)-COOH、NH₂-(CH₂)₄-COOH、NH₂-C(CH₃)₂-CH(CH₂)₃-COOH、NH₂-CH(CH₃)-(CH₂)₂-CH(CH₃)-COOH、NH₂-CH(CH₂)₃-CH(CH₂OH)-CH₃、NH₂-(CH₂)₃-CH(R₁₁)-CH₃(分子链的长度与二肽相当)等都是本发明所指非氨基酸。其中R₁₁表示天然氨基酸的侧链。肽中的所谓[非氨基酸残基]，例如-NH-CH(CH₂OH)-CH₂-、-CH₂-CH(R₁₁)-CO-、-CH₂-CH(R₁₁)-CH₂-(分子链的长度与肽相当)，以及-NH-(CH₂)₃-CH(CH₂OH)-CO-、-NH-(CH₂)₄-CO-、-NH-C(CH₃)₂-CH(CH₂)₃-CO-、-NH-CH(CH₃)-(CH₂)₂-CH(CH₃)-CO-、-NH-(CH₂)₃-CH(CH₂OH)-CH₂-、-NH-(CH₂)₃-CH(R₁₁)-CH₃-(分子链的长度与二肽相当)，它们与相邻氨基酸的键都不是肽键。
[肽]和[肽片段]指多个氨基酸通过肽键相连组成的化合物。当含有非氨基酸时，有时该非氨基酸与相邻的氨基酸相连接的键不是肽键，也称为肽和肽片段。
[被保护的肽片段]指肽片段的氨基酸或非氨基酸的侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上在制备肽片段时不能引起不利副反应的反应性取代基用保护性基团加以保护的肽片段。本发明中以下简称[保护性肽片段]。
[受到修饰的的氨基酸或非氨基酸]用式1：-A(R)-表示。(式1中A表示氨基酸或非氨基酸，R表示为修饰该化合物而导入并结合在A的侧链上的取代基)。
上述取代基R可以和从氨基酸或非氨基酸侧链上的羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团除去氢原子而形成的基团相结合，也可以直接和氨基酸或非氨基酸的α-碳原子结合。取代基R也可以是氨基酸或非氨基酸的修饰的侧链。
上述取代基并无特别限定。例如可以用以下几个式来表示R基团：
式2-(CH₂)_n-P-Q
(式中n表示整数1-10；P表示-CO-、-SO₂-、-CO-O-、-O-CO-、-O-、-CO-S-、-S-C-O-、-CS-S-、-S-CS-、-S-、-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-NH-CO-、-CS-NH-CS-、-S-S-、-CS-NH-或-NH-CS-；Q表示氢原子或C_1-35，最好是C_1-20烷基、C_6-20芳基和C_7-16芳烷基)
式3-P-Q
(式中P和Q表示的意义与式2相同)
式4-Q
(式中Q表示的意义与式2相同)。
此外，上述R与氨基酸或非氨基酸的α-碳原子直接结合时，也可以通过或不通过含1个以上碳原子的烷基以酯基、醚基、二硫基、硫酯基、酰胺基或脲基中的任何一种形式结合着C_1-35，最好是C_1-20烷基、C_6-20芳基和C_7-16芳烷基结合的基团。取代基R与氨基酸或非氨基酸的α-碳原子直接结合时，取代基不包括天然氨基酸中与α-碳原子结合的取代基。当取代基R与氨基酸或非氨基酸的侧链中的反应性基团相结合时，该取代基R可以是用式4-Q(本式中Q表示的意义与前述相同)表示的基团。
上述[烷基]，表示环状、直链或支链的烷基。例如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、环戊基、己基、异己基、环己基、3，3-二甲丁基、庚基、1-丙丁基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、和十五烷基等，其中也可以部分包含不饱和碳原子键，碳原子数目为1至35，其中以1至20较好，而1至10更好。
上述[芳基]可以举出苯基、1-或2-萘基、联二苯基、1-，2-或9-蒽基、1-，2-，3-，4-或9-菲基、苊基、蒽基、莫基等。碳原子数为6至20，以6至15为最佳。
上述[芳烷基]可以举出苄基、p-甲氧苄基、3，4-二甲氧苄基、o-硝基苄基、p-硝基苄基、二苯甲基、三苯甲基等。碳原子以7至16为最佳。
这些烷基、芳基和芳烷基还可以在本专业领域内具有常用的取代基，只要是从化学原理上可能允许的位置和数目。
[受到修饰的的氨基酸或非氨基酸]可以指丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天门冬氨酸、酪氨酸或天门冬酰胺；取代基R可以用式5：-(CH₂)_n-P¹-Q¹(式中n与上述意义相同，P¹代表酯键、醚键、硫醚键、二硫键、酰胺键、O-糖苷键或N-糖苷键，Q¹代表的意义与上述Q相同)表示。
具体而言，氨基酸A是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和羟脯氨酸时，氨基酸的侧链上有羟基，因此[受到修饰的氨基酸]可以举侧链羟基被醚化或酯化的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和羟脯氨酸为例；如果氨基酸A是半胱氨酸，则其侧链有巯基，[受到修饰的氨基酸]就是被硫醚化或硫酯化或二硫化的半胱氨酸；如果氨基酸A是赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸等，因为其侧链有氨基，[受到修饰的氨基酸]就是侧链氨基被酰胺化、硫代酰胺化、脲基化、硫脲基化或烷基化的赖氨酸、精氨酸、2，3-二氨基丙酸等；如果氨基酸A是组氨酸、色氨酸、脯氨酸或羟脯氨酸，因为其侧链有氨基，[受到修饰的氨基酸]是指侧链氨基被酰胺化、硫代酰胺化、亚氨醚化、亚氨硫醚化和烷基化的组氨酸、色氨酸、脯氨酸或羟脯氨酸。
另外，[受到修饰的的氨基酸或非氨基酸]还包括侧链羟基被酯化的丝氨酸和苏氨酸。
再者，上述取代基R中，当氨基酸或非氨基酸A侧链有-OH-、-SH、-NH-或-NH₂时，将这些基团酰化形成的基团也符合要求。这样发生的酰基，可以举出从有机羧酸、有机磺酸和有机磷酸化合物除去羟基形成的基团为例。具体而言，上述有机羧酸可以脂肪酸为例，这些脂肪酸的碳原子数可以是2-35个，较合适的是6-18个，最合适的是8-16个。这样的脂肪酸可以列举辛酸、正癸酸、十二烷酸、丁酸、己酸、十一烷酸、十六烷酸、癸酸、十九烷酸、二十二烷酸、二十九烷酸和三十二酸等饱和脂肪酸；例如丙烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和硬脂炔酸等不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸中，可以是单烯酸，也可以是多烯酸。其中八碳酸(辛酸最佳)、十碳酸(正癸酸最佳)、十二烷酸(月桂酸最佳)是最有代表性的例子。上述有机磺酸或有机磷酸化合物，其碳原子数目也是2-35个。
[修饰肽或蛋白质]指在肽或蛋白质中含有一个以上上述经修饰的氨基酸或非氨基酸的肽或蛋白质。
[促成长素]是一种内源性激素分泌促进因子(GHS)，有增加细胞内钙离子浓度的活性和诱导分泌生长激素的活性。其中包括来自人类、大鼠、小鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙、鲑鱼或犬的促成长素。更具体而言，所谓[促成长素]是有编号为1或2的氨基酸序列，其第3位的丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基的氢原子被n-辛酰基、丁酰基、己酰基、癸酰基或十二酰基中之一置换的蛋白质；或者是编号为1或2的氨基酸序列，除氨基末端起第一到第四个氨基酸之外的部分，发生1-10个，优选的是一个到几个氨基酸置换、添加或缺失而产生的氨基酸序列，其第3位的丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基的氢原子被n-辛酰基、丁酰基、己酰基、癸酰基或十二酰基中之一置换，并且具有增加细胞内钙离子浓度活性的蛋白质。
