制备生物活性产品的方法 【技术领域】
本发明涉及一种制备可以让人类和其他生物安全食用的生物活性产品的方法。尤其特别地，本发明涉及一种通过脱水来稳定天然物质，而不破坏该天然物质的功效的方法。采用高渗条件进行加工，引起微生物的质壁分离，同时保护(protesting)该物质。降低终产品中的水活度(Aw)，保证得到了一种卫生的产品。
本申请是2000年9月29日申请的专利申请60/237,005的部分续展。
背景技术
许多天然物质已经在各种领域中得到应用，这些物质需要被合适加工以作为一种商品。以往，保持一些可能有用的物质的生物活性并将其安全地提供给指定的接受者，特别在病原体安全以及对有害的酶活的控制方面，是十分昂贵的，而且生物活性物质的变性往往导致其功效降低。一些商业领域销售基于天然生物活性产品的商品，如药物和食物添加剂领域、食品领域、药品领域、非处方药领域以及化妆品领域。本发明的方法适合于在所有这些领域中应用。
应用本发明的方法的一个实施例是制备用于关节炎患者的II型胶原蛋白。据报道，这种化合物对关节炎患者的免疫系统起增强作用。如Eugene Moore博士地专利申请(美国专利号5,570,144、5,529,786、5,637,321和5,645,851)所描述，为了确保有效，显然必须通过最接近其天然状态的方式来制备II型胶原蛋白。但是，Moore所建议传送这种物质给消费的方法中包括保留大量水分，这使得该产品容易受到病原体的交叉污染。
在非处方药领域，早在公元前400年最先通过咀嚼柳树皮来降低发烧和减轻疼痛，这是由希波克拉底建议的。由于在制备来源广泛的产品中存在许多问题，包括产品的储存、处理和配制，德国化学家FelixHoffman于1898年合成并稳定了柳树皮中的活性成分乙酰水杨酸，即现在众所周知的阿司匹林。当本法明用于柳树皮脱水时，能够制备一种比合成的阿司匹林更有效的稳定物质。
在食品领域，人造黄油样涂层是现在可以购买到的含有植物stanol酯的超市奶制品。这些酯来源于含油种子的加工生产，已经被证明能够降低胆固醇。本发明的方法用于稳定含油种子，可以使其安全、有效和更容易吸收。用现有方法处理含油种子来减少酶的分解，会导致功效降低。
在制药领域，洋地黄是一种用于产生更有效心跳的药品，它是一种得自紫花洋地黄属的普通毛地黄叶子的糖苷。这种方法可以用于稳定毛地黄叶子，使洋地黄对消费者来说是更安全、更有效和更容易获得的。
在医药领域，已知1型、3型和5型胶原蛋白有益于皮肤健康，用于促进伤口愈合。本发明的方法可被用于稳定这些胶原蛋白，使其用于伤口愈合是具有生物活性和安全的，而且使该产品对于消费者来说更容易获得。
在化妆品领域，许多面霜中含有胶原蛋白。这种方法可以用于稳定这些胶原蛋白，使其生物活性更高和更安全。
因此，照射、热处理、使用防腐剂、冷冻干燥以及其他已知杀菌方法都或者是低效率的，或者是难以用于稳定适于人类食用并且保留天然物质的原始生物结构的产品。因此，急需一种用于使天然物质中的生物活性成分保持其原始形式的新方法，该活性成分可以以一种安全和经济的方式被递送给人类食用和其他生物利用。
【发明内容】
本发明的方法涉及提高具有已知有益效果的天然物质的利用度，这些物质保留其原始的天然结构，同时消除影响其质量和功效的微生物。这种处理包括在用于减少病原体输入的抗微生物成分存在下和低于常规加工温度下，脱水并稳定天然物质。优选的是还存在可电离的盐时进行脱水，在所用浓度下，该盐对消费者是无害的。在一些应用中也可以只使用其它高渗试剂，如糖和乙醇，或者与盐结合使用。盐在加工过程中或者之后作为一种进一步抗微生物的稳定剂，抑制加工过程中的病原体和腐败菌的生长以及可能的交叉感染，这些盐时常地在所关注的有机体的培养温度下加入。
