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1、10申请公布号CN104082143A43申请公布日20141008CN104082143A21申请号201410309505622申请日20140701A01H4/0020060171申请人南京农业大学（海南）滩涂农业研究所地址572541海南省乐东黎族自治县付佛罗镇太阳城72发明人刘兆普刘联刘玲隆小华74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称一种海水组培选育耐盐库拉索芦荟的方法57摘要本发明公开了一种海水组培选育耐盐库拉索芦荟的方法，包括组培材料的前期处理；不同浓度海水培养基的配方；不同浓度海水驯化筛选耐盐分化芽的操作技术。通过不同程度的盐胁迫培养。
2、研究，利用基质盐分化学渐近递增的方式，诱导植物体内的盐应答基因的表达逐步增强，从而培养、分离、筛选出适合海涂盐渍地区种植和适应淡水缺乏地区海水灌溉的耐盐新品种，再通过在高盐培养基中的多代驯化培养稳定其性状，然后利用组织海水培养快繁技术达到耐盐新品种的选育。本发明的有益效果是利用海水组培技术，可以大量快繁芦荟耐盐品系，加速库拉索芦荟的耐盐高产品种并推广应用。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页10申请公布号CN104082143ACN104082143A1/1页21一种海水组培选育耐盐库拉索芦荟的方法，其特。
3、征在于按照以下步骤进行步骤1在大田经体积比13的海淡水浇灌一年后选取与淡水灌溉芦荟生长量没有差异的植株，取出分化组织在常规培养基上培养，此时常规培养基可选取A0分化培养基，待芦荟诱导出丛芽后，选择健壮、分化旺盛的无污染丛芽；步骤2将选取的丛芽转入A0、A1这两种分化培养基上培养28D，再转移到A0、A1两种生根的培养基上培养28D，形成A0和A1方式处理后的丛芽；步骤3从A1处理中挑选健壮幼苗诱导丛芽，按照步骤2中在A1上培养的模式条件再转接到A2分化培养基与生根培养基上继续进行分化与生根培养，以此类推，在A3、A4、A5、A6培养基上均按此模式条件进行培养，选取出健壮且整齐一致的株系；步骤4。
4、A0处理的丛芽继续在A0培养基按照A0培养的条件循环培养5个轮回，选取健壮且整齐一致的植株作为对照，分别以淡水与海淡水比3070的混合水进行幼苗入圃实验与大田对比试验，经过多轮筛选出耐盐性强、产量高、品质好的芦荟品系。2按照权利要求1所述一种海水组培选育耐盐库拉索芦荟的方法，其特征在于整个培养试验在温度281、光照度为2000LX下进行，每天光照11H。3按照权利要求1所述一种海水组培选育耐盐库拉索芦荟的方法，其特征在于所述培养基配方为保持基本基质即A0配方不变，按7个梯度，即基本基质依次增加10海水作为一个梯度，改变基质盐离子浓度配制7种分化培养基及7种生根培养基；分化培养基本基质MS肌醇1。
5、00MG/L单位下同烟酸05盐酸硫胺素10盐酸吡哆醇05甘氨酸20蔗糖30000卡拉胶58006BA20NAA01；PH6025；生根培养基本基质MS肌醇100MG/L单位下同烟酸05盐酸硫胺素10盐酸吡哆醇05甘氨酸20蔗糖30000卡拉胶6800NAA10IBA05活性炭1000；PH6025。权利要求书CN104082143A1/5页3一种海水组培选育耐盐库拉索芦荟的方法技术领域0001本发明属于海洋生物技术领域，涉及一种海水组培选育耐盐库拉索芦荟的方法。背景技术0002全世界约有95108HM2的土地为盐渍土，占耕地面积的25，中国约有33107HM2的盐渍土，其中沿海滩涂盐渍土面积为。
6、20106HM2。近年来，全球性的干旱日趋严重。我国是农业大国，淡水资源总量严重不足、时空分布不均、水环境恶化、可耕地逐年减少等不利因素已严重影响农业发展。如今发展海水灌溉农业、开发荒滩荒涂已被列为海洋开发及国家发展战略中的重要一环，也是世界各国科学家研究的热点。发展海水农业，关键要选育出耐盐性很强、有经济价值的植物或作物品种。0003芦荟是百合科LILIACEAE芦荟属ALOE多年生肉质草本植物,大多数生长在热带和亚热带地区含有芦荟大黄素等70多种对人体有益的物质,对肠胃病、心血管病及各种灼烧、烫伤等均有不同程度的疗效,并具有较高的观赏价值,是集药用、食用、美容及观赏于一身的热带植物,有极高。
