一株以三聚氰胺为底物的降解菌及其筛选和应用.pdf

本发明公开了一株以三聚氰胺为底物的降解菌及其筛选和应用；所述降解菌为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)CGMCC No.9843；所述筛选方法包括：降解菌的富集；降解菌的驯化培养；降解菌平板划线分离单菌落；降解菌透明圈筛选；所述用途具体为以三聚氰胺为底物的降解菌在修复三聚氰胺污染土壤中的用途；所述使用方法包括向三聚氰胺污染土壤中加入降解菌的菌液或吸附有降解菌的生物炭。本发明筛选的降解菌可以利用三聚氰胺为唯一碳源，并有效降解三聚氰胺，为开发新的生物修复微生物资源提供了一种快速便捷的手段。

权利要求书
1.  一株以三聚氰胺为底物的降解菌，其特征在于，所述降解菌为洋葱伯克霍尔德 菌Burkholderia cepacia CGMCC No.9843。

2.  一种根据权利要求1所述的以三聚氰胺为底物的降解菌的筛选方法，其特征 在于，所述筛选方法包括如下步骤：
步骤一、降解菌的富集培养：称取受三聚氰胺污染的土样于含三聚氰胺的富集培养 基中，20-37℃、140-210r/min条件下培养7-10天，转接至新鲜的含三聚氰胺的富集培 养基培养，转接数次，得富集菌液；
步骤二、降解菌的驯化培养：取富集菌液，转接至基础培养基中，添加三聚氰胺进 行驯化培养，20-37℃、140-210r/min条件下培养7-10天，转接数次，得驯化菌液；
步骤三、分离单菌落：稀释驯化菌液，接种至LB固体培养基平板，于20-37℃恒温 倒置培养3-5天，获得降解菌的单菌落；
步骤四、降解菌筛选：取降解菌的单菌落，转接入含有三聚氰胺的筛选培养基中， 20-37℃恒温倒置培养7-10天，挑选能够生长并且有明显透明圈的菌株，即得以三聚氰 胺为底物的降解菌。

3.  根据权利要求2所述的以三聚氰胺为底物的降解菌的筛选方法，其特征在 于，步骤一中，所述富集培养基包括组分及含量：


4.  根据权利要求2所述的以三聚氰胺为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于， 步骤一中，所述富集培养基中，三聚氰胺的浓度随转接次数的增加而增加。

5.  根据权利要求2所述的以三聚氰胺为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于， 步骤四中，所述筛选培养基的组分及含量包括：



6.  根据权利要求5所述的以三聚氰胺为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于， 所述筛选培养基的组分及含量为：


7.  根据权利要求2所述的以三聚氰胺为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于， 步骤四中，所述三聚氰胺的浓度为10～60mg/L。

8.  一种根据权利要求1所述的以三聚氰胺为底物的降解菌在修复三聚氰胺污染土 壤中的用途。

9.  一种根据权利要求1所述的以三聚氰胺为底物的降解菌在修复三聚氰胺污染土 壤中的使用方法，所述方法包括向三聚氰胺污染土壤中加入以三聚氰胺为底物的降解菌 的菌液、吸附有以三聚氰胺为底物的降解菌的生物炭或吸附有以三聚氰胺为底物的降解 菌的含聚乙烯醇和海藻酸钠载体。

