《一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用.pdf（18页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410797909.4(22)申请日 2014.12.19CGMCC No.10130 2014.12.02C12N 1/20(2006.01)C12P 19/04(2006.01)A61K 35/747(2015.01)A61K 31/715(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A23C 9/123(2006.01)C12R 1/25(2006.01)(71)申请人 北京工商大学地址 100048 北京市海淀区阜成路 11 号北京工商大学东区耕耘楼 6 层配楼乳品实验室(72)发明人 杨贞耐 王辑 田政 杨亚威郑。
2、喆(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 关畅 白艳(54) 发明名称一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用(57) 摘要本发明公开了一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用。本发明提供了一株植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum SKT109，其保藏编号为 CGMCC No.10130。上述的植物乳杆菌SKT109 在权利要求 1 所述的植物乳杆菌 SKT109和 / 或其菌悬液和 / 或其发酵液和 / 或其代谢产物在制备胞外多糖中的应用。本发明的实验证明，本发明发现了一株新的植物乳杆菌 SKT109，其可产胞外多糖，利用其制备发酵。
3、酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量，同时赋予产品良好的口感和风味，本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书10页序列表2页 附图4页(10)申请公布号 CN 104498402 A(43)申请公布日 2015.04.08CN 104498402 A1/1 页21.一 株 植 物 乳 杆 菌 Lactobacillus plantarum SKT109，其 保 藏 编 号 为 CGMCC No.10130。2.权利要求 1 所述的植物乳杆菌 SKT109 和 / 或其菌悬液和 / 。
4、或其发酵液和 / 或其代谢产物在制备胞外多糖中的应用。3.根据权利要求 2 所述的应用，其特征在于 ：所述胞外多糖具有如下 1) 和 / 或 2) 的特征 ：1) 所述胞外多糖重均分子量为 2.1106Da ；2) 所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为 3 ：1。4.权利要求 1 所述的植物乳杆菌 SKT109 和 / 或其菌悬液和 / 或其发酵液和 / 或其代谢产物在制备抑制肿瘤或抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于 ：所述肿瘤为结肠癌 ；所述肿瘤细胞为结肠癌细胞 HT-29。6.权利要求 1 所述的植物乳杆菌 SKT109 。
5、和 / 或其菌悬液和 / 或其发酵液和 / 或其代谢产物在发酵酸乳中的应用。7.一种制备胞外多糖的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的植物乳杆菌SKT109，收集发酵产物，即得到胞外多糖。8.根据权利要求 7 所述的方法，其特征在于 ：所述发酵的条件为 ：37培养 24-36h。9.由权利要求7或8中所述的方法制备的胞外多糖 ；所述胞外多糖具体具有如下1)和/或2)的特征：1) 所述胞外多糖重均分子量为 2.1106Da ；2) 所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为 3 ：1。权 利 要 求 书CN 104498402 A1/10 页3一株具有生理活性产胞外。
6、多糖植物乳杆菌及其应用技术领域0001 本发明属于生物技术领域，涉及乳品加工技术领域，尤其涉及一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌及其应用。背景技术0002 乳酸菌胞外多糖 (Exopolysaccharides，EPSs) 是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到胞外的荚膜多糖或黏液多糖。乳酸菌胞外多糖作为一种新兴的天然食品级添加剂，具有使用安全的天然优势。在食品加工领域，乳酸菌胞外多糖具有重要的工艺学功能，包括改善发酵乳、干酪及多数乳制品的流变学特性、质构、口感以及风味等。乳酸菌胞外多糖可以提高菌体对胃肠道表面的非特异性粘附能力，改善肠道菌群结构，保护菌体抵抗外界不利环境，促进菌体对金属离子的吸附以。