[促成长素衍生物]是指有增加细胞内钙离子浓度活性，以含有一个以上受到修饰的氨基酸或非氨基酸为特征的肽，或被容许作医药的它们的盐类。其中编号为1的肽氨基酸序列中，该肽至少有从氨基末端起到第4个氨基酸为止的序列、也可以是有从氨基末端起到第5个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第6个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第7个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第8个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第9个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第10个氨基酸为止的序列的肽，或被容许作医药的盐类。而且，编号为1～21的氨基酸序列中，从氨基末端起到第4个氨基酸为止的序列、也可以是从氨基末端起到第5个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第6个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第7个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第8个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第9个氨基酸为止的序列、从氨基末端起到第10个氨基酸为止的序列等以外的部分，至少含有一个氨基酸，也可以是1-10个氨基酸，优选的是1-几个氨基酸发生了缺失、置换和/或添加而产生的氨基酸序列的肽，以及被容许作医药的盐。在上述全部形态的肽和容许作医药的该肽的盐类中，从氨基末端起到第2个或第3个氨基酸，更确切是从氨基末端起到第3个氨基酸是受到修饰的氨基酸或非氨基酸尤为合适。
同时，编号1-21记载的氨基酸序列，或该序列至少有一个氨基酸，也可以是1-10个氨基酸，更确切说是1-几个氨基酸发生了缺失、置换和/或添加而产生的氨基酸序列中，从氨基末端起至第4个氨基酸为止的氨基酸序列可以用式6；A-B-C-D表示(式中A代表氨基酸、非氨基酸或没有；B代表氨基酸、非氨基酸或没有，但是A+B的分子链长与肽相当；C和D可以相同也可以不同，表示：(a)被修饰氨基酸；(b)有疏水性侧链的氨基酸；(c)有碱性侧链的氨基酸)，用该式表示氨基酸序列的肽片断被置换的肽，以及被容许作医药的盐类，也是合适的形态。
上述[有疏水性侧链的氨基酸]指亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、同型亮氨酸、同型异亮氨酸、萘基丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、环己丙氨酸，或这些化合物的N-甲基氨基酸或D-型异构体。上述[有碱性侧链的氨基酸]指赖氨酸、精氨酸或组氨酸，或这些氨基酸的D-型异构体。再者，上述式6中的C尤指受到上述修饰的氨基酸，D尤指有疏水性侧链的氨基酸。
还可以使用用式7：A¹-B¹-C¹-D¹表示的肽片段代替式6：A-B-C-D表示的肽片段(式中A¹代表氨基酸或非氨基酸，尤指天然氨基酸和它的D型异构体；B¹和C¹二者至少一个，只有一种是被修饰的氨基酸或非氨基酸时，另一种是没有被修饰的氨基酸或非氨基酸，尤指天然氨基酸和它的D型异构体。同时A¹+B¹的分子链长与二肽相当。D¹代表有疏水性侧链的氨基酸)。
同时，还可以使用式8：B²-C²-D²表示的肽片段代替式6：A-B-C-D表示的肽片段(式中B²代表有相当肽分子长度的非氨基酸，C²代表被修饰的氨基酸或非氨基酸，D²代表有疏水性侧链或有盐基性侧链的氨基酸)。
[促成长素衍生物]还可以指上述形态的肽或被容许作医药的该肽的盐类的氨基末端或羧基末端进行了修饰的化合物。具体而言，可以是上述形态的肽或被容许作医药的该肽的盐类的羧基末端再结合了碱性氨基酸的化合物。也可以是上述形态的肽或被容许作医药的该肽的盐类的氨基末端被一个碳原子以上的饱和或不饱和烷基，或酰基修饰，和/或羧基末端的羧基之OH基被转换成OZ或NR2R3(Z表示医药行业运行使用的阳离子或低级支链或非支链的烷基；R2和R3表示氢原子和低级(C_1-6)支链或非支链的烷基中选出的相同或不同的基团)的化合物。还可以是将以上几种修饰加以组合形成的化合物。
本发明所涉及的修饰肽或蛋白质的制造方法以以下3项工序为特征：(a)用弱酸性脱离树脂制造含有一个以上受到修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性肽片段；(b)与(a)制造保护性肽片段相区别地另行制造不含受到修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性肽片段；再将(a)及(b)两工序制造地保护性肽片段加以缩合。
下面具体叙述制造修饰肽或蛋白质的各工序。
由于借助本发明的制造方法得到的修饰肽或蛋白质或它们的片段是具有肽性质的化合物，所以可以用本身是公知的肽合成方法合成。这里所谓修饰肽或蛋白质，或它们的片段包含有用保护性基团保护了它们的反应性功能基团的化合物。肽合成的方法，例如固相合成法、液相合成法都可以使用。即把初步修饰的肽或蛋白质或构成它们的片段的部分肽或氨基酸与剩余部分相缩合，当产物含有保护性基团时则要使保护基脱离，由此制造目的肽的方法。公知的缩合方法和使保护性基团脱离的方法可以举以下文献1～3记载的方法：
1.泉屋信夫他《肽合成的基础和实验》丸善株式会社发行(1985年)
2.矢岛治明与神原俊平《生物化学实验讲座I、蛋白质的化学IV》日本生化学会编，东京化学同人发行
3.矢岛治明监修：《续医药品之开发、第14卷、肽合成》广川书店发行
含有一个以上受到修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性肽片段的制造工序，其特征是采用再弱酸性脱离树脂上使肽链延长的固相化学合成法。更具体而言，是采用弱酸性脱离树脂，在α-氨基和侧链上将在制造肽片段时可能引起不利副反应的反应性功能基加以适当保护的氨基酸或非氨基酸，依照目的肽片段的序列，按照本身为公知的各种缩合方法在弱酸性脱离树脂上加以缩合，再把制成的保护的肽片段从弱酸性脱离树脂上脱离下来而不使保护性基团脱离，从而可以获得所需要的保护性多肽片段。
上述弱酸性脱离树脂，是指被用于合成肽的树脂，可以在该树脂上制备肽片段并在弱酸性条件下将该肽片段脱离下来。作为弱酸性树脂，在含有一种以上下述化合物的溶液中，即可将在树脂上制备的肽片段从树脂上脱离下来。这些化合物包括乙酸、三氟乙酸、或甲酸等羧酸，以及三氟乙醇或六氟异丙醇等氟化醇类。弱酸性树脂具体有诸如2-氯代三苯甲基树脂、三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂、4-甲氧基三苯甲基树脂、Rink Amide Barlos树脂等三苯甲基系列树脂，以及Sieber Amide树脂等。
α-氨基和侧链上反应性功能基(以下简称侧链功能基)的保护基并没有特别限定。α-氨基的保护基可以举出叔丁氧基羰基(BOC)、三氯乙基氧羰基、叔戊基氧羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲基磺酰基乙氧羰基、三氯乙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基或者吡啶-4-甲氧基羰基等的可有取代基的烷氧羰基；环庚氧羰基或者环己氧羰基等的可有取代基的环烷基氧羰基；苄氧羰基(Z)、对甲氧基苄基氧羰基(PMZ)、P-氯苄氧羰基(C1-Z)、对溴苄氧羰基(Br-Z)、对硝基苄基氧羰基、金刚烷氧碳基、2-苯基异丙基氧羰基、对甲基苯基异丙基氧羰基、对朕苯基异丙基氧羰基、3，5-二甲氧基-α，α-二甲基苄基氧羰基等的可有取代基的芳烷氧羰基：苄基(BZ1)、二苯甲基、三苯甲基等的可有取代基的芳烷基；三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、苯磺酰基、对甲苯磺酰基(TS)、邻硝基苯基亚磺酰基、2，4-二硝基苯基亚磺酰基、3-硝基-2-吡啶基亚磺酰基等的可有取代基的酰基；二硫琥珀酰基、2-硝基苯基硫、二苯基五磺酰基、二苯基磷酰硫基、二甲基磷酰硫基等。
丝氨酸等的羟基可以用乙酰基等低级(C_1-6)链烷酰基，苯甲酰基等芳酰基、苄氧羰基、乙氧基羧基等由碳酸衍生而来的基团来保护。
精氨酸的胍基可以用硝基、Z基、Ts基、P-甲氧苯磺酰基(Mbs)、4-甲氧基-2，6-二甲基苯磺酰基(Mbs)、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)、均三甲苯基-2-磺酰基(Mts)、2，3，4，5，6-五甲基苯磺酰基(Pme)、2，4，6-三甲氧苯磺酰基(Mtb)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、2，2，4，6，7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)等来保护。
半胱氨酸的巯基可以用诸如三苯甲基、乙酰氨基甲基(Acm)、叔丁基、苄基、p-甲基苄基、p-甲氧基苄基、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基和丁基硫基等来保护。
