利用太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的酶解工艺方法.pdf

一种利用太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的酶解工艺方法，其操作技术方法是：将太平洋狭鳕鱼肉绞碎后，添加20AU/kg～80AU/kg枯草杆菌内切蛋白酶和8000LAPU/kg～40000LAPU/kg曲霉菌外切蛋白酶；或添加20AU/kg～80AU/kg芽孢杆菌复合蛋白酶，与1.2∶1～1∶1.5的水均匀混合，在酶反应器中酶解2hr～12hr，酶解温度50℃～60℃，起始pH＝6.6，酶解液再经灭活、离心分离、膜分离、喷雾干燥或烘干。即可获得水溶性蛋白寡肽粉和副产品。本发明制备的蛋白寡肽粉为淡乳白色、无苦味、微鱼腥味，分子量(＞85％)可分别控制为≤1000Da和1000～5000Da，蛋白寡肽粉回收率(相对原料总蛋白含量)达到65％－79％。

1.  一种利用太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的酶解工艺方法，其特征在于它的工艺方法是：太平洋狭鳕鱼肉(去头、去脏、去皮、清洗)经绞肉机绞碎后，投入酶反应器加温灭菌，再加水和蛋白酶制剂混合，在优化的酶解工艺参数(料水比、时间、温度、pH)条件下酶解，然后升温酶解液将蛋白酶灭活，粗滤分离骨刺，酶解液进一步三相离心分别获得可溶性蛋白寡肽水相、不溶性蛋白沉淀和鱼油，可溶性蛋白寡肽水相经超滤提纯、脱腥，喷雾干燥后获得蛋白寡肽粉，不溶性蛋白沉淀经烘干获得副产品蛋白粉，所述的蛋白酶制剂为：枯草杆菌内切蛋白酶和曲霉菌外切蛋白酶的组合、或芽孢杆菌复合蛋白酶；所述的蛋白酶制剂其用量E/S为：枯草杆菌内切蛋白酶20AU/kg～80AU/kg、曲霉菌外切蛋白酶8000LAPU/kg～40000LAPU/kg、芽孢杆菌复合蛋白酶20AU/kg～80AU/kg；所述的酶解工艺参数为：料水比1.2∶1～1∶1.5；时间2hr～12hr；温度50℃～60℃；起始pH＝6.6；所述的蛋白寡肽粉的提纯、脱腥，是采用8000rpm高速离心与100kDa超滤膜超滤相结合的方法，彻底截留去除大分子腥味物质和热源物质。

利用太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的酶解工艺方法
技术领域：
本发明属于海洋生物工程酶法生产工艺技术，是一种酶法水解太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的工艺方法。
背景技术：
蛋白酶酶解是制备蛋白寡肽制品最有发展前景地工艺方法，蛋白寡肽制品的回收率、分子量(与生物活性密切相关)、口味风味等经济质量指标主要取决于所选用的蛋白酶制剂种类、原料品种、酶解参数(E/S既酶重量或酶活力单位/kg蛋白质、料水比、时间、温度)等条件，结果可呈现很大差异。在本发明作出之前，法国F.Guerard等(2001，2002)采用Alcalase蛋白酶和“Umamizyme”中性蛋白酶(E/S＝1g/kg～15g/kg，料水比1∶1.5)水解黄鳍金枪鱼副产品，蛋白寡肽回收率为57％，蛋白寡肽分子量(＞85％)可控制为≤5000Da，未对蛋白寡肽的口味风味进行评定；美国Azizah A.H等(2002)用Alcalase蛋白酶，E/S＝20g/kg，从罗非鱼肉提取获得DH值14.9％的蛋白寡肽并真空喷雾干燥；挪威B.Liaset等(2000)研究比较了采用Neutrase、Alcalase、Pepsin和Kojizyme蛋白酶酶解大西洋鳕鱼和大西洋鲑鱼加工副产品鱼排的效果，其中采用Alcalase蛋白酶(E/S＝30AU/kg)，和Kojizyme蛋白酶(E/S＝5000LAPU/kg)两步法酶解大西洋鲑加工副产品鱼排(料水比1∶2)，蛋白寡肽回收率最高为67％，蛋白寡肽分子量(＞85％)可控制为≤1000Da，但未讨论蛋白寡肽的风味。目前，未见以太平洋狭鳕为特定原料制备蛋白寡肽粉的酶解工艺方法的报道，利用其它鱼类制备蛋白寡肽的相关酶解工艺方法研究，仍局限于实验室工作，大多未对酶解工艺参数进行优化筛选，存在着蛋白寡肽粉回收率低的缺点。此外，鱼类蛋白寡肽制品脱苦、脱腥技术的相关报道很少。
发明内容：
本发明的目的是提出一种利用太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的酶解工艺方法，优化筛选了酶解工艺参数，以提高蛋白寡肽粉的回收率，脱除蛋白寡肽粉的苦味和鱼腥味，获得两种不同分子量范围的蛋白寡肽粉。
