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1、10申请公布号CN104162169A43申请公布日20141126CN104162169A21申请号201410443946522申请日20140902A61K47/48200601A61K31/58200601A61K31/704200601A61K9/113200601A61P35/0020060171申请人国家纳米科学中心地址100190北京市海淀区中关村北一条11号72发明人陈春英吴雁周会鸽胡克磊刘颖74专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332代理人巩克栋侯桂丽54发明名称一种药物组合物及其制备方法和用途57摘要一种药物组合物及其制备方法，该药物组合物包括载体和负载在该载体上的。
2、活性成分，所述载体为结构式如下式1所示的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子，式1中N为1630的整数，Y与X的比例范围为131，Y为153549的整数，X为73385的整数。本发明的药物组合物能够实现定向输送，使药物在细胞内快速释放，提高药效。51INTCL权利要求书4页说明书18页附图10页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书18页附图10页10申请公布号CN104162169ACN104162169A1/4页21一种药物组合物，其包括载体和负载在该载体上的活性成分，其特征在于，所述载体为结构式如下式1所示的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物式1。
3、中N为1630的整数，Y与X的比例范围为131，Y为153549的整数，X为73385的整数。2根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，所述透明质酸的重均分子量为660012000DA；优选地，所述聚乳酸羟基乙酸的重均分子量为2000050000DA。3根据权利要求1或2所述的聚合物，其特征在于，所述透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400370000DA；优选地，所述透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的粒径为190280NM；优选地，所述活性成分为阿霉素和/或环巴胺；优选地，所述活性成分与透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的质量比为120100，优选为310100。4。
4、一种权利要求13任一项所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤A在第一有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和聚乳酸羟基乙酸接触，得到式3所示的酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物；式3中Y与X的比例为131，Y为153549的整数，X为73385的整数；B在有机胺的存在下，在第二有机溶剂中，使步骤A所得的酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物和胱氨接触，得到由式4所示的胱氨聚乳酸羟基乙酸；权利要求书CN104162169A2/4页3式3中Y与X的比例范围为131，Y为153549的整数，X为73385的整数；C在第三有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和透明质酸接触，得到活化的透明质酸溶液；D在有机胺的存在下，。
5、将步骤B所得产物与步骤C所得活化的透明质酸溶液接触，得到式1所示的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物；式1中N为1630的整数，Y与X的比例为131，Y为153549的整数，X为73385的整数；E当活性成分均为脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使活性成分、步骤D所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入水制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；当活性成分均为非脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使步骤D所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入活性组分的水溶。
6、液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；当活性成分同时含有脂溶性和非脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使脂溶性活性成分、步骤D所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入非脂溶性活性成分的水溶液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物。5根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤A所述聚乳酸羟基乙酸一端为羧基，另一端酯封；优选地，所述聚乳酸羟基乙酸的分子量为2000050000DA；权利要求书CN10。
