一种从干扰素制剂中去除内毒素的方法 【技术领域】
本发明涉及重组蛋白质药物的生产，具体地说是一种从干扰素制剂中去除内毒素的方法。
背景技术
随着基因工程技术的日益成熟，越来越多的重组蛋白质药物被开发利用，由于生产过程中涉及到革兰氏阴性菌及分离纯化过程复杂，因此会造成内毒素的污染。
亲和技术是分离纯化生物大分子的有效手段，主要利用配基与生物大分子之间的亲和作用原理；将配基通过共价键键合到多孔介质上就得到亲和介质，可以用来选择性地吸附内毒素，实现从重组蛋白质溶液中去除内毒素的目标；已有的亲和配基和亲和介质包括：单克隆抗体，多克隆抗体，抗生素，多粘菌素B，聚乙烯亚胺，组氨酸，凝胶过滤柱，亲和膜，颗粒吸附剂等。
由于重组蛋白质种类较多，其分离纯化步骤各不相同，生产过程中对其中的内毒素含量要求也有差异，因此去除内毒素的方法和效果无法完全通用。韩国专利(KR8902068)采用凝胶过滤柱Sephacryl S-200，利用分子筛原理来分离分子大小不同的内毒素和干扰素，以除去干扰素中的内毒素；但流速低，为4ml/hr，过程中需要添加其它物质如Triton X-100。欧洲专利(EP0800862)采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用离子交换的原理，来去除重组蛋白质肿瘤坏死因子或白介素中的内毒素，主要吸附重组蛋白质。欧洲专利(EP0337243)使用串联的两只反相液相色谱柱，来纯化重组人IL-2，在纯化重组人白介素-2地同时，去除内毒素杂质，流速低，介质昂贵。美国专利(US4885168)采用低分子量壳聚糖，利用壳聚糖上带正电荷的氨基来与带负电荷的核酸与内毒素作用，达到除去核酸与内毒素的目的，但壳聚糖的利用率低。中国专利(00123290.6)魏桂林等的一种用于内毒素去除的疏水荷正电亲和膜，将胺类疏水荷正电亲和配基键合到纤维素膜上，得到相应的亲和膜；胺类疏水荷正电亲和配基包括2～12碳的烃基二胺、带有乙烯基的不饱和杂环化合物、带有环氧基团的季铵盐及带有多个疏水基团的季铵盐；其主要应用于水中内毒素的去除。D.Petsch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91)采用去氧胆酸钠，或己二胺作为亲和配基，以微孔尼龙膜为介质，制成亲和膜；采用单张亲和膜，可以去除缓冲液或牛血清白蛋白中的内毒素；但流速低，阻力高，处理量少，不易放大。
针对干扰素制剂生产过程中的内毒素，需要根据其分子量大小、等电点的范围、溶液中其它物质的含量和种类，来判断和选择亲和配基的种类和亲和介质，达到去除内毒素、又尽可能减少干扰素活性损失的目的。现有技术的方法并不能满足干扰素制剂生产的需求。
【发明内容】
本发明的目的在于，提供一种流速较高，处理量大，符合生产要求的从干扰素制剂中去除内毒素的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将壳聚糖，或去氧胆酸钠，或己二胺作为亲和配基，共价结合到多孔介质上，以动态过滤或静态吸附(或静态浸泡)的方式进行操作，用以去除重组干扰素制剂中的内毒素；其中亲和配基在多孔介质上的量为：含氮量0.02％～3％。
所述多孔介质是含有多羟基的多糖介质，如纤维素、葡聚糖或琼脂糖；或者是含有多羟基的合成介质，如聚乙烯醇；重组干扰素溶液的pH为pH3.5～6.0；以壳聚糖为亲和配基，壳聚糖的分子量范围为1万～100万；所述多孔介质的型式为平板膜、中空纤维膜、小球或颗粒；所述动态过滤重组干扰素溶液的流速为1～20ml/min；静态吸附的操作条件为4℃至室温，静置2～24小时。
本发明具有如下优点：
1.本发明方法内毒素去除率高，干扰素活性回收率高。过滤后溶液的内毒素浓度从＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干扰素的活性(效价)回收率为90％。
2.本发明特异性好(处理的重组干扰素浓度不同，或活性不同)，适合生产的要求。过滤后溶液的内毒素浓度(＜10EU/ml)符合药典生产要求。
3.本发明实用范围广，前景好。可以去除干扰素制剂生产中含有的内毒素污染物，解决其产品质量问题，达到药典规定的生产要求；还可望应用于其它重组蛋白质药物的生产过程，去除生物药物中内毒素等有害物质，提高我国的药物生产水平；创造较高的经济效益。
总而言之，亲和膜法既结合了膜的流速高、表面积大、孔径均匀、液体与配基之间扩散半径小的优势，又结合了亲和法高选择性、高效率的优点，将亲和膜制备成相应的去除器，容易实现放大以满足药物生产的需要。因此，采用亲和膜来去除干扰素制剂中的内毒素，流量高、去除效果好、有效成分回收率高，优于柱亲和层析法。
【具体实施方式】
实施例1.
