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1、10申请公布号CN104095934A43申请公布日20141015CN104095934A21申请号201410322558122申请日20140708A61K36/638200601A61K49/00200601A61P31/04200601A61P37/0420060171申请人湖南农业大学地址410128湖南省长沙市芙蓉区湖南农业大学11教学楼309室72发明人朱丽娜陈仕贵雷凌华陈扬张子烨74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法57摘要本发明公开了一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的。
2、构建方法，该方法包括制备复方女贞子；将实验小鼠分组及处理，用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定；饲喂结束后，对小鼠进行碳粒廓清试验；对小鼠进行溶菌酶活性的测定；进行猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定；对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用；数据分析。本发明验证了复方女贞子作为饲料添加剂可以通过提高免疫器官指数，增加单核巨噬细胞的活性，显著提高溶菌酶活性，从而达到对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠良好的保护作用。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图2页10申请公布号CN104095934ACN104095934A1/2。
3、页21一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法包括步骤一、用女贞子、淫羊藿、白术、茯苓制备复方女贞子，女贞子、淫羊藿、白术、茯苓的质量比为21511；以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成11的复方女贞子药液，再分别稀释成120、140和180的复方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠料的表面，制成含复方女贞子005、01、015W/W的鼠料，备用；步骤二、将实验小鼠分组及处理，用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定；步骤三、饲喂结束后，对小鼠进行碳粒廓清试验；步骤四、对小鼠进行溶菌酶活性的测定；步骤五、进行猪多杀性巴。
4、氏杆菌对小鼠半数致死量的测定；步骤六、对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用；步骤七、数据分析。2如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的制备复方女贞子的具体方法为以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成11的复方女贞子药液，再分别稀释成120、140和180的复方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠料的表面，制成含复方女贞子005、01、015W/W的鼠料，备用。3如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，将实验小鼠分组及处理的具体方法为80只3周龄和60只8周龄SPF级白雄鼠，饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为28，相。
5、对湿度为5010，动物饲养适应3天后进行试验，将80只3周龄小鼠随机分成4组，每组20只，、组为实验组，分别饲喂含复含方女贞子005、01、015W/W的鼠料，组为对照组，饲喂普通鼠料，连续饲喂30D，60只7周龄小鼠用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定。4如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，碳粒廓清试验的具体方法为饲喂结束后，每组随机取10只小鼠，称重，每只小鼠使用胰岛素注射器由尾静脉注入01ML/10G的印度墨汁生理盐水稀释6倍，注射后分别在2MINT1、7MINT2乙醚麻醉后用玻璃毛细管从小鼠眼眶静脉丛采血20L，溶于20ML01NA2CO3。
6、溶液中摇匀，静置20MIN后每个样品取100L加入到96孔板中，取两次样分别加入不同孔中，以01溶液为空白对照，使用酶标仪在680NM波长测量其OD值，将小鼠处死后取肝脏和脾脏，用滤纸吸干血迹后称重，根据公式计算廓清指数K值、校正廓清指数KA值及免疫器官指数，计算公式为其中，M体重，M1肝脏重，M2脾脏重，A为吸光光度值。5如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，溶菌酶活性的测定的具体方法为每组剩下的10只小鼠采用眼眶静脉丛采血约06ML，4冰箱静置保存2H后分离血清，权利要求书CN104095934A2/2页3按以下方法检测溶菌酶LZM活性取200L。
7、的待测血清、溶菌酶标准液01MG/ML200U/ML作为阳性对照、双蒸水作为空白样，分别加入20ML浓度025MG/ML微球菌菌液，立即混匀，37水浴15MIN，按时取出置于0的冰水浴中3MIN，530NM，1CM光径，以蒸馏水调透光度100，测定各管的透光度，计算公式如下溶菌酶含量U/ML测定管透光度对照管透光度/标准管透光度对照管透光度2000U/ML。6如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定的具体方法为将菌株PMC439在加有5犊牛血清的TSB培养基在37恒温摇床上180R/MIN培养10H，将细菌依次10。