本发明的主要特征之一，提供一种允许使用显著低于热处理时的加热的温度的方法，消除有害的微生物介质特别是病原体，从而保留原始产品的生物状态。
本发明的另一个主要特征，得到的产品在室温存储条件下超过3年后仍保留其生物安全性。此外，由于酶活性会导致不良的感官特性，例如难闻的气味，控制任何有害酶活会获得更加期望的具有商业吸引力的产品。此外，酶活性会降低天然产品的功效。
本发明提供一种更经济地将天然物质转化为稳定的、可食用的产品的方法，该方法也可以应用于迄今已经采用如化学防腐剂等物质和热处理、照射、惰性气氛、冷冻干燥以及其他抗微生物稳定的方法处理的其它产品。
以往，由于得到的产品在感官上不可接受，在本发明所用的温度下不能制备可食用的产品。对食物添加剂行业的最新介绍，允许少量添加剂用于食用，使本发明变得有意义。不仅在于本发明的方法生产的产品长期稳定和可食用，而且天然物质保留了天然原始结构便具有了完整的功效。结果，获得的改进产品可以用作食物添加剂、药物、非处方药、乳液或医学设备中的洗剂(例如作为生物活性乳液)的局部产品，例如生物活性绷带，以及功能食品中的特定成分。
本发明的方法优选应用于作为可能和有用的食品添加剂或者药物的蛋白质，不会使该蛋白质的原始结构发生改变，并且保护期望的天然蛋白质中存在的各种蛋白质相互作用所产生的协同作用。
【具体实施方式】
本发明的方法包括在保留有机物质的完整性和结构的条件下，对有机物质进行脱水，该方法还消除大部分存在的病原体，以及如果需要，消除引起腐败的其他细菌，而不会对该物质的原始结构产生实质性影响。更特别地，本发明的方法包括存在可以是可电离的盐的抗微生物介质时，优选是更有效的抗微生物介质和可电离、可食用的盐结合时，在低于发生变性的温度下，和如果需要，在低压条件下，加热天然有机物质。这种盐用于保护该物质(高渗条件)，避免病原体和腐败有机物在处理温度下生长，而且该盐作为稳定剂，防止干燥产品在加工过程中或者之后变质。
本方法中所用的物质可以是任何含有大量水分的有机物，在光照、酶、病原体和腐败有机体的作用下，这些水分会引起有机物变质。本方法中所用物质在加工、保存、处理和配制和食用和/或使用时应当稳定，才不会发生有害作用。这些物质通常在室温下保存，也可以被冷藏和/或冷冻，虽然说这一般是没必要的。
通过本发明的方法脱水的天然物质可以是任何含有大量水分或者具有适合病原体或者其他微生物存在和生长适宜条件的有机物，以及会遭受有害酶攻击的物质。因此，包括蛋白质、脂质如脂肪和碳水化合物，以及任何其他含水的生物活性物质。由于该方法适用于有机物的混合物，因此不需要纯化所用有机物。添加其他天然或者合成的添加剂，例如着色剂、滑润剂和抗氧化剂的产品也包括在本发明保护范围内。
然而，本发明的方法在期望保持蛋白质原始未变性结构的蛋白质脱水和食品物质脱水方面具有特定用途，其中食品物质含有在食用时会产生协同作用的蛋白质的组合。例如，鸡软骨中不仅含有II型胶原蛋白，还含有葡萄糖胺和软骨素等蛋白质。如Eugene Moore的专利US5,645,581、5,637,321、5,529,786和5,750,144所描述，II型胶原蛋白用于减缓风湿性关节炎的症状，这可能部分由于未变性的II型胶原蛋白的性质或者II型胶原蛋白与鸡软骨中存在的其他蛋白质的组合在起作用。相反，纯化的II型胶原蛋白不能产生与未变性的II型胶原蛋白相同的减轻和有益的作用。
