环脲和环酰胺衍生物 发明领域
本发明涉及作为黄体酮受体促效剂和拮抗剂的化合物，以及它们的制备和用途。
发明背景
细胞内受体(IR)形成一类结构相关的基因调节剂，称为“配体依赖性转录因子”(R.M.Evans，Science，240，889，1988)。类固醇受体家族是IR家族的一个亚类，包括黄体酮受体(PR)、雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)、糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR)。
对PR而言，天然激素或配体是类固醇黄体酮，但也制备了合成化合物如甲羟孕酮醋酸酯或左炔诺孕酮，它们可作为配体。一旦细胞周围的液体中存在配体，配体就通过被动扩散穿过膜，并与IR结合产生受体/配体复合物。这种复合物与细胞DNA中存在的特异性基因启动子结合。一旦结合于DNA，复合物就调节mRNA和该基因编码的蛋白质的产生。
将结合于IR且模拟天然激素作用地化合物称为促效剂，而抑制激素作用的化合物称为拮抗剂。
已知，PR促效剂(天然的和合成的)在妇女健康中起重要作用。PR促效剂可用于生育控制制剂，通常在存在ER促效剂时。ER促效剂可用于治疗绝经期综合症，但是伴有子宫增生的作用，这会导致患子宫癌危险的上升。同时施用PR促效剂可降低或消除这种危险。
PR拮抗剂可用于避孕。在这种情况下，它们可以单独给予(Ulmann等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，261，248，1995)，与可与PR促效剂联用(Kekkonen等人，Fertility and Sterility，60，610，1993)或与部分ER拮抗剂(如他莫昔芬)联用(WO 96/19997 A1，1996年7月4日)。
PR拮抗剂可以用于治疗激素依赖性乳腺癌(Horwitz等人，Horm.Cancer，283，出版商Birkhaeuser，Boston，Mass.，编者Vedeckis)，以及子宫癌和卵巢癌。PR拮抗剂还可用于治疗非恶性慢性病如纤维瘤(Murphy等人，J.Clin.Endo.Metab.，76，513，1993)和子宫内膜异位(Kettel等人，Fertilityand Sterility，56，402，1991)。
PR拮抗剂还可用于激素替代治疗，与部分ER拮抗剂(如他莫昔芬)联用治疗绝经后的患者(美国专利5719136)。
已显示，在激素依赖性前列腺癌模型中，PR拮抗剂(如米非司酮和奥那司酮(onapristone))是有效的，表明它们可用于治疗男性的这类疾病(Michna等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，761，224，1995)。
本发明的化合物已表现出可作为结合于PR的黄体酮的竞争性抑制剂，且无论在体外和体内的功能性模型中都可作为促效剂和/或拮抗剂起作用。这些化合物可用于避孕，治疗纤维瘤、子宫内膜异位、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和前列腺癌中，以及用于绝经后激素代替疗法。
Jones等人(美国专利No.5,688,810)描述了PR拮抗剂二氢喹啉1。
Jones等人描述了作为PR配体的烯醇醚2(美国专利No.5,693,646)。
Jones等人描述了作为PR配体的化合物3(美国专利No.5,696,127)。
Zhi等人描述了作为PR拮抗剂的内酯4，5和6(J.Med.Chem.，41，291，1998)。
Zhi等人描述了作为PR拮抗剂的醚7(J.Med.Chem.，41，291，1998)。
Combs等人公开了作为PR配体的酰胺8(J.Med.Chem.，38，4880，1995)。
8
Perlman等人描述了作为PR配体的维生素D类似物9(Tet.Letters，35，2295，1994)。
Hamann等人描述了PR拮抗剂10(Ann.N.Y.Acad.Sci.，761，383，1995)。
Chen等人描述了PR拮抗剂11(Chen等人，POI-37，16th Int.Cong.Het.Chem.，Montana，1997)。
Kurihari等人描述了PR配体12(J.Antibiotics，50，360，1997)。
Christ等人的专利(WO9814436)要求保护化合物A等环酰胺(cyclo amide)，它们可作为HIV逆转录酶的抑制剂。其他现有技术包括Turck等人(Tetrahedron，49(3)，599-606(1993).)的哒嗪环酰胺，如化合物B，以及Canonne等人(J.heterocyclic Chem.26，113(1989).)的化合物C。在Turck和Canonne的出版物中没有报道活性数据。