8、倍稀释，分别取10L涂于巧克力平板培养后计数；同时将上述10倍稀释的菌液分别腹腔注射100L/稀释浓度小鼠，每个浓度处理10只7周龄的白小鼠，采用6个浓度，每天观察并记录小鼠死亡情况，连续观察4天，小鼠半数致死量的计算按REED和MUENCH氏法，计算公式为距离比例高于50的死亡百分数50/高于50的死亡百分数低于50的死亡百分数；LD50的对数LGLD50死亡率高于50的对数距离比例稀释系数的对数。7如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用的具体方法为将进行溶菌酶活性测定的小鼠饲喂3天，待其恢复健康后，腹腔注射100。
9、0个LD50菌液100L进行攻毒，每天观察小鼠状态并记录死亡情况，连续观察4D。8如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，数据分析的数据使用“平均值标准差”表示，使用SPSS170软件以单因素变异数分析进行组间差异显著性检验，P005为具有统计学意义。权利要求书CN104095934A1/6页4复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法技术领域0001本发明属于药理实验领域，尤其涉及一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法。背景技术0002中国是世界上最重要的生猪养殖和猪肉消费大国，拥有悠久的养猪传统。多杀性巴氏杆菌病是猪场常见病。
10、之一，目前主要使用疫苗预防该病，但是该菌分布广泛，血清型多，致使疫苗预防效果不佳。现代中药药理学研究表明，“滋补”类中药具有一定的免疫增强作用，本发明根据中药配伍原则和组方理论，将性能相关的中药配合应用，筛选和优化经验配方得到女贞子、淫羊藿、白术、茯苓四味中药组成“复方女贞子”作为免疫增强剂饲喂小白鼠，考察其对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠的保护作用及其机理。发明内容0003本发明的目的在于提供一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，旨在考察复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠的保护作用及其机理。0004本发明是这样实现的，一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法包括0。
11、005步骤一、用女贞子、淫羊藿、白术、茯苓制备复方女贞子，女贞子、淫羊藿、白术、茯苓的质量比为21511；以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成11的复方女贞子药液1ML药液相当于1G原药材，再分别稀释成120、140和180的复方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠料的表面，制成含复方女贞子005、01、015W/W的鼠料，备用；0006步骤二、将实验小鼠分组及处理，用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定；0007步骤三、饲喂结束后，对小鼠进行碳粒廓清试验；0008步骤四、对小鼠进行溶菌酶活性的测定；0009步骤五、进行猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定；0010步骤六、对感染猪多杀性巴氏杆菌小。
12、鼠保护作用；0011步骤七、数据分析。0012进一步，所述的制备复方女贞子的具体方法为0013以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成11的复方女贞子药液1ML药液相当于1G原药材，再分别稀释成120、140和180的复方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠料的表面，制成含复方女贞子005、01、015W/W的鼠料，备用。0014进一步，将实验小鼠分组及处理的具体方法为001580只3周龄和60只8周龄SPF级白雄鼠，饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为28，相对湿度为5010，动物饲养适应3天后进行试验，将80只3周龄小鼠随机分成4组，每组20只，、组为实验组，分别饲喂含复含方女贞子005、01、015W。
13、/W的说明书CN104095934A2/6页5鼠料，组为对照组，饲喂普通鼠料，连续饲喂30D，60只7周龄小鼠用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定。0016进一步，碳粒廓清试验的具体方法为0017饲喂结束后，每组随机取10只小鼠，称重，每只小鼠使用胰岛素注射器由尾静脉注入01ML/10G的印度墨汁生理盐水稀释6倍，注射后分别在2MINT1、7MINT2乙醚麻醉后用玻璃毛细管从小鼠眼眶静脉丛采血20L，溶于20ML01NA2CO3溶液中摇匀，静置20MIN后每个样品取100L加入到96孔板中，取两次样分别加入不同孔中，以01溶液为空白对照，使用酶标仪在680NM波长测量其OD值，将小鼠处死后取肝。