本发明是按以下技术方案实现的，其工艺方法是：太平洋狭鳕鱼，去头、去脏、去皮、清洗，经绞肉机绞碎后投入酶反应器加温灭菌，再加水和蛋白酶制剂混合，在优化的酶解工艺参数(料水比、时间、温度、pH)条件下酶解，然后酶解液升温使蛋白酶灭活，粗滤分离骨刺，酶解液进一步三相离心分别获得可溶性蛋白寡肽水相、不溶性蛋白沉淀和鱼油，可溶性蛋白寡肽水相经超滤提纯、脱腥，喷雾干燥后获得蛋白寡肽粉，不溶性蛋白沉淀经烘干获得副产品蛋白粉。
蛋白酶制剂为：枯草杆菌内切蛋白酶和曲霉菌外切蛋白酶的组合或芽孢杆菌复合蛋白酶；蛋白酶制剂用量E/S为：枯草杆菌内切蛋白酶为：20AU/kg～80AU/kg、曲霉菌外切蛋白酶为：8000LAPU/kg～40000LAPU/kg或芽孢杆菌复合蛋白酶为：20AU/kg～80AU/kg。
优化酶解工艺参数为：料水混合比例(w/v)：1.2∶1～1∶1.5；酶解温度：50℃～60℃；酶解时间：2hr～12hr；酶解液起始pH值6.6。
蛋白寡肽粉的脱腥采用了8000rpm高速离心与100kDa超滤膜超滤相结合的方法，彻底截留大分子腥味物质。
实施方式：
下面通过实施例1和2详细叙述本发明的工艺方法；
本发明利用太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的酶解工艺流程是：选用去头、去脏、去皮的清洁太平洋狭鳕鱼肉，绞碎后升温至95℃、保温10℃min灭菌，再与定量蛋白酶制剂和水混合，在时间、温度、pH等参数可控的酶反应器中酶解，酶解反应结束后，酶解液升温至90℃保温10℃min进行灭活、离心分离、膜分离，各分离相经喷雾干燥或烘干，既获得目标产品：水溶性蛋白寡肽粉和副产品鱼油、鱼骨粉、不可溶蛋白粉。
本发明技术采用枯草杆菌内切蛋白酶和曲霉菌外切蛋白酶组合或芽孢杆菌复合蛋白酶为蛋白酶制剂，进行了每批次200kg太平洋狭鳕鱼肉制备蛋白寡肽粉的实验。获得的蛋白寡肽粉为淡乳白色、无苦味、微鱼腥味，分子量(＞85％)可分别为1000Da和1000～5000Da，蛋白寡肽粉回收率(相对原料总蛋白含量)达到65％-79％。
蛋白酶制剂种类或蛋白酶制剂组合的确定：蛋白酶及其组合的酶解动力学特性，对蛋白质酶解产物的苦味、色泽、分子量分布等理化性能及蛋白寡肽粉回收率高低起着最主要的决定作用。因此，蛋白酶选择要以酶解产物的苦味和分子量分布为主要技术指标，进行综合评价。在本发明实施例1中，蛋白酶采用了枯草杆菌内切蛋白酶和曲霉菌外切蛋白酶组合；本实施例2中，蛋白酶采用了芽孢杆菌复合蛋白酶。蛋白质被水解后，由于隐藏在蛋白质长肽链和蛋白质多维结构中的疏水基团及一些苦味氨基酸被暴露，使酶解液产生苦味。上述两实施例中所采用的酶制剂或酶制剂组合均具有蛋白质肽链外切特性，可分解修饰蛋白寡肽分子中的疏水基团，达到去处苦味效果。苦味脱除与太平洋狭鳕鱼肉水解同步完成。
E/S筛选：应注意较高的E/S有利于提高蛋白寡肽粉回收率、缩短酶解时间，而这种效果当E/S过高时将会接近最高值而趋于平缓，另一方面生产成本则会因蛋白酶用量的提高而增加。本实施例1中采用的蛋白酶制剂组合中E/S分别为：枯草杆菌内切蛋白酶为50AU/kg、曲霉菌外切蛋白酶为30000LAPU/kg、实施例2中蛋白酶制剂E/S为：芽孢杆菌复合蛋白酶为40AU/kg。
优化酶解工艺参数：料水比、酶解温度、酶解时间和起始pH值是影响蛋白酶酶解效率的主要工艺参数。应注意较高的料水比有利于提高蛋白寡肽粉的提取回收率，但也会增加后续浓缩、干燥工序的能源消耗；酶解温度过高过低均会降低蛋白酶的活性；延长酶解时间可适量减少酶制剂用量，并有利于提高蛋白寡肽的提取回收率，另一方面则降低了设备的周转使用率；酶解起始pH可能会影响酶解过程的蛋白酶的活性。最佳的料水比、酶解温度、酶解时间和起始pH值组合，可使酶解工艺方法的蛋白寡肽粉回收率、蛋白寡肽粉物理指标、能源消耗等综合指标得到优化。本实施例1中：料水比(w/v)1∶1、酶解温度50℃、酶解时间：5hr；酶解液起始pH值：6.6。本实施例2中：料水比(w/v)1∶1、酶解温度55℃、酶解时间：3hr；酶解液起始pH值：6.6。
离心与超滤膜组合脱腥、提纯方法：太平洋狭鳕鱼肉腥味成分主要来自脂肪，本实施例1和实施例2的工艺过程中，采用8000rpm高速离心和100kDa超滤膜超滤结合的方法，可较彻底地截留大分子腥味成分及过敏源和热源物质。
本实例工艺过程如下，
实施例1：
选料：太平洋狭鳕鱼肉(去头、去脏、去皮)，
蛋白酶制剂组合和E/S比为：枯草杆菌内切蛋白酶50AU/kg、曲霉菌外切蛋白酶30000LAPU/kg，
