一种高山被孢霉原生质体的制备方法.pdf

本发明公开了一种高山被孢霉原生质体的制备方法。本发明的酶解液由活性酶、渗透压稳定剂和水组成，其中活性酶的混合比为：300～375U/ml的纤维素酶、15～20mg/ml的蜗牛酶和2500～5000U/ml的溶菌酶。本发明的制备方法是将活化后的高山被孢霉接种在液体培养基中，振荡培养收集菌丝体并洗涤干净；在菌丝体中加入无菌酶解液，充分酶解后去除菌丝体碎片，收集洗涤得到原生质体。本发明的酶解液，可以高效地酶解高山被孢霉菌丝体的细胞壁，制备得到高品质的高山被孢霉原生质体，原生质体产量可达5.5×107个/ml。

权利要求书
1.  一种制备高山被孢霉原生质体的酶解液，由活性酶、渗透压稳定剂和水组成，其特征在于：其活性酶的混合比为：300～375U/ml的纤维素酶、15～20mg/ml的蜗牛酶和2500～5000U/ml的溶菌酶。

2.  一种高山被孢霉原生质体的制备方法，包括如下步骤：
1）将活化后的高山被孢霉接种在液体培养基中，振荡培养收集菌丝体并洗涤干净；
2）在菌丝体中加入无菌酶解液，充分酶解后去除菌丝体碎片，收集洗涤得到原生质体；
其中，酶解液的组成如权利要求1所述。

3.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：菌株在液体培养基中振荡培养的时间为15～20h。

4.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：按1g湿菌体中加入酶液5ml的比例将菌丝体与酶解液混合，酶解液中，纤维素酶的酶活为300～375U/ml、蜗牛酶的酶活为15～20mg/ml、溶菌酶的酶活为2500～5000U/ml。

5.  根据权利要求2、3或4所述的制备方法，其特征在于：酶解液的渗透压稳定剂NaCl，其在酶解液中的浓度为0.7～0.9 mo1/L。

6.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：酶解液的渗透压稳定剂为0.8 mo1/L 的NaCl。

7.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：酶解的温度为29～35℃，酶解时间为1.5～6小时。

8.  根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：酶解的温度为30～32℃，酶解时间为2～4小时。

