人多能干细胞用培养基质及其用途.pdf

本发明提供能够在无饲养细胞的培养环境中使人多能干细胞在保持多能性的状态下进行维持培养的培养基质以及使用该培养基质的人多能干细胞的培养方法。在以优选0.5μg/cm2～25μg/cm2的浓度涂布有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段的人多能干细胞培养用培养基质上，以4×104细胞/cm2～10×104细胞/cm2的密度对分散为单个细胞的人多能干细胞进行接种，由此使人多能干细胞在保持多能性的状态下快速扩增。

权利要求书
1.  一种人ES细胞以外的人多能干细胞培养用培养基质，其特征在于，涂布有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段。

2.  如权利要求1所述的培养基质，其特征在于，以0.5μg/cm2～25μg/cm2的浓度涂布有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段。

3.  如权利要求1或2所述的培养基质，其中，人ES细胞以外的人多能干细胞为人iPS细胞。

4.  一种人ES细胞以外的人多能干细胞的培养方法，其特征在于，使用权利要求1～3中任一项所述的培养基质。

说明书人多能干细胞用培养基质及其用途
本申请是申请号为201080045114.8(国际申请号为PCT/JP2010/067618)、中国国家阶段进入日为2012年4月6日(国际申请日为2010年10月7日)、发明名称为“人多能干细胞用培养基质及其用途”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及人多能干细胞用培养基质及其用途，具体而言，涉及人多能干细胞用培养基质、以及使用该培养基质的人多能干细胞的培养方法、人多能干细胞的快速扩增方法及来源于单个细胞的人多能干细胞克隆的分离方法。
背景技术
人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞在再生医疗中的应用正受到全世界的关注。但是，为了使人多能干细胞在保持多能性(pluripotency)的状态下进行培养、维持，通常，普遍的方法是使用来源于小鼠或人的成纤维细胞作为饲养细胞来进行共培养，而饲养细胞的使用已成为人多能干细胞的临床应用上的巨大制约。为了解决该问题，迄今为止正在尝试使用各种粘附蛋白作为人ES细胞的胞外基质来代替饲养细胞，其中，有报道称，从过量产生基底膜的小鼠EHS肉瘤中提取、纯化出的基底膜成分マトリゲル(商品名)具有最高的维持多能性的活性。但是，由于マトリゲル来源于小鼠，是混有异种蛋白和多糖类的复杂的混合物，因此不适于培养用于再生医疗的人多能干细胞。
为了将人多能干细胞应用于再生医疗，要求培养环境满足：从培养体系中排除异种来源成分的无异源成分(Xeno-Free)条件和不使用饲养细胞的无饲养细胞条件。因此，正在尝试使用人玻连蛋白或人纤连 蛋白作为同种来源的胞外基质，但是，与マトリゲル相比，上述物质使人ES细胞维持未分化的效果差、粘附效率差，在质量、材料来源的确保、安全性等方面存在问题。由此可见，现状是适于维持培养人多能干细胞的胞外基质的开发没有进展，因而迫切要求开发一种使用化学组成均一的人源性胞外基质的、新的人多能干细胞培养技术。
层粘连蛋白是基底膜中的主要的细胞粘附蛋白，是由α、β、γ链这三条亚基链构成的异三聚体，是分子量为80万Da的巨大糖蛋白。三条亚基链在C端侧键合而形成卷曲螺旋结构，并通过二硫键而形成稳定化的异三聚体分子。本发明人对人ES细胞所表达的整合蛋白的类型进行了分析，结果报道了α6β1整合蛋白是人ES细胞的主要粘附受体、以及人层粘连蛋白(特别是由α3β3γ2构成的层粘连蛋白332和由α5β1γ1构成的层粘连蛋白511)的重组蛋白对于维持人ES细胞的多能性有效(参考非专利文献1)。另外，本发明人还报道了层粘连蛋白511对α6β1整合蛋白具有非常高的亲和性、以及层粘连蛋白511的E8片段具有与全长的层粘连蛋白511同等的α6β1整合蛋白结合活性(参考非专利文献2)。
但是，由于层粘连蛋白与各种细胞表面分子和细胞外基质分子结合，因此为了获取不含杂质且均一的纯化层粘连蛋白，需要克服很多技术问题。另外，由于构成层粘连蛋白的三条亚基链的分子量均高达20万～40万Da，因此存在如下问题：直接以重组蛋白的形式表达上述亚基链结合而成的异三聚体分子的技术本身并不容易，且收量也少。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Miyazaki T,Futaki S,Hasegawa K,Kawasaki M,Sanzen N,Hayashi M,Kawase E,Sekiguchi K,Nakatsuji N,Suemori H.Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells.Biochem.Biophys.Res.Commun. 375:27-35,2008.
非专利文献2：Taniguchi Y,Ido H,Sanzen N,Hayashi M,Sato-Nishiuchi R,Futaki S,Sekiguchi K.The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins.J Biol Chem.284:7820-7831,2009.