7、的开发应用前景。库拉索芦荟,我国叫翠叶芦荟,学名ALOEVERALINN,为芦荟中的珍品,其叶片肥厚多肉,翠绿,叶表有蜡质白粉,叶缘有刺,叶面在幼苗期有白斑,成株后消失,其蒽醌其中芦荟大黄素为基本成分含量为00505随植株生长发育不同而变化,而中国芦荟仅为00056,相差10100倍。0004库拉索芦荟一般生长数年后才能开花结实，加之雌雄花开放时间不一致，故种子很少。生产上多采用分株或扦插法进行繁殖，在自然条件下，分生芽极低，且生长缓慢，同时，长期的无性繁殖也会使芦荟变异率小，导致自然选择机率低。为了加速美国库拉索芦荟的繁殖，利用植物组织培养方法，成功地繁殖出大量种苗，满足市场需要。当前,国内。
8、外对芦荟的研究工作主要集中在医药，美容，栽培，以及生态方面，对其抗盐耐海水的研究没有报道。且常规库拉索芦荟组培苗耐海水能力差，对大田栽培与生产指导作用受到影响。发明内容0005本发明的目的在于提供一种海水组培库拉索芦荟的方法，解决了目前耐盐芦荟株系培育进程缓慢的问题。0006本发明的目的是提供海水组培与海水胁迫栽培轮回选育库拉索芦荟新品系的方法，获得库拉索芦荟耐盐分化苗与生根苗。本发明所采用的技术方案是利用海水组培时间短、继代驯化周期快的特点，结合大田海水灌溉系统选育方法，轮回驯化培育，以快速高效选育库拉索芦荟的耐盐高产品种。本发明具体步骤如下0007步骤1在大田经体积比13的海淡水浇灌一年后。
9、选取与淡水灌溉芦荟生长量没有差异的植株，取出分化组织在常规培养基上培养，此时常规培养基可选取A0分化培养基，待芦荟诱导出丛芽后，选择健壮、分化旺盛的无污染丛芽；0008步骤2将选取的丛芽转入A0、A1这两种分化培养基上培养28D，再转移到A0、A1说明书CN104082143A2/5页4两种生根的培养基上培养28D，形成A0和A1方式处理后的丛芽。0009步骤3从A1处理中挑选健壮幼苗诱导丛芽，按照步骤2中在A1上培养的模式条件再转接到A2分化培养基与生根培养基上继续进行分化与生根培养，以此类推，在A3、A4、A5、A6培养基上均按此模式条件进行培养，选取出健壮且整齐一致的株系；0010步骤4。
10、A0处理的丛芽继续在A0培养基按照A0培养的条件循环培养5个轮回，选取健壮且整齐一致的植株作为对照，分别以淡水与海淡水比3070的混合水进行幼苗入圃实验与大田对比试验，经过多轮筛选出耐盐性强、产量高、品质好的芦荟品系。0011进一步，整个培养试验在温度281、光照度为2000LX下进行，每天光照11H。0012进一步，所述培养基配方为保持基本基质即A0配方不变，按7个梯度，即基本基质依次增加10海水作为一个梯度，改变基质盐离子浓度配制7种分化培养基及7种生根培养基；0013分化培养基本基质0014MS肌醇100MG/L单位下同烟酸05盐酸硫胺素10盐酸吡哆醇05甘氨酸20蔗糖30000卡拉胶5。
11、8006BA20NAA01；PH6025；0015生根培养基本基质0016MS肌醇100MG/L单位下同烟酸05盐酸硫胺素10盐酸吡哆醇05甘氨酸20蔗糖30000卡拉胶6800NAA10IBA05活性炭1000；PH6025。0017本发明的有益效果是利用海水组培技术，可以大量快繁芦荟耐盐品系，加速库拉索芦荟的耐盐高产品种并推广应用。附图说明0018图1为本发明海水组培选育南盐1号流程示意图；0019图2为大田海水灌溉对两种芦荟地上部A和根B鲜重的影响示意图。具体实施方式0020下面根据附图和具体实施方式对本发明进行说明。0021如图1所示为本发明海水组培选育南盐1号流程示意图。本发明方法按。
12、照以下步骤进行0022步骤1在大田经体积比13的海淡水浇灌一年后选取与淡水灌溉芦荟生长量没有差异的植株，取出分化组织在常规培养基上培养，此时常规培养基可选取A0分化培养基，待芦荟诱导出丛芽后，选择健壮、分化旺盛的无污染丛芽；0023步骤2将选取的丛芽转入A0、A1这两种分化培养基上培养28D，再转移到A0、A1两种生根的培养基上培养28D，形成A0和A1方式处理后的丛芽。0024步骤3从A1处理中挑选健壮幼苗诱导丛芽，按照步骤2中在A1上培养的模式条件再转接到A2分化培养基与生根培养基上继续进行分化与生根培养，以此类推，在A3、A4、A5、A6培养基上均按此模式条件进行培养，选取出健壮且整齐一。
13、致的株系命名为南盐1号株系，代号F6；0025步骤4A0处理的丛芽继续在A0培养基按照A0培养的条件循环培养5个轮回，选取健壮且整齐一致的植株作为对照代号F0，以F6与F0为材料进行分别以淡水与海淡说明书CN104082143A3/5页5水比3070的混合水进行幼苗入圃实验与大田对比试验，幼苗入圃实验与大田对比试验过程将筛选出的健壮的耐盐分化芽在A6处理继代培养3个轮回，以保证其稳定的优良性状。将最后筛选获得的南盐1号库荟株系与对照处理A06同时打开瓶盖炼苗三天，洗净生根苗基部培养基，移栽苗圃，分别用淡水、30海水、60海水的的天然海水灌溉处理，重复3个，进行耐盐性比较，以培育筛选芦荟耐盐品系。