说明书一种高山被孢霉原生质体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种高山被孢霉原生质体的制备方法。
背景技术
    花生四烯酸（ARA）是一种人体必需的ω-6型多不饱和脂肪酸。ARA不仅作为一种重要的结构脂类（磷脂）广泛存在于哺乳动物的器官，肌肉和血液组织中，而且还是许多具有特殊活性的二十碳酸衍生物的直接前体，ARA的药学价值，营养保健功能卓越，已在医药、食品、饲料等领域得到广泛的应用。
    高山被孢霉(Mortierella alpina)是生产ARA最有潜力的菌株之一，但在研究过程中发现，油脂中ARA产量和占总脂肪酸的百分含量较低，使之成为利用微生物发酵生产ARA的技术瓶颈之一。利用传统的生物工程技术，如诱变选育以及发酵过程控制等，都无法对ARA生物合成代谢途径进行有效的调控从而突破该瓶颈难题。通过基因工程技术对高山被孢霉进行分子改造，定向选育ARA高产菌株，是提高ARA发酵生产水平和在总油脂的含量的有效途径，而构建原生质体是进行以上研究的基础和关键技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备高山被孢霉原生质体的酶解液。
本发明的另一目的在于提供一种高山被孢霉原生质体的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种制备高山被孢霉原生质体的酶解液，由活性酶、渗透压稳定剂和水组成，其特征在于：其活性酶的混合比为：300～375U/ml的纤维素酶、15～20mg/ml的蜗牛酶和2500～5000U/ml的溶菌酶。
一种高山被孢霉原生质体的制备方法，包括如下步骤：将活化后的高山被孢霉接种在液体培养基中，振荡培养收集菌丝体并洗涤干净；在菌丝体中加入无菌酶解液及渗透压稳定剂，充分酶解后去除菌丝体碎片，收集洗涤得到原生质体；其中，酶解液的组成如上所述。
进一步的，菌株在液体培养基中振荡培养的时间为15～20h。
进一步的，菌株的酶解步骤为：按1g湿菌体中加入酶液5ml的比例将菌丝体与酶解液混合；酶解液中，纤维素酶的酶活为300～375U/ml、蜗牛酶的酶活为15～20mg/ml、溶菌酶的酶活为2500～5000U/ml。
进一步的，酶解液的渗透压稳定剂为NaCl，其在酶解液中的浓度为0.7～0.9 mo1/L 。
进一步的，酶解液的渗透压稳定剂为0.8 mo1/L 的NaCl。
进一步的，酶解的温度为29～35℃，酶解时间为1.5～6小时。
进一步的，酶解的温度为30～32℃，酶解时间为2～4小时。
本发明的有益效果是：
本发明的酶解液，可以高效地酶解高山被孢霉菌丝体的细胞壁，制备得到高品质的高山被孢霉原生质体。
本发明提供了一种高山被孢霉原生质体的制备方法，通过本发明能够获得较高得率的原生质体，原生质体产量可达5.5×107个/ml，并且原生质体比较稳定。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实验所用蜗牛酶购自sigma公司。
高山被袍霉菌丝体的活化：
将高山被袍霉（本实验室保藏）接种到斜面PDA培养基上，培养一周后，用无菌水制备孢子悬液，稀释至108个孢子/ml，备用。
实施例1：
    1）孢子悬液扩大培养：上述孢子悬液1ml接入装液量为50ml/250ml的三角瓶中，28℃、150 r/min振荡培养15～16h，3000r /min离心收集菌丝，并用无菌水与渗透剂各洗涤两次，供制备原生质体用；
    2）制备酶解液：按照以下比例对三种酶液进行混合，300U/ml的纤维素酶、15mg/ml的蜗牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0.8mol/L NaCl作为渗透压稳定剂进行配置，调整pH5.8；经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
    3）原生质体制备：取5ml酶液加人1g湿菌体，摇匀，30℃下温育并轻轻振荡，酶解4小时后用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，在1500r /min离心15min，沉淀用稳定剂悬浮，洗涤两次，血球板计数。得到原生质体产量达5.5×107个/ml，并且原生质体比较稳定。
实施例2：
    1）孢子悬液扩大培养：上述孢子悬液1ml接入装液量为50ml/250ml的三角瓶中，28℃、150 r/min振荡培养15～16h，3000r /min离心收集菌丝，并用无菌水与渗透剂各洗涤两次，供制备原生质体用；
    2）制备酶解液：按照以下比例对三种酶液进行混合，300U/ml的纤维素酶、15mg/ml的蜗牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0.8mol/L NaCl作为渗透压稳定剂进行配置，调整pH5.8；经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
    3）原生质体制备：取5ml酶液加人1g湿菌体，摇匀，35℃下温育并轻轻振荡，酶解 4小时后用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，在1500r /min离心15min，沉淀用稳定剂悬浮，洗涤两次，血球板计数。得到原生质体产量达4.4×107个/ml，并且原生质体比较稳定。
实施例3：
    1）孢子悬液扩大培养：上述孢子悬液1ml接入装液量为50ml/250ml的三角瓶中，28℃、150 r/min振荡培养16h，3000r /min离心收集菌丝，并用无菌水与渗透剂各洗涤两次，供制备原生质体用；
2）制备酶解液：按照以下比例对三种酶液进行混合，375U/ml的纤维素酶、20mg/ml的蜗牛酶和5000U/ml的溶菌酶，利用0.8mol/L NaCl作为渗透压稳定剂进行配置，调整pH5.8；经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