作为组氨酸的咪唑基可以使用例如Boc基、三苯甲基(Trt)、Ts基、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、2，4-二硝基苯酚(DNP)基、苄基氧甲基(Bom)基、叔丁氧甲基(Bum)基、Fmoc基等。
色氨酸的吲哚基可以用例如，甲酰基、Z基、2，4-二氯苄氧羰基、三氯乙基氧羰基、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、2，4，6-三甲氧苯磺酰基等保护。
用固相合成法进行缩合反应可以用上述弱酸性脱离树脂将氨基酸逐个顺次延长进行缩合的逐次延长法，可以用将二个以上氨基酸组成的肽片段进行缩合的片段缩合法，也可以将这两种方法组合起来进行缩合。而上述二个以上氨基酸组成的肽片段可以采用常用的液相法、固相法等由氨基酸制造。
首先，要将上述适当保护了α-氨基和侧链功能基的氨基酸或非氨基酸(以下除特别注明，均简称为保护性氨基酸)活化，在弱酸性脱离树脂上缩合活化了的保护性氨基酸。此时须从已知可以用于肽缩合反应的溶剂中适当选择用于活化保护性氨基酸和用于与树脂缩合的溶剂。例如可以用N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等的酰胺类；二氯甲烷、三氯甲烷等卤代烃类；三氟乙醇、苯酚等的醇类；二甲基亚砜等的亚砜类；吡啶、二噁烷、四氢呋喃等的醚类；乙腈、丙腈等的腈类；醋酸甲酯、醋酸乙酯等的酯类或它们的适当混合物。反应温度可以和形成肽键反应的温度相同，通常在-20-50℃之间作适当选择。活化的保护性氨基酸一般1-4倍过量使用，可以用茚三酮反应测试，当缩合反应不充分时可以在不使保护基团脱离的条件下反复进行缩合反应，以便进行完全。在反复进行缩合仍然不能充分完成时，可以用无水乙酸或乙酰咪唑将未反应的保护性氨基酸乙酰化，这样不会影响后续的反应。
然后，将缩合在弱酸性脱离树脂上的保护性氨基酸按所需要的序列将保护性氨基酸缩合。各保护性氨基酸的缩合反应，可以采用常用的诸如羧基末端活化法、偶合剂偶合法等。羧基末端保护法包括活性酯化法和对称酸酐法等。上述活性酯化法中采用的活性酯可以有诸如氰基甲基酯等的烷基酯；硫代苯基酯、对硝基硫代苯基酯、对甲磺酰苯基酯、对硝基苯基酯、2，4-二硝基苯基酯、2，4，6-三氯苯基酯、五氯苯基酯等的苯基酯；1-羟基丁二酰亚胺(HOSu)、N-羟基邻苯二酰亚胺酯、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酸亚酰胺(HONB)等的二羧酸亚胺酯；8-氢喹啉酯、N-羟基派啶酯、2-羟基吡啶酯等的羟基胺衍生物。
上述偶合剂偶合法，可举以下诸方法为例：例如，使用二环己基碳化二亚胺(DCC)、水溶性碳化二亚胺(WSC)等碳化二亚胺法；DCC-活性化法；羰基二咪唑法(CDI)；乌德互特(woodward)反应剂(N-乙基-5-苯基异噁唑基-3′-磺酸盐)或者N-乙基-2′-羟基苯并异噁唑三氟硼酸盐等的异噁唑盐、1-乙氧基羰基-2-乙氧-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、1-乙氧羰基-2-异丁氧-1，2-二羟基喹啉(IIDQ)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)-磷鎓六氟磷酸酯(BOP)、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲基-六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲基-六氟磷酸酯(HBTU)、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基-脲基-四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷酰叠氮(DPPA)等的方法。
上述碳化二亚胺法中使用的水溶性碳化二亚胺(WSC)中包括EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚铵、N-环己基-N′-吗啉基乙基碳化二亚胺、N-环己基-N′-(N，N′-二乙基氨基)环己基碳化二亚胺等。水溶性碳化二亚胺也可以是盐酸盐等盐类。
上述DCC-添加法包括DCC-HOSu法、DCC-HOBt(1-羟基苯丙三唑)法、DCC-HONB法、DCC-2-羟基亚氨基-2-氰基醋酸乙酯法、WSC-HOSu法、WSC-HOBt法等。
宜采用的缩合反应包括碳化二亚胺法、活性酯法、DCC-添加法等。更好的缩合反应包括阻止外消旋化的方法、例如活性酯法、DCC-添加法(如DCC-HOBt法、DCC-HOSu法、WSC-HOSu法、WSC-HOBt法)等。
所需的保护性肽片段含有至少一个被修饰的氨基酸或非氨基酸。将被修饰的氨基酸或非氨基酸接入肽链的方法可以有以下两种。
第一种方法是预先对所选定的氨基酸或非氨基酸的侧链进行修饰，再在肽链伸长阶段将这些氨基酸或非氨基酸(以下称为“经残基特异性修饰的氨基酸或非氨基酸)导入。更具体而言，即经残基特异性修饰的氨基酸或非氨基酸(包括在这些α-氨基上附加了保护性基团的化合物)可以用本身公知的合成方法合成。例如酯化反应、酰胺化反应、醚化反应、酰化反应和烷基化反应等，这些反应可以采用同行界惯用的公开方法来进行。而且，用上述任何一种缩合反应，都可以将它们导入肽链。此时把保护性肽片段从弱酸性脱离树脂上脱离下来要适当选择下述条件，该条件应该是不会使所需的经残基特异性修饰的氨基酸或非氨基酸侧链的取代基R脱离的条件。
第二种方法是按上述方法制备由氨基酸和/或非氨基酸组成的有特定序列的肽片段，然后特异地修饰所需氨基酸或非氨基酸的侧链(以下简称为残基特异性修饰)。可以用公知方法进行残基特异性修饰，不特别限定某种方法。例如酯化反应、酰胺化反应、醚化反应、酰化反应和烷基化反应等，这些反应可以采用同行界惯用的公开方法来进行。此外，还有磷酸化修饰法，可见Tetrahedron Letter 41卷p.4457-4461，2000年；Biopolymers 60卷，p.3-31，2001年等文献，以及糖基修饰法，可见Int.J.Peptide Protein Res.，42卷，p.165-170，1993年；Science，291卷，p.2344-2350，2001年；Science，291卷，p.2357-2364，2001年等文献。
有关方法可以分成以下两类。即在用保护性基团保护要进行残基特异性修饰的氨基酸或非氨基酸之侧链功能基时，一种情况是在脱去保护性基团的同时将被保护的肽片段从树脂上完全脱离下来；另一种情况是在脱去保护性基团的同时不把被保护的肽片段从树脂上脱离下来。在前一情况下，羧基末端的羧基被保护性基团保护后，可以用自身公知的合成方法进行残基保护性修饰，然后适当选择后述方法将羧基末端的羧基脱保护即可得到所需之多肽片段；在后一种情况下，可以在树脂上以自身公知的合成方法进行残基保护性修饰，然后即可适当选择后述方法将所需肽片段从树脂上脱离下来。
在本发明种，用上述方法制备由氨基酸和/或非氨基酸组成的有特定序列的肽片段，然后用保护性基团保护要进行残基特异性修饰的氨基酸或非氨基酸的侧链上的反应性功能基。此时最好采用将保护性基团脱保护，用自身公知的合成方法在树脂上施行残基特异性修饰，然后将保护性肽片段从下述弱酸性脱离树脂上脱离下来，并根据要求进行各种保护性基团的脱保护。
在上述方法中，施行残基特异性修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性基团，虽然并不特别限制要在将有关保护性基团脱保护时不使保护性肽片段从树脂上脱离下来，但最好用叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等甲硅烷类基团。在脱去这些保护性基团时，可以采用特异性脱保护试剂。这些试剂可以特异地将施行残基特异性修饰的氨基酸或非氨基酸的侧链功能基的保护性基团脱去，而不把保护性肽片段从树脂上脱离下来。这类试剂可以根据弱酸性图例树脂和保护性基团的种类不同而作适当选择，当上述保护性基团是甲硅烷基时，可以用氟代季铵盐，用四丁基氟化铵(TBAF)则更好。
如果按上述方法选择保护基，在为了使肽链延长进行缩合反应而将氨基末端的氨基脱保护时，被保护的肽片段不从各保护性氨基酸侧链功能基的保护性基团和弱酸性脱离树脂上脱离下来，而且在从所得到的肽-树脂结合体上把弱酸性树脂脱离开时，各氨基酸残基侧链功能基的保护性基团则不脱离。之所以要这样，是因为这样可以阻止副产物的形成。因此，可以以较好的收率简便地获得高纯度的侧链功能基被保护性基团保护了的肽片段。这种肽片段由于侧链功能基被保护了，不须导入新的保护性基团，在下一工序用它作为原料，在借助液相法制备所需修饰肽或蛋白质时用起来更合适。
