一种甾体皂甙元化合物的制备方法和用途 技术领域
本发明涉及两种甾体皂甙元化合物及其应用。具体而言，涉及两种甾体皂甙元的制备及其作为杀菌剂在荔枝霜疫霉菌(Peronophythoralitchii Chen)防治方面的应用。
背景技术
荔枝霜疫霉病是由低等真菌(Peronophythora litchii Chen)引起的病害，可造成荔枝嫩梢干枯、落花、落果、烂果，是严重影响荔枝产量和品质的主要病害。目前，在生产上防治荔枝霜疫霉病仍然是以化学合成药剂——雷多米尔(Ridomil)为主，药剂种类比较单一，尚未见有植物源杀菌剂应用于此病防治的报道。
发明内容
本发明的目的提供能抑制荔枝霜疫菌的植物源活性的两种甾体皂甙元化合物。
本发明另一个目的提供这种化合物的制备方法。
本发明的还有一个目的提供这种活性化合物在荔枝霜疫霉病防治中的应用。
本发明提供的两个化合物均为多羟基取代的螺甾烷型甾体衍生物。第一个化合物(简称化合物I)，其名称为1β，2β，3β，4β，5β，7α-六羟基螺甾-25(27)-烯-6-酮(1β，2β，3β，4β，5β，7α-hexahydroxyspirost--25(27)-en-6-one)，其结构如式I；第二个化合物(简称化合物II)，其名称为螺甾-25(27)-烯-1β，2β，3β，4β，5β，6β，7α-七醇(spirost-25(27)-ene-1β，2β，3β，4β，5β，6β，7α-heptol)，其结构如式II。两化合物的光谱数据见实施例六。
式I
式II
化合物I和化合物II均是以百合科植物开口箭(Tupistrachinensis Bak.)的根茎为原料，通过甲醇浸泡、有机溶剂分部、硅胶柱层析等方法分离得到的。其具体分离制备步骤为：(1)按重量体积比于开口箭粉碎物中加入3-5倍开口箭粉碎物重的甲醇或乙醇，在回流条件下提取，提取温度为60～80℃，提取时间为4～8小时。或按重量体积比于开口箭粉碎物加入3-8倍开口箭粉碎物重的甲醇或乙醇，浸提24小时以上，得甲醇或乙醇提取物；(2)甲醇或乙醇提取物，按重量体积比用5-10的氯仿和乙酸乙酯依次分部萃取3次以上，各萃取液经浓缩干燥得相应地萃取物；(3)将氯仿与乙酸乙酯萃取物合并，用硅胶(200-300目)柱层析、反相硅胶(RP-18)柱层析和凝胶(SephadexLH-20)柱层析分离得到化合物I；(4)氯仿和乙酸乙酯萃取物用硅胶(200-300目)柱层析和反相硅胶(RP-18)柱层析得到本发明的化合物II。
本发明的两个化合物具有抗荔枝霜疫霉菌的活性。用孢子萌发法对荔枝霜疫霉菌进行离体生物活性跟踪测试证明：化合物I对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的有效抑制中浓度(EC50)为100.28μg/ml，化合物II对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的有效抑制中浓度(EC50)为124.37μg/ml；用接种法对两化合物进行荔枝霜疫霉菌的活体抗菌试验证明：浓度为500μg/mL的化合物I和化合物II药液，用喷雾、浸泡或涂布的方法能防治荔枝霜疫霉病，对荔枝(品种为“淮枝”)霜疫霉病具有明显的防治效果。
本发明的两个化合物可作为有效成分单独、组合或与防治荔枝霜疫霉病的杀菌剂(如雷多米尔)复配，用于荔枝霜疫霉病的防治。使用含有本发明甾体皂甙化合物的植物提取物、分部提取物和分离部位亦可。
实施例
下面结合实例来说明本发明的实质，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：化合物的粗提取和分离
开口箭根茎干粉3kg，用95％，9L甲醇反复浸泡直至浸出液几乎无色为止，甲醇浸提液减压浓缩得棕色膏状物283g，将该浓缩物用1500mL石油醚、氯仿和乙酸乙酯依次分部萃取，减压浓缩得各分部提取物，将乙酸乙酯提取物和氯仿提取物合并15.5g，上硅胶(100-200目，300g)柱，用氯仿和甲醇混合液进行梯度梯度洗脱，氯仿和甲醇混合比，体积比为9∶1和8∶1，按400mL为一个馏分接收，并用孢子萌发法对荔枝霜疫霉菌进行离体生物活性跟踪测试，得22-26馏分1.78g和27-37馏分1.32g两活性部。
实施例二：化合物I的提取和分离
将实施例一所述的第22-26馏分，上硅胶(200-300目，60g)柱，用氯仿和甲醇进行洗脱，氯仿和甲醇体积比为8∶1.5，按50mL为一个馏分接受，并用孢子萌发法对荔枝霜疫霉菌进行离体生物活性跟踪测试，得9-12馏分0.37g活性部。将该活性部上反相硅胶(RP-18)柱，用甲醇和水混合液洗脱，甲醇和水体积比为8∶2，按10mL为一个馏分接收，并用孢子萌发法对荔枝霜疫霉菌进行离体生物活性跟踪测试，得第11-15馏分0.11g活性部。将该活性部上凝胶(Sephadex LH-20)柱，用四氢呋喃洗脱，按2mL为一个馏分接收，得第5-7馏分32mg，即为化合物I。
实施例三：化合物II的提取和分离