优化酶解工艺参数：料水比(w/v)1∶1、酶解温度50℃、酶解时间：5hr；酶解液起始pH值：6.6，
离心与超滤膜组合脱腥、提纯方法：采用8000rpm高速离心和100kDa超滤膜超滤结合的方法。
实施例2：
选料：太平洋狭鳕鱼肉(去头、去脏、去皮)，
蛋白酶制剂和E/S比为：芽孢杆菌复合蛋白酶40AU/kg。
优化酶解工艺参数：料水比(w/v)1∶1、酶解温度55℃、酶解时间：3hr；酶解液起始pH值：6.6。
离心与超滤膜组合脱腥、提纯方法：采用8000rpm高速离心和100kDa超滤膜超滤结合的方法。
具体流程是：
200kg去头、去脏、去皮的清洁太平洋狭鳕鱼片，经绞肉机绞碎后放入酶反应罐，升温至95℃并保温10min灭菌，然后实施例1：加水和蛋白酶制剂枯草杆菌内切蛋白酶50AU/kg、曲霉菌外切蛋白酶30000LAPU/kg。料水比(w/v)1∶1、酶解温度50℃、酶解时间5hr、起始pH＝6.6；实施例2：加水和蛋白酶制剂芽孢杆菌复合蛋白酶40AU/kg。料水比(w/v)1∶1、酶解温度55℃、酶解时间3hr、起始pH＝6.6。持续搅拌酶解完成后，升温至95℃并保温10min进行蛋白酶灭活，酶解液随后经筛绢粗滤分离鱼骨刺(烘干粉碎获得鱼骨粉)，粗滤液在约90℃温度条件下离心(8000rpm)分离鱼油和非水溶性蛋白沉淀(烘干粉碎获得蛋白粉)，获得的水溶性蛋白寡肽水相进一步经两次超滤(超滤膜分子截留量100kDa和1kDa/5kDa)后，超滤液经喷雾干燥即获得蛋白寡肽粉制品。
本实施例1、2获得的蛋白寡肽粉制品理化特性和主要成分见表1。
表1.蛋白寡肽粉制品理化特性和主要成分
                           实施例1                     实施例2
                     50AU枯草杆菌内切蛋白       40AU芽孢杆菌复合蛋白
                     酶+30000LAPU曲霉菌         酶，料水比1∶1，起始
酶解工艺方法         外切蛋白酶，料水比1∶1，   pH6.6，温度55℃，酶解
                     起始pH6.6，温度50℃，      3hr，粗滤，超滤(100kDa)
                     酶解5hr，粗滤，超滤(100    +超滤(5kDa)
                     kDa)+超滤(1kDa)
寡肽分子量(＞85％)、
                      ≤1000Da，DH^*＝54％      1000-5000Da，DH＝23％
DH值
寡肽蛋白回收率(％)            72                        68
色泽                        淡乳白色                  淡乳白色
苦腥味                   无苦味，微腥味            无苦味，微腥味
水溶性                        易溶                      易溶
主要成分：
蛋白质％                    ≥90             ≥90
脂  肪％                    ≤0.1            ≤0.1
灰  分％                    ≤6.0            ≤6.0
水  分％                    ≤4.0            ≤4.0
^*蛋白质水解度：DH＝％(游离α-amino N/总α-amino N*100)
本发明与已有相关技术相比，具有以下特点：
1.太平洋狭鳕鱼属大洋野生鱼类，为白色鱼肉，食品安全性高，能满足制备高品质蛋白寡肽粉的要求。原料价格适中，来源稳定，易于实现产业化。
2.筛选优化了利用太平洋狭鳕鱼肉制备提取蛋白寡肽的酶制剂、酶解参数、分离提纯等工艺方法，蛋白寡肽粉回收率高(相对原料总蛋白含量)，可达到65％-79％。要求的相关酶反应器、离心、超滤、干燥设备等技术成熟度高、可行性强。
3.通过酶制剂组和、酶解参数调控、离心和超滤膜过滤方法，可分别获得分子量(＞85％)≤1000Da和1000Da-5000Da的两种蛋白寡肽粉，同时达到纯化分离大分子过敏源或热源物质的效果。
4.蛋白寡肽粉无苦味、微腥味。蛋白寡肽粉苦味脱除与太平洋狭鳕鱼肉水解同步进行，较通常活性炭等吸附、掩饰工艺效果彻底、简便经济。脱腥工艺采用了离心和超滤膜过滤的物理方法，更有利于保证产品的天然性和安全性。