发明内容
本发明的目的在于提供能够在无饲养细胞的培养环境中使人多能干细胞在保持多能性的状态下进行维持培养的培养基质以及使用该培养基质的人多能干细胞的培养方法。
为了解决上述课题，本发明包含以下的发明。
[1]一种人多能干细胞培养用培养基质，其特征在于，涂布有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段。
[2]如上述[1]所述的培养基质，其特征在于，以0.5μg/cm2～25μg/cm2的浓度涂布有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段。
[3]如上述[1]或[2]所述的培养基质，其中，人多能干细胞为人ES细胞或人iPS细胞。
[4]一种人多能干细胞的培养方法，其特征在于，使用上述[1]～[3]中任一项所述的培养基质。
[5]一种人多能干细胞的培养方法，对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养，其特征在于，包括：
使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤，和
使用上述[1]～[3]中任一项所述的培养基质，对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养的步骤。
[6]一种人多能干细胞的快速扩增方法，其特征在于，
包括：
使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤，和
使用上述[1]～[3]中任一项所述的培养基质，对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养的步骤；并且
以2×104细胞/cm2～20×104细胞/cm2的密度对分散为单个细胞的人多能干细胞进行接种。
[7]一种来源于单个细胞的人多能干细胞克隆的分离方法，其特征在于，
包括：
使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤，和
使用上述[1]～[3]中任一项所述的培养基质，对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养的步骤；并且
形成来源于单个细胞的集落。
[8]一种人多能干细胞的单个细胞培养方法，其特征在于，
包括：
使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤，和
使用上述[1]～[3]中任一项所述的培养基质，对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养的步骤；并且
以单个细胞的状态进行维持。
发明效果
根据本发明，可以提供能够在无饲养细胞的培养环境中使人多能干细胞在保持多能性的状态下进行维持培养的培养基质以及使用该培养基质的人多能干细胞的培养方法。并且，如果组合使用无异源成分的培养基，则能够在无异源成分且无饲养细胞的条件下培养人多能干细胞，从而可以提供安全性高的人多能干细胞。另外，如果使用本发 明的培养基质，则能够使分散为单个细胞的人多能干细胞快速地扩增，同时能够分离来源于单个细胞的克隆并且能够以单个细胞的状态进行维持。此外，由于涂布在本发明的培养基质上的人层粘连蛋白α5β1γ1E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段可以以重组蛋白的形式高收量地制备，因此，能够以低成本制备涂布有高纯度且均一的人源蛋白质的高质量的培养基质。
附图说明
图1是表示对人ES细胞在各种胞外基质中的浓度依赖性粘附效率进行比较的结果的图。
图2是表示对涂布有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或マトリゲル的培养器皿中依赖于接种密度的单个人ES细胞的粘附效率进行研究的结果的图。
图3是表示涂布有人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段的培养器皿中的人ES细胞的形态的图。
图4是表示涂布有人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段的培养器皿中的人ES细胞的形态的图。
图5是表示使用涂布有人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段、人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或マトリゲル的培养器皿进行培养的人ES细胞的表面抗原分析的结果的图。
具体实施方式
[人多能干细胞用培养基质]
本发明提供涂布有层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段或人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段的人多能干细胞培养用培养基质。作为多能干细胞，可以列举：ES细胞(胚胎干细胞)、iPS细胞(人造多能干细胞)、mGS细胞(多能生殖干细胞)、人ES细胞与体细胞的融合细胞等。
人层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段(以下记作“人层粘连蛋白511E8”)是指相当于小鼠层粘连蛋白α1β1γ1的E8片段(以下记作“小鼠层粘连 蛋白111E8”)的人层粘连蛋白α5β1γ1(以下记作“人层粘连蛋白511”)的片段；人层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段(以下记作“人层粘连蛋白332E8”)是指相当于小鼠层粘连蛋白111E8的人层粘连蛋白α3β3γ2(以下记作“人层粘连蛋白332”)的片段。
层粘连蛋白的E8片段是将小鼠层粘连蛋白α1β1γ1(以下记作“小鼠层粘连蛋白111”)用弹性蛋白酶进行消化而得到的片段中，作为具有强细胞粘附活性的片段而被鉴定的片段(Edgar D.,Timpl R.,Thoenen H.The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival.EMBO J.,3:1463-1468,1984.、Goodman SL.,Deutzmann R.,von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading.J.Cell Biol.,105:589-598,1987.)。推测人层粘连蛋白511及人层粘连蛋白332用弹性蛋白酶进行消化时也存在与小鼠层粘连蛋白111E8相当的片段，但是还没有对它们进行分离、鉴定的报道。因此，本发明所使用的人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8不需要为人层粘连蛋白511或人层粘连蛋白332的弹性蛋白酶消化产物，只要是具有与小鼠层粘连蛋白111E8同样的细胞粘附活性、具有同样的结构、且具有相同程度的分子量的人层粘连蛋白511或人层粘连蛋白332的片段即可。