14、，经过多轮筛选出耐盐性强、产量高、品质好的南盐1号芦荟品系。0026整个培养试验在温度281、光照度为2000LX下进行，每天光照11H。所有试验每处理重复100样瓶，每瓶8株。0027本发明培养基的设计在基本培养基组成的基础上按6个梯度增加海水比例表1，每个处理培养100个样品。0028表1002900300031海水成分优选为NA18664、K2875、CA21169、MG24746、CL24835单位MMOLL1。0032有益效果本发明所提供的海水组培库拉索芦荟的方法具有如下优点和积极效果00331利用海水组培技术，可以大量快繁芦荟耐盐品系，加速其推广应用。00342通过盐梯度胁迫驯化组。
15、培库拉索芦荟苗，可以快速有效培育耐盐库拉索芦荟分化苗，加快耐盐株系选育的进程，大大提高工作效率。00353通过盐梯度胁迫驯化组培库拉索芦荟苗，其分化生长、生根生长、入圃苗海水耐受性大为提高。0036下面列举具体实施例对本发明进行说明。0037实施例1以海南乐东太阳城中试基地以30比例海水灌溉一年的健壮库拉索芦荟为外植体，按株系做好标记，除去外层老叶，用利刀切去较长的叶片，仅留下基部34CM，自来水冲洗20MIN。在超净工作台内用75酒精溶液浸外植体30S，无菌水冲洗35次，再用01升汞溶液消毒810MIN。放在无菌滤纸上吸干水分，并切成具有12个芽点的茎切段，接种到常规培养基上培养，PH60，。
16、温度281，光照强度为2000LX，每天光说明书CN104082143A4/5页6照11H，将导的分化芽，分别接种到A0与A1分化培养基上进行平行培养，人工光照强度为2000LX，每天照11H7001800。培养28D后，在A1分化培养基上选取与对照处理A01发育一致的分化苗，一部分用于A1生根培基上进行生根培养验证其发育状态，一部分转接到A2分化培养基上进分海水浓度递增驯化培养，在A2分化培养基上选取与对照处理，即一开始在A0上培养第二次，记为A02发育一致的分化苗，一部分用于A2生根培基上进行生根培养验证其发育状态，一部分转接到A3分化培养基上进分海水浓度递增驯化培养。以此类推，直至A6配。
17、方组培出与对照处理A06没有显著差异的分化苗与生根苗。详细记录每个处理的各株系植株生长情况。以上各实验重复三次，将筛选出的健壮的耐盐分化芽在A6处理继代培养3个轮回，以保证其稳定的优良性状。将最后筛选获得的南盐1号库荟株系与对照处理A06同时打开瓶盖炼苗三天，洗净生根苗基部培养基，移栽苗圃，分别用淡水、30海水、60海水的的天然海水灌溉处理，重复3个，进行耐盐性比较，选育出耐盐性强、产量高、品质好的南盐1号芦荟品系。0038试验方案1海水组培外植体材料的获得用CK淡水、30、60比例的大田海水灌溉处理一年后，分别从CK、30处理中选取发育一致植株60比例海水灌溉无发育正常植株进行对照培养基分化。
18、的继代培养，以稳定其遗传性状。结果所有田间处理后的植株作为植外体用常规培养基培养，正常分化率均达到95以上。2选取上述外植体材料进行海水组培驯化，按海水浓度梯增组培法最终得到的F6，以F6进行60海水培养基的分化试验，结果见表20039表2F6在高海水培养基中的分化情况0040处理正常分化苗数CK99560海水9680041再以F6分化苗进行生根试验，结果如表30042表3F6在高海水培养基中的生根情况00430044可以看出，本发明选育的芦荟品系F6移栽入圃后用50海水灌溉时，芦荟植株根系发达，生长正常，而库拉索芦荟则盐胁迫症状明显表4。经一年的大田海水灌溉比较试验发现，南盐1号F6的地上部。
19、与根部鲜重在淡水灌溉下与库拉索芦荟没有差异，而在30和60比例的海水灌溉下均显著高于库拉索芦荟；在用30的海水灌溉培养下，南盐1号地上部产量与淡水灌溉的产量无显著差异，而库拉索芦荟的地上部产量却比淡水处说明书CN104082143A5/5页7理降低1520。结果表明，通过海水组织培养能筛选出芦荟耐盐品系。图2中大田海水灌溉对两种芦荟地上部A和根B鲜重的影响示意图。0045表4度海水灌溉对两种芦荟入圃生根苗生长的影响004600470048以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。说明书CN104082143A1/2页8图1说明书附图CN104082143A2/2页9图2说明书附图CN104082143A。