7、4162169A3/4页4优选地，所述聚乳酸羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比131；优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺和/或N,N二环己基碳二亚胺；优选地，所述的酰化活化剂为N羟基琥珀酰亚胺和/或1羟基苯并三唑；优选地，所述第一有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿；优选地，所述碳二亚胺缩合剂和酰化活化剂摩尔比为151；优选地，所述碳二亚胺缩合剂和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比为261；优选地，相对于1G聚乳酸羟基乙酸，所述第一有机溶剂的用量为210ML；优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；优选地，所述接触的温度为2040，接触的时间为24小时；优。
8、选地，步骤A还包括将所得反应粗产物酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物中的第一有机溶剂去除，然后将所述产物酯化聚乳酸羟基乙酸沉淀出来，得到粘稠状产物，再将所得产物洗涤后真空干燥；优选地，所述沉淀使用乙醚进行，优选使用冷却的乙醚；优选地，所述洗涤使用乙醚/甲醇混合溶液进行，乙醚和甲醇的体积比没有特别的限定，但是优选使用体积比为191的乙醚/甲醇混合溶液；优选地，所述真空干燥的温度为2030；真空干燥的时间为2448小时。6根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤B中所述有机胺为N,N二异丙基乙胺和/或三乙胺；优选地，所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N二甲基甲酰胺；优选地，所述胱氨和所述酯化聚乳酸。
9、羟基乙酸聚合物的摩尔比2101；优选地，相对于1G步骤A得到的酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为00515ML，所述第二有机溶剂的用量为510ML；优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；优选地，所述接触的温度为2040，接触的时间为1224小时；优选地，步骤B中还包括将所得胱氨聚乳酸羟基乙酸从第二有机溶剂中沉淀出来，再将所得固体产物洗涤后真空干燥；优选地，所述沉淀剂洗涤使用水进行，优选使用蒸馏水；优选地，所述真空干燥的温度为2030；真空干燥的时间为2448小时。7根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤C中所述透明质酸的重均分子量为6600。
10、12000DA；优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺和/或N,N二环己基碳二亚胺；优选地，所述的酰化活化剂为N羟基琥珀酰亚胺和/或1羟基苯并三唑；优选地，所述第三有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N二甲基甲酰胺；优选地，所述碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和透明质酸摩尔比为55140401；优选地，相对于1G所述透明质酸，所述第三有机溶剂的用量为530ML；优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；优选地，所述接触的温度为2040，接触时间为24小时。权利要求书CN104162169A4/4页58根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤D中所。
11、述胱氨聚乳酸羟基乙酸和所述酯化透明质酸的质量比481；优选地，相对于1G胱氨聚乳酸羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为00215ML；优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行；优选地，所述接触的温度为2040，接触的时间为1224小时；优选地，步骤D中还包括将所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物产物溶液放入透析袋中透析；优选地，所述透析在2035的蒸馏水中透析2472小时。9根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤E中所述第四有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿；优选地，所述表面活性剂为聚乙烯醇和/或聚乙二醇聚丙二醇嵌段聚合物；优选地，所述活性成分与透明质酸胱胺。
12、聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的质量比为120100，优选为310100；优选地，所述表面活性剂的水溶液中的表面活性剂浓度为024WT；优选地，相对于1MG所述透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物，所述表面活性剂的水溶液或非脂溶性活性成分的水溶液或水的用量为0255ML，所述第四有机溶剂的用量为051ML；优选地，所述初乳或复乳的制备通过超声进行。10权利要求13任一项所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述药物组合物用于抗肿瘤药物的制备。权利要求书CN104162169A1/18页6一种药物组合物及其制备方法和用途技术领域0001本发明属于药物领域，特别涉及一种药物组合物及其制备方法和用途。背景技。