人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8的制备方法没有特别限制，可以列举例如：用弹性蛋白酶等蛋白分解酶消化全长的人层粘连蛋白511或人层粘连蛋白332并分离、纯化目标片段的方法，以重组蛋白的形式进行制备的方法等。从制备量、质量的均一性、制备成本等观点考虑，优选以重组蛋白的形式制备。
重组人层粘连蛋白511E8或重组人层粘连蛋白332E8，可以通过适当应用公知的基因重组技术来制备。作为重组人层粘连蛋白511E8的制备方法，例如可以通过如下方法进行制备：分别获取编码人层粘 连蛋白511E8的α链、β链及γ链的各蛋白的DNA，将其分别插入表达载体中，将得到的三种表达载体共同导入到适当的宿主细胞中进行表达，并利用公知的方法对形成三聚体的蛋白质进行纯化。本申请发明人按照Ido等人(Hiroyuki Ido，Aya Nakamura，Reiko Kobayashi，Shunsuke Ito，Shaoliang Li，Sugiko Futaki，and Kiyotoshi Sekiguchi，“The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins”The Journal of Biological Chemistry，282，11144-11154，2007.)记载的方法进行制备(参考实施例)，但是并不限定于此。对于重组人层粘连蛋白332E8，也可以采用同样的方法进行制备(参考实施例)。另外，分别编码构成人层粘连蛋白511的α5链、β1链、γ1链和构成人层粘连蛋白332的α3链、β3链、γ2链的基因(cDNA)的碱基序列信息和各链的氨基酸序列信息，可以用表1所示的登录号从公知的数据库(GenBank等)获取。
表1
人层粘连蛋白序列信息(登录号)
 氨基酸序列碱基序列α5链NP_005551NM_005560β1链NP_002282NM_002291γ1链NP_002284NM_002293α3链NP_000218NM_000227β2链NP_000219NM_000228γ2链NP_005553NM_005562
使用适当的溶剂例如PBS、生理盐水、用三羟甲基氨基甲烷或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸调节为中性pH的生理盐水等，对所得到的人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8进行稀释，将该溶液添加到适 当的培养器皿中，并在约室温～约37℃下静置约1小时～约12小时，由此，将人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8涂布于培养器皿表面，从而能够制备本发明的培养基质。作为培养器皿，只要可以用于培养人多能干细胞则没有限定，可以列举例如：玻璃制或塑料制的培养皿、烧瓶、多孔板、培养载玻片、微载体、聚偏二氟乙烯膜等聚合物膜等。
人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8的涂布浓度，优选约0.5μg/cm2～约25μg/cm2，更优选约1.5μg/cm2～约10μg/cm2。与涂布以往使用的マトリゲル、人层粘连蛋白511或人层粘连蛋白332的情况相比，即使以较低的涂布浓度，也能够粘附大量人多能干细胞并使其增殖。
本发明的培养基质可以仅单独涂布有人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8，也可以涂布有两者。另外，也可以涂布有人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8以外的人源成分。可以列举例如：血清成分、细胞外基质分子、生长因子、分化诱导因子、成形素(morphogen)等。另外，也可以涂布有合成高分子凝胶(合成聚合物)等非生物成分。
本发明的培养基质，通过涂布有人层粘连蛋白511E8或人层粘连蛋白332E8，能够在不使用干细胞培养中通常使用的饲养细胞的培养环境(无饲养细胞)中，使人多能干细胞在保持多能性的状态下进行维持培养。通常，为了维持克隆增殖和未分化性，多能干细胞的培养使用在通过X射线照射或丝裂霉素C处理而使增殖停止的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)等饲养细胞上对多能干细胞进行共培养的培养体系，而不使用这种饲养细胞的培养体系则为无饲养培养体系。
另外，如果使用排除了异种来源成分的培养基，则能够在完全不含异种来源成分的培养条件(无异源成分，Xeno-free)下培养人多能干细胞，从而能够提供对人表达免疫原性的可能性非常低、安全性高的人多能干细胞。
另外，如果使用本发明的培养基质，则能够进行在以往的培养体系中不可能进行的、对分散为单个细胞的人多能干细胞的培养。因此，与以往的培养体系相比，能够显著地快速扩增人多能干细胞。另外，能够容易地分离来源于单个细胞的人多能干细胞克隆，并且能够以单个细胞的状态进行维持。
[人多能干细胞的培养方法]
本发明提供使用上述本发明的培养基质来培养人多能干细胞的方法。本发明的培养方法，优选用于在无饲养细胞的培养条件下培养人多能干细胞的情况，特别优选用于在无饲养细胞且无异源成分的培养条件下培养人多能干细胞的情况。
本发明的培养方法中使用培养基，没有特别限定，优选合成培养基，特别优选不含异种成分的(无异源成分)合成培养基。作为市售或预定市售的合成培养基，可以列举mTeSR1(商品名，StemCell Technologies)、TeSR2(商品名，StemCell Technologies)、StemPro hESC SFM(商品名，Invitrogen)、hESF-GRO(商品名，株式会社细胞科学研究所)等。其中，TeSR2为不含异种成分的培养基。另外，也可以适当地使用以下的文献(1)～(5)中所述的培养基。
(1)Liu,Y.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,346:131-139,2006.
(2)Vallier,L.等,J.Cell Sci.118:4495-4509,2005.
(3)Li,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,91:688-698,2005.
(4)Yao,S.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103:6907-6912,2006.
(5)Lu,J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103:5688-5693,2006.