3）原生质体制备：取5ml酶液加人1g湿菌体，摇匀，30℃下温育并轻轻振荡，酶解4小时后用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，在1500r /min离心15min，沉淀用稳定剂悬浮，洗涤两次，血球板计数。得到原生质体产量达4.6×107个/ml，并且原生质体比较稳定。
实施例4：
    1）孢子悬液扩大培养：上述孢子悬液1ml接入装液量为50ml/250ml的三角瓶中，28℃、150 r/min振荡培养20h，3000r /min离心收集菌丝，并用无菌水与渗透剂各洗涤两次，供制备原生质体用；
    2）制备酶解液：按照以下比例对三种酶液进行混合，300U/ml的纤维素酶、15mg/ml的蜗牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0.8mol/L NaCl作为渗透压稳定剂进行配置，调整pH5.8；经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
    3）原生质体制备：取5ml酶液加人1g湿菌体，摇匀，30℃下温育并轻轻振荡，酶解4小时后用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，在1500r /min离心15min，沉淀用稳定剂悬浮，洗涤两次，血球板计数。得到原生质体产量达4.6×107个/ml，并且原生质体比较稳定。
实施例5：
    1）孢子悬液扩大培养：上述孢子悬液1ml接入装液量为50ml/250ml的三角瓶中，28℃、150 r/min振荡培养16h，3000r /min离心收集菌丝，并用无菌水与渗透剂各洗涤两次，供制备原生质体用；
    2）制备酶解液：按照以下比例对三种酶液进行混合，300U/ml的纤维素酶、15mg/ml的蜗牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0.7mol/L NaCl作为渗透压稳定剂进行配置，调整pH5.8；经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
    3）原生质体制备：取5ml酶液加人1g湿菌体，摇匀，35℃下温育并轻轻振荡，酶解2小时后用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，在1500r /min离心15min，沉淀用稳定剂悬浮，洗涤两次，血球板计数。得到原生质体产量达3.47×107个/ml，并且原生质体比较稳定。
对比例1：
    1）孢子悬液扩大培养：上述孢子悬液1ml接入装液量为50ml/250ml的三角瓶中，28℃、150 r/min振荡培养16h，3000r /min离心收集菌丝，并用无菌水与渗透剂各洗涤两次，供制备原生质体用；
    2）制备酶解液：对纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶三种酶液进行另外一种比例混合，包括150U/ml的纤维素酶、10mg/ml的蜗牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0.8mol/L NaCl作为渗透压稳定剂进行配置，调整pH5.8；经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
    3）原生质体制备：取5ml酶液加人1g湿菌体，摇匀，30℃下温育并轻轻振荡，完全酶解4小时后，用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，在1500r /min离心15min，沉淀用稳定剂悬浮，洗涤两次，血球板计数，得到原生质体产量达1.4×107个/ml。
    结论：通过对比发现纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶在酶解液中的浓度比例不同，对高山被孢霉原生质体的制备有很大影响，对比实验中得到的原生质体产量就远远小于本发明最优条件下的产量。
对比例2：
    1）孢子悬液扩大培养：上述孢子悬液1ml接入装液量为50ml/250ml的三角瓶中，28℃、150 r/min振荡培养较长时间，达到20h， 3000r /min离心收集菌丝，并用无菌水与渗透剂各洗涤两次，供制备原生质体用；
    2）制备酶解液：按照以下比例对三种酶液进行混合，300U/ml的纤维素酶、15mg/ml的蜗牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0.8mol/L KCl作为渗透压稳定剂进行配置，调整pH5.8；经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
    3）原生质体制备：取5ml酶液加人1g湿菌体，摇匀，30℃下温育并轻轻振荡，完全酶解4小时后，用四层高级擦镜纸过滤除去菌丝体碎片，在1500r /min离心15min，沉淀用稳定剂悬浮，洗涤两次，血球板计数，得到原生质体产量达1.8×107个/ml。
    结论：渗透压稳定剂作为酶的溶解作用环境及原生质体的存在环境，对于原生质体的制备至关重要；稳定剂的性质和浓度是维持和控制原生质体数量的主要因素，而同时稳定剂对裂解酶的活性具有一定的促进作用；通过对比发现采用0.8mol/L KCl作为渗透压稳定剂制备得到的原生质体产量偏低。
原生质体再生实验对比：
    1）制备培养基：高渗再生培养基为加入0.8mol/L NaCl的PDA培养基；低渗再生培养基为PDA培养基；
    2）原生质体再生：选择实施例1、2、3和对比例1、2得到的原生质体进行原生质体的再生实验，将上述纯化的原生质体悬液，用0.8mol/L NaCl做不同稀释度分别接种于高渗和低渗再生培养基，并血球计数板计数做对照，28℃培养三天后菌落计数，计算再生率；
    3）再生率计算。
    原生质体再生实验的结果如表1所示：

再生率=(A-B)/C
A：高渗再生培养基上的再生菌落数；B：低渗再生培养基上的再生菌落数；C：血球计数器法测得的原生质体×稀释倍数，稀释后的原生质体浓度C=520个/ml。
    结论：实例中得到的原生质体的再生率明显高于对比例中的原生质体。本发明制备得到的高山被孢酶原生质体，相对稳定，重复实验表明原生质体的平均再生率为22%。