最后，是把制备的被保护的多肽片段从弱酸性脱离树脂上脱离下来。此时应在弱酸性条件下进行，这种条件可使被保护的肽片段中的保护性基团，即氨基酸或非氨基酸侧链功能基的保护性基团不会发生脱保护。所谓弱酸性条件，是将弱酸性脱离树脂悬浮在含有以下化合物的溶液中，这些化合物有乙酸、三氟乙酸或甲酸等羧酸类，以及/或者三氟乙醇、六氟异丙醇等氟代醇类。具体而言，可以采取把制备的被保护的肽片段放在上述溶液中搅拌一定时间(5分钟-4小时，更优选是10分钟-2小时)，使该肽片段从弱酸性脱离树脂上脱离下来。更具体的方法可以采用Barlos的方法(Tetrahedron Lett，30卷p.3947，1989年)等公知方法。例如可以将肽片段悬浮在0.5％三氟乙酸/二氯甲烷或乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷＝1/2/7的溶液中，或悬浮在乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷＝2/2/6的溶液中。
在本发明中，还可以不插入被修饰的氨基酸或非氨基酸到肽链中而使被保护的肽片段从弱酸性脱离树脂上脱离下来，然后对特定氨基酸残基进行残基特异性修饰，这样来制备含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸的肽片段。残基特异性修饰方法与上述相同。
上述制造方法并无特别限制地适用于含一个以上受到修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性肽片段。对于制备含有一个以上受到以下列式9表示的修饰的氨基酸或非氨基酸的肽片段或它们的盐类，采用上述方法是适宜的。
式9：(R1)n-Gly-Ser(X1)-A(R)-Phe-Leu-Ser(X2)-Pro-OR2
其中-A(R)-代表上述受到修饰的氨基酸或非氨基酸化合物。其中A可以是丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、2-氨基己二酸、二氨基乙酸、2-氨基丙二酸、天门冬氨酸、酪氨酸或天门冬酰胺；R通过酯键、醚键、硫醚键、二硫键、酰胺键、O-糖苷键或N-糖苷键等与A的侧链上的反应性取代基结合。R1表示可以举出叔丁氧基羰基(BOC)、三氯乙基氧羰基、叔戊基氧羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲基磺酰基乙氧羰基、三氯乙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基或者吡啶-4-甲氧基羰基等的可有取代基的烷氧羰基；环庚氧羰基或者环己氧羰基等的可有取代基的环烷基氧羰基；苄氧羰基(Z)、对甲氧基苄基氧羰基(PMZ)、P-氯苄氧羰基(C1-Z)、对溴苄氧羰基(Br-Z)、对硝基苄基氧羰基、金刚烷氧羰基、2-苯基异丙基氧羰基、对甲基苯基异丙基氧羰基、对联苯基异丙基氧羰基、3，5-二甲氧基-α，α-二甲基苄基氧羰基等的可有取代基的芳烷氧羰基；苄基(BZ1)、二苯甲基、三苯甲基等的可有取代基的芳烷基；三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、苯磺酰基、对甲苯磺酰基(TS)、邻硝基苯基亚磺酰基、2，4-二硝基苯基亚磺酰基、3-硝基-2-吡啶基亚磺酰基等的可有取代基的酰基；二硫琥珀酰基、2-硝基苯基硫、二苯基亚磺酰基、二苯基磷酰硫基、二甲基磷酰硫基等，
n为1或2
X1和X2表示丝氨酸侧链羟基的保护性基团，既表示乙酰基等低级(C_1-6)烷酰基、苯甲酰基等芳酰基、苄氧羰基等或者乙氧羰基等碳酸衍生的基团，又表示适合醚化，即通过醚键把上述取代基结合到侧链上的基团。例如丁基、苄基、四氢吡喃基、三苯甲基和叔丁基二甲基甲硅烷基等甲硅烷基R2表示有或没有保护性基团。如有保护性基团，则是烷基酯基团(例如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、叔丁酯、环戊酯、环己酯、环庚酯、环辛酯、2-金刚酯等直链、支链或环状的烷基酯基团)、芳烷基酯基(如苄基酯、4-硝基苄基酯、4-甲氧基苄基酯、4-氯苄基酯、二苯甲基酯基)、苯甲酰甲基酯基、苄基氧羰肼基、叔丁氧基羰肼基、三苯甲基肼基)
式9中，R1可以是Boc基、Z基、pMZ基或Pmoc基，以X1和X2表示的保护性基团可以是叔丁基或3，4苄基，更合适的是是叔丁基。R2可以是氢原子或硫酯。
再者，上述制造方法可以适用于制备促成长素，可以是人类、大鼠、小鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙和鲑鱼，以及犬的促成长素或它们的衍生物。此外，也可以用于制备上述促成长素或它们的衍生物中含有的被修饰的氨基酸或非氨基酸部分。上述各种生物的促成长素的结构见表1所示。
更具体而言(a)在记载为编号1-21的任何一种氨基酸序列中，至少有从氨基末端第1个到第4个氨基酸序列，但可以由该氨基酸序列从氨基末端第一个到第5个氨基酸序列组成，或者由该氨基酸序列从氨基末端第一个到第7个氨基酸序列组成；(b)从氨基末端起第3个氨基酸丝氨酸或苏氨酸的侧链的羟基发生酰基化，优选是被饱和或不饱和的碳原子数为2-35个的烷基，最好是碳原子数为6-18个的烷基酰化；(c)氨基酸的侧链上羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上可能在制造肽片段时引起不利副反应的反应性功能基，最好是羟基和氨基用保护性基团给予保护了的肽片段的制备，也可以采用上述方法。
本发明中，用不同于制造上述含有受到修饰的氨基酸和非氨基酸的保护性肽片段的方法制造不含有受到修饰的氨基酸和非氨基酸的保护性肽片段。
在本发明中，肽和蛋白质不含有受到酰化、糖基化、磷酸化等修饰的氨基酸和非氨基酸的肽片段，可以用自身公知的基因重组和酶法制造。例如具有上述肽片段氨基酸序列的肽(以下称为目的肽)可以通过以下工序来制造：即培养被转化的具有编码该肽碱基序列的表达载体的细胞，然后由该细胞培养物提取目的肽的方法；以及用保护性基团保护借助上述工序获得的目的肽侧链功能基中有可能引起不利副反应的功能基的工序。表达载体的制备可以采用该领域常规方法进行。在制备表达载体时，可以从现有的方法中适当选用高表达目的肽所必要的其它条件，例如启动子、终止子、剪接部位等。用上述表达载体转化的宿主细胞并无特别限定，可以在已知的方法中从原核细胞或真核细胞，例如大肠杆菌等微生物细胞、酵母菌或动物细胞等适当选择能够顺利表达编码目的肽的序列的载体。目的肽侧链功能基的保护可以采用与上述相同的方法。
不含有受到修饰的氨基酸和非氨基酸的肽片段，也可以通过以下工序制造：
工序(1)根据目的肽的要求，通过合适的接头序列附加上保护性肽而成为融合蛋白，将具有编码此融合蛋白的碱基序列的表达载体转化细胞，培养该转化细胞，从该细胞培养物中提取融合蛋白；
工序(2)从由工序(1)得到的融合蛋白中，把保护性肽和合适的接头序列，以及目的肽切断分离，再根据需要进行纯化；
工序(3)在由工序(2)得到的目的肽的侧链功能基中，将那些可能引起不利副反应的功能基用保护性基团加以保护。
保护性肽是用于阻止目的肽在宿主细胞内被酶分解，只要达到该目的，并无特别限制，可以采用来自大肠菌β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的片段。类似该种酶的氨基酸序列在本专业是公知的，来自β-半乳糖苷酶的肽片段在本专业中广泛用作为融合蛋白的保护性肽。
接头的序列是在工序(2)中没有适合用来切断分离保护性肽和目的肽的酶类时，或不能顺利切断分离保护性肽和目的肽时，被插入到保护性肽和目的肽之间的序列。因此，当工序(2)中不能顺利切断分离接头序列和目的肽时，应该适当选择该序列。
把保护性肽和合适的接头序列，以及目的肽切断分离，可以采用酶法或/和化学法来进行。
酶法或化学法切断的方法可以使用记载在Methods in Enzymology，185卷，Gene Expression Technology(David V.Goeddel)等编辑，AcademicPress Inc.出版)等书籍中的方法。
化学法切断的方法，有用溴氰基(Bromcyan)切断蛋氨酸羧基末端的方法(D.V.Goeddel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.76，p.106-110，1979)、用甲酸切断序列-Asp-Pro-之间的键的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.40，p.1173，1970)、用羟胺切断序列-Asn-Gly-之间的键的方法和用BNPS-三甲基吲哚或N-琥珀酰亚胺切断胰蛋白酶羧基末端等方法。例如在涉及目的肽的氨基酸序列中不含蛋氨酸时，可以在邻接目的肽的切断部位范围内的末端导入蛋氨酸，再以化学方法用溴氰基处理在切断部位进行切断。