以下示出使用本发明的培养方法培养人ES细胞时的一个实施方式。另外，本发明的培养方法并不限定于此，只要是使用上述本发明的培养基质的人多能干细胞的培养方法即可。
(1)从与饲养细胞的共培养体系中回收人ES细胞
使用以下的方法1或方法2中的任意一种方法，从与饲养细胞的共培养体系中回收人ES细胞。
方法1：
在与饲养细胞(例如MEF)共培养的人ES细胞的培养皿(第3～5天)中添加0.25％胰蛋白酶/DMEM-F12(例如1ml/60mm皿)，在37℃下恒温处理2～3分钟，用DMEM-F12洗涤培养皿以除去饲养细胞。加入培养液，使全部细胞物理剥离而得到的细胞悬浮液通过100μm的BD Falcon细胞过滤网(BD Falcon#352460)，然后洗涤过滤网，由此仅对人ES细胞的集落进行分离、回收。
方法2：
在与饲养细胞(例如MEF)共培养的人ES细胞的培养皿(第3～5天)中添加人ES细胞剥离液(例如，灵长类ES细胞用细胞剥离液(リプロセルRCHETP002、1mg/ml分散酶/DMEM-F12、10mg/ml胶原酶IV/DMEM-F12等)(例如1ml/60mm皿)，在37℃下恒温处理5分钟，剥离人ES细胞和MEF。将细胞转移至15ml离心管中，加入约10ml培养液使细胞悬浮，然后将管静置5分钟而仅使集落沉降。除去上清，将同样的操作重复2次以上，从而仅使人ES细胞的集落沉降，并将其回收。
(2)将人ES细胞转移至本发明的培养基质
将回收的人ES细胞的集落分散为单个细胞。分散为单个细胞的方法没有特别限定，可以列举例如通过使用P-1000ピペットマン移液器等将培养液吹洗几次而将集落打散的方法等。分散为单个细胞后，悬浮于适当的培养液(例如TeSR2等)中，并接种至本发明的培养基质(例如涂布有人层粘连蛋白511E8(1.5μg/cm2)的培养皿)上。在适合于所使用的培养液的CO2浓度条件下进行培养，并每天更换培养液。
(3)传代培养
以扩增区域的不足或集落内死细胞的出现变得显著为大致标准而进行传代操作。本发明的培养方法中，可以通过与以往的方法同样地在使人ES细胞维持适度大小的集落形态的状态下进行接种的方法来进行传代培养，也可以通过使人ES细胞分散为单个细胞后进行接种的方法来进行传代培养。在此，分散为单个细胞的状态并不需要细胞悬浮液中的全部细胞均分散为单个细胞，下述状态也包括在分散为单个细胞的状态中：除了分散为单个细胞的细胞以外，细胞悬浮液中还包含约几个～约十几个粘附状态的细胞。
分散为单个细胞的情况下：
在培养有人ES细胞的本发明的培养基质(例如涂布有人层粘连蛋白511E8(1.5μg/cm2)的培养皿)中添加TrypLE Select(商品名，Invitrogen#12563011)(例如1ml/60mm皿)，在37℃下恒温处理5分钟。使用例如P-1000ピペットマン移液器等将培养液吹洗几次，由此将人ES细胞的集落打散，使其分散为单个细胞。加入培养液使细胞悬浮，并回收至离心管中。重复两次离心(200×g、3分钟)和使用该培养液进行的洗涤操作，然后将细胞悬浮于新鲜的培养液中，并以例如约40000细胞/cm2的接种密度将分散为单个细胞的人ES细胞接种到本发明的培养基质(例如涂布有人层粘连蛋白511E8(1.5μg/cm2)的培养皿)中。在适合于所使用的培养液的CO2浓度条件下进行培养，并每天更换培养液。
不分散为单个细胞的情况下：
不使人ES细胞分散为单个细胞的情况下，细胞的剥离时使用胶原酶IV、分散酶、Accutase等酶。在培养有人ES细胞的本发明的培养基质中添加10mg/ml胶原酶/DMEM-F12、或2mg/ml分散酶/DMEM-F12、或Accutase(Millipore#SCR005)(例如1ml/60mm皿)，在37℃下恒温处理5分钟。除去酶液后加入培养液，使用例如P-1000ピペットマン移液器等将培养液吹洗几次，由此将人ES细胞细微打散至维持约50个～约 100个集落状的程度。将细胞悬浮液回收至离心管中，重复两次离心(200×g、3分钟)和使用该培养液进行的洗涤操作，然后将细胞悬浮于新鲜的培养液中，并将二分之一～四分之一的稀释量接种到本发明的培养基质(例如涂布有人层粘连蛋白511E8(1.5μg/cm2)的培养皿)中。在适合于所使用的培养液的CO2浓度条件下进行培养，并每天更换培养液。
[人多能干细胞的快速扩增方法]
本发明提供人多能干细胞的快速扩增方法。本发明的快速扩增方法，只要是包括：使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤，和使用上述本发明的培养基质、对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养的步骤；并且以约2×104细胞/cm2～约20×104细胞/cm2的密度对分散为单个细胞的人多能干细胞进行接种的方法即可。接种密度更优选约3×104细胞/cm2～约10×104细胞/cm2，进一步优选约4×104细胞/cm2～约5×104细胞/cm2。以往的培养体系中，以上述细胞密度接种单个分散的人ES细胞时粘附效率低于10％，而通过本发明的快速扩增方法，能够得到显著高的粘附效率，并且在之后旺盛地增殖，因此，与以往的方法相比，能够以非常快的速度使人多能干细胞增殖。
在使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤中，与上述的“分散为单个细胞的情况下”同样，通过使用例如P-1000ピペットマン移液器等对培养液进行几次吹洗而将从培养皿中剥离、回收的人多能干细胞的集落分散为单个细胞。接着，使用公知的细胞计数方法对细胞数进行计数，并适当地调节细胞悬浮液的细胞浓度以达到上述接种密度。关于培养方法，可以按照上述本发明的培养方法中的记载来进行。
[来源于单个细胞的人多能干细胞克隆的分离方法]
本发明提供来源于单个细胞的人多能干细胞克隆的分离方法。本发明的来源于单个细胞的克隆的分离方法，只要是包括：使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤，和使用上述本发明的培养基质、对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养的步骤；并且形成来源于单个细 胞的集落的方法即可。通过本发明的来源于单个细胞的克隆的分离方法，能够进行在以往的培养体系中难以进行的来源于单个细胞的人多能干细胞克隆的形成和分离，并且能够容易地获取均一的人多能干细胞。
形成来源于单个细胞的集落并分离来源于单个细胞的克隆的方法，没有特别限定。可以适当地使用例如公知的有限稀释法等。根据所使用的方法来选择适当的细胞密度以及所使用的本发明的培养基质，对分散为单个细胞的人多能干细胞进行接种，并进行培养即可。关于培养方法，可以按照上述本发明的培养方法中的记载来进行。
[人多能干细胞的单个细胞培养方法]
本发明提供人多能干细胞的单个细胞培养方法。本发明的单个细胞培养方法，只要是包括：使人多能干细胞分散为单个细胞的步骤，和使用上述本发明的培养基质、对分散为单个细胞的人多能干细胞进行培养的步骤；并且在不使细胞增殖的情况下以单个细胞的状态进行维持的方法即可。对于形成了集落的人多能干细胞而言，有时集落周缘部与集落内部的细胞的状态不同，通过本发明的单个细胞培养方法，细胞不形成集落，因此能够得到状态均一的人多能干细胞，能够期待分化诱导效率的提高。