10.  一种含有根据权利要求1所述的以三聚氰胺为底物的降解菌和生物炭的组合物 或含有以三聚氰胺为底物的降解菌、聚乙烯醇和海藻酸钠载体的组合物。

说明书一株以三聚氰胺为底物的降解菌及其筛选和应用
技术领域
本发明涉及生物降解有机污染物技术领域，具体地说是一株以三聚氰胺为底物的降解菌及其筛选和应用。
背景技术
三聚氰胺(Melamine)，又称密胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式为C3N6H6，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被广泛应用于化学工业的有机合成单体。工业中大量使用的三聚氰胺最终会引起土壤和水体环境污染，进而间接污染动植物产品。另外，已有研究报道，由于三聚氰胺含氮量高达66.67％，工业生产中产生的大量三聚氰胺废渣可制成肥料施入土壤。环境中残留的这些三聚氰胺会造成植物中三聚氰胺的累积，进而影响植物性农产品的食用安全性，因此，近年来，土壤中三聚氰胺的降解引起了国内外的广泛关注。
利用微生物来降解各类人工合成的有机污染物，使其完全降解为无机物是目前最具潜力的有效方法之一。三聚氰胺的微生物降解研究起步晚、成果少，现今国内外仅有几篇报道。因此，分离、筛选具有高效降解三聚氰胺的微生物，对净化环境、保障食品安全具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一株以三聚氰胺为底物的降解菌及其筛选和应用，具体为一株以三聚氰胺为底物的降解菌及其筛选方法、用途、使用方法及含有该菌的组合物。
本发明所涉菌株洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.9843，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种以三聚氰胺为底物的降解菌，所述降解菌为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)CGMCC No.9843。
第二方面，本发明提供一种以三聚氰胺为底物的降解菌的筛选方法，所述筛选方 法包括如下步骤：
步骤一、降解菌的富集培养：称取受三聚氰胺污染的土样于含三聚氰胺的富集培养基中，20-37℃、140-210r/min条件下培养7-10天，，转接至新鲜的含三聚氰胺的富集培养基培养，转接数次，得富集菌液；
步骤二、降解菌的驯化培养：取富集菌液，转接至基础培养基中，添加三聚氰胺进行驯化培养，20-37℃、140-210r/min条件下培养7-10天，转接数次，得驯化菌液；
步骤三、分离单菌落：稀释驯化菌液，接种至LB固体培养基平板，于20-37℃恒温倒置培养3-5天，获得降解菌的单菌落；
步骤四、降解菌筛选：取降解菌的单菌落，转接入含有三聚氰胺的筛选培养基中，20-37℃恒温倒置培养7-10天，挑选能够生长并且有明显透明圈的菌株，即得以三聚氰胺为底物的降解菌。
优选地，步骤一中，所述富集培养基包括组分及含量：

更优选地，所述富集培养基包括组分及含量：

优选地，步骤一中，所述富集培养基中，三聚氰胺的浓度随转接次数的增加而增加。
更优选地，首次用于富集培养的富集培养基中的三聚氰胺的浓度为10mg/L，在随后的转接中，每转接一次，富集培养基中的三聚氰胺浓度增加10mg/L。
优选地，步骤一中，所述转接的接种量为10wt％，转接次数为4次。
优选地，步骤二中，所述三聚氰胺浓度为40mg/L。
优选地，步骤二中，所述转接的接种量为10wt％，所述转接的次数为3次。
优选地，步骤二中，所述基础培养基的组分及含量包括：

更优选地，所述基础培养基的组分及含量包括：

优选地，步骤三中，所述稀释具体指将驯化菌液稀释100-10000倍。
优选地，步骤三中，所述接种的方式包括划线、涂布。
优选地，步骤三中，所述LB固体培养体的组分及含量包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，pH为6.0-8.0。
更优选地，所述LB固体培养基的组分及含量包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，pH为7.0。
优选地，步骤四中，所述转接包括用点涂的方式接种。
优选地，步骤四中，所述筛选培养基的组分及含量包括：