作为酶法切断的方法，由于用于处理的酶能够特异地识别底物，设定切断部位即可。例如精氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、精氨酸-赖氨酸、以及赖氨酸-精氨酸等碱性氨基酸对中间的肽键、或者精氨酸-蛋氨酸、精氨酸-丙氨酸、或精氨酸-缬氨酸等氨基酸对的中间的肽链，可以用大肠杆菌OmpT蛋白酶(Sugimura，K.和Nishihara，T.J.Bacteriol，170：5625-5632，1988)切断；X-Gly或Pro-X-Gly-Pro序列中的-X-Gly-序列可以用胶原酶切断(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.81，p.4692-4696，1984)，-Asp-Asp-Asp-Lys-序列(序列编号22)的赖氨酸羧基末端可以用肠激酶，-Ile-Glu-Gly-Arg-序列(序列编号23)的精氨酸羧基末端可以用血液凝固因子Xa(日本公开专利昭和61年-135591号公报)，-Gly--Pro-Arg-序列的精氨酸羧基末端可以用凝血酶(日本公开专利昭和62年-135500号公报)，-Arg-的羧基末端可以用胰蛋白酶或梭菌蛋白酶，Arg或Lys的羧基末端可以用内切蛋白酶ArgC(Nature，Vol.285，p456-461，1980)，Lys-Arg、Arg-Arg或Pro-Arg序列的羧基末端可以用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Kex2蛋白酶及其衍生物(Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.144，p.807-814，1987；日本公开专利平成1年-199578号公报；日本公开专利平成10年-229884号公报)，Lys的羧基末端可以用lys1内切蛋白酶或lysC内切蛋白酶lysC(日本公开专利昭和61年-275222号公报)，Asp或Glu羧基末端可以用金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)的V8蛋白酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.69，p.3506-3509，1972)，-Phe-Arg-序列羧基末端用激肽释放酶(日本公开专利昭和62年-248489号公报)，-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-序列(序列编号24)的-Leu-Leu-之间的键可以用凝乳酶(日本公开专利昭和60年-262595号公报)，Glu-Gly-Arg-序列羧基末端用尿激酶(日本公开专利平成2年-100685号公报)，-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列(序列编号25)羧基末端用肠肽酶(Biotechnology，Vol.6，p.1204-1210，1988)，poly-Gly羧基末端用溶葡球菌酶(日本公开专利平成1年-160496号公报)，-Lys-Arg、Arg-Arg或Pro-Arg等的羧基末端用乳酸克鲁维酵母(Kluverromyces lactis)(日本公开专利平成1年-124390号公报)等。
本方法中的表达载体、宿主细胞和目的肽的侧链功能基的保护等与上述方法相同。
再者，不含有受到基因重组法或酶法修饰的氨基酸或非氨基酸的肽片段的制造，可以采用记载在编号为WO 99/38984的国际公开专利中的方法。
对于促成长素及其衍生物的不含受到修饰的氨基酸或非氨基酸的肽片段，该不含受到修饰的氨基酸或非氨基酸的肽片段，用基因重组法或酶法制造的方法记载在编号为WO01/07475的国际公开专利中。
记载在编号为WO 00/52193的国际公开专利中在生产类胰高血糖素肽-1时采用的保护性蛋白质和接头序列也可以适用于采用OmpT蛋白酶及其衍生物和Kex2蛋白酶及其衍生物用两步酶法制造促成长素片段(非修饰成分)。由于在这个方法中有可能应用宿主大肠杆菌的内源OmpT蛋白酶，没有必要另行制备酶。上述OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶及其衍生物如果有与OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶相同的活性则不须特别规定。OmpT蛋白酶衍生物有大肠杆菌的OmpT蛋白酶、以沙门氏菌的pgtE蛋白酶为代表的属于Omptin家族的酶和含有OmpT蛋白酶活性部位的肽等；Kex2蛋白酶衍生物有记载在日本公开专利平成10年-229884号公报中的衍生物和以Furin、PC1/3为代表的属于Kex2家族的酶。
如实施例13所示，在本方法中，没有采用记载在编号为WO00/52193的国际公开专利中的接头序列EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(序列编号26)，而是采用第35个氨基酸以精氨酸置换了原来的脯氨酸的序列EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR(序列编号27)作为接头序列，通过使用OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶的二步酶处理法，能够有效获得促成长素片段(非修饰成分)，包括促成长素(8-28)，特别是促成长素(8-28)。新发现的记载为编号27的接头序列内，尽管还有除OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶切断识别部位外的另外的切断识别部位，但只在所需要切断的部位发生正常的切断(参见实施例3)。
再者，当纯化和保存保护性肽片段(非修饰成分)时，可以通过调整用于纯化和保存的溶液的pH为4-8来防止保护性基团脱离。因此，通过阻止保护性基团脱离可以高纯度高收率制备修饰肽或蛋白质。上述用于纯化和保存的溶液可以是水溶液。具体而言是水，尤其是超滤水和乙酸钠溶液等。如实施例15所示，测定水溶液中保护性人类促成长素(8-28)片段的稳定性的结果表明，用Boc基保护的肽片段随水溶液的状态不同稳定性而不同，特别是在pH2以下的水溶液中可发现该保护基脱离，因此在采用Boc基时，应该特别设定纯化和保存时的溶液pH为4-8之间。
其次，本发明中要将按上述方法得到的(a)含有1个以上受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护性肽片段和(b)不含有受到修饰的氨基酸或非氨基酸保护性肽片段加以缩合，再按需要使氨基酸或非氨基酸的侧链功能基的保护性基团脱保护。
上述缩合反应最好用液相法进行。同时，将上述(a)和(b)两种肽片段用液相法缩合时，这两种肽片段的各氨基酸或非氨基酸侧链的功能基一般是被保护性基团保护着的。上述保护性基团可以是前述各种功能基的保护性基团。较适宜的保护性基团是那些在相同脱离条件下可以使上述(a)和(b)两种保护性肽片段的保护性基团脱离下来的保护性基团。再者，在这种情况下，由于弱酸性脱离树脂已经脱离，所以不必考虑弱酸性脱离树脂的脱离条件，在这种情况下，侧链功能基的保护性基团最好用那些使氨基末端氨基脱离的条件来脱离。
用液相法进行上述(a)和(b)两种保护性肽片段缩合反应时，应适当选择前面记载的用于缩合反应的试剂和条件。最好用那些较难使肽或蛋白质副产消旋化异构体等杂质的方法。用于缩合反应较好的试剂有2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、2-(1-氢苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸酯(TBTU)、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、二苯基偶磷氰酸酯(DEPC)、二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DDC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)。其中缩合剂有，更好的在用上述缩合剂缩合肽片段时，在有二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、二环己基碳化二亚胺(DCC)或者1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，使用上述缩合剂的肽片段的缩合是在1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)或者3，4-二氢-3-羟基-4-氧基-苯并三嗪(HOOBt)的存在下进行时则更好。