作为在不使细胞增殖的情况下以单个细胞的状态进行维持的方法，优选：根据所使用的本发明的培养基质选择适当的细胞密度来对分散为单个细胞的人多能干细胞进行接种，并在细胞增殖前将细胞用于其他用途。另外，例如，可以通过使用不含增殖因子的培养液或增殖因子量减少的培养液来延长能够以单个细胞的状态进行维持的时间。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限定于这 些实施例。
[实验材料]
(1)胞外基质
使用：重组人层粘连蛋白511E8(以下记作“rhLM511E8”)、重组人层粘连蛋白332E8(以下记作“rhLM332E8”)、重组人层粘连蛋白511(以下记作“rhLM511”)、重组人层粘连蛋白332(以下记作“rhLM332”)、重组人层粘连蛋白111(以下记作“rhLM111”)、マトリゲル(BD Bioscience#354230)、人纤连蛋白(按照Sekiguchi等人的方法(Sekiguchi K.and Hakomori S:Domain structure of human plasma fibronectin.Differences and similarities between human and hamster fibronectins.The Journal of Biological Chemistry,258,3967-3973,2003.)，使用明胶固定的亲和柱进行纯化而得到)、以及玻连蛋白(按照Yatohgo等人的方法(Yatohgo T.,Izumi,M.,Kashiwagi,H.,and Hayashi,M.Novel purification of vitronectin from human plasma by heparin affinity chromatograhy.Cell Structure and Function,13,281-292,1988)，使用肝素固定的亲和柱进行纯化而得到)。
(2)使用的细胞
人ES细胞使用京都大学再生医科学研究所建立的细胞株(KhES-1、KhES-2、KhES-3)和从国家干细胞库(National Stem Cell Bank)购买的细胞株(H1、H9)。人iPS细胞使用从国家干细胞库购买的细胞株(克隆名：iPS(IMR90)-1-DL-1、iPS(IMR90)-4-MCB-1、iPS(foreskin)-1-DL-1)。
各细胞按照各机构推荐的培养方法进行维持培养。例如，人ES细胞H9，按照National Stem Cell Bank推荐的方法，通过与小鼠饲养细胞的共培养来进行维持。在共培养皿中添加0.25％胰蛋白酶/DMEM-F12，除去小鼠饲养细胞后，通过100μm的BD Falcon细胞过滤网(BD Falcon#352460)并洗涤过滤网，由此对人ES细胞H9的集落 进行分离。用人ES细胞培养液回收残留的集落，使用P-1000ピペットマン移液器将其细微打散，然后悬浮于mTeSR1(StemCell Technologies)中，并接种到涂布有マトリゲル的培养器皿中。将刚接种后设为传代数(P1)，在5％CO2/95％空气的条件下，在确认未混入小鼠饲养细胞的同时每天更换培养液，进行扩增培养至4天为止。将能够确认未混入小鼠饲养细胞的细胞供给实验。对于其他细胞，也通过同样的方法进行维持培养和扩增培养，并供给实验。需要说明的是，以下的实施例中，只显示了人ES细胞H9的结果，但其他细胞也得到同样的结果。
(3)rhLM511E8的制备方法
rhLM511E8按照Ido等人(Hiroyuki Ido,Aya Nakamura,Reiko Kobayashi,Shunsuke Ito,Shaoliang Li,Sugiko Futaki,and Kiyotoshi Sekiguchi,“The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the lamininγchains in integrin binding by laminins”The Journal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007.)所述的方法，如下进行制备。
首先，以克隆用质粒pBluescript KS(+)(Stratagene公司)为模板，使用以下三种引物组进行PCR，分别制备在质粒的多克隆位点内的EcoRV的5’侧插入有编码6×His标签(HHHHHH)的DNA、编码HA(血凝素)标签(YPYDVPDYA)的DNA、或编码FLAG标签(DYKDDDDK)的DNA的三种pBluescript KS(+)。
(i)用于引入6×His标签的引物
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’(正向，序列号1)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’(反向，序列号2)
(ii)用于引入HA标签的引物
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’(正向，序列号3)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(反向，序列号 4)
(iii)用于引入FLAG标签的引物
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’(正向，序列号5)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(反向，序列号4)
然后，以包含α5链、β1链、γ1链的全长碱基序列的质粒(Ido等,J.Biol.Chem.,279,10946-10954,2004.)为模板，使用以下的引物进行PCR，对各链的相当于α5(Ala2534-Ala3327)、β1(Leu1561-Leu1786)、γ1(Asn1362-Pro1608)的区域进行扩增。
(iv)用于扩增α5链E8片段的引物
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’(正向，序列号6)
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’(反向，序列号7)
(v)用于扩增β1链E8片段的引物
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’(正向，序列号8)
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’(反向，序列号9)
(vi)用于扩增γ1链E8片段的引物
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’(正向，序列号10)