7、及预防噬菌体的侵染等作用。在生物学活性方面，乳酸菌胞外多糖具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降胆固醇、降血压等作用。0003 近年来，部分具有特定生物活性的产胞外多糖嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌作为附属发酵剂已成功应用于发酵乳制品生产中，并取得了良好的经济效益。植物乳杆菌为革兰氏阳性菌，通常作为附属发酵剂与主发酵剂合并制备发酵乳。植物乳杆菌作为乳酸菌中的一员在我国传统食品中有着广泛的来源。近年来我国学者已从发酵蔬菜制品、发酵乳制品及肉制品中筛选出多株具有良好益生特性及功能特性的植物乳杆菌。虽然植物乳杆菌的胞外多糖产量普遍较低，但作为天然的增稠剂，不仅能改善乳制品的质地，同时还会赋。
8、予产品独特的风味，深受消费者的青睐。0004 然而，从目前国内来看，研究成熟并且能够在实践中推广应用的产胞外多糖植物乳杆菌菌株并不是很多。因此，开展产胞外多糖植物乳杆菌的研究，尤其是开展对提高植物乳杆菌胞外多糖产量方法研究、胞外多糖理化及生物活性的分析及产胞外多糖植物乳杆菌在发酵乳中的应用研究，对于改善发酵乳品质、开发具有特定功能性的乳酸菌发酵乳制品，具有十分重要的研究价值和经济价值。发明内容0005 本发明的一个目的是提供一株具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌Lactobacillus plantarum SKT109。0006 本发明提供的植物乳杆菌 Lactobacillus planta。
9、rum SKT109，其保藏编号为CGMCC No.10130。0007 上述的植物乳杆菌 SKT109 和 / 或其菌悬液和 / 或其发酵液和 / 或其代谢产物在制备胞外多糖中的应用也是本发明保护的范围。0008 上述应用中，所述胞外多糖具有如下 1) 和 / 或 2) 的特征 ：0009 1) 所述胞外多糖重均分子量为 2.1106Da ；0010 2) 所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为3 ：1 。说 明 书CN 104498402 A2/10 页40011 上述的植物乳杆菌 SKT109 和 / 或其菌悬液和 / 或其发酵液和 / 或其代谢产物在制备抑。
10、制肿瘤或抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用。0012 上述应用中，所述肿瘤为结肠癌 ；所述肿瘤细胞为结肠癌细胞 HT-29。0013 上述的植物乳杆菌 SKT109 和 / 或其菌悬液和 / 或其发酵液和 / 或其代谢产物在发酵酸乳中的应用。0014 上述应用中，所述植物乳杆菌 SKT109 以 SKT109 发酵剂的形式存在 ；0015 所述 SKT109 发酵剂按照如下方法制备 ：发酵上述的植物乳杆菌 SKT109，收集发酵产物，离心收集沉淀 ；将所述沉淀与冻干保护剂按照体积比为 1:2 混匀，冷冻干燥，得到SKT109 发酵剂 ；0016 所述 SKT109 发酵剂中植物乳杆菌 SKT109 。
11、的活菌数浓度为 1010cfu/g ；0017 所述冻干保护剂由质量百分含量 11脱脂乳粉、质量百分含量 3甘油、质量百分含量 1谷氨酸钠、质量百分含量 1乳糖及质量百分含量 84水组成。0018 本发明的另一个目的是提供一种制备胞外多糖的方法。0019 本发明提供的方法，包括如下步骤 ：发酵上述的植物乳杆菌 SKT109，收集发酵产物，即得到胞外多糖。0020 上述方法中，所述发酵的条件为 ：37培养 24-36h。0021 上述方法中，在所述收集发酵产物的步骤后，还包括如下步骤 ：0022 1) 用三氯乙酸加入所述发酵产物的上清至其质量体积百分比为 6，混匀，收集上清液 A ；0023 2。
12、) 用 95乙醇水溶液加入所述上清液 A，混匀，收集沉淀 ；0024 3) 溶解所述沉淀后进行透析，得到胞外多糖。0025 由上述的方法制备的胞外多糖也是本发明保护的范围 ；所述胞外多糖具体具有如下1)和/或2)的特征：0026 1) 所述胞外多糖重均分子量为 2.1106Da ；0027 2) 所述胞外多糖组分包括果糖和葡萄糖，所述果糖和所述葡萄糖的物质摩尔比为3 ：1 。0028 菌株SKT109于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC，地址 ：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏号为。