具有稳定作用的盐是食用安全、可电离的盐，特别是氯化钠或者氯化钾。盐浓度根据所涉及的食品物质的性质和期望稳定的程度而广泛地变化。因此，如果旨在消除除了引起腐败的微生物之外的病原体，通常尽可能使用较低浓度的盐。可以通过陈化食品物质并且观测是否出现不希望有的病原体的输入，由实验确定最佳或者期望的盐浓度。过量的盐不会妨碍脱水，但是可能会影响脱水物质的利用度。就蛋白质脱水来说，通常期望采用相对于起始原料的重量的约15％的盐浓度，在脱水产品中产生约45％的浓度。
可以通过添加如盐酸或者醋酸等酸提高盐的作用。
一般而言，实施该方法直到起始原料中的水含量降低到重量的15％以下，优选在1-8％范围内。进一步降低水的含量不会产生额外的有益效果。当水的含量超过15％时，稳定和消除病原体及其它微生物只是部分进行，没有充分地稳定该物质。
抗微生物的含氯介质，如次氯酸钠，单独或者与一种适宜的酸如盐酸组合以溶液形式加入到起始原料中，进一步有助于减少初期微生物的输入。特别是在稳定该物质是为了抵抗如能引起腐败的微生物的情形。有益的氯化物浓度范围是1ppm-10,000ppm。所用酸的pH范围从pH1到pH10。当使用一种氯化物介质时，期望在进行干燥处理之前，先将原料浸泡在氯化物介质中。
通常粉碎将要脱水的物质，目的在于除去水分和防止颗粒内部的湿点。颗粒尺寸降低，脱水能力相应地升高。但是，颗粒的尺寸不能被减小到影响所脱水的物质的结构，或者引起大量凝结。颗粒优选为在1-1000目尺寸的范围内。
在本发明的方法中可以使用各种各样商业上可以购买得到的干燥设备。优选的是那些不需要机械地研磨颗粒就能够均衡地干燥该物质的设备。特别优选的是能持续监控温度和湿度的流化床或者转鼓式干燥器。脱模剂等物质在天然物质的干燥中起辅助作用，可以加入到干燥步骤中。那些有助于减少凝结和干燥机内壁上的覆盖层的助剂，如卵磷脂和甲基纤维素羟丙酯，在本发明的方法中是有用的。
本发明特别适用于制备稳定形式的蛋白质物质，保留其原始结构以及原始的药用价值。当通过适当方式制备时，来源于鸡软骨的II型胶原蛋白是一种生物活性蛋白分子。当进行稳定和安全化的加工时，采用许多常规的稳定技术，如常用的热处理，容易引起该成分功能的丧失，因而保留该功能是重要的。众所周知，当加热处理时，该成分失活。如照射和冷冻干燥等技术加工最初可能保留了该成分的活性，但是从加工后保持生物稳定性和安全性方面看，现有技术远远不如这种新方法，这种新方法是显著和经济的优选。一个重要问题是由处理或者食用该产品的个体行为造成加工后的交叉污染。这种新方法确保适度的不当行为，从这点上看，不会产生一种不安全的产品。而且在与期望的物质在自然环境中起作用时相同的温度下进行加工，确保该物质保留了天然功能状态。由于这种温度是病原体的培养温度，会导致这些病原体指数性生长，从而得到不卫生的产品，因此，不可能采用常规的加工方法。
许多救生药品中的生物活性成分最初是通过化学方法从植物分离得到，但是这些方法的处理经过大量调节过程，是缓慢和昂贵的。这种新方法以显著低的加工费用用于保持这些植物化学成分的生物活性。由于所需调节较少，这些天然产品可以在较短时间内和以较低价格销售。本发明的方法制备的产品保留了原始天然状态，在较低浓度下和在长期保存之后都具有显著的功效。
天然生物活性成分包括软骨素和葡萄糖胺，它们是如鸡软骨等物质的成分，用本发明的方法加工后仍具有生物活性。用这种方法脱水的落基山刺柏的浆果具有生物活性。含有天然洋地黄的毛地黄用这种方法加工后具有生物活性。用这种方法加工的西特喀山灰分具有类似的生物活性。
