一种解淀粉芽孢杆菌及其应用.pdf

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2015075。所述解淀粉芽孢杆菌能显著抑制羽衣草单囊壳菌、葡萄孢菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌等病原菌的生长繁殖，有效防治草莓白粉病、黄瓜灰霉病等植物病害，效果显著。本发明所述解淀粉芽孢杆菌可单独作为生防菌剂应用于植物病害的预防和治疗，也可以与其他具有抑菌作用的芽孢杆菌、霉菌等组合成复合微生物制剂，对白粉病、灰霉病、褐斑病、果腐病等植物病害的防治效率达到85%-90%，应用前景广阔。

权利要求书
1.  一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌的保藏号为CCTCCNO：M2015075。

2.  一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。

3.  如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和黑曲霉中的任意一种或两种或多种的组合。

4.  如权利要求2或3所述的微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂中权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的活菌量至少为107 CFU/ml。

5.  权利要求2或3所述的微生物制剂在植物病害防治中的应用。

6.  如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为白粉病、灰霉病、枯萎病、褐斑病和果腐病中的任意一种。

说明书一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用。
背景技术
随着植物种类的不断增多，植物栽培方式的不断多样化，植物病害日趋严重，而传统的化学防治方法存在着许多弊端，比如：化学农药的大量使用引起了严重的环境污染，农产品的农药残留也越来越严重，病菌抗药性产生速度也越来越快等一系列对人们生活有害的影响。在当今倡导低碳经济、环保节约型社会中，寻求既能保护人类生活，又可增产的新技术十分适应当今社会的发展。
生物防治方法是利用生物多样性达到有害生物的可持续控制和无公害治理，符合当今社会的发展和要求，有着广阔的应用前景。其中，微生物防治主要是利用有益的微生物，通过生物间的竞争作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及诱导抗性等，来抑制某些病原物的存活和活动，即利用生态系统中各种生物之间相互依存、相互制约的生态学现象和某些生物学特性，以一种或一类生物或其产物抑制另一种或另一类生物。简言之，以菌治虫，以菌治病，其优越性在于资源丰富，选择性强、无残留、无污染、成本、低、兼防兼治增产增收，保持生态平衡，起到长效的作用。所以开发微生物农药有广阔的应用前景。(张丽，张书娥；2010年)
目前研究发现，可用于生物防治的微生物主要包括真菌、细菌、放线菌和酵母菌等微生物种群。但是，生防微生物对农药的反应敏感，种类比较单一，抗菌谱较窄，且在植株上定殖较难，生防效果不稳定，都限制了其在植物领域的广泛应用。因此，进一步开发广谱抗菌、生防效果稳定的微生物资源迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用。所述解淀粉芽孢杆菌筛选自草莓根际土壤，对羽衣草单囊壳菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、葡萄孢菌等病原菌均有很强的抑制能力，可有效防治白粉病、枯萎病、褐斑病、果腐病、灰霉病等常见植物病害，效果显著。
本发明一方面提供了一种解淀粉芽孢杆菌VLD-3(Bacillus amyloliquefaciens VLD-3)，已于2015年1月30日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2015075。
本发明另一方面提供了一种微生物制剂，包含上述解淀粉芽孢杆菌VLD-3。
所述微生物制剂还包含枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和黑曲霉中的任意一种或两种或多种的组合。
所述微生物制剂中解淀粉芽孢杆菌VLD-3的活菌量至少为107CFU/ml。
本发明还提供了上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。
所述植物病害包括白粉病、灰霉病、枯萎病、褐斑病和果腐病中的任意一种。
有益效果
本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌VLD-3能显著抑制羽衣草单囊壳菌、葡萄孢菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌等病原菌的生长繁殖。所述菌株能有效预防草莓白粉病的发生，实验组草莓的病情指数远远低于对照组，且当解淀粉芽孢杆菌VLD-3菌液稀释至700倍时，实验组草莓的病情指数仍低于8％，防治效率高达91.8％；此外，所述菌株对白粉病疫情较重的草莓和灰霉病疫情较重的黄瓜均有显著的治疗效果，50倍稀释后的解淀粉芽孢杆菌VLD-3菌液可使草莓的白粉病病情指数降低至14.2％，黄瓜的灰霉病病情指数降低至13.2％，而对照组的病情指数已普遍高于96％，取得了意料不到的技术效果。本发明所述解淀粉芽孢杆菌VLD-3可单独作为生防菌剂应用于植物病害的预防和治疗，也可以与其他具有抑菌作用的芽孢杆菌、霉菌等组合成复合菌剂，对植物白粉病、灰霉病、褐斑病、果腐病等植物病害的防治效率达到85％-90％，应用前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。