更优选地，所述筛选培养基的组分及含量包括：

pH为7.0；所述百分比为质量比。
优选地，步骤四中，所述三聚氰胺的浓度为10～60mg/L；小于10mg/L筛选效果不理想，大于60mg/L抑制细菌生长。
本发明筛选得到的降解菌株是以三聚氰胺为唯一碳源的降解菌株。
第三方面，本发明提供一种以三聚氰胺为底物的降解菌在修复三聚氰胺污染土壤中的用途。
第四方面，本发明提供一种以三聚氰胺为底物的降解菌在修复三聚氰胺污染土壤中的方法。
优选地，所述方法包括向三聚氰胺污染土壤中加入以三聚氰胺为底物的降解菌的菌液、吸附有以三聚氰胺为底物的降解菌的生物炭或吸附有以三聚氰胺为底物的降解菌的含聚乙烯醇和海藻酸钠载体。
更优选地，所述方法为向三聚氰胺污染土壤中加入吸附有降解菌的生物炭。
第五方面，本发明提供一种含有以三聚氰胺为底物的降解菌和生物炭的组合物。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所采用的筛选方法中通过设计菌株筛选的各种培养基的配方，从普通水稻田土壤中获得高效降解三聚氰胺的菌株。所筛选的菌株对三聚氰胺降解效果明显，消解率达到82％以上。所述的筛选方法简单易行、廉价经济。所得的菌株可以用来制备三聚氰胺的降解菌剂，在实践中有良好的应用潜力。
(2)本发明利用普通水稻田土壤为处理对象，所得的降解菌是田间土壤中的土著 菌，制成菌剂后在田间应用不易被排斥，效果良好。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为透射电子显微镜下菌株MB4的形态图；
图2为本发明提供的以三聚氰胺为底物的降解菌的生长曲线和对三聚氰胺的降解效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种三聚氰胺降解菌MB4，即洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepacia，(CGMCC No.9843)的筛选。
菌液的制备：称取长期受三聚氰胺污染的土样于含三聚氰胺的富集培养基中，培养条件37℃，180r/min，摇床培养7天，三聚氰胺的梯度接种量为10、20、30、40mg/L，以10mg/L的梯度递增，转接4次；
所述富集培养基的组分包括：MgSO4·7H2O(0.2g/L)，K2HPO4(0.1g/L)，(NH4)2SO4(0.1g/L)，CaSO4(0.05g/L)，FeSO4·7H2O(0.002g/L)，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH为7.0，灭菌条件：121℃湿热灭菌20min。
取上述培养的最终富集菌液，以5wt％的接种量转接到基础培养基中，添加进行驯化培养，培养条件37℃，180r/min，摇床培养7天，如此重复进行3次驯化，得到降解三聚氰胺的菌液。
所述基础培养基的组成包括：MgSO4·7H2O(0.4g/L)，K2HPO4(0.2g/L)，(NH4)2SO4(0.2g/L)，CaSO4(0.1g/L)，FeSO4·7H2O(0.002g/L)，三聚氰胺(40mg/L)，pH为7.0。
降解菌平板划线分离单菌落：取上述培养的最终驯化菌液稀释后划线涂布于LB固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养7天，获得降解菌的单菌落。
所述LB固体培养体的组成包括：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl(10g/L)，pH为7.0。
再取上述分离获得的单菌落，点涂于添加有三聚氰胺的筛选培养基中37℃恒温倒置培养7天，挑选能够生长并且有明显透明圈的菌株，作为筛选的以三聚氰胺为唯一碳源的降解菌株。
所述筛选培养基的组成包括：MgSO4·7H2O(0.1g/L)，K2HPO4(0.75g/L)，(NH4)2SO4(0.8g/L)，KH2PO40.5g/L)，NaCl(1.0g/L)，琼脂1.8-2.0％，三聚氰胺(40mg/L)，pH为7.0。
最终获得三聚氰胺降解菌MB4。
用光学和透射电子显微镜观察菌株MB4的形态，透射电子显微镜(20000×)观察显示(见图1)，菌体细胞为长杆状，无芽孢，长度3.2～5.5μm，宽度0.8～1.2μm。