在缩合反应的产物中，氨基酸或非氨基酸侧链的保护性基团可以适当脱保护。此时应适当选择脱保护的试剂和条件，所用方法应是较难使肽或蛋白质副产外消旋化异构体等杂质的方法。
各种保护性基团的脱离方法可以采用诸如《肽合成的基础和实验》等书籍中记载的方法。保护性基团的脱离方法，有采用强酸、弱酸、碱基、还原剂(接触还原、金属、硫醇等)、氧化剂、求核试剂、亲电子试剂、离子、电子、光、溶剂、酶等形形色色的方法，在选择上述保护性基团时，要考虑这些脱离方法的脱离条件。
脱保护还可以采用以下方法，包括用三氟乙酸、乙酸、无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸或它们的混合液等(最好是三氟乙酸、乙酸等)处理，用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等碱基处理，在有Pd-碳等催化剂存在下在氢气流中接触还原，在乙酸中用锌粉(Zn/AcOH)处理，以及氟化四丁基铵(TBAF)处理等。上述脱保护反应一般在40℃以下进行，在25℃以下较好，这样可以有效阻止肽或蛋白质副产外消旋化异构体等杂质。上述脱保护反应的反应时间通常为0.5-约5小时。
在进行上述酸处理时，可以添加阳离子捕获剂，例如水、三异丙基硅烷(TIPS)、苯酚、苯甲醚、硫代苯甲醚、间甲酚、对甲酚、甲硫醚、1，4-丁烷二硫醇、1，2-乙烷二硫醇等(优选是苯酚)。此外，用作组氨酸的咪唑基的保护性基团的2，4-二硝基苯基可以用硫苯酚除去，色氨酸的吲哚基的保护性基团的甲酰基可以在有上述1，2-乙烷二硫醇、1，4-丁烷二硫醇等存在下通过酸处理而脱保护，用稀氢氧化钠溶液、稀氨水等进行碱处理也可以除去保护性基团。
由本发明所得到的反应产物，可以用诸如凝胶过滤、离子交换色谱、分配色谱、高效液相色谱、反向高效液相色谱、电泳等常用的分离纯化手段进行纯化。此外，用上述分离纯化手段适当纯化的产物，显然不限于所需要的最终产物，即修饰了的肽或蛋白质，还可以是含有一个以上受到修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性肽片段、不含受到修饰的氨基酸或非氨基酸的保护性肽片段、以及整个制造工序内得到的中间体。
按上述方法可以制造修饰肽和蛋白质。本发明涉及的上述制造方法可以无特别限制地适用于修饰肽和蛋白质，可以用于制造促成长素，尤其适用于制造人类、大鼠、小鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙和鲑鱼和犬的促成长素，以及促成长素的衍生物。上述各种生物的促成长素的结构记载在表1中。用本发明获得的促成长素或它们的衍生物比起用以往技术得到的促成长素或它们的衍生物，杂质(特别是成长素或它们的衍生物的外消旋化异构体)大幅度减少，是品质极高的成长素或它们的衍生物。结果得到了一种有更简便纯化方法进行有效的充分纯化，工序时间缩短，收率提高的促成长素及其衍生物的制造方法。
上述所谓[高品质的促成长素及其衍生物]，具体而言，是纯化的促成长素及其衍生物或它们的盐类中，有关类缘物质的总量在1％以下(通常约为0.9％以下，较好时约为0.8％以下，最好时约为0.7％以下)，所谓类缘物质，是可以用高效液相色谱检出的全部杂质的总和。杂质有促成长素或促成长素衍生物的外消旋化异构体、高极性的类缘物质和其它不纯物质等。
用本发明制造修饰肽或蛋白质的最佳状态包括如下所述工序。
工序1(a)在记载为编号1-21的任何一种氨基酸序列中，至少有从氨基末端第1个到第4个氨基酸序列，可以由该氨基酸序列从氨基末端第一个到第5个氨基酸序列组成，或者由该氨基酸序列从氨基末端第一个到第7个氨基酸序列组成；(b)从氨基末端起第3个氨基酸丝氨酸或苏氨酸的侧链的羟基发生酰基化，优选是被饱和或不饱和的碳原子数为2-35个的烷基，最好是碳原子数为6-18个的烷基酰化；(c)氨基酸的侧链上羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上可能在制备肽片段和以下述工序(4)进行肽片段缩合反应时引起不利副反应的反应性功能基，尤其是羟基和氨基用保护性基团给予保护了的肽片段在弱酸性脱离树脂上制备的工序。
工序(2)在弱酸性条件下把上述肽片段从弱酸性脱离树脂上脱离下来，而不使肽片段上的保护性基团脱离的工序。
工序(3)以下肽片段的制造方法，即记载为编号1-21的任何一种氨基酸序列中，除由工序(1)和(2)制备的肽片段所具有的氨基酸序列外，还有由其它序列组成的肽片段，这些序列可以是从该氨基酸序列氨基末端第6个到28个的氨基酸序列组成，可以是该氨基酸序列氨基末端第8个到28个的氨基酸序列组成，而且氨基酸或非氨基酸侧链上羟基、氨基、胍基、咪唑基、吲哚基、巯基和羧基等基团中任何一种以上、有可能在按下述工序(4)进行肽片段缩合反应时引起不利副反应的反应性取代基被保护性基团给予保护了的肽片段。
工序(4)把由上述工序(2)制备的肽片段和由工序(3)制备的肽片段进行缩合，然后根据需要将反应性功能基的保护性基团脱保护。
用本发明所涉及的方法得到的修饰肽或蛋白质，能够因反应条件不同而得到游离的肽或它们的盐类，游离肽及其盐可用常规方法相互转换。当把游离肽制成符合药理要求的盐类时，可以用下述无机酸或有机酸等进行反应。上述肽或蛋白质的盐类应该是符合药理要求的盐类。当该肽或蛋白质有氨基等碱性基团时，可以是无机酸(亦称有机游离酸，例如碳酸、重碳酸、盐酸、硫酸、硝酸、硼酸等)、有机酸(亦称无机游离酸，例如琥珀酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸等)的盐；当该肽或蛋白质有羧基等酸性基团时，可以是无机盐基(亦称无机游离碱基，例如钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属)，或有机碱基(亦称有机游离盐基，例如三乙胺等有机胺类、精氨酸等碱性氨基酸类等)的盐类。该肽或蛋白质还可以形成金属配合物(如铜配合物、锌配合物等)。
用本发明所涉及的方法得到的修饰肽或蛋白质，能够在各种用途中利用。例如上述纯化的促成长素或促成长素衍生物毒性低，可以作为哺乳动物(例如人类、猴类、犬类、大鼠、小鼠)的摄食障碍治疗药、生长激素分泌促进药、心脏病治疗药、胃功能性疾病治疗药、肠道粘膜保护剂和静脉输液时小肠粘膜障碍预防药、骨质疏松治疗药、慢性病虚弱减少剂、肺功能不全治疗剂等医药品。同时，上述纯化的促成长素或促成长素的衍生物可以根据需要制成糖衣丸剂、胶囊、酏剂或缓释剂等口服剂型，也可以与水或药理学许可的其它溶液配成无菌溶液、悬浊液或缓释制剂等针剂，制成溶液、悬浊液等滴鼻剂、喷雾剂或吸入剂等非口服剂型。上述纯化的促成长素或促成长素衍生物可以和已被生理学接受的公知载体、香味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等，以通常制备制剂要求的单位用量一起混合来制造上述制剂。
实施例
下面用实施例来进一步详细说明本发明，但本发明并不只限于这些内容。除特别注明者外，本实施例中所使用的试验方法和仪器注明如下。
(本发明中使用的主要省略符号)
HBTU   2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯
DCC    二环己基碳化二亚胺
HOBt   1-羟基苯丙三唑
HOOBt  3-羟基-3，4-二氢-4-氧-1，2，3苯并三嗪
TFA    三氟乙酸
TIPS   三异丙基硅烷
DIPHA  二异丙基乙胺
TBAF   氟化四丁铵
TFE    三氟乙醇
Fmoc   芴甲氧基羰基
Boc    叔丁氧基羰基
tBu    叔丁基
TBDMS  叔丁基二甲硅烷基
Trt    三苯甲基
Pac    苯甲酰甲基(phenacyl)
DMF    N，N-二甲基甲酰胺
DCM    二氯甲烷
NMP    N-甲基吡咯烷酮
Et₂O   乙醚
DMAP   4-二甲氨基吡啶
EDC    1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺
『用于合成的保护性氨基酸和树脂』