实施例1菌株的分离筛选与鉴定
1.芽孢杆菌初筛
采集青岛市崂山区北宅种植基地的草莓植株根际土壤10g，放入盛有40ml灭菌水的三角烧瓶中；震荡混匀后，将上清液转移至新的灭菌试管；将试管经80℃水浴20min处理，杀死非孢营养型细胞；将上述溶液稀释20倍后，吸取100μl涂布于营养肉汤培养基上，37℃培养12h。将形态相异的菌落经平板划线纯化出单菌落后，移入营养肉汤斜面，37℃培养12h，4℃冰箱保存备用。
采用上述筛选分离方法，共获得23株芽孢杆菌。
2.抑菌实验
(1)芽孢杆菌菌液制备：
将分离得到的23株芽孢杆菌分别接种于营养肉汤培养基中，37℃，200rpm培养12h；(2)病原菌制备：
将尖孢镰刀菌或立枯丝核菌(由青岛农业大学赠送)的菌块(Φ7mm)接于PDA固体培养基中央，30℃培养7d；
(3)平板拮抗法初筛：
在PDA固体培养基的中央接种尖孢镰刀菌或立枯丝核菌菌块(Φ7mm)；然后，在距培养皿中央25mm的对称两侧点接上述筛选到的芽孢杆菌菌液，每株芽孢杆菌设3个平行。将接种上病原菌和芽孢杆菌的平板放入30℃培养箱，72h后观察发现，共有8株芽孢杆菌的周围形成明显的抑菌带，分别将其命名为VLD-1，VLD-2，VLD-3，……，VLD-8。
(4)打孔扩散法复筛：
将灭菌后的PDA培养基温度保持在55℃，然后用无菌水轻轻冲洗病原菌(尖孢镰刀菌或立枯丝核菌)斜面获得病原菌孢子悬液，并取适量加入PDA培养基中，混匀后倒平板。待凝固后，即制得病原菌含量约为107cfu/ml的PDA固体培养基。用牛津杯在距培养皿中央25mm的对称两侧各打一个孔(Φ7mm)，并加入150μl待测芽孢杆菌(VLD-1，VLD-2，VLD-3，……，VLD-8)的菌液于孔内，每株芽孢杆菌设3个平行。将平板放入30℃培养箱，72h后测量抑菌圈的直径。结果显示，加入芽孢杆菌VLD-3菌液的平板的抑菌圈直径最大，从而可以说明，本发明筛选到的8株芽孢杆菌中VLD-3的抑菌效果最强。
3.菌株鉴定
将芽孢杆菌VLD-3进行分子生物学鉴定，测得其16s rRNA序列，并通过NCBI BLAST比对，最终确认该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，将其命名为解淀粉芽孢杆菌VLD-3(Bacillus amyloliquefaciens VLD-3)，并于2015年1月30日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015075。.
实施例2解淀粉芽孢杆菌VLD-3抑菌实验
将羽衣草单囊壳菌、葡萄孢菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌4种病原菌菌块(Φ10mm)分别置于PDA固体培养平皿(Φ90mm)的中央；用直径为60mm的无菌空白平皿(Φ60mm)的边缘蘸取活菌浓度为109cfu/ml的解淀粉芽孢杆菌VLD-3菌液后，在上述PDA固体培养平皿中的病原菌块周围进行环形接种。空白对照组则是用无菌水进行环形接种。将接种后的PDA固体培养平皿置于30℃培养箱中，分别在培养66h、90h、120h和190h时，测量病原菌块的直径，利用以下公式计算抑菌率，具体结果见表1。
抑菌率(％)＝(1-(处理组病原菌斑直径/对照组病原菌斑直径))×100
表1 解淀粉芽孢杆菌VLD-3对病原菌的抑菌效果

从表1的实验结果可以看出，本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌VLD-3能显著抑制羽衣草单囊壳菌、葡萄孢菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的繁殖，且在培养120h时抑菌率基本达到峰值，抑菌率普遍高于55％，效果显著。
实施例3解淀粉芽孢杆菌VLD-3对草莓白粉病的预防效果
1、菌液制备
将解淀粉芽孢杆菌VLD-3接种于液体营养肉汤培养基，37℃，200rpm培养12h，得到活菌含量为108-109cfu/ml的菌液。
2、实验地点：青岛市城阳上马种植基地的草莓大棚；
3、使用方法
1)实验组：三个处理组，每个处理组10垄草莓，共1800棵，每个处理组之间设立保护行；
在草莓开花初期，将解淀粉芽孢杆菌VLD-3菌液加水稀释300、500、700倍后，分别均匀喷洒在草莓叶片反正面及茎上；每次喷洒间隔7天，连用3次；最后一次喷洒完菌液10天后，检查草莓白粉病的发病情况。
2)对照组：使用不含菌的营养肉汤培养基，其它操作与实验组均相同。
4、结果分析
病害分级标准：0级无病斑；1级：病斑面积占叶面积的1/4以下；2级：病斑面积占叶面积的1/4-2/4；3级：病斑面积占叶面积的2/4-3/4；4级：病斑面积占叶面积的3/4以上。
病情指数＝[∑(病级值×该级发病叶数)/(调查总叶数×最高病级值)]×100％
防治效率的计算公式＝[1-(处理的病情指数/对照的病情指数)]×100％。
以SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果如表2所示：
表2 解淀粉芽孢杆菌VLD-3对草莓白粉病的预防效果