将实施例一所述的第27-37馏分上反相硅胶柱(RP-18)，用甲醇和水混合液洗脱，甲醇和水体积比8∶2，按10mL为一个馏分接收，并用孢子萌发法对荔枝霜疫霉菌进行离体生物活性跟踪测试，得第17-30馏分852mg活性部，即为化合物II。
实施例四：化合物I和化合物II对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发抑制作用的离体活性测定
先将化合物I和化合物，配成浓度为1000μg/mL的贮液。再取在25℃和98％RH条件下培养，菌龄为5天的荔枝霜疫霉菌菌种，用无菌水冲洗，制成不同浓度孢子囊悬浮液。用不同浓度的孢子囊悬浮液分别与化合物I和化合物II的贮液配成浓度50，100，150，200，250μg/ml的含药菌液，含药菌液的浓度为每视野下20个孢子囊，将含药菌液摇匀，置于25℃和98％RH条件下培养6小时，同时设空白对照，然后取培养后的含药菌在10×40倍显微镜下统计萌发率或抑制率。数据统计分析得：化合物I对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的有效抑制中浓度(EC50)为100.28μg/ml，化合物II对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的有效抑制中浓度(EC50)为124.37μg/ml。结果如附图1。
图1为化合物I和化合物II对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的抑制
化合物I和化合物II对荔枝霜疫霉菌的活体抑菌测定
将经挑选的荔枝(品种为淮枝)先用表面消毒剂洗果，接着用自来水冲净药液、凉干，然后用毛笔蘸取浓度为500μg/mL的化合物I和化合物II药液(配制方法同实施例四)，均匀涂布于荔枝果尖处、凉干，再用毛笔蘸取霜疫霉菌孢子囊悬浮液(2×105个/mL)，均匀涂布于施药处，单果包装并于25℃和98％RH条件下培养3天后，统计病、健果，计算感染率。试验结果如表1：
表1：化合物I和化合物II对荔枝霜疫霉菌的活体抑菌结果* 处理浓度(μg/mL)病果(个)健果(个)感病率(％) 对照 79 11 87.8a 化合物I 500 15 75 16.7b 化合物II 500 17 73 18.9b
*后随字母相同者，表示在5％水平上差异不显著(DMRT法)。
甾体皂甙的结构鉴定
化合物I：为白色粉末，分子式为C27H40O9。核磁共振氢谱(400MHz，氚代吡啶)：δ4.32(1H，br s，H-1)，4.40(1H，br s，H-2)，4.74(1H，br s，H-3)，5.81(1H，d，J＝3.2Hz，H-4)，4.54(1H，br s，H-7)，4.56(1H，m，H-16)，0.87(3H，s，H-18)，1.45(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J＝6.8Hz，H-21)，4.01(1H，d，J＝12.0Hz，H-26eq)，4.41(1H，d，J＝12.0Hz，H-26ax)，4.76(1H，br s，H-27a)，4.79(1H，brs，H-27b)：核磁共振碳谱(100MHz，氚代吡啶)：见表2。
化合物II：为白色粉末，分子式为C27H42O9。核磁共振氢谱(400MHz，氚代吡啶)：δ4.34(1H，br s，H-1)，4.31(1H，br s，H-2)，4.74(1H，d，J＝3.0Hz，H-3)，5.31(1H，d，J＝3.0Hz，H-4)，5.00(1H，d，J＝2.8Hz，H-6)，4.48(1H，br s，H-7)，2.61(1H，br t，J＝11.6Hz，H-8)，4.56(1H，dd，J＝14.4，7.6Hz，H-16)，0.93(3H，s，H-18)，1.98(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J＝6.8Hz，H-21)，3.98(1H，d，J＝12.0Hz，H-26eq)，4.40(1H，d，J＝12.0Hz，H-26ax)，4.75(1H，br s，H-27a)，4.78(1H，br s，H-27b)：核磁共振碳谱(100MHz，氚代吡啶)：见表2。
表2：化合物I和化合物II的核磁共振碳谱数据 碳 化合物I 化合物II 碳 化合物I 化合物II 1 76.5 79.7 2 67.9 67.2 3 75.5 75.6 4 71.2 69.8 5 86.3 78.2 6 211.1 73.6 7 75.2 71.8 8 40.9 34.6 9 38.0 37.6 10 50.2 40.4 11 22.0 21.4 12 39.4 39.8 13 40.7 40.4 14 49.3 50.1 15 31.5 32.0 16 81.3 81.3 17 62.9 63.1 18 16.3 16.4 19 13.0 15.6 20 42.1 42.1 21 15.0 15.0 22 109.5 109.5 23 33.2 33.2 24 29.0 29.0 25 144.4 144.5 26 65.1 65.0 27 108.8 108.7