对于环酰胺，Singh等人和Kumar等人(Singh等人J.Med.Chem.37(2)，248-254(1994)；Kumar等人J.Org.Chem.57(25)，6995-6998(1992).)公开了诸如D和E之类的化合物，它们被声称是cAMP PDE III抑制剂。
发明详述
本发明提供了式I化合物，或其药学上可接受的盐：
式中：
A，B和D是N或CH，条件是A，B和D不能都是CH；
R1和R2是选自下组的独立取代基：H，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C2-C6链烯基，取代的C2-C6链烯基，C2-C6炔基，取代的C2-C6炔基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，CORA，或NRBCORA；
或R1和R2稠合形成选自a)，b)或c)的螺环，每个螺环可任选地被1-3个C1-C3烷基取代：
a)3-8元螺环烷基环；
b)3-8元螺环链烯基环；或
c)任选取代的3-8元杂环，它含有1-3个选自下组的杂原子：O、S和N；a)，b)和c)的螺环可任选地被选自下组的1-4个基团取代：氟，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6烷硫基，-CF3，-OH，-CN，NH2，-NH(C1-C6烷基)，或-N(C1-C6烷基)2；
RA是H，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，芳基，取代的芳基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3氨烷基，或取代的C1-C3氨烷基，
RB是H，C1-C3烷基，或取代的C1-C3烷基，
R3是H，OH，NH2，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C6链烯基，取代的C1-C6链烯基，或CORC，
RC是H，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，芳基，取代的芳基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3氨烷基，或取代的C1-C3氨烷基，
R4是如下所示含有取代基X、Y、和Z的三取代苯环：
X选自下组：卤素，CN，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3硫代烷氧基，取代的C1-C3硫代烷氧基，氨基，C1-C3氨烷基，取代的C1-C3氨烷基，NO2，C1-C3全氟烷基，含1-3个杂原子的5或6元环，CORD，OCORD，或NRECORD；
RD是H，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，芳基，取代的芳基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3氨烷基，或取代的C1-C3氨烷基；
RE是H，C1-C3烷基，或取代的C1-C3烷基；
Y和Z是选自下组的独立取代基：H，卤素，CN，NO2，C1-C3烷氧基，C1-C3烷基，或C1-C3硫代烷氧基；
或者
R4是含1、2或3个选自下组的杂原子的5或6元环：O，S，SO，SO2或NR5，并且含1-2个选自下组的独立取代基：H，卤素，CN，NO2，和C1-C3烷基，C1-C3烷氧基，C1-C3氨烷基，CORF，或NRGCORF；
RF是H，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，芳基，取代的芳基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3氨烷基，或取代的C1-C3氨烷基；
RG是H，C1-C3烷基，或取代的C1-C3烷基；
R5是H或C1-C3烷基；
Q是O，S，NR6，或CR7R8；
R6选自下组：CN，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，或SO2CF3；
R7和R8是选自下组的独立取代基：H，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，NO2，CN，或CO2R9；
R9是C1-C3烷基；
或者，CR7R8形成如下结构的6元环：
W是O或化学键。
当W是化学键时，应理解，式I以如下形式存在：
优选化合物是那些式I化合物，或其药学上可接受的盐：
式中：
A，B和D是N或CH，条件是A，B和D不能都是CH；
R1是H，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，CORA，或NRBCORA；