13、 CGMCC No.10130，该菌株分类命名为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)。0029 本发明的实验证明，本发明发现了一株新的具有生理活性植物乳杆菌 SKT109，其可产胞外多糖，利用其制备发酵酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量，同时赋予产品良好的口感和风味，本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。附图说明0030 图 1 为本发明具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌 SKT109 的细胞形态0031 图 2 为本发明具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌 SKT109 在 SDM 培养基中 37培养 56h 期间的活菌数、发酵液粘度、pH 及胞外多糖产量变化情况0032 。
14、图3为本发明植物乳杆菌SKT109胞外多糖粗品分别在DEAE-52阴离子交换柱(A)说 明 书CN 104498402 A3/10 页5和 Sepharose CL-6B 琼脂糖凝胶柱 (B) 上的洗脱曲线 ；0033 其中纵坐标为经过苯酚 - 硫酸法测得的在 490nm 处的吸光度值，横坐标为管号0034 图 4 为本发明植物乳杆菌 SKT109 胞外多糖纯品的体外抑制结肠癌细胞 HT-29 增殖0035 图 5 为利用具有生理活性产胞外多糖植物乳杆菌 SKT109 制备的发酵酸乳与对照组发酵酸乳在 4冷藏 21 天期间的活菌数、胞外多糖含量、pH 及持水力的变化0036 图 6 为利用具有。
15、生理活性产胞外多糖植物乳杆菌 SKT109 制备的发酵酸乳 (A) 与对照组发酵酸乳 (B) 在 4冷藏期第 1 天时的风味离子图 ；0037 图中标号与表 3 中化合物序号相对应0038 图 7 为葡萄糖为基准物质的多糖标准曲线具体实施方式0039 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0040 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0041 下述实施例中所用培养基的制备方法如下 ：0042 还原脱脂乳培养基 (RSM)：将脱脂乳粉按照 110g/L 用水还原成脱脂乳培养基，115灭菌 15min，冷却备用。0043 SDM 液体培养基 (1L)。
16、 ：胰蛋白胨 10.0g、YNB( 酵母氮源 )6.7g、K2HPO42.0g、无水乙酸钠 5.0g、柠檬酸钠 5.0g、MgSO47H2O 0.2g、MnSO4H2O 0.05g、葡萄糖 20.0g、吐温 801mL、1mol/L 乙酸调 pH6.6，121灭菌 15min，冷却备用。0044 植物乳杆菌选择性琼脂培养基 (1L) ：蛋白胨 10.0g、酵母粉 5.0g、牛肉膏 10.0g、D- 山梨醇 20.0g、无水乙酸钠 5.0g、柠檬酸铵 2.0g、磷酸钾 2.0g、硫酸镁 0.1g、硫酸锰0.05g、溴甲酚紫 0.02g、环丙沙星 0.004g( 过滤除菌 )、琼脂粉 15.0g，。
17、蒸馏水 1000mL，1mol/L 乙酸调 pH6.0，121灭菌 15min，冷却备用。0045 实施例 1、菌株的分离和鉴定0046 一、菌株的分离0047 本发明从中国传统发酵制品西藏灵菇中分离筛选菌株。将西藏灵菇接种至 RSM中，于 42培养 8h 至凝乳凝固。取 0.5mL 凝乳加入含 4.5mL 灭菌生理盐水的试管中逐级稀释涂布于 SDM 培养基平板，37培养 24 36h。挑取表面光滑、边缘整齐的乳白色单菌落，将挑选出的菌落进行反复划线培养获得纯化的菌株。将纯化后的菌株依次经过过氧化氢酶实验、革兰氏染色，筛选出氧化氢酶阴性、革兰氏阳性菌株。将其接种到 SDM 液体培养基中培养后，。
18、加入 20甘油， 80冰箱保存备用。0048 采用苯酚硫酸法测定多株纯培养菌株胞外多糖的产量，筛选出一株胞外多糖产量高的菌株，将其命名为 SKT109。0049 上述苯酚硫酸法测定菌株胞外多糖产量的方法如下 ：0050 1) 葡萄糖标准曲线的绘制0051 取适量分析纯葡萄糖置于鼓风干燥箱中 80干燥 2h，冷却后准确称取葡萄糖100mg 于 500mL 容量瓶中，加水至刻度。反应体系各溶液体积按表 1 添加，先将标准葡萄糖溶液加入到具塞刻度试管中，再加入 6的苯酚溶液，最后加入 10mL 浓硫酸混匀静置，待其说 明 书CN 104498402 A4/10 页6冷却后于 490nm 处测定吸光值。