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’(反向，序列号11)
将扩增出的cDNA插入到附加有标签序列的pBluescript KS(+)的多克隆位点的EcoRV位点，然后用限制性内切酶EcoRI和HindIII将包含5’侧的编码标签的序列在内的扩增的cDNA切出，并将其插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2B(Invitrogen)的该位点，从而分别制备人α5链E8片段(N末端侧包含6×His标签)、人β1链E8片段(N末端侧包含HA标签)、人γ1链E8片段(N末端侧包含FLAG标签)的表达载体。
rhLM511E8的表达通过将制备的各链的表达载体导入到来源于人 肾脏的293F细胞(从Invitrogen公司购买)中来进行。使用转染试剂293fectin(商品名，Invitrogen)和Opti-MEM(商品名，Invitrogen)，将各链的表达载体各180μg同时对300ml的293F细胞(1.0×106个/ml)进行转染，并进行72小时培养，然后回收培养液。培养液以1000×g离心10分钟，其上清再以15000×g离心30分钟，除去细胞和不溶物。在培养上清中添加5ml的Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN)并温育过夜，从而吸附目标蛋白。回收Ni-NTA琼脂糖，并用TBS(-)(不含Ca、Mg的Tris缓冲生理盐水)和10mM咪唑/TBS(-)洗涤，然后用200mM咪唑/TBS(-)洗脱。洗脱级分通过SDS-PAGE和银染色进行确认，在洗脱出rhLM511E8的级分中添加2ml的抗FLAG M2亲和凝胶(SIGMA)，并在4℃下旋转过夜。将凝胶转移至经济柱(エコノカラム)中，用包含1mM PMSF的TBS(-)洗涤，然后用包含100μg/ml FLAG肽(SIGMA)的TBS(-)洗脱。洗脱级分通过银染色进行确认，将洗脱出rhLM511E8的级分合并后在TBS(-)中进行透析。
(4)rhLM332E8的制备方法
(4-1)人层粘连蛋白α3链E8片段表达载体的制备
以克隆用质粒pBluescript KS(+)(Stratagene公司)为模板，使用以下的引物组进行PCR，制备在质粒的多克隆位点内的EcoRV的5’侧插入有限制性内切酶AscI识别序列(GGCGCGCC)和编码6×His标签(HHHHHH)的DNA的pBluescript KS(+)。
(vii)用于引入6×His标签的引物
5’-ATGATGATGGGCGCGCCAAGCTTATCGATACCGT-3’(正向，序列号12)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGC-3’(反向，序列号13)
然后，以包含人层粘连蛋白α3链(除外层粘连蛋白的第4和第5个球状结构域)的cDNA序列的质粒(Ido等,J.Biol.Chem.,282,11144-11154,2007)为模板，使用以下的引物组进行PCR，对相当于α3 链(Ala579-Ala1364)的区域进行扩增。需要说明的是，在反向(reverse)引物的5’侧附加有XbaI识别序列(TCTAGA)。
(viii)用于扩增α3链E8片段的引物
5’-GCGGCCGAGGACGCAGCCAACAGG-3’(正向，序列号14)
5’-GGTCTAGACTAAGCATCTTGCCACACC-3’(反向，序列号15)
将扩增出的cDNA插入到附加有AscI识别序列和6×His标签序列的pBluescript KS(+)的多克隆位点的EcoRV和XbaI位点。然后，用限制性内切酶AscI和Not I将包含5’侧的编码6×His标签和α3链E8片段的序列的cDNA切出，并插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2A(Invitrogen)的该位点，从而制备人α3链E8片段(N末端侧包含6×His标签)的表达载体。
(4-2)人层粘连蛋白β3链E8片段表达载体的制备
为了获得从5’侧开始依次编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽、HA标签、β3链E8片段的cDNA片段，分别获取编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽和HA标签的cDNA片段以及编码β3链E8的cDNA片段，并通过延伸PCR将这两种片段进行连接和扩增。
首先，以人层粘连蛋白β1链E8表达载体(Ido等,J.Biol.Chem.,282,11144-11154,2007)为模板，使用以下的引物组进行PCR，对相当于小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽和HA标签的区域进行扩增。需要说明的是，在反向(reverse)引物的5’侧附加有延伸PCR所使用的序列。
(ix)用于扩增信号肽序列和HA标签序列的引物
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(正向，序列号16)
5’-TCTGGGACAGATCTGCATAATCTGGCAC-3’(反向，序列号17)
然后，以包含人层粘连蛋白β3链的cDNA序列的质粒(Ido等,J.Biol.Chem.,282,11144-11154,2007)为模板，使用以下的引物组进行PCR，对相当于β3链(Leu949-Lys1172)的区域进行扩增。需要说明的是，在正向(forward)引物的5’侧附加有延伸PCR所使用的序列，在反向(reverse)引物的5’侧附加有EcoRI识别序列(GAATTC)。
(x)用于扩增β3链E8片段的引物
5’-AGATTATGCAGATCTGTCCCAGACCAAG-3’(正向，序列号18)
5’-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3’(反向，序列号19)
通过使用以下引物进行的延伸PCR，将所得到的两种cDNA片段进行连接和扩增，得到编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-HA标签-β3链E8的cDNA片段。用限制性内切酶NheI和EcoRI消化扩增出的cDNA，并插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2B(Invitrogen)的该位点，从而制备人β3链E8片段(N末端侧包含HA标签)的表达载体。需要说明的是，NheI识别序列(GCTAGC)紧邻起始密码子而存在于5’侧。
(xi)用于扩增小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-HA标签-β3链E8的引物
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(正向，序列号16)