14、脏和脾脏，用滤纸吸干血迹后称重，根据公式计算廓清指数K值、校正廓清指数KA值及免疫器官指数，计算公式为00180019其中，M体重，M1肝脏重，M2脾脏重，A为吸光光度值。0020进一步，溶菌酶活性的测定的具体方法为0021每组剩下的10只小鼠采用眼眶静脉丛采血约06ML，4冰箱静置保存2H后分离血清，按以下方法检测溶菌酶LZM活性，取200L的待测血清、溶菌酶标准液01MG/ML200U/ML作为阳性对照、双蒸水作为空白样，分别加入20ML浓度025MG/ML微球菌菌液，立即混匀，37水浴15MIN，按时取出置于0的冰水浴中3MIN，530NM，1CM光径，以蒸馏水调透光度100，测定各管的。
15、透光度，计算公式如下0022溶菌酶含量U/ML测定管透光度对照管透光度/标准管透光度对照管透光度2000U/ML。0023进一步，猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定的具体方法为0024将菌株PMC439在加有5犊牛血清的TSB培养基在37恒温摇床上180R/MIN培养10H，将细菌依次10倍稀释，分别取10L涂于巧克力平板培养后计数；同时将上述10倍稀释的菌液分别腹腔注射100L/稀释浓度小鼠，每个浓度处理10只7周龄的白小鼠，采用6个浓度，每天观察并记录小鼠死亡情况，连续观察4天，小鼠半数致死量的计算按REED和MUENCH氏法，计算公式为0025距离比例高于50的死亡百分数50/高于5。
16、0的死亡百分数低于50的死亡百分数；0026LD50的对数LGLD50死亡率高于50的对数距离比例稀释系数的对数。0027进一步，对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用的具体方法为0028将进行溶菌酶活性测定的小鼠饲喂3天，待其恢复健康后，腹腔注射1000个LD50菌液100L进行攻毒，每天观察小鼠状态并记录死亡情况，连续观察4D。0029进一步，数据分析的数据使用“平均值标准差”表示，使用SPSS170软件以单因素变异数分析进行组间差异显著性检验，P005为具有统计学意义。0030效果汇总0031本发明验证了复方女贞子作为饲料添加剂可以通过提高免疫器官指数，增加单核巨噬细胞的活性，显著提高溶菌酶。
17、活性，从而达到对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠良好的保护作用。说明书CN104095934A3/6页6附图说明0032图1是本发明实施例提供的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法流程图；0033图2是本发明实施例提供的血清溶菌酶活性测定结果；0034图3是本发明实施例提供的攻毒后小鼠的存活情况。具体实施方式0035为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。0036在本发明中的，所有的比值均为质量比。0037实施例一00381、实验材料003911试验菌株PMC。
18、439猪多杀性巴氏杆菌菌株。004012实验动物80只3周龄和60只8周龄SPF级白雄鼠，饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为28，相对湿度为5010。动物饲养适应3天后进行试验。004113主要试剂女贞子、淫羊藿、白术、茯苓四种药材，印度墨水，溶菌酶检测试剂盒比浊法，巧克力色琼脂糖培养基0042TSB液体培养基3的TSB溶液在加入小牛血清，配成含5CSV/V，3TSBM/V的液体培养基。004314主要仪器0044电热恒温水浴锅，日本岛津紫外分光光度计，台式离心机，德国全自动高压灭菌锅，酶标仪，生化培养箱，超净工作台0045图1示出了本发明的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法流程，。
19、如图所示，本发明是这样实现的，一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法包括0046S101用女贞子、淫羊藿、白术、茯苓21511制备复方女贞子；0047S102将实验小鼠分组及处理，用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定；0048S103饲喂结束后，对小鼠进行碳粒廓清试验；0049S104对小鼠进行溶菌酶活性的测定；0050S105进行猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定；0051S106对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用；0052S107数据分析。0053进一步，S101所述的制备复方女贞子的具体方法为0054以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成11的复方女贞子药液1ML药。
20、液相当于1G原药材，再分别稀释成120、140和180的复方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠料的表面，制成含复方女贞子005、01、015W/W的鼠料，备用。0055进一步，将实验小鼠分组及处理的具体方法为说明书CN104095934A4/6页7005680只3周龄和60只8周龄SPF级白雄鼠，饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为28，相对湿度为5010，动物饲养适应3天后进行试验，将80只3周龄小鼠随机分成4组，每组20只，、组为实验组，分别饲喂含复方女贞子005、01、015W/W的鼠料，组为对照组，饲喂普通鼠料，连续饲喂30D，60只7周龄小鼠用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定。0057免疫器官。