13、术0002小分子药物如阿霉素、环巴胺等没有靶向性，不能识别肿瘤组织和细胞，这就降低了它们的药效，也增加了副作用。同时，某些药物有很好的疗效，但由于水溶性差如环巴胺，很难被人体有效吸收，导致药效难以充分发挥，对它们在临床上的应用造成一定影响。0003环巴胺CYCLOPAMINE，简称CYC是一种异甾体类生物碱，对HEDGEHOG通路有抑制作用，对多种肿瘤有治疗作用，尤其对肿瘤干细胞抑制作用很明显，但是对其他肿瘤细胞基本没有抑制现象，其水溶性很差。阿霉素DOXORUBICIN，简称DOX是一种广谱抗癌的化学药物，其盐酸盐形式水溶性很好，在临床上用于治疗多种癌症，乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、。
14、甲状腺癌、前列腺癌等。但是这两种小分子药物不能同时使用而发挥药效，在生物体内都不能靶向聚集到病灶，应用时不仅用量大，而且会产生多种不良免疫反应，给病人带来极大的痛苦。0004为了解决以上问题，研究能够靶向癌细胞，联合用药，同时在癌细胞内快速释放发挥药效的载药体系成为人们关心的热点。理想的剂型应具有剂量小、毒性小、副作用小、靶向缓释等特点，而两亲性聚合物纳米粒子恰好能满足这样的要求。给聚合物接上具有靶向能力的分子，同时，两亲性聚合物在水包油包水双乳化溶剂蒸发法W/O/W中能形成水包油包水的双层纳米结构，在其最里层的亲水内核中可以包载亲水性药物，在中间疏水层可以包载疏水性药物，最外的亲水层可以保证。
15、纳米粒子在水相中的溶解度和稳定性。纳米粒子通过内吞作用进入癌细胞后，可以通过设计载体对周围环境的改变，在细胞内快速释放药物，如氧化还原响应。发明内容0005本发明的目的之一在于针对肿瘤细胞的特点，提供一种联合用药，靶向输送，氧化还原响应的药物组合物。0006为达上述目的，本发明采用如下技术方案0007一种药物组合物，其包括载体和负载在该载体上的活性成分，所述载体为结构式如下式1所示的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物0008说明书CN104162169A2/18页70009式1中N为1630的整数，Y与X的比例范围为131，Y为153549的整数，X为73385的整数；透明质酸和聚乳酸羟基乙。
16、酸之间用小分子2胱氨链接，00100011本发明提供的载体透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物解决了活性成分如环巴胺等某些药物水溶性差的问题，也解决了药物载体不具有主动靶向，无法对细胞内外环境响应的问题，可以将传统的化疗药物如阿霉素和治疗肿瘤干细胞的新药如环巴胺联合使用，并且由于本发明中的纳米粒子具有主动靶向作用、良好的生物相容性和溶解性、对细胞内外的氧化还原环境进行响应的特点，所以能够实现定向输送，使药物在细胞内快速释放，提高药效。0012根据本发明的药物组合物，所述透明质酸重均分子量为660012000DA，例如为7000DA、8500DA、10000DA、11500DA等。0013根据本。
17、发明的药物组合物，所述聚乳酸羟基乙酸重均分子量为2000050000DA，例如为22000DA、35000DA、43000DA等。0014根据本发明的药物组合物，所述透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400370000DA。0015优选地，所述透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物能够形成粒径为180280NM的纳米粒子。0016根据本发明的药物组合物，所述活性成分为阿霉素和/或环巴胺。0017优选地，所述活性成分与透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的质量比为120100，优选为310100。0018本发明的目的之一还在于提供本发明所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤0。
18、019A在第一有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和聚乳酸羟基乙酸接触，得到式3所示的酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物；0020说明书CN104162169A3/18页80021式3中Y与X的比例为131，Y为153549的整数，X为73385的整数；由于聚乳酸羟基乙酸的端羧基在碳二亚胺缩合剂如1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺或N,N二环己基碳二亚胺活化下生成不稳定的活性中间体，若不用酰化活化剂转化为相应的活性酯或活性酰胺，其自身易成脲；所以在反应体系中加入一定比例的酰化活化剂如N羟基琥珀酰亚胺或1羟基苯并三唑，可生成稳定的活性酯或活性酰胺；0022B在有机胺的存在下，在第二有机溶剂中，使步骤A所得。