5’-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3’(反向，序列号19)
(4-3)人层粘连蛋白γ2链E8片段表达载体的制备
为了获得从5’侧开始依次编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽、FLAG标签、γ2链E8片段的cDNA片段，分别获取编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽和FLAG标签的cDNA片段以及编码γ2链E8的cDNA片段，并通过延伸PCR将这两种片段进行连接和扩增。
首先，以人层粘连蛋白γ1链E8表达载体(Ido等,J.Biol.Chem.,282,11144-11154,2007)为模板，使用以下的引物组进行PCR，对相当于小 鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽和HA标签的区域进行扩增。需要说明的是，在反向(reverse)引物的5’侧附加有延伸PCR所使用的序列。
(xii)用于扩增信号肽序列和FLAG标签序列的引物
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(正向，序列号16)
5’-GGATGCTCTCATCCTTATCATCATCATCC-3’(反向，序列号20)
然后，以包含人层粘连蛋白γ2链的cDNA序列的质粒(Ido等,J.Biol.Chem.,282,11144-11154,2007)为模板，使用以下的引物组进行PCR，对相当于γ2链(Glu949-Gln1172)的区域进行扩增。需要说明的是，在正向(forward)引物的5’侧附加有延伸PCR所使用的序列，在反向(reverse)引物的5’侧附加有EcoRI识别序列(GAATTC)。
(xiii)用于扩增γ2链E8片段的引物
5’-GATGATGATAAGGATGAGAGCATCCTTAAAAAC-3’(正向，序列号21)
5’-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3’(反向，序列号22)
通过使用以下引物进行的延伸PCR，将所得到的两种cDNA片段进行连接和扩增，得到编码小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-FLAG标签-γ2链E8的cDNA片段。用限制性内切酶NheI和EcoRI消化扩增出的cDNA，并插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2B(Invitrogen)的该位点，从而制备人γ2链E8片段(N末端侧包含FLAG标签)的表达载体。
(xiv)用于扩增小鼠Ig-κ链V-J2-C信号肽-FLAG标签-γ2链E8的引物
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’(正向，序列号16)
5’-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3’(反向，序列号 22)
(4-4)rhLM332E8的表达与纯化
rhLM332E8的表达通过将制备的各链的表达载体导入到来源于人肾脏的293F细胞(Invitrogen)中来进行。使用转染试剂293fectin(商品名，Invitrogen)和Opti-MEM(商品名，Invitrogen)，将各链的表达载体各70μg同时对300ml的293F细胞(1.0×106个/ml)进行转染，并进行72小时培养，然后回收培养液。培养液以1000×g离心10分钟，其上清再以15000×g离心30分钟，除去细胞和不溶物。在培养上清中加入咪唑使其终浓度达到10mM并充分搅拌。然后，添加40ml的50％(v/v)Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN公司)，通过4℃下过夜的批式法(バッチ法)吸附目标蛋白。回收Ni-NTA琼脂糖，并用TBS(-)洗涤，然后用200mM咪唑/TBS(-)洗脱。以280nm的吸光度为指标来确认洗脱出rhLM332E8的级分。在洗脱出rhLM332E8的级分中添加2ml的抗FLAGM2亲和凝胶(SIGMA)，并通过4℃下过夜的批式法来吸附目标蛋白。将凝胶转移至经济柱(Bio-Rad公司制)中，用TBS(-)洗涤，然后用包含100μg/ml FLAG肽(SIGMA)的TBS(-)洗脱。洗脱级分通过银染色进行确认，将洗脱出rhLM332E8的级分在TBS(-)中进行透析(截留分子量20kDa)。
(5)重组人层粘连蛋白(rhLM511、rhLM332、rhLM111)的制备方法
rhLM511按照Ido等人(Hiroyuki Ido,Kenji Harada,Sugiko Futaki,Yoshitaka Hayashi,Ryoko Nishiuchi,Yuko Natsuka,Shaoliang Li,Yoshinao Wada,Ariana C.Combs,James M.Ervasti,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Molecular dissection of theα-dystroglycan-and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10”Jhe Journal of Biological Chemistry,279,10946-10954,2004.)所述的方法进行制备。
rhLM332按照Ido等人(Hiroyuki Ido,Aya Nakamura,Reiko  Kobayashi,Shunsuke Ito,Shaoliang Li,Sugiko Futaki,and Kiyotoshi Sekiguchi,“The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the lamininγchains in integrin binding by laminins”The Journal of Biological Chemistry,282,11144-11154,2007.)所述的方法进行制备。
rhLM111按照Ido等人(Hiroyuki Ido,Kenji Harada,Yoshiki Yagi,and Kiyotoshi Sekiguchi,“Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511with the function-blocking monoclonal antibody 4C7”Matrix Biology,25,112-117,2006.)以及Taniguchi等人(Yukimasa Taniguchi,Hiroyuki Ido,Noriko Sanzen,Maria Hayashi,Ryoko Sato-Nishiuchi,Sugiko Futaki,and Kiyotoshi Sekiguchi,“The C-terminal region of lamininβchains modulates the integrin binding affinities of laminins”The Journal of Biological Chemistry,284,7820-7831,2009.)所述的方法进行制备。