通过下面的实施例进一步说明本发明。
实施例1
本实施例表明在无菌实验室环境下，鸡胸软骨、去骨鸡胸脯和机械分割鸡的微生物状态和水活度。
鸡胸软骨来自健康年轻(小于60日龄)的鸡，取自鸡处理机。对该原料的分析得到82.0％水分、0.2％脂肪、12.7％蛋白质、2.2％灰分和2.9％碳水化合物。去骨鸡胸脯和机械分割鸡(MSC)也取自相同的鸡处理机，但是没有进行近似分析。
对这三种物质进行抗微生物活性和抗微生物介质(次氯酸钠)作用的测试。这些产品经过系列3步(首先在加入氯化物之前、其次在加入氯化物之后和最后在约100°F无菌干燥之后)，测定每一步的微生物分布型，并且在干燥后测定水活度指数。将物质粉碎成约1/16″-1/8″块(步骤1)。将得到的颗粒浸泡在200ppm次氯酸钠溶液中(步骤2)。用常规的食物干燥机干燥约3天，间断的内部加热和使用外部热源来控制温度。得到如下结果：胸骨需氧平板计数(APC)大肠菌大肠杆菌水活度(Aw)步骤1134菌落形成单位(CFU)/克(g)1CFU/g ND未得到(NA)步骤2未检测到(ND)ND NDNA步骤3未检测到ND ND0.243胸脯 需氧平板计数 (APC) 大肠菌大肠杆菌水活度(Aw)步骤1 5300CFU/g 3CFU/g ND未得到(NA)步骤2 ND ND NDNA步骤3 ND ND ND0.458MSC 需氧平板计数 (APC) 大肠菌 大肠杆菌水活度(Aw)步骤1 354,000CFU/g 3500 CFU/g 700CFU/g未得到(NA)步骤2 ND ND NDNA步骤3 ND ND ND0.227
注释：在所有实施例中的全部微生物检测都采用公认的AOAC方法进行。可得到的水活度(Aw)指数是对物质中水含量的测定，表示一种微生物如沙门氏菌病原体，或者一种酶生长所需的水的浓度。
本实施例表明，即使采用低温干燥来保护蛋白质的原始结构，在无菌条件下能够制备一种对人类食用来说是安全的产品，而不需要考虑在生产条件下存在的交叉污染的可能性，也不需要考虑在加工后由处理者或者食用者造成的交叉感染的可能性。
实施例2
获得另一批新鲜胸骨并进行微生物状态的测定。结果表明APC(s)为78,000CFU/g和57,500CFU/g，大肠菌(s)为17CFU/g和5CFU/g，大肠杆菌(s)为3CFU/g和35CFU/g，以及沙门氏菌(s)对这种病原体均为阳性。在给定的这些条件下，单独使用抗微生物介质不足以保护蛋白质在加工后以及食用前的储存阶段免受病原体和酶的攻击。因此，加入抗微生物的步骤，将一种离子盐混入粉碎的胸骨中，浓度为约76％鸡胸骨对24％氯化钾(KCl)，采用与实施例1类似方式进行加工。检测生产的产品的APC、大肠菌、大肠杆菌、沙门氏菌和酵母/菌落。所有测试均为阴性。
这种盐的使用不会对最终产品的感官特性产生负面影响，而且最终产品的微生物分布型是卫生的。制备的产品含有少于10％的水分，Aw小于0.5。就生产、加工、保存、配制过程和最终用户的行为产生的潜在交叉污染方面而言，提供了一种稳定产品。与不存在这些盐时干燥那些物质料相比，这些盐的存在还提高水的去除速率。
实施例3
通过将KCl的含量提高到一定量来扩展实施例2，这使之成为适合于作为一种食物添加剂(符合FDA日值)的II型胶原蛋白生物活性物质。试验采用约56％鸡胸软骨与44％KCl的混合物。使用自动控温的转鼓式干燥机。在加工前使用前面描述的抗微生物介质，按前述方法粉碎该物质。加工过程中的温度不超过110°F。制备20个以上批量。水分含量从最高的3.9％到最低的0.9％，Aw为最高的0.437到最低的0.158。所有批量进行微生物测定，APC(s)的范围为最高的270CFU/g到未检测到。未检测到大肠菌。未检测到大肠杆菌。所有沙门氏菌检测都为阴性。这些结果表明本法明制备了一种卫生的、消费者喜欢的安全产品。