19、，每组做 3 个平行。以葡萄糖含量 (mg/L) 为横坐标，吸光度(A490) 为纵坐标绘制标准曲线，见表 1。0052 表 1 为苯酚 - 硫酸法标准曲线绘制0053 0054 采用苯酚-硫酸法绘制的标准曲线如图7所示，标准曲线公式为：Y0.0087X+0.0232，R2 0.9994。式中 ：Y 为波长为 490nm 处的吸光度 A，X 为溶液中胞外多糖质量浓度 (mg/L)。0055 二、菌株的鉴定0056 1、形态特征0057 将步骤一分离获得的菌株SKT109在SDM培养基平板上进一步划线分离，37培养24h。0058 观察菌株形态，如图 1 所示，菌株生长良好。菌落为圆形，凸起，边。
20、缘整齐，颜色乳白，挑取拉丝，不透明，表面湿润光滑。菌落呈短杆状，不产芽孢，不运动。0059 2、生理生化试验0060 将步骤一获得的菌株 SKT109 为 H2O2酶试验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，需氧或兼性厌氧生长。0061 3、糖发酵试验鉴定0062 挑取少许菌株 SKT109 培养物，接入 API 50CH 液体培养基 ( 生物梅里埃中国有限公司，API50CH Medium) 中制成菌悬液，接入 API 50CH 鉴定试剂条 ( 生物梅里埃中国有限公司 )，37培养 48h，记录菌株对 49 种碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件 API LAB PLUS，。
21、反应结果如表 2 所示。经数据库查询，菌株 SKT109 与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具有99.8的相似性，因此将菌株SKT109初步鉴定为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)。0063 表 2. 菌株 SKT109 碳源利用结果0064 说 明 书CN 104498402 A5/10 页70065 0066 注 ：“+”反应阳性 ；“-”反应阴性。说 明 书CN 104498402 A6/10 页80067 4、16S rDNA 分子鉴定0068 将菌株 SKT109 按体积比 3的接种量接种于 SDM 培养基中，37培养 24h，。
22、收集沉淀。采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒 ( 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 ) 提取菌株的基因组 DNA。DNA 片段扩增 ：采用乳酸菌 16S rDNA 基因的通用引物，正向引物 ：A27F 5 -AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3，反向引物 ：A1495R 3 -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5，1.5琼脂糖凝胶电泳，目标片段长度约1500bp。PCR 产物委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序，菌株 SKT109 的 16S rDNA 基因的核苷酸序列为序列表中序列 1。
23、，其与已报道的植物乳杆菌 M10-1(Genbank acc.No.KF030756.1) 和 WCFS1(Genbank acc.No.NR075041.1) 序列同源性达 99。0069 综合上述结果，菌株 SKT109 被鉴定为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)。0070 菌株SKT109于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC，地址 ：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏号为 CGMCC No.10130，该菌株分类命名为植物乳杆菌 (Lactobaci。
24、llus plantarum)。0071 实施例 2、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)SKT109 在产胞外多糖中的应用0072 一、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)SKT109 产胞外多糖检测0073 1、菌株活化0074 将实施例 1 中的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)SKT109CGMCC No.10130按体积比为3接种于SDM培养液中，37下培养16h进行活化，连续活化2代，获得活化培养液。0075 2、产胞外多糖0076 将步骤1获得的植物乳杆菌(Lactobacillus plantaru。