19、的酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物和胱氨接触，得到由式4所示的胱氨聚乳酸羟基乙酸；00230024式3中Y与X的比例范围为131，Y为153549的整数，X为73385的整数；0025C在第三有机溶剂中，使碳二亚胺缩合剂，酰化活化剂和透明质酸接触，得到活化的透明质酸溶液；0026D在有机胺的存在下，将步骤B所得产物与步骤C所得活化的透明质酸溶液接触，得到式1所示的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物；0027说明书CN104162169A4/18页90028式1中N为1630的整数，Y与X的比例为131，Y为153549的整数，X为73385的整数；透明质酸和聚乳酸羟基乙酸之间用小分子2胱氨链接。00。
20、290030E当活性成分均为脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使活性成分、步骤D所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入水制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；0031当活性成分均为非脂溶性药物时，则在第四有机溶剂中，使步骤D所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入活性组分的水溶液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物；0032当活性成分同时含有脂溶性和非脂溶性药物时，则。
21、在第四有机溶剂中，使脂溶性活性成分、步骤D所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶于第四有机溶液中，然后加入非脂溶性活性成分的水溶液制得油包水的初乳；然后向制得的油包水的初乳中加入表面活性剂的水溶液制得水包油包水的复乳；除去第四有机溶剂即得所述药物组合物。0033根据本发明的制备方法，步骤A所述聚乳酸羟基乙酸一端为羧基，另一端酯封。0034优选地，所述聚乳酸羟基乙酸的分子量为2000050000DA。0035优选地，所述聚乳酸羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比131。0036优选地，所述的碳二亚胺缩合剂为1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺和/或N,N二环己基碳二亚胺。0037优选地，所述的酰化活化。
22、剂为N羟基琥珀酰亚胺和/或1羟基苯并三唑。0038优选地，所述第一有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿。0039优选地，所述碳二亚胺缩合剂和酰化活化剂摩尔比为151。说明书CN104162169A5/18页100040优选地，所述碳二亚胺缩合剂和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比为261。0041优选地，相对于1G聚乳酸羟基乙酸，所述第一有机溶剂的用量为210ML。0042优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。0043优选地，所述接触的温度为2040，接触的时间为24小时。0044优选地，步骤A还包括将所得反应粗产物酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物中的第一有机溶剂去除，然后将所述产物酯。
23、化聚乳酸羟基乙酸沉淀出来，得到粘稠状产物，再将所得产物洗涤后真空干燥。0045优选地，所述沉淀使用乙醚进行，优选使用冷却的乙醚。0046优选地，所述洗涤使用乙醚/甲醇混合溶液进行，乙醚和甲醇的体积比没有特别的限定，但是优选使用体积比为191的乙醚/甲醇混合溶液。0047优选地，所述真空干燥的温度为2030；真空干燥的时间为2448小时。0048根据本发明的制备方法，步骤B中所述有机胺为N,N二异丙基乙胺和/或三乙胺。0049优选地，所述第二有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N二甲基甲酰胺。0050优选地，所述胱氨和所述酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物的摩尔比2101。0051优选地，相对于1G步骤A得到的。
24、酯化聚乳酸羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为00515ML，所述第二有机溶剂的用量为510ML。0052优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。0053优选地，所述接触的温度为2040，接触的时间为1224小时。0054优选地，步骤B中还包括将所得胱氨聚乳酸羟基乙酸从第二有机溶剂中沉淀出来，再将所得固体产物洗涤后真空干燥。0055优选地，所述沉淀剂洗涤使用水进行，优选使用蒸馏水。0056优选地，所述真空干燥的温度为2030；真空干燥的时间为2448小时。0057根据本发明的制备方法，步骤C中所述透明质酸的重均分子量为660012000DA。0058优选地，所述。
25、的碳二亚胺缩合剂为1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺和/或N,N二环己基碳二亚胺。0059优选地，所述的酰化活化剂为N羟基琥珀酰亚胺和/或1羟基苯并三唑。0060优选地，所述第三有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N二甲基甲酰胺。0061优选地，所述碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和透明质酸摩尔比为55140401。0062优选地，相对于1G所述透明质酸，所述第三有机溶剂的用量为530ML。0063优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。0064优选地，所述接触的温度为2040，接触时间为24小时。0065根据本发明的制备方法，步骤D中所述胱氨聚乳酸羟基乙酸和所述酯化透明质酸。