R2是H，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C2-C6链烯基，取代的C2-C6链烯基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，CORA，或NRBCORA；
或者
R1和R2稠合形成如上所述的任选取代的3-8元螺环烷基，链烯基或杂环；
RA是H，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，芳基，取代的芳基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3氨烷基，或取代的C1-C3氨烷基；
RB是H，C1-C3烷基，或取代的C1-C3烷基，
R3是H，OH，NH2，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C6链烯基，取代的C1-C6链烯基，或CORC；
RC是H，C1-C4烷基，取代的C1-C4烷基，芳基，取代的芳基，C1-C4烷氧基，取代的C1-C4烷氧基，C1-C4氨烷基，或取代的C1-C4氨烷基；
R4是如下所示的含取代基X、Y和Z的三取代苯环：
X选自：卤素，CN，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3硫代烷氧基，取代的C1-C3硫代烷氧基，C1-C3氨烷基，取代的C1-C3氨烷基，NO2，C1-C3全氟烷基，含1-3个杂原子的5元杂环，CORD，OCORD，或NRECORD；
RD是H，C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，芳基，取代的芳基，C1-C3烷氧基，取代的C1-C3烷氧基，C1-C3氨烷基，或取代的C1-C3氨烷基；
RE是H，C1-C3烷基，或取代的C1-C3烷基；
Y和Z是选自下组的独立取代基：H，卤素，CN，NO2，C1-C3烷氧基，C1-C3烷基，或C1-C3硫代烷氧基；
或者
R4是含1、2或3个选自下组的杂原子的5或6元环：O，S，SO，SO2或NR5，并且含1-2个选自下组的独立取代基：H，卤素，CN，NO2，和C1-C3烷基，或C1-C3烷氧基；
R5是H或C1-C3烷基；
Q是O，S，NR6，或CR7R8；
R6选自下组：CN，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，或SO2CF3；
R7和R8是选自下组的独立取代基：H，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，NO2，或CN，或CO2R9；
R9是C1-C3烷基；
或者，CR7R8形成如下结构的6元环：
W是O或化学键。
另外，更优选的化合物是那些式I化合物，或其药学上可接受的盐：
式中：
A，B和D是N或CH，条件是A，B和D不能都是CH；
R1＝R2并选自下组：C1-C3烷基，取代的C1-C3烷基，或通过稠合R1和R2形成3-6元螺环所构成的螺环烷基；
R3是H，OH，NH2，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，或CORC；
RC是H，C1-C4烷基，或C1-C4烷氧基；
R4是如下所示含取代基X和Y的二取代苯环：
X选自下组：卤素，CN，C1-C3烷氧基，C1-C3烷基，NO2，C1-C3全氟烷基，含1-3个杂原子的5元杂环，或C1-C3硫代烷氧基；
Y是在4’或5’位上的选自下组的取代基：H，卤素，CN，NO2，C1-C3烷氧基，C1-C4烷基，或C1-C3硫代烷氧基；
或者
R4是具有如下结构的5元环：
U是O，S，或NR5；
R5是H，或C1-C3烷基，或C1-C4 CO2烷基；
X’选自：卤素，CN，NO2，C1-C3烷基，或C1-C3烷氧基；
Y’选自：H和C1-C4烷基；
或者
R4是具有如下结构的6元环：
X1是N或CX2；
X2是卤素，CN或NO2；
Q是O，S，NR6，或CR7R8；
R6选自：CN，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，或SO2CF3；
R7和R8是选自下组的独立取代基：H，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，NO2，CN，或CO2R9；
R9是C1-C3烷基；
或CR7R8形成如下结构的6元环：
更优选的化合物包括那些式I化合物，或其药学上可接受的盐：
式中，
A，B和D是N或CH，条件是A，B和D不能都是CH；
R1＝R2并选自：CH3和通过稠合R1和R2形成6元螺环所构成的螺环烷基；
R3是H，OH，NH2，CH3，取代的甲基，或CORC；
RC是H，C1-C3烷基，或C1-C4烷氧基；
R4是如下所示含取代基X和Y的二取代苯环：