25、m)SKT109活化液按体积比为 3的接种量接种于 SDM 培养基中，37培养 56h，每隔 8h 测定培养液的活菌数及胞外多糖含量。0077 绘制SKT109的生长曲线及胞外多糖产量曲线，结果如图2所示，植物乳杆菌SKT109 在 16h 进入稳定期，此时的活菌数浓度为 109cfu/mL，胞外多糖产品为 58mg/L( 培养液 )，培养液粘度为 15cp。0078 二、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)SKT109 胞外多糖的制备0079 1、粗多糖的提取0080 将上述一的 1 制备的 SKT109 活化培养液 ( 培养液 ) 按体积比为 3的接种量接种于 S。
26、DM 培养基，于 37培养 24h 得发酵液，所得发酵液在 95加热 30min，冷却至室温，8000g，4离心 15min，收集上清液并向上清液中加入三氯乙酸至终浓度为 6，室温搅拌 3h，离心收集上清液，向上清液中加入 2 倍体积的体积分数为 95的乙醇水溶液，4静置 16h，10000g，4离心 45min 收集沉淀，沉淀用去离子水充分溶解后透析 48h，每 8h 换一次水，透析截留液经真空冷冻干燥，得到植物乳杆菌胞外多糖的粗品。0081 2、胞外多糖的纯化0082 采用 DEAE-52 阴离子交换层析柱 ( 柱体积 ：26mm40mm、上样量 ：5mL，10 20mg/mL) 对步骤 。
27、1 所得的胞外多糖粗品进行分离纯化，进行阶梯段梯度洗脱，洗脱方式为 ：先说 明 书CN 104498402 A7/10 页9用去离子水以洗脱速度为 1mL/min 洗脱 150min、再用 0.2mol/L 氯化钠水溶液以洗脱速度为 1mL/min 洗脱 150min、最后用 0.5mol/L 的氯化钠水溶液以洗脱速度为 1mL/min 下洗脱150min，收集去离子水洗脱出峰管的洗脱液，去离子水中透析 48h，每 8h 换一次水，透析截留液经真空冷冻干燥，得到植物乳杆菌胞外多糖的初级纯品 ( 图 3A)。0083 采 用 Sepharose CL-6B 琼 脂 糖 凝 胶 层 析 柱 ( 柱。
28、 体 积 ：25mm50mm、上 样量 :2mL,2mg/mL) 对上述所得的胞外多糖初级纯品进行分离纯化，洗脱液为 0.9的氯化钠水溶液，洗脱速度为 0.5mL/min，收集出峰管的洗脱液，去离子水中透析 48h，每 8h 换一次水，透析截留液经真空冷冻干燥，得到植物乳杆菌胞外多糖的纯品 ( 图 3B)。0084 三、植物乳杆菌 SKT109 胞外多糖的理化特性分析0085 1、胞外多糖分子量的测定0086 将上述二收集得到的胞外多糖纯品采用凝胶渗透色谱 (GPC) 联用多角度激光光散射 (MALLS) 法测定重均分子量 (Mw)。0087 测试条件 ：凝胶渗透色谱柱(Shodex SB-8。
29、06m-HQ，8.0mm ID300mm L)，配备DAWN HELEOS-II Wyatt多角度激光光散射仪和Optilabwyatt示差折光检测器 ；流速0.5mL/min ；流动相，0.1M 的 NaNO3；进样体积 200L ；柱温 40 ；比折光指数增量 (dn/dc)0.147。0088 结果植物乳杆菌 SKT109 胞外多糖的重均分子量为 2.1106Da。0089 2、胞外多糖的单糖组成测定0090 (1) 多糖的水解0091 将上述二收集得到的胞外多糖纯品5mg加入2mL 2M的三氟乙酸，置于安培瓶中封口，120水解 2h，水解液减压蒸干后，再加入少量甲醇减压蒸干，重复 3 。
30、次，以除去残留的三氟乙酸，加少量水溶解，经冷冻干燥，得到完全水解的单糖样品。0092 (2) 衍生0093 采用三甲基硅醚法对单糖样品进行衍生。向上述的多糖水解样品中加入 1mL 嘧啶、0.4mL 六甲基二硅氮烷和 0.2mL 的三甲基氯硅烷，80下反应 30min，反应结束后加入1.5mL 蒸馏水并震荡，待溶液分层后，1000rpm/min 离心 10min，取上层嘧啶层进行气相色谱分析。0094 (3) 色谱条件0095 色谱柱 HP-5(5 Phenyl Methyl SiloxaneCapillary,30m0.32mm0.25m) ；柱温 210 ；进样口温度 250 ；氢火焰离子检。