Boc-Gly，Fmoc-Ser(TBDMS)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Leu，Fmoc-Ser，Fmoc-Pro等由渡边化学工业公司和APPLIED BIOSYSTEM公司制造，脯氨酰-2-氯代三苯甲基树脂由NOVOBIOCHEM公司制造。
『使用的仪器』
(a)肽自动合成仪APPLIED BIOSYSTEM公司制造433A机
(b)分析用HPLC系统
仪器：岛津LC-10A系统
柱：YMC-Pack PROTEIN-RP或YMC-Pack ODS AP-302或YMC-Pack PROTEIN-C8(规格皆为4.6mmΦ×150mm)
柱温：40℃
洗脱液：0.1％三氟乙酸中乙腈浓度按直线改变，直至100％为止。
流速：1mL/分钟
检测：UV(波长210nm和214nm)
进样量：10～50μL
(c)分析用色谱系统
仪器1：AKTA explorer 10S(AMASIUM PARMACIA公司制色谱系统)
柱：SP-Sepharose big beads(XK26/30)
(AMASIUM PARMACIA公司制树脂)
内径26mm×长300mm
YMC-ODS 120 s50(HR26/15)(YMC公司制树脂)
内径26mm×长15mm
Vydac C4(HR10/30)(Vydac公司)
内径10mm×长300mm
Source 30RPC(HR10/30)23ml(AMASIUM PARMACIA公司制树脂)
内径10mm×长30mm
流速、洗脱液等条件在实施例中另行说明。
仪器2：Applied Biosystem BioCAD perfusion Chromatographyworkstation
柱：SP-Toyopearl 550-c(内径16mm×长280mm TOSOH公司制造)
YMC-ODS AM(粒径20μm，内径21.5mm×长300 YMC公司制造)反向色谱ODS-80Ts(内径21.5mm×长300柱(108ml)，粒径20μm，TOSOH公司制造)
流速、洗脱液等条件在实施例中另行说明。
(d)制备用色谱系统
仪器1：Waters 600 Multisolvent Delivery System
柱：YMC-Pack ODS-A(5μm，20mm×250mm)或YMC-PackPROTEIN-RP(5μm，C4，20mm×250mm)
洗脱液：0.1％三氟乙酸中乙腈浓度按直线改变，直至100％为止。
流速：10mL/分钟
检测：波长210nm和260nm
进样量：10～2000μL、2000μL以上，用泵注入
(e)质谱仪
仪器1：FINICAN MAT TSQ700
离子源：BS1
检测离子模式：Positive
喷雾电压：4.5kV
毛细管温度：250℃
移动相：0.2％乙酸·甲醇混合液(1∶1)
流速：0.2mL/分钟
扫描范围：m/z300～1500
仪器2：API 3000(宝酒造)
离子源：BS1
检测离子模式：Positive mode
扫描类型：Q1scan
流速：0.3mL/分钟
在5分钟chase过程中1count/0.1msec
分子量范围：500～3000Mass
(f)氨基酸序列分析
仪器1：PE公司制造APPLIED BIOSYSTEM 477A型序列分析仪
(g)氨基酸组成分析
仪器：日立公司制造，L-8500型氨基酸分析仪
样品：用含0.1％苯酚的6M盐酸在密封管中，于110℃水解24小时。
【来源于人类的促成长素(8-28)[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]制造规模概述】
以下所述是实施例1到实施例8以获得最后纯化制品达到0.6g水平的[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]hGhrelin(8-28)(表示来源于人类的促成长素，下同)为目的的培养和纯化结果。如实施例1所述，用表达载体转化大肠杆菌，表达具有同实施例所示之氨基酸序列的融合蛋白。在2L发酵罐中进行高密度培养，回收包含体。用一半回收的包含体开始纯化。OmpT反应[0.9L规模]、阳离子交换SP-sepharose big beads[160ml规模]、Boc化反应[0.5L规模]、反向柱YMC ODS-120 s50[80ml规模]和Kex2反应[0.3L规模]各进行一次，最后在纯化反向柱Vydac C4[25ml规模]上处理两次。只在最终纯化工序中用直线梯度浓度程序洗脱并分部收集。用蒸发器除去溶剂，用玻璃纤维滤纸(WHATMAN公司制造)进行减压过滤。
实施例1 hGhrelin(8-28)衍生物表达载体p117 8-28oRR的构建
根据hGhrelin的cDNA基因序列(Kojima等Nature，402卷，p.656-660，1999年)，用全合成的寡聚DNA(PHAMACIA BIOTECH公司)以退火法得到hGhrelin(8-28)的DNA片段。用于退火法的全合成寡聚DNA及其氨基酸序列如图1A所示。
将此DNA片段插入质粒pGP117ompPR中，该质粒中已经导入了编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶衍生物和人类胰高血糖素样多肽1的融合蛋白的基因。为此，用限制性内切酶SalI和SacII处理质粒pGP117ompPR，用琼脂胶电泳制备缺失了编码人类胰高血糖素样多肽1基因的DNA片段。在用碱性磷酸酯酶处理后，先用SacII，再用T4DNA连接酶使它和经T4DNA激酶处理过的hGhrelin(8-28)衍生物基因片段相连接。用连接而成的该质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，得到质粒p1178-28oPR。该质粒表达融合蛋白，该由接头连接着的融合蛋白含有hGhrelin(8-28)的氨基酸序列和β-半乳糖苷酶的部分片段117个氨基酸残基，接头序列为EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(序列编号26)。
再以该质粒p117 8-28oPR为模板，用KOD plus聚合酶(东洋纺织)，用以下两种引物
ORI-RR：
GGTTCCGGATCCCCTTCTCGACATCGCCGGGAACAC(序列编号28)
SAL^*R：ATAAGTCGACTTATCGTGGCTGCAG(序列编号29)
进行PCR，从电泳过的凝胶上切出增幅片段。然后用限制性内切酶Sal I和BamH 1处理该增幅片段。和质粒p117 8-28oPR一样，用T4DNA连接酶将此片段与上述经过Sal I和BamH 1处理并纯化的样品相连接，用连接好的质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，得到质粒p1178-28oRR。该质粒表达融合蛋白，该由接头连接着的融合蛋白含有hGhrelin(8-28)的氨基酸序列和β-半乳糖苷酶的部分片段117个氨基酸残基，接头序列为EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR(序列编号27)。表达的融合蛋白如图1B所示。
实施例2大肠杆菌之重组的表达和包含体的回收
用3L发酵罐装培养2L上述转化后的大肠杆菌，该大肠杆菌为用实施例1制备的质粒p117 8-28oRR转化大肠杆菌W3110菌株而来。该表达质粒由pBR322而来，可以用lac启动子诱导表达。同时，该质粒保有抗药基因四环素抗性基因。前培养用LB肉汤在32℃振荡培养14小时。主培养采用以下培养基：4g/L酵母膏、4g/L K₂HPO₄、4g/LKH₂PO₄、2.7g/L Na₂HPO₄、0.2g/L NH₄Cl、1.2g/L (NH₄)₂SO₄、2g/LMgSO₄·7H₂O、40mg/L CaCl₂、40mg/L FeSO₄7H₂O、10mg/L MnSO₄·nH₂O、10mg/L AlCl₃·6H₂O、4mg/L CoCl₂·6H₂O、2mg/L ZnSO₄·7H₂O、2mg/LNa₂MoO₄·2H₂O、1mg/LcuCl₂·2H₂O、0.5mg/L H₃BO₄。在开始的培养基中加入1％葡萄糖作为碳源，37℃培养。待葡萄糖消耗殆尽再补加。培养结束，将培养液用加压菌体破碎机(マントンゴ-リン)破碎菌体，再通过离心回收得约80g包含体。再将包含体悬浮在2L无离子水中，洗净离心回收的包含体。最终得到OD₆₆₀值为530的包含体旋浊液200mL。
以下实施例中将此包含体悬浊液平分为100ml使用之。
实施例3利用hGhrelin(8-28)融合蛋白之内在性OmpT蛋白酶进行的加工
将由实施2所得之包含体悬浊液调节为OD₆₆₀值为100，按下述反应条件用无离子水稀释的添加物并按下述反应条件进行OmpT的反应。