实施例2
本实施例涉及筛选菌株MB4对三聚氰胺降解能力的测定。
将上述分离、纯化后菌株MB4进行活化，所述活化即把无机盐固体培养基保存的MB4菌株，转移到250mL三角瓶中，每瓶装有150mL已灭菌的LB培养基。180r/min，37℃振荡培养1d。即为MB4菌液。所述LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl(10g/L)，pH为7.0。
降解效果实验采用摇瓶液体培养法。每个处理设3个重复。将降解菌株制成A600＝1.0的菌悬液，以5％接入含有30mg/L三聚氰胺的无机盐培养基中，37℃，180r/min摇培，设置不接菌为对照，每个处理设置3个重复，间隔1天取样，连续2周，每次取样的同时测定A600值。
所取培养液用氨水甲醇溶液(5/95，v/v)洗脱，收集洗脱液N2吹干，用20％甲醇溶液定容，过0.45μm有机滤膜，用高效液相色谱检测其残留。
色谱条件：色谱柱：SPHERI-5RP-18(5μm，250mm×4.6mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈/庚烷磺酸钠和柠檬酸缓冲液(15/85，V/V)；检测波长：240nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。
根据标准曲线计算出样品中三聚氰胺的残留量，根据公式求出其降解率。三聚氰胺降解率(％)＝[1-(处理实测残留量/对照实测残留量)]×100％
经过高效液相色谱分析得出，该菌株在30mg/L的三聚氰胺液体无机盐培养基中培养10d，降解效率能达到81.67％，经过反复验证得知该菌株降解重现性良好。菌株MB4的生长和三聚氰胺降解曲线见图2。
实施例3
高效降解菌MB4通过生物炭固定化处理后对两种土壤中三聚氰胺的降解效果测定。
生物炭固定化菌株MB4小球的制作：称取1.0g生物炭，加入含有10mL菌悬液(A600＝1.0)的锥形瓶中，摇床培养8h。5000r/min离心清洗得吸附载体，加入无菌水定容至20mL备用。包埋：将聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)按10％+0.5％混合配成50mL水溶液，在水浴(90℃)中加热并连续搅拌溶解，冷却后(40℃)得混合胶体；交联：加入20mL上述吸附载体，用无菌水定容至100mL充分混匀后，用注射器将其滴入含4％CaCl2的饱和硼酸溶液中(NaOH调pH值至6.7)，在4℃下静置24h，固化成球后备用。
采用黑土和水稻土两种土壤，土壤样品经高压灭菌锅120℃灭菌20min后，准确称取500g样品，置于1000mL烧杯中。加入含三聚氰胺的20％甲醇溶液，形成50mg/kg的土壤样品。两种土壤分别设置生物炭固定化菌、菌悬液、无菌生物炭固定化小球和空白对照四个处理，每处理重复3次。处理后的土壤样品置于30℃、湿度为40％的恒温培养箱中，连续培养35d，每隔一周取样检测三聚氰胺残留量，研究生物炭固定化降解菌对土壤中三聚氰胺的降解效果。
表1为生物炭固定化降解菌对水稻土和黑土中三聚氰胺的降解作用，由表中数据可知，无论是水稻土还是黑土，在35d培养期内：
水稻土空白对照(PS-CK)、黑土空白对照(BS-CK)中，几乎无三聚氰胺降解作用发生；菌液处理的水稻土(PS-B)和黑土(BS-B)中三聚氰胺的降解率分别为14.67％和21.86％；生物炭处理后，一周内水稻土和黑土中三聚氰胺的含量分别下降了13.6％和14.4％。这主要是由生物炭对三聚氰胺的吸附作用引起的；而添加生物炭固定化降解菌后，土壤中三聚氰胺的浓度显著下降，在35天培养期间，水稻土和黑土中三聚氰胺的浓度分别降低了67.34％和70.66％。
表1

本发明筛选出的降解菌株具有明显的三聚氰胺降解效果，在使用过程中，将其与生物炭复配，则三聚氰胺的降解效果显著提高，说明在三聚氰胺污染的土壤中，生物炭及 降解菌株的使用具有明显的协同作用，这一发现对环境修复具有重要意义，所以本发明具有创造性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。