26、的质量比481。0066优选地，相对于1G胱氨聚乳酸羟基乙酸聚合物，所述有机胺的用量为说明书CN104162169A106/18页1100215ML。0067优选地，所述接触在惰性气氛如氮气、零族气氛等下进行，优选在氮气气氛中进行。0068优选地，所述接触的温度为2040，接触的时间为1224小时。0069优选地，步骤D中还包括将所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物产物溶液放入透析袋中透析。0070优选地，所述透析在2035的蒸馏水中透析2472小时。透析后的产物可在烘箱如真空箱中进行干燥，如在2040的真空箱中干燥10小时以上，如1248小时。0071制得的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝。
27、聚合物纳米粒子可以冻干保存。0072根据本发明的制备方法，步骤E中所述第四有机溶剂为二氯甲烷和/或氯仿。0073优选地，所述表面活性剂为聚乙烯醇和/或聚乙二醇聚丙二醇嵌段聚合物。0074优选地，所述活性成分与透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的质量比为120100，优选为310100。其中，所述的活性成分指的是用于本发明的药物组合物的所有的活性成分。0075优选地，所述表面活性剂的水溶液中的表面活性剂浓度为024WT。0076优选地，相对于1MG所述透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物，所述表面活性剂的水溶液或非脂溶性活性组分的水溶液或水的用量为0255ML，所述第四有机溶剂的用量为051M。
28、L。0077优选地，所述初乳或复乳的制备通过超声进行。0078以1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺为碳二亚胺缩合剂，N羟基琥珀酰亚胺为酰化活化剂合成透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物为例，步骤A到步骤D的反应路线如下所示00790080说明书CN104162169A117/18页1200810082说明书CN104162169A128/18页130083本发明的目的之一还在于提供所述药物组合物用于抗肿瘤药物的制备中的用途。0084本发明的药物组合物采用水包油包水双乳化溶剂蒸发法W/O/W制备，可直接使用透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物作为载体形成水包油包水的双层结构。因此其所形成纳米粒子的亲。
29、水内核可以负载亲水性的药物，中间疏水层可负载水溶性差的药物，避免了繁琐和复杂的修饰步骤，操作过程方便，降低生产成本，利于推广。且制备的载药纳米粒子为单分散的规则球体，粒径控制在100300NM，无团聚现象。0085另外，透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物在水介质中自组装形成纳米粒子，具有核壳结构，粒径分布很窄。初乳时，亲水链段由于亲疏水作用力而聚集形成内核，疏水链段则形成外壳，复乳时，正好相反，疏水链段在疏水作用力下相聚成中间层，亲水链段则形成最外层的外壳。这些亲水链段如透明质酸通常具有良好的生物相容性，对粒子在水中的分散起到立体稳定的作用，因此可使药物在细胞中持续释放，延长药物血液半衰期。。
30、0086同时，透明质酸具有靶向作用，在很多肿瘤细胞的表面都有它的受体CD44，LYVE1等，例如人乳腺癌细胞MCF7，可使载体定向输送药物。透明质酸胱胺聚乳酸共聚羟基乙酸接枝聚合物具有良好的生物相容性和可降解性，可增强穿透作用，因此被研制成为生物大分子药物的运送载体，以增强药物在体内的有效浓度，提高疗效。而与其它种类的高分子药物载体相比，透明质酸胱胺聚乳酸共聚羟基乙酸接枝聚合物不仅原料丰富，而且具有低成本，可生物降解，良好生物相容性和生物亲和性、无毒、易于化学改性等优点。0087本发明中，载体纳米粒子对活性成分阿霉素的包封率为3091，载药量为0541WT，对活性成分环巴胺的包封率为3594，。
31、载药量为0642WT。利用本发明载有活性成分如阿霉素和/或环巴胺等的透明质酸胱胺聚乳酸共聚羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子对乳腺癌细胞MDAMB231和MCF7、肺癌细胞A542、肝癌细胞HEPG2进行细胞毒性实验，结果表明所制备的载药纳米粒子能够识别细胞MCF7、A549、HEPG2表面的受体，并对该肿瘤细胞有显著的生长抑制作用。说明书CN104162169A139/18页14附图说明0088图1A为实施例1中的聚乳酸羟基乙酸的红外谱图；0089图1B为实施例1中的胱胺聚乳酸羟基乙酸的红外谱图；0090图1C为实施例1中的透明质酸的红外谱图；0091图1D为实施例1中的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸。