31、测器 (FID) ；检测器温度 250 ；载气 N2。程序升温为 ：起始温度 100维持 5min，以 5 /min 升至 150，并于 150维持 5min，最后以5 /min 升至 240，并于 240维持 1min ；采用不分流进样，进样量为 1L。0096 结果植物乳杆菌 SKT109 胞外多糖主要由果糖和葡萄糖组成，两者的物质摩尔比为3：1。0097 实施例 3、植物乳杆菌 SKT109 胞外多糖的体外抗肿瘤活性测定0098 1、HT-29 细胞培养0099 在无菌培养瓶中加入含 10热灭活胎牛血清和 Sigma 抗真菌溶液 ( 青霉素 100U/mL、链霉素 100g/mL、两性霉。
32、素 B 0.25g/mL) 的 DMEM 完全培养液，于 37、5 CO2、相 对湿度 RH 90的培养箱中培养 HT-29 细胞 ( 中国医学科学院肿瘤医院细胞库 )，每天换 1 次培养液。待细胞贴壁生长为单层后，用0.25胰酶消化，重悬于DMEM完全培养液中，血球计说 明 书CN 104498402 A8/10 页10数板测定细胞浓度，将细胞浓度调整为 2105/mL。0100 2、MTT 法检测胞外多糖对 HT-29 细胞增值的影响0101 将步骤1中调整好的浓度为2105/mL的结肠癌细胞HT-29细胞加入到96孔板中(每孔100L)，培养24h后，分别加入含有不同浓度(50、100、。
33、200、400和600mg/mL)的预先用DMEM配制好的实施例2的二收集得到的胞外多糖培养液，继续分别培养24h、72h。当达到每个处理的时间点时，每孔加入 10L 的 MTT 试剂 (5.0mg/mL)，继续培养 4h。弃掉上清液，每孔加入 100L 的 DMSO 试剂，溶解已形成的结晶甲蜡后，用酶标仪测定吸光度 (570nm)。选用 5- 氟尿嘧啶 (5-Fu) 为阳性对照。0102 抑制率 ( ) 1-(A样品-A空白)/(A对照-A空白)1000103 式 中 ：A样品代表有样品的吸光度值 ；A空白代表无细胞的吸光度值 ；A对照代表无样品的吸光度值。0104 结果如图 4 所示，可以。
34、看出，肿瘤细胞 HT-29 经植物乳杆菌 SKT109 胞外多糖处理后，其增殖受到明显抑制，且随着胞外多糖浓度的升高，抑制率也在逐渐增加 ；处理 24h 时，抑制率由 24.7增加到 45.1 ；处理 72h 后，抑制率由 23.4增加到 46.5。0105 实施例 4、产胞外多糖植物乳杆菌 SKT109 直投式发酵剂在发酵酸乳中的应用0106 一、产胞外多糖植物乳杆菌 SKT109 直投式发酵剂的制备0107 将上述实施例 2 的一制备的收集得到的 SKT109 活化培养液按体积比为 3的接种量接种于 SDM 培养液中，37条件下培养 24h，4条件下 5000rpm/min 离心 15mi。
35、n，得到离心沉淀物，按离心沉淀物体积 2 倍添加冻干保护剂 ( 离心沉淀物和冻干保护剂体积比为1:2)，在无菌条件下混合均匀，冷冻干燥，得到 SKT109 直投式发酵剂，SKT109 直投式发酵剂中植物乳杆菌 SKT109 的活菌数浓度为 1010cfu/g。0108 上述保护剂由质量百分含量 11脱脂乳粉、质量百分含量 3甘油、质量百分含量 1谷氨酸钠、质量百分含量 1乳糖及质量百分含量 84水组成。0109 二、发酵酸乳制备及检测0110 1、发酵酸乳的获得0111 实验设实验组和对照组，每组重复 3 次，具体如下 ：0112 (1) 实验组0113 将原料乳鲜奶 ( 未经过任何处理的新鲜。
36、牛奶 ) 在 95加热灭菌 20min 后，冷却至42；将上述一制备的 SKT109 直投式发酵剂按鲜奶量的 0.1 ( 质量百分含量 ) 加入原料乳鲜奶中，再将商业发酵乳直投式发酵剂(Danisco，商品编号YO-MIX)按鲜奶量的0.006( 质量百分含量 ) 也加入原料乳鲜奶中，42发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.6，pH 达到 4.5，4冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳 A。0114 (2) 对照组0115 将原料乳鲜奶 ( 未经过任何处理的新鲜牛奶 ) 在 95加热灭菌 20min 后，冷却至42；将商业发酵乳直投式发酵剂 (Danisco，商品编号 YO-MIX) 按鲜奶量的 0.006加入所述原料乳鲜奶中，42发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为 0.6，pH 达到 4.5，4冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳 B。0116 2、发酵酸乳的检测0117 分别检测步骤 1 获得的实验组和对照组发酵酸乳 A 和 B 在冷藏的第 1 天 ( 即温度说 明 书CN 104498402 A。