[实施例1：人ES细胞在各种胞外基质中的浓度依赖性粘附效率的比较]
将rhLM511E8、rhLM332E8、rhLM511、rhLM332、rhLM111、マトリゲル、纤连蛋白、玻连蛋白用Dulbecco’s PBS(和光纯药#045-29795)或DMEM-F12(SIGMA#D6241)进行稀释，在96孔微孔板(BD Bioscience#351172)中加入各胞外基质溶液使最终浓度达到0～25μg/cm2的范围，在室温下静置2小时以进行涂布。
在mTeSR1培养细胞(P1)中加入TrypLE Select(Invitrogen#12563011)，在37℃下恒温处理3分钟，使细胞分散为单个细胞。对细胞数进行计数后，以5×104细胞/孔的密度将细胞接种至微孔板中。从细胞接种开始经过6小时后，除去上清，用DMEM-F12将孔洗涤一次，并加入10％中性福尔马林缓冲液将细胞固定10分钟。置换为100％乙醇并经过5分钟后，加入4％结晶紫/100％甲醇溶液，将细胞染色5 分钟。将微孔板浸入到大量的蒸馏水中而除去过量的染色液后，将其风干。加入1％SDS将细胞裂解，使用多功能酶标仪测定波长570nm的吸光度。
结果如图1所示。由图1可知，rhLM511E8和rhLM332E8即使在低浓度的涂布时也显示出明显高的粘附细胞数。可以看出，rhLM511E8的粘附细胞数在任意一种浓度下均高于已知的胞外基质中人ES细胞的粘附能力最高的マトリゲル的粘附细胞数的最大值。另外，可以看出，以比全长的rhLM511或rhLM332的涂布量少的涂布量即可粘附大量细胞。由该结果可以认为，rhLM511E8和rhLM332E8的最适涂布浓度为约1.0μg/cm2～约20μg/cm2。
[实施例2：涂布有rhLM511E8的培养器皿中依赖于接种密度的单个人ES细胞的粘附效率的研究]
人ES细胞的传代中，在使用胰蛋白酶/EDTA等分散为单个细胞时，细胞的生存率极端低下，因此一般在维持集落形状的状态下进行传代。因此，对涂布rhLM511E8时单个人ES细胞的粘附效率与涂布マトリゲル时单个人ES细胞的粘附效率进行了比较。
将rhLM511E8用Dulbecco’s PBS进行稀释，使最终浓度达到1.5μg/cm2。将マトリゲル用DMEM-F12进行稀释，使最终浓度达到25μg/cm2。将各稀释液添加到48孔多孔板(BD Bioscience #351178)中，在室温下静置2小时以进行涂布。
在mTeSR1培养细胞(P1)中加入TrypLE Select，在37℃下恒温处理3分钟，使细胞分散为单个细胞。在涂布有rhLM511E8或マトリゲル的48孔多孔板中，以1×103细胞/cm2～5×105细胞/cm2范围的细胞密度各接种3孔。从细胞接种开始经过6小时后，除去上清，用PBS洗涤，并利用0.25％胰蛋白酶/EDTA使细胞剥离。对细胞数进行计数，求出各细胞密度下粘附细胞数与接种细胞数之比。
结果如图2所示。由图2可知，涂布マトリゲル的情况下，单个人ES细胞的粘附效率与以往一样地极端低，而涂布rhLM511E8的情况下，在5×104细胞/cm2的接种密度下有约50％的细胞粘附、生存。由该结果可以认为，涂布有rhLM511E8的培养器皿中细胞接种密度的最佳值为约5×104细胞/cm2～约10×104细胞/cm2。
[实施例3：涂布有rhLM511E8或rhLM332E8的培养器皿中人ES细胞的形态观察及表面抗原分析]
将rhLM511E8或rhLM332E8用Dulbecco’s PBS进行稀释，使最终浓度达到1.5μg/cm2。将マトリゲル用DMEM-F12进行稀释，使最终浓度达到25μg/cm2。将各稀释液添加到35mm易握型(イージーグリップ)细胞培养皿(BD Falcon #353001)中，在室温下静置2小时以进行涂布。
在mTeSR1培养细胞(P1)中加入TrypLE Select，在37℃下恒温处理3分钟，使细胞分散为单个细胞。在涂布有rhLM511E8、rhLM332E8或マトリゲル的35mm易握型细胞培养皿中，以5×104细胞/cm2的细胞密度进行接种。从细胞接种开始每天进行观察，并拍摄记录形态变化。
从细胞接种开始5天后，为了进行表面抗原分析，将细胞用TrypLE Select处理3分钟，使细胞分散为单个细胞，并用工作液(0.1％BSA/PBS)进行洗涤处理。添加抗SSEA-1抗体、抗SSEA-4抗体、抗Tra-1-60抗体、抗Tra-1-81抗体、抗Tra-2-54抗体(以上均获得自Developmental Studies Hybridoma Bank，アイオワ大学)或抗GCTM-2抗体(Invitrogen)作为一抗，在4℃下染色30分钟后，用工作液进行洗涤。然后添加二抗(Beckman Coulter#731735)，在4℃下染色30分钟。用工作液将细胞洗涤两次，使用BD FACSCalibur HG测定荧光强度。
使用涂布有rhLM332E8的培养皿培养的人ES细胞的形态观察的结果如图3所示。另外，使用涂布有rhLM511E8的培养皿培养的人ES 细胞的形态观察的结果如图4所示。由图3和图4可以看出，分散为单个细胞的人ES细胞在涂布有rhLM332E8或rhLM511E8的培养皿中单独发生粘附、或者与邻近的细胞重建集落形状而发生粘附(参考图3、图4各自的上半部分，第一天)，之后，显示出旺盛的增殖(参考图3、图4各自的下半部分，第三天)。由该结果表明，如果使用涂布有rhLM332E8或rhLM511E8的培养基质，则能够提供以往不可能实现的单个分散方式的人ES细胞的培养方法。
表面抗原分析的结果如图5所示。图5中，左列为使用涂布有マトリゲル的培养皿进行培养的细胞的结果，中列为使用涂布有rhLM332E8的培养皿进行培养的细胞的结果，右列为使用涂布有rhLM511E8的培养皿进行培养的细胞的结果。由图5可以看出，表面抗原分析的结果在三者中没有差异，未分化标记(SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、Tra-2-54、GCTM2)均显示高阳性率，而分化标记(SSEA-1)均未显示阳性。由该结果表明，即使使用涂布有rhLM332E8或rhLM511E8的培养基质，也可以与以往的方法相比毫不逊色地维持人ES细胞的未分化状态。
需要说明的是，本发明并不限定于上述的各实施方式及实施例，在权利要求所示的范围内可以进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段进行适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的学术文献及专利文献的全部内容以参考的方式援引到本说明书中。