32、接枝聚合物的红外谱图；0092图2A为实施例1中的透明质酸的核磁共振氢谱图；0093图2B为实施例1中的聚乳酸羟基乙酸的核磁共振氢谱图；0094图2C为实施例1中的胱胺聚乳酸羟基乙酸的核磁共振氢谱图；0095图2D为实施例1中的透明质酸聚乳酸羟基乙酸的核磁共振氢谱图；0096图3为实施例1中的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图；0097图4为实施例1中的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子光散射示意图的粒径分布图；0098图5为实施例1中的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子光散射示意图的ZETA电位分布图；0099图6A为暴露在不同DOX阿霉素浓度下，M。
33、CF7细胞的活力；0100图6B为暴露在不同DOX浓度下MDAMB231细胞的活力0101图6C为暴露在不同DOX浓度下A549细胞的活力0102图6D为暴露在不同DOX浓度下HEPG2细胞的活力0103图7A为暴露在不同CYC环巴胺浓度下MCF7细胞的活力0104图7B为暴露在不同CYC浓度下MDAMB231细胞的活力0105图7C为暴露在不同CYC浓度下A549细胞的活力0106图7D为暴露在不同CYC浓度下HEPG2细胞的活力具体实施方式0107为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。0108以下实施例。
34、中的重均分子量是通过美国沃特斯5152410的凝胶渗透色谱GPC测得的，溶剂为四氢呋喃。0109对以下实施例中的透明质酸、聚乳酸羟基乙酸、胱氨聚乳酸羟基乙酸、透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物进行红外光谱检测，检测条件包括样品与KBR质量比为150，混匀后，研磨成透明薄片，通过红外光谱仪美国珀金埃尔默公司，型号为SPECTRUMONE进行检测。0110对以下实施例中的透明质酸、聚乳酸羟基乙酸、胱氨聚乳酸羟基乙酸、透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物进行核磁共振氢谱瑞士，布鲁克公司，型号为AV400检测，透明质酸的核磁共振氢谱的检测条件包括水为内标，所用溶剂为重水；聚乳酸羟基乙酸的核磁共振氢谱。
35、的检测条件包括二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚说明书CN104162169A1410/18页15砜，胱氨聚乳酸羟基乙酸的核磁共振氢谱的检测条件包括二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜，透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的核磁共振氢谱的检测条件包括二甲基亚砜为内标，溶剂为氘代二甲基亚砜。0111对以下实施例中所得到的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子进行动态光散射ZETASIZERNANOZS、透射电镜美国FEI,TECNAIG220STWIN，200KV。0112实施例10113载有阿霉素和环巴胺的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的制备0114A将5G的聚乳酸羟基。
36、乙酸75/25，分子量5万，济南岱罡、0115G的1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺ALFARAESAR公司，98和0081G的1羟基苯并三唑阿拉丁试剂上海有限公司，99置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入10ML的氯仿溶解，温度为40，氮气保护下反应4小时，得到1羟基苯并三唑活化的聚乳酸羟基乙酸粗产品。将粗产物溶液在25下旋转蒸发除去氯仿，然后用200ML乙醚进行沉淀，甲醇/乙醚55混合溶液清洗100ML3次，在25真空烘箱箱中干燥36小时，得到固体产物1羟基苯并三唑活化的聚乳酸羟基乙酸4461G。0115B将1羟基苯并三唑活化的聚乳酸羟基乙酸4461G加入到30MLN,N二甲基甲酰胺中，制备1。
37、羟基苯并三唑活化的聚乳酸羟基乙酸N,N二甲基甲酰胺溶液；将0101G的胱胺二盐酸盐FLUKA公司，98和05ML的N,N二异丙基乙胺国药集团化学试剂有限公司，99用5MLN,N二甲基甲酰胺溶解，制备胱胺和N,N二异丙基乙胺混合的N,N二甲基甲酰胺溶液；将5ML的胱胺和三乙胺混合的N,N二甲基甲酰胺溶液滴加到1羟基苯并三唑活化的聚乳酸羟基乙酸N,N二甲基甲酰胺溶液中，温度为40，在氮气的保护下反应12H，得到透明的胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物粗产物溶液。将该粗产物溶液加入到200ML的蒸馏水中沉淀，然后用9500RMP转数离心20分钟得到胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物粗产物，再用100ML蒸馏水清洗产物，。
38、继续用9500RMP转数离心20分钟，重复23次。得到纯化胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物产物在25真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物4213G。0116C将05G透明质酸华熙福瑞达生物医药有限公司，分子量12000DA、0319G的1乙基3二甲基氨基丙基碳二亚胺ALFARAESAR公司，98和0225G的1羟基苯并三唑阿拉丁试剂上海有限公司，99置于三口烧瓶中，抽真空1小时后，加入15ML的N,N二甲基甲酰胺溶解，常温下，氮气保护下反应4小时，得到1羟基苯并三唑活化的透明质酸溶液。0117D将4G纯化后的胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物加入到上述步骤3中的1羟基苯并三唑化透明。