从表2的数据可以看出，本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌VLD-3能有效抑制病原菌(主要是羽衣草单囊壳菌)的生长繁殖，预防草莓白粉病的发生，实验组草莓的病情指数远远低于对照组，且当解淀粉芽孢杆菌VLD-3菌液稀释至700倍时，实验组草莓的病情指数仍低于8％，防治效率高达91.8％，取得了意料不到的预防效果。
实施例4解淀粉芽孢杆菌VLD-3对草莓白粉病的治疗效果
1、菌液制备
将解淀粉芽孢杆菌VLD-3接种于液体营养肉汤培养基，37℃，200rpm培养12h，得到活菌含量为108-109cfu/ml的菌液。
2、实验地点：青岛市即墨石门镇种植基地的草莓大棚；
3、使用方法
1)实验组：三个处理组，每个处理组10垄草莓，共1800棵，每个处理组之间设立保护行；
在草莓白粉病疫情较重时(每株病叶率达50％以上)，将解淀粉芽孢杆菌VLD-3加水稀释50、100、200倍后，分别均匀喷洒在草莓叶片反正面及茎上，每垄喷洒量为1L；每次喷洒间隔5天，连用5次；最后一次喷洒完菌液7天后，检查草莓白粉病的治疗情况。
2)对照组：使用不含菌的营养肉汤培养基，其他操作与实验组均相同。
按照实施例3所述结果分析方法，以SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果如表3所示：
表3 解淀粉芽孢杆菌VLD-3对草莓白粉病的治疗效果

从表3的数据可以看出，本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌VLD-3能有效杀灭病原菌(主要是羽衣草单囊壳菌)，对白粉病疫情较重的草莓有显著的治疗效果，50倍稀释后的解淀粉芽孢杆菌VLD-3菌液可使草莓的白粉病病情指数降低至15％以下，而对照组的病情指数已高达96.6％，取得了意料不到的技术效果。
实施例5解淀粉芽孢杆菌VLD-3对的黄瓜灰霉病的治疗效果
1、菌液制备
将解淀粉芽孢杆菌VLD-3接种于液体营养肉汤培养基，37℃，200rpm培养12h，得到活菌含量为108-109cfu/ml的菌液。
2、实验地点：烟台市海阳蔬菜种植基地的黄瓜大棚；
3、使用方法
1)实验组：三个处理组，每个处理组10垄草莓，共360棵，每个处理组之间设立保护行；
在黄瓜灰霉病疫情较重时(每株病叶率达50％以上)，将解淀粉芽孢杆菌VLD-3加水稀释50、100、200倍后，分别均匀喷洒在黄瓜叶片反正面及瓜茎上，每垄喷洒量为2L；每次喷洒间隔5天，连用5次；最后一次喷洒完菌液6天后，检查草莓白粉病的治疗情况。
2)对照组：使用不含菌的营养肉汤培养基，其他操作与实验组均相同。
按照实施例3所述结果分析方法，以SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果如表4所示：
表4 解淀粉芽孢杆菌VLD-3对黄瓜灰霉病的治疗效果

从表4的数据可以看出，本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌VLD-3能有效杀灭病原菌(主要是葡萄孢菌)，对灰霉病疫情较重的黄瓜有显著的治疗效果，50倍稀释后的解淀粉芽孢杆菌VLD-3菌液可使黄瓜的灰霉病病情指数降低至13.2％，防治效率高达到86.5％，治疗效果明显。
进一步的，申请人通过大量实验发现，除了植物白粉病和灰霉病外，本发明筛选到的解淀粉芽孢杆菌VLD-3还对由镰刀菌和立枯丝核菌引起的植物枯萎病、褐斑病和果腐病等均有明显的拮抗作用，防治效率均能到达85％-95％。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌VLD-3可单独作为生防菌剂应用于植物病害的预防和治疗，也可与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的任意一种或两种或多种的组合，制备得到复合微生物制剂。所述复合微生物制剂对植物白粉病、灰霉病、枯萎病、褐斑病、果腐病等植物病害的防治效率达到85％-90％，应用前景广阔。