X是卤素，CN，甲氧基，NO2，或2-噻唑；
Y是在4’或5’位且选自下组的取代基：H和F；
或者
R4是具有如下结构的5元环：
U是O，S，或NH；
X’是卤素，CN，或NO2；
Y’是H或C1-C4烷基；
Q是O，S，NR6，或CR7R8；
R6是CN，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，或SO2CF3；
R7和R8是选自下组的独立取代基：H，C1-C6烷基，取代的C1-C6烷基，C3-C8环烷基，取代的C3-C8环烷基，芳基，取代的芳基，杂环，取代的杂环，NO2，或CNCO2R9；
R9是C1-C3烷基；
或CR7R8形成如下结构的6元环：
W是O或化学键。
上述每一类和亚类化合物，以及利用它们的治疗方法和药物组合物，可进一步分为2个小类，一个是Q是氧，而另一个是Q是硫或NR6或CR7R8。
本发明的化合物可含有不对称碳原子，且本发明的一些化合物可含有一个或多个不对称中心，并因此可以有光学异构体和非对映体。虽然式I并未以立体化学显示，但本发明包括这些光学异构体和非对映体；以及消旋的和拆解的对映体纯R和S的立体异构体；以及R和S立体异构体的其他混合物和它们药学上可接受的盐。
本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-8个碳原子(较佳地1-6个碳原子)的脂族烃类基团；“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-8个碳原子(较佳地2-6个碳原子)的直链和支链烃基；“炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-8个碳原子(较佳地2-6个碳原子)的直链和支链烃基。
术语“取代的烷基”、“取代的链烯基”和“取代的炔基”指被一个或多个选自下组的取代基所取代的上述烷基、链烯基和炔基：卤素、CN、OH、NO2、氨基、芳基、杂环、取代的芳基、取代的杂环、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基、烷基羰基、烷基羧基、烷基氨基、芳硫基。这些取代基可连接于烷基、链烯基或炔基基团的任何碳原子上，但条件是这种连接构成稳定的化学结构部分。
本文的术语“芳基”指芳族体系，可以是单环或原本稠合的或连接在一起的多芳环，从而使至少一部分稠合或连接的环形成共轭的芳系。芳基基团包括(但不限制于)：苯基、萘基、联苯基、蒽基、四氢萘基、菲基。
术语“取代的芳基”指被1-4个选自下组的基团所取代的上述芳基：卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基、烷基羰基、烷基羧基、烷基氨基或芳硫基。
本文所用的术语“杂环”指稳定的4-7元单环或稳定的多环杂环，该杂环可以是饱和的、部分不饱和的或不饱和的，且由碳原子和选自以下的1-4个杂原子构成：N、O和S原子。N和S原子可以被氧化。杂环还可包括任何多环，其中任一上述杂环可稠合于芳环。该杂环还可连接于任何杂原子或碳原子，但条件是所生成的结构必须是化学稳定的。这些杂环基团包括：例如，四氢呋喃、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌啶基、吖庚因基、吡咯烷基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、异噁唑基、吗啉基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜和异喹啉基。
本文所用的术语“取代的杂环”指被以下1-4个取代基所取代的上述杂环：卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、取代的烷基、环烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基、烷基羰基、烷基羧基、烷基氨基、或芳硫基。本文所用的术语“烷氧基”指OR基团，其中R是烷基或取代的烷基。本文所用的术语“芳氧基”指OR基团，其中R是芳基或取代的芳基。本文所用的术语“烷基羰基”指RCO基团，其中R是烷基或取代的烷基。本文所用的术语“烷基羧基”指COOR基团，其中R是烷基或取代的烷基。术语“氨烷基”指仲胺或叔胺，其中含有1-8个碳原子的烷基或取代的烷基可以是相同或不同的，且连接点是在氮原子上。“卤素”指Cl、Br、F或I。
本发明的化合物可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。
本发明还包括药物组合物以及治疗方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的一种或多种作为黄体酮受体拮抗剂的上述化合物，其中Q是氧。本发明还提供了类似的方法和组合物，它们采用本文的一种或多种化合物作为黄体酮受体的促效剂，其中Q是S、NR6或NR7R8。