39、质酸溶液中，抽真空，加入05MLN,N二异丙基乙胺溶液，在氮气氛围下反应12H，得到透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶液。将所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物溶液加入到透析袋1200014000DA中,在蒸馏水中透析72H，去除杂质，得到透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物浊液，用9500RMP转数离心20分钟，得到透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物粗产物，再用100ML蒸馏水清洗产物，继续用9500RMP转数离心20分钟，重复23次。得到纯化透明质酸胱说明书CN104162169A1511/18页16胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物25真空干燥箱中干燥32小时，得到干燥固体产物透明质酸。
40、胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物4021G。0118E10MG透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物和05MG环巴胺溶于1ML的二氯甲烷中，加入200L，125MG/ML阿霉素水溶液，在超声细胞粉碎机中用5的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4ML聚乙烯醇1WT和嵌段式聚醚F681WT混合溶液，在超声细胞粉碎机中用25的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。0119经检测，所得到的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为370000DA，经计算阿霉素的载药量为27，包封率为73，环。
41、巴胺的载药量为32，包封率为87。0120其它各项检测图谱见图1至图5。其中，图1A表示实施例1中的聚乳酸羟基乙酸的红外光谱图。图1B表示实施例1中的胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物的红外光谱图。图1C表示实施例1中的透明质酸的红外光谱图。图1D表示实施例1中的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的红外光谱图。0121与图1A相比，图1B在1625和1576CM1附近出现两个新的吸收峰，这是聚乳酸羟基乙酸端羧基与胱胺端氨基反应生成的酰胺键特征峰，1625CM1对应酰胺峰，1576CM1对应酰胺峰，这说明胱胺和聚乳酸羟基乙酸端羧基发生了反应；与图1A和1C相比较，图1D的3458CM1为透明质酸羟基OH。
42、的伸缩振动峰，1631和1570CM1为胱胺端氨基与聚乳酸羟基乙酸端羧基反应生成的酰胺键、胱胺端氨基与透明质酸羧基反应生成酰胺键的特征峰，其中1631CM1对应酰胺峰，1570CM1对应酰胺峰，这些都说明胱胺将聚乳酸羟基乙酸和透明质酸链接上生成透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备可以得到透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物。0122图2A表示实施例1中的透明质酸的核磁共振氢谱；图2B表示实施例1中的聚乳酸羟基乙酸的核磁共振氢谱；图2C表示实施例1中的胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物的核磁共振氢谱；图2D表示实施例1中的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的核磁共振氢谱。。
43、0123同图2B相比较，图2C中在143PPM、487PPM和520PPM处的信号分别对应于胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物中聚乳酸羟基乙酸链段中CH3、CH和CH2上的质子吸收峰，在273PPM和288PPM处的信号分别对应于胱胺聚乳酸羟基乙酸聚合物中胱胺链段中CH2S和CH2N上的质子吸收峰，这些说明了胱胺与聚乳酸羟基乙酸反应生成了胱胺聚乳酸羟基乙酸。0124同图2A、2B和2C相比较，图2D中在143PPM、487PPM和520PPM处的信号分别对应于透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物中聚乳酸羟基乙酸链段中CH3、CH和CH2上的质子吸收峰，在264PPM和277PPM处的信号分别对应于透明质。