反应条件：4M尿素，20mM Tris-HCl pH7.4，50mM NaCl；反应体积800mL，反应温度32℃；反应时间40分钟。
用8M尿素溶液400mL将包含体溶解稀释为1000 D₆₆₀/mL，加入Tris-HCl和NaCl使之达到上述浓度，用无离子水调成800mL浆状。再调节pH为7.4开始反应。在反应开始后0分钟、20分钟和40分钟取样用HPLC分析，当反应40分钟切断率超过80％停止反应。反应停止后用5N NaON使pH上升为为11。反应停止后，低速离心除去残渣，得到上清液。
[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的浓度：2.23mg/mL
溶液量：800mL
肽含量：1.7g
HPLC测定结果和质谱分析结果表明发生着正常的加工过程，游离出[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)。用FINICAN MAT公司的质谱仪(TSQ-700)进行RSI-MS，其测定值为4078(理论值为4077)。
实例4[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的纯化(用阳离子交换法纯化)
将实例3所得之OmpT蛋白酶反应液的上清液用阳离子交换色谱进行纯化。
方法：
使用的色谱柱：SP-sepharose big beads(XK26/30)(160mL)
(AMASIUM PARMACIA公司制树脂)
平衡、洗涤液：1.5M尿素，50mM NaHCO₃，pH11
洗脱液：1.5M尿素，0.5M NaCl，50mM NaHCO₃，pH11
活化、再生液：0.4M NaOH
流速：10mL/分(2.5cm/min)
操作：
活化、平衡化：0.4M NaOH柱容积 无离子水2倍柱容积平衡液：100％3倍柱容积
装样：装样，平衡，用洗涤液反复洗涤到UV值下降为止(约4倍柱容积)
洗脱：用洗脱液100％的分段洗脱
结果：在洗脱液中得到的肽的纯度为90％，本工序的回收率为91.6％。
[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的浓度：4.75mg/mL
溶液量：300mL
肽含量：1.43g
实例5[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的Boc化
进行在纯化的[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)上附加Boc基团的反应，含于氨基末端的α氨基和序列中的Lys残基的侧链的氨基用Boc基保护。
方法：将阳离子色谱洗脱液300mL全部装在玻璃烧杯中，加入等量(300mL)的乙腈，达到50％乙腈。再边搅拌边加入1M的(Boc)₂O8.8mL(终浓度为20mM，25当量)，即相当于存在于[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)中的α氨基和赖氨酸残基侧链的ε氨基数目(约5处)的5倍摩尔量。再用5N NaOH调节pH不低于9，再在搅拌机搅拌下于室温中反应60分钟。用HPLC分析和分子量测定监控反应效率。反应结束后立即蒸发除去溶剂，然后用乙酸调节pH到5.5，析出的沉淀用玻璃纤维滤纸(Whatman公司制)减压过滤。通过此工序得到的含有产品[N^α-Boc，Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)1740mg的溶液580mL。
工序回收率：116％(工序回收率大于100％可认为是由于附加了Boc基而使HPLC测定吸光度数值增大，因而增加了表观回收率)
质谱分析采用FINICAN MAT公司的质谱仪(TSQ-700)进行RSI-MS，其测定值为4578(理论值为4577)。
主要看到，比起Boc之前(测定分子量＝4077，理论分子量＝4077)来，反应后分子量增加了500(测定分子量＝4578，理论分子量＝4577)。据推测，这个峰是hGhrelin(8-28)序列内的赖氨酸残基侧链存在4个ε氨基，以及氨基末端的α氨基被Boc基保护了而生成的[N^α-Boc，Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)。
实施例6用反相柱纯化[N^α-Boc，Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)
实施例5得到的[N^α-Boc，Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)采用反向柱纯化。
方法：
所用的色谱柱是YMC-ODS 120 s50(HR26/15)80mL(YMC公司制树脂)内径26mm×长15mm
平衡、洗涤液：10％的乙腈，30mM乙酸钠，pH到5.5
洗脱液：50％的乙腈，30mM乙酸钠，pH到5.5
树脂再生液：80％的乙腈
流速：流速：7mL/分(2cm/min)
用3倍柱容积的平衡用液平衡后，装样品到柱中，用3倍柱容积的平衡液洗涤柱子，(洗涤到UV值下降为止)。用100％的乙腈分段洗脱，洗脱后再用再生液洗涤干净。
得到含有得到的含有产品[N^α-Boc，Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)1770mg的溶液150mL。在此溶液中加入75mL超滤水稀释1.5倍，在蒸发器中将含在溶液中的乙腈蒸发干净。
工序回收率：98％
实施例7用Kex2蛋白酶制造[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)
由实施例6得到的肽溶液在下述条件下制备Kex2反应液。即，将ODS洗脱液用超滤水稀释成8mg/mL后，加入1M Tris-HCl pH8.3使其浓度为50mM。再加入CaCl₂使其浓度为5Mm，30℃保温10分钟，加入Kex2蛋白酶(日本公开专利平成10年-229884号公报)溶液(1×10⁷Unit/mL)使其浓度为2.5×10⁴Unit/mL用搅拌器不断搅拌，在30℃恒温葙中反应120分钟。反应结束后，用乙酸调节pH到5.5，停止反应。根据HPLC、质谱分析和氨基酸分析结果，得知作为酶解前后原料的[N^α-Boc，Lys16，19，20，24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)消失了，而[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)增加了，因此该工序进行正常。
实施例8[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)的纯化
实施例7所得到的含有[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)的反应后溶液，用反向色谱柱在下述条件下纯化。
方法：
所用的反向色谱柱是Yydac C4(HR10/30)23mL柱(Yydac公司制)内径10mm×长300mm
条件：
平衡、洗涤液：10％的乙腈，0.1％TFA，pH 3
洗脱液：50％的乙腈，0.1％TFA，pH 3
流速：流速：2mL/分(线性流速3cm/min)
用3倍柱容积的平衡液平衡后，分两次将完成Kex2反应的样品液装到柱中(20mg/mL)，用2倍柱容积的10％洗脱液洗干净柱子，以最后共8倍柱容积的洗脱液以10％-80％的梯度程序洗脱，随后用100％、2倍柱容积的洗净柱子，分部收集洗脱液，每部分6mL。分部收集的洗脱液进行HPLC分析，取出不含接头-[N^α-Boc]-[RHHGSGSPSRHRR]和未切断的[N^α-Boc，Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]hGhrelin(8-28)的部分。
结果：回收率：84.4％，纯度：97.5％
[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)浓度：5.62mg/mL
溶液量：120mL
肽含量：600mg
洗脱液用蒸发器除去溶剂，冷冻干燥。从用OmpT蛋白酶衍生物加工得到的1700mg前体(实施例3)获得600mg[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)(图2)
实施例9[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)纯化的回收率和纯度表。
表2是实施例3到实施例8制备[Lys^{16，19，20，24}(Boc)]-hGhrelin(8-28)的收率一览表。