实施例4
确定原料干燥过程中的微生物分布型。除了用85/15的胸骨对KCl的混合物替代单独的胸骨之外，按实施例1的描述制备产品。得到如下结果：
过程(小时) APC*大肠菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 酵母/ 菌落 水分0 43,000 ND** ND ND NEG*** 60 NA****3 34,000 ND ND ND NEG 20 68.9％6 11,200 ND ND ND NEG 80 46.7％10 5,300 ND ND ND NEG ND 33.5％24 1,080 ND ND ND NEG ND 24.3％28 820 ND ND ND NEG ND 13.4％34 320 ND ND ND NEG ND 4.8％48 120 ND ND ND NEG ND 4.3％
*总数CFU/g，**ND未未检测到(＜10CFU/g)，***NEG为阴性，****NA是未得到
结果表明，在特定条件下实施本发明时，产生特定的产品制备过程中的微生物分布型。众所周知，鸡肉和许多其他生物物质含有影响公众健康的病原体。本发明还解决对交叉污染的关注，制备具有期望生物活性并且适合于消费者安全使用的产品。尽管众所周知110°F的温度适合大量微生物生长，而采用本发明的方法可以阻止发生。
实施例5
众所周知，当含有II型胶原蛋白的鸡软骨经过例如用于稳定目的的高温等条件，II型胶原蛋白分子变性并导致用于特定目的的生物活性失去。
本实施例证明本发明能够持续保持鸡胸软骨中含有的未变性的天然的和生物活性的II型胶原蛋白，以及产品的微生物安全和感官特性。采用60％鸡胸软骨和40％KCl的混合物，按照实施例4制备产品。得到的产品用4种方法进行研究：(1)电子显微镜(EM)检测，(2)进行数量和质量的酶联免疫分析(ELISA)，(3)连续溶解/沉淀胶原酶特异性酶分析(S/PCSE)和，(4)近似分析。
电子显微镜检测表明本发明的方法制备的产品保持天然鸡胸软骨中的II型胶原蛋白纤维的完整的、天然的、未变性的形态。ELISA测试确认和证实本发明的方法制备的产品能够保持用于特定用途的生物活性的II型胶原蛋白并且可以用于量化。S/PCSE测试进一步确认和证实本发明的方法的产物能够保持用于特定用途的生物活性的II型胶原蛋白并且可以作为量化使用。与已报道的文献资料相比，对本发明制备的产品的近似分析证实了所有测试具有预期的蛋白质比例。
本发明制备的产品在零时进行测定，并且与在室温下保存一年以上的产品进行比较。试验表明产品的稳定性超过一年。时间近似分析-蛋白质*S/PCSEELISAEM零时12.4％11.7％NA检测＞1年11.5％10.4％12.3％NA
注释：NA-未得到
为了比较，新鲜的鸡胸软骨经过热处理，该热处理可能保持产品在加工过程中的安全性(由于潜在交叉污染，不能保持加工后的安全性)。经过S/PCSE分析证明，虽然新鲜的鸡胸骨具有大约8％非稳定形式的活性II型胶原蛋白，但是在250°F下处理1小时后，S/PCSE的结果表明即便有II型胶原蛋白，也只留下不到1％(几乎不可检测)。