制备以壳聚糖为配基的亲和膜：
取50片直径为47毫米的纤维素膜，用大量水冲洗干净，置于一个200ml的烧杯中，加入40ml环氧氯丙烷、120ml 1M的NaOH和0.19gNaBH4，混合均匀，室温下静置过夜，进行活化；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，沥干，然后加入150ml 1％壳聚糖(分子量35万)溶液(1％醋酸溶液配制)，于60℃下过夜(16小时以上)；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，沥干，然后加入100ml0.25％硼氢化钠溶液(0.1M pH8.5磷酸缓冲液配制)，室温下还原反应4小时，取还原后的膜，用大量水洗至中性，沥干并烘干。该亲和膜的含氮量为0.02％。
以壳聚糖为配基的亲和膜的应用效果：
将10张亲和膜制成相应的分离器，以9ml/min的流速过滤干扰素制剂200ml(干扰素效价91406IU/ml，溶液pH3.5)，过滤后溶液的内毒素浓度从＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干扰素的活性(效价)回收率为90％。
实施例2.
制备以己二胺为配基的亲和膜：
取320片直径为47毫米的纤维素膜，用大量水冲洗干净，置于一个1000ml的烧杯中，加入650毫升氧化液中(含2％NaIO4)，30℃烘箱过夜进行活化；次日，取活化后的膜，用大量水洗至中性，沥干，然后加入800ml1％己二胺(0.1M pH＝7磷酸缓冲液配制)，30℃烘箱过夜，进行交联反应；次日取交联后的膜，用大量水洗至中性，沥干，加入800ml 0.6％NaBH4(0.1MpH＝9磷酸缓冲液配制)还原，30℃烘箱过夜。再用大量水洗至中性，沥干并烘干。该亲和膜的含氮量为2.2％。
以己二胺为配基的亲和膜的应用效果：
将10张亲和膜制成相应的分离器，以18ml/min的流速过滤干扰素制剂225ml(干扰素效价93976IU/ml，溶液pH4.2)，过滤后溶液的内毒素浓度从＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干扰素的活性(效价)回收率为88％。
实施例3.
制备以去氧胆酸钠为配基的亲和膜：
取50片直径为47毫米的纤维素膜，用大量水冲洗干净，置于一个200ml的烧杯中，加入40ml环氧氯丙烷、120ml 1M的NaOH和0.19克NaBH4，混合均匀，室温下静置过夜，进行活化；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，沥干，然后加入125ml 1％己二胺溶液(1％pH9磷酸缓冲液配制)，于60℃下过夜(16小时以上)；次日取膜，用大量水洗至中性，沥干，然后加入125ml 0.1M pH6.0的MES缓冲液，再加入2.5克去氧胆酸钠、1.25克EDC，混匀，室温下过夜。取交联后的膜，用大量水洗至中性，沥干并烘干。即得以去氧胆酸钠为配基的亲和膜。
以去氧胆酸钠为配基的亲和膜的应用效果：
将10张亲和膜制成相应的分离器，以9ml/min的流速过滤干扰素制剂200ml(干扰素效价91406IU/ml，溶液pH6)，过滤后溶液的内毒素浓度从＞80EU/ml降低到＜40EU/ml，干扰素的活性(效价)回收率为70％。