44、酸聚乳酸羟基乙酸聚合物中胱胺链段中CH2S和CH2N上的质子吸收峰，在193PPM和326453PPM分别对应于透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物中透明质酸链段的COCH3和CH2O，葡萄糖骨架上的质子吸收峰，这说明书CN104162169A1612/18页17些说明了活化透明质酸与胱胺聚乳酸羟基乙酸反应生成了透明质酸聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物。由此可见，采用本发明的方法制备得到了目标化合物透明质酸聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物。0125图3表示实施例1中的载药透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子的透射电镜图。从该图可以看出，载药透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球形结。
45、构，粒径在200NM左右；同时可以看出典型的核壳结构，内核是疏水的聚乳酸羟基乙酸，外壳为亲水的透明质酸。0126图4表示实施例1中的载药透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的粒径分布图，其中平均粒径184NM，分散系数0073。与图1相比，粒径较电镜图中的粒径大，这是由于透射电子显微镜样品制备过程中胶束壳层的塌陷收缩，在真空环境下使得胶束缩小，而动态光散射测定的是具有核壳结构的胶束在溶液中完全舒展时的水合力学直径，在水中存在亲水性外壳溶胀。0127图5表示实施例1中的载药透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子动态光散射示意图中的电位分布图，从图5可以看出，透明质。
46、酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子表面带一定的负电荷，平均ZETA电位为289MV。纳米粒子表面带一定的电荷有利于粒子的稳定性，防止粒子之间相互团聚。0128实施例20129按照实施例1的方法进行步骤A至D，方法中所涉及的各物质的用量、条件以及得到的结果见表1至表4。0130E10MG透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物和02MG环巴胺溶于1ML的二氯甲烷中，加入200L，05MG/ML阿霉素水溶液，在超声细胞粉碎机中用5的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4ML聚乙烯醇2WT溶液，在超声细胞粉碎机中用25的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二。
47、氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。0131经检测，所得到的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为66400DA。其它各项检测图谱与实施例1的相应图谱类似。透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在2238NM，分散系数为01250023，平均ZETA电位为26131MV；经计算阿霉素的载药量为12，包封率为81，环巴胺的载药量为23，包封率为89。0132实施例30133按照实施例1的方法进行步骤A至D，方法中所涉及的各物质的用量、条件以及得到的结果分别见表1至表4。0134E10MG透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚。
48、合物和1MG环巴胺溶于1ML的二氯甲烷中，加入200L，25MG/ML阿霉素水溶液，在超声细胞粉碎机中用5的功率，超声2分钟，得到油包水的初乳，再向初乳中加入4ML聚乙烯醇4WT溶液，在超声细胞粉碎机中用25的功率，超声5分钟，得到水包油包水复乳。将所得乳液用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，得到带蓝光的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子。0135经检测，所得到的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的重均分子量为87000DA。其它各项检测图谱与实施例1的相应图谱类似。透明质酸胱胺聚乳说明书CN104162169A1713/18页18酸羟基乙酸接枝聚合物纳米粒子具有规整的圆球性结构；粒子大小在。
49、2492NM，分散系数为02100053，平均ZETA电位为22329MV。经计算阿霉素的载药量为37，包封率为71，环巴胺的载药量为27，包封率为79。0136表101370138说明书CN104162169A1814/18页190139表2014001410142表30143说明书CN104162169A1915/18页2001440145表40146说明书CN104162169A2016/18页2101470148实施例40149药液1的制备将实施例1制得的载有阿霉素和环巴胺的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子HAPLGADOXCYC用相应的培养基进行稀释，得到以阿霉素计，浓度分别为0M、1M、2M、3M、4M的不同浓度的药液1。0150药液2的制备除了不加阿霉素和环巴胺以外，其它按照实施例1的步骤5的方法制备透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子HAPLGA，并按照药液1的制备方法，将所得透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物的纳米粒子用相应的培养基进行稀释，使所得的不同浓度药液2中的透明质酸胱胺聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物浓度与相应浓。