21、指数测定结果如表1，各试验组小鼠免疫器官指数相对于对照组略有提高表1，其中组的肝脏指数提高最大，为523，组的脾脏指数提高最多，达333，但肝脏指数与脾脏指数的提高不同步。0058表1小鼠免疫器官指数00590060进一步，碳粒廓清试验的具体方法为0061饲喂结束后，每组随机取10只小鼠，称重，每只小鼠使用胰岛素注射器由尾静脉注入01ML/10G的印度墨汁生理盐水稀释6倍，注射后分别在2MINT1、7MINT2乙醚麻醉后用玻璃毛细管从小鼠眼眶静脉丛采血20L，溶于20ML01NA2CO3溶液中摇匀，静置20MIN后每个样品取100L加入到96孔板中，取两次样分别加入不同孔中，以01溶液为空白对。
22、照，使用酶标仪在680NM波长测量其OD值，将小鼠处死后取肝脏和脾脏，用滤纸吸干血迹后称重，根据公式计算廓清指数K值、校正廓清指数KA值及免疫器官指数，计算公式为00620063其中，M体重，M1肝脏重，M2脾脏重，A为吸光光度值。0064各试验组小鼠的校正廓清指数KA较对照组有所提高，其中组提高最明显较对照组提高了1463，说明单核巨噬细胞的吞噬活性有所提高，如表2所示。0065表2碳粒廓清试验结果00660067进一步，溶菌酶活性的测定的具体方法为说明书CN104095934A5/6页80068每组剩下的10只小鼠采用眼眶静脉丛采血约06ML，4冰箱静置保存2H后分离血清，按以下方法检测溶。
23、菌酶LZM活性，取200L的待测血清、溶菌酶标准液01MG/ML200U/ML作为阳性对照、双蒸水作为空白样，分别加入20ML微球菌菌液025MG/ML，立即混匀，37水浴15MIN，按时取出置于0的冰水浴中3MIN，530NM，1CM光径，以蒸馏水调透光度100，测定各管的透光度，计算公式如下0069溶菌酶含量U/ML测定管透光度对照管透光度/标准管透光度对照管透光度2000U/ML。0070各试验组小鼠的血清溶菌酶活性显著提高P005，其中组溶菌酶活性提高率达到了6264。见图2。0071进一步，猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定的具体方法为0072将菌株PMC439在加有5犊牛血清的。
24、TSB培养基在37恒温摇床上180R/MIN培养10H，将细菌依次10倍稀释，分别取10L涂于巧克力平板培养后计数；同时将上述10倍稀释的菌液分别腹腔注射100L/稀释浓度小鼠，每个浓度处理10只7周龄的白小鼠，采用6个浓度，每天观察并记录小鼠死亡情况，连续观察4天，小鼠半数致死量的计算按REED和MUENCH氏法，计算公式为0073距离比例高于50的死亡百分数50/高于50的死亡百分数低于50的死亡百分数；0074LD50的对数LGLD50死亡率高于50的对数距离比例稀释系数的对数。0075菌株PMC439在37培养10H后，将细菌10被稀释涂布巧克力平板，计数得到菌落数为431011个细菌。
25、/ML。小鼠死亡情况如表3所示，稀释倍数为105103处理小鼠，在3D内全部死亡；加大稀释浓度有不同程度死亡。根据REED和MUENCH氏法计数得到LD501065，即为431011菌液浓度1065101注射量为01ML431035细菌数。0076表3小鼠半数致死量LD50的测定00770078进一步，对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用的具体方法为0079将进行溶菌酶活性测定的小鼠饲喂3天，待其恢复健康后，腹腔注射1000个LD50菌液100L进行攻毒，每天观察小鼠状态并记录死亡情况，连续观察4D。0080小鼠攻毒后在24H内有狂躁不安的表现，随后精神萎靡，被毛凌乱，畏冷，食欲废绝，少数出现摆。
26、头的神经症状。从图3可以看出，小鼠死亡主要集中在第3天，对照组只存活一只小鼠，而饲喂添加复方女贞子饲料后小鼠的存活率大大提高了，在第3天分别为组方小存活4只，组方中存活5只，组方大存活了5只。直至第5天，对照组仅存活一只，其他说明书CN104095934A6/6页9组分别存活了2只、3只、4只。0081进一步，数据分析的数据使用“平均值标准差”表示，使用SPSS170软件以单因素变异数分析进行组间差异显著性检验，P005为具有统计学意义。0082复方女贞子作为饲料添加剂可以通过提高免疫器官指数，增加了单核巨噬细胞的活性，显著提高了溶菌酶活性，从而达到了对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠良好的保护作用，。
27、其中的机理可能与各个组分的有效成分的作用有关。0083本方中的主药女贞子中的红景天苷及其苷元酪醇具有提高机体免疫功能、抗炎抑菌、升高白细胞、降血糖、调血脂等功效。女贞子多糖对小鼠的免疫作用与机体的免疫状态有关，对非特异性细胞免疫有增强作用，对正常小鼠的特异性细胞免疫无显著影响，对免疫抑制状态小鼠的细胞免疫有增强作用。0084淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿作用，淫羊藿经口给药发挥主治功效的物质基础主要为其代谢产物，如淫羊藿素、去甲淫羊藿素和朝藿定A等。淫羊藿苷可以提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，并能使受到环磷酰胺损伤以及电离辐射的小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能恢复至正常水平，还可以通过影响巨噬细胞。
28、因子的分泌而调节免疫机能。白术具有提高机体抗病能力、保肝利尿，抗菌等作用；茯苓主要成分有茯苓多糖和茯苓素，具有保肝利尿、免疫调节、抗炎、抗病毒、抗氧化等多种药理作用。0085四种“滋补”药物的配伍使用，更是发挥了相须相使的作用，提高了药效，减少了用药量，达到了较好的保护作用。复方女贞子方剂有望作为一种有效的预防猪多杀性巴氏杆菌的饲料添加剂运用到养殖业中。0086上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。说明书CN104095934A1/2页10图1说明书附图CN104095934A102/2页11图2图3说明书附图CN104095934A11。