下列数据表示本发明制备的产品的微生物稳定性：时间APC*大肠菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌酵母/菌落零时ND ND ND ND ND ND＞1年ND ND ND ND ND ND
ND是未检测到
从感官上看，储存第一天的产品为淡褐色、淡淡的鸡肉芳香、没有臭味。在储存超过一年后，仍具有相同状态。
由此得出，本发明以特定方式加工制备了一种微生物安全的产品，本发明保持了所要的II型胶原蛋白的生物活性形式。
实施例6
按照实施例5的操作，采用85份软骨、15份KCl和5份1M盐酸，以及不同的干燥时间来制备产品。
过程(小时) APC*大肠菌大肠杆菌沙门氏菌0 80 ND** ND NEG***11 ND ND ND NEG48 70 ND ND NEG50 20 ND ND NEG
*总数CFU/g，**ND为未检测到(＜10CFU/g)，***NEG为阴性，
本实施例说明酸的使用增强了对微生物的控制，允许采用较短的干燥时间。
实施例7
向按照实施例1描述制备的粉碎的鸡软骨和15％KCl的混合物中加入5份甲基纤维素羟丙酯作为干燥剂，以及2份卵磷脂作为流化剂。与不含有这些添加剂的混合物相比，在转鼓式干燥机中干燥时，该混合物在较短时间内能更加均匀地干燥，而且不会粘到转鼓上。
实施例8
将实施例2中的粉碎鸡软骨和KCl的混合物分散在水中，然后渗透到棉织物上。接着得到的湿织物按照实施例1的描述进行干燥，直到水的含量低于10％。该棉织物用作绷带来促进伤口愈合。
实施例9
将粉碎的凤梨与15％KCl混合，按照实施例2的方法干燥，直到水的含量低于10％。得到的干燥的凤梨不含有病原体并且稳定地抵抗酶的降解。
实施例10
按照实施例2的操作粉碎和脱水柳树皮。得到的产品保留天然乙酰水杨酸的活性，其与柳树皮中含有的其他有益成分组合，是一种可以得到的非处方药。
实施例11
将毛地黄叶子粉碎后，加入抗微生物介质和15％的KCl，然后在100°F温度下脱水，直到水分含量低于约7％。得到产品用作可获得的药物洋地黄。
实施例12
将油菜种子粉碎后，按照实施例2的操作脱水，至水的含量低于10％。终产品作为一种添加剂加入食品来控制胆固醇。
实施例13
将芦荟的叶子粉碎，与抗微生物介质和20％KCl混合，然后采用实施例2的方法干燥。得到的产品可以内服来提高免疫抵抗力，或者局部应用来促进伤口愈合。
实施例14
从猪骨头上分离软骨，粉碎，然后按照实施例2的操作脱水。得到的产品含有原始状态的胶原蛋白1、3和5，可用于局部应用。
实施例15
将85份含有高比例II型胶原蛋白的鸡胸骨与15份氯化钾混合。100份这种混合物在300份40°F的含有200ppm氯化物的溶液中浸泡2小时。重复这种浸泡步骤两次总共至少6个小时，再将水滤除。
然后将含II型胶原蛋白的混合物重复地通过研磨机，直到颗粒的尺寸降低到大约1/16″。得到的微粒与另外的15份氯化钾混合，再研磨。然后将混合物加入到转鼓式干燥机中，在104°F下加热，直到水的含量降低到大约5％。进一步研磨得到的被稳定的物质，直到筛孔尺寸为70-100，得到含有大约38％蛋白质和60％氯化钾的自由流动的微粒。
从上面的描述可以看出，多种含有生物活性成分的有机物质可以被脱水，而不破坏这些成分的原始结构，从而保持了活性成分的功效。前述的实施例不应解释成对本发明保护范围的限制。本发明发现了含有仍保留了原始天然状态的生物活性成分的产品在药物和医学领域、食物添加剂、非处方的草药、化妆品工业和常规食品方面的用途。