单用或联用本发明的黄体酮受体拮抗剂，可用于避孕和治疗和/或预防良性和恶性肿瘤的方法。本发明的化合物和药物组合物的具体用途包括：治疗和/或预防子宫肌层纤维瘤、子宫内膜异位、良性前列腺肥大；子宫粘膜、卵巢、乳腺、结肠、前列腺、垂体腺的癌和腺癌，脑膜瘤和其他激素依赖性肿瘤。本发明黄体酮受体拮抗剂的其他用途包括：家畜发情的同步化。
单用或联用本发明的黄体酮受体促效剂，可用于避孕和治疗和/或预防功能失调性出血、子宫平滑肌瘤、子宫内膜异位；多囊性卵巢综合症，子宫粘膜、卵巢、乳腺、结肠、前列腺的癌和腺癌。本发明黄体酮受体促效剂的其他用途包括：促进摄食。
当化合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约25-90％，通常约为5％-60％(重量)的活性成分。
所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.5-500mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为1-100mg，较佳地约为2-80mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
这些活性化合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下途径给药。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。化合物的口服给药是优选的。
这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物生长。
适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
本发明的化合物可用下列所示流程进行制备：
如流程I所示，通常可通过利用合适的偶联反应作为最后步骤来制备本发明的化合物。在惰性气氛如氩气或氮气中，在-78至室温下，适当取代的邻-氨基酸或其衍生物，如乙酯(X＝Br，I，Cl，或潜在的偶联前体，如烷氧基，它能转化为偶联反应中合适的OTf基团)，用合适的有机金属试剂(如Grignard试剂)，在合适的非质子性溶剂(nonprotic solvents)(包括但并不限于THF或乙醚)中进行处理，形成邻-氨基甲醇2。使甲醇2闭环以形成噁嗪-2-酮3通常是用缩合剂如羰二咪唑、光气、碳酸二甲酯或碳酸二乙酯，在合适的非质子性溶剂(如THF)，在室温至65℃下实现。用各种偶联反应(包括Suzuki反应和Stille反应等)，可实现噁嗪-2-酮3的芳基化，从而形成化合物4。这些反应通常在过渡金属催化剂存在下进行，例如，通常与膦配基(如Ph3P，1，1’-双(二苯膦基)二茂铁，1，2-双(二苯膦基)乙烷)形成的钯和镍复合物，或诸如乙酸钯之类的钯盐。在这种催化条件下，适当取代的亲核试剂(如芳基硼酸、芳基锡烷或芳基锌化合物)与噁嗪酮3偶联，生成化合物4。如果反应中需要碱，通常使用的碱包括(但不限制于)：碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸钾、碳酸钡、乙酸钾或氟化铯。在这些反应中最常用的溶剂包括：苯、DMF、异丙醇、乙醇、DME、乙醚、丙酮或任一上述溶剂与水的混合物。通常在惰性气氛(如氮气或氩气)中，在从室温到95℃的温度下，进行偶联反应。噁嗪酮3可被转变成亲核试剂如芳硼酸(boronic acid)，后者与合适的亲电试剂(如芳基溴或芳基碘)采用上述的偶联反应条件偶联可得到6。
在-78℃至室温，在惰性气氛(如氩气或氮气)下，通过在非质子性溶剂(如THF或乙醚)中用有机金属试剂(如正丁基锂)处理3，然后用合适的亲电试剂(如硼酸三甲酯、硼酸三异丙酯、双六烷基锡(bishexalkyl tin)试剂或氯化锌)淬灭反应溶液，可将3转变为5。在惰性气氛(如氩气或氮气)下，在溶剂沸点温度下，通过用在合适非质子性溶剂(如甲苯、氯苯、苯或二甲苯)中的合适硫试剂如P2S5或Lawesson试剂处理6，可以轻易地将氨基甲酸酯6转变为硫代氨基甲酸酯7。
流程II描述了在4位具有两个不同取代基的噁嗪酮的制备程序。当在质子性溶剂(如乙醇或异丙醇)中，在惰性气氛(如氩气或氮气)和回流温度下，用N-，O-二甲基羟基胺盐酸盐处理时，可从合适取代的N-羧氨基苯甲酸酐制得Weinreb酰胺9。将酰胺9与芳基亲电子试剂如芳基硼酸或芳基锡烷偶联以形成10，可以通过采用典型的偶联反应(如Suzuki，Stille偶联程序)，按与制备噁嗪酮4中所述的类似方式进行。在惰性气氛(如氩气或氮气)下，在-78℃到室温的温度范围，用有机金属化合物(如烷基锂、炔基锂、芳基锂，或它们的Grignard对应物)，在非质子性溶剂(如THF或乙醚)中处理Weinreb酰胺10，生成氨基酮11。在惰性气氛(如氩气或氮气)下，-78℃至室温的温度范围，在非质子性溶剂(如THF或乙醚)中，用有机金属试剂(如烷基、炔基或芳基Grignard化合物)处理10，可将酮11转化成甲醇12。也可在惰性气氛下，0℃至溶剂沸点的温度范围，在合适的溶剂(如THF、乙醚或无水乙醇)中，用适当的还原剂(如氢化铝锂、硼氢化钠)将11的酮基团还原成12的甲醇部分，从而将酮11转化成甲醇12。可用缩合剂如羰二咪唑、光气、碳酸二甲酯或碳酸二乙酯，在合适的非质子性溶剂(如THF)，在室温至65℃下，使甲醇12闭环以形成本发明化合物13。在惰性气氛(如氩气或氮气)下，在溶剂沸点温度下，通过用在合适非质子性溶剂(如甲苯、氯苯、苯或二甲苯)中的合适硫试剂如P2S5或Lawesson试剂处理13，可以轻易地将氨基甲酸酯13转变为硫代氨基甲酸酯14。
流程II
或者，如流程III所示，还可在惰性气氛(如氩气或氮气)下，-78℃至室温的温度范围，在合适溶剂(THF或乙醚)中，用有机金属化合物(如有机锂试剂或Gringard试剂)处理邻-氨基腈16，从而制得邻氨基酮11。按与制备Weinreb酰胺10相似的方式，用合适的偶联反应(如Stille或Suzuki流程)，从适当取代的腈(如溴代苄腈15)可轻易制得腈16。
流程III
下列不起限定作用的实施例阐述了本发明化合物的制备。
实施例1
2-氨基-5-溴-3-吡啶羧酸
在氮气和室温下，向2-氨基-烟酸(10g，72.5mmol)的乙酸(70mL)溶液滴加溴(9.8mL，79.8mmol)。反应结束后，真空去除溶剂，残留物与乙醚一起研磨，过滤收集，得到2-氨基-5-溴-3-吡啶羧酸为黄色固体(15.7g，99％)：mp 272℃，(分解的)；1H-NMR(DMSO-d6)δ8.8-7.8(bs，2H)，8.44(d，1H，J＝2.48Hz)，8.34(d，1H，J＝2.48Hz)；MS(EI)m/z 216/218([M+]+，100％)
实施例2
2-(2-氨基-5-溴-吡啶-3-基)-丙-2-醇
在氮气下，于0℃，向2-氨基-5-溴-3-吡啶羧酸(5g，23mmol)的THF(70mL)溶液，加入溴化甲基镁(13.7g，115mmol)。加入后，在65℃加热反应混合物12小时，冷却至室温，用饱和氯化铵水溶液淬灭。加入乙酸乙酯，分离有机层，用硫酸钠干燥并浓缩，残留物通过快速色谱法纯化，得到2-(2-氨基-5-溴-吡啶-3-基)-丙-2-醇为黄色固体(1.2g，23％)：mp 107-108℃；1H-NMR(DMSO-d6)δ7.89(d，1H，J＝2.3Hz)，7.40(d，1H，J＝2.3Hz)，6.28(bs，2H)，5.51(s，1H)，1.4(s，6H)；MS(APCI)m/z 231([M+H]+，100％)。
实施例3
6-溴-4，4’-二甲基-1，4-二氢-3-氧杂-1，8-二氮杂-萘-2-酮
将2-(2-氨基-5-溴-吡啶-3-基)-丙-2-醇(0.86g，3.7mmol)和1，1’-羰基二咪唑(过量)在THF(10mL)中的混合物，在35℃加热过夜。将反应溶液冷却至室温，倒入乙酸乙酯(200mL)，用1N HCl(2×50mL)洗涤，用硫酸钠干燥，并浓缩。残留物通过快速色谱法(硅胶，25％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到6-溴-4，4’-二甲基-1，4-二氢-3-氧杂-1，8-二氮杂-萘-2-酮(0.9g，94％)，为白色固体：mp 251-252℃；1H-NMR(DMSO-d6)δ10.9(s，1H)，8.32(d，1H，J＝2.19Hz)，8.0(d，1H，J＝2.22Hz)，1.6(s，6H)；MS(EI)m/z 256([M]+，80％)；C9H9BrN2O2的分析值：C，42.05，H，3.53，N，10.90.实测值：C，42.15，H，3.65，N，10.80。
实施例4
6-(3-氯-苯基)-4，4-二甲基-1，4-二氢-3-氧杂-1，8-二氮杂-萘-2-酮
将6-溴-4，4’-二甲基-1，4-二氢-3-氧杂-1，8-二氮杂-萘-2-酮(0.1g，0.39mmol)，3-氯苯基硼酸(0.075g，0.47mmol)，四(三苯基膦)合钯(O)(0.023g，0.02mmol)，和碳酸钠(0.1g，0.94mmol)在DME(8mL)和水(5mL)中的混合物，在氮气覆盖层下，于50℃放置15分钟，然后在85℃加热30分钟。反应冷却至室温，加入乙酸乙酯(100mL)。有机层用氯化铵溶液(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩。将产物溶解在二氯甲烷，然后通过酸式硅酸镁(magnesol)塞。除去溶剂，将获得的透明油与乙醚(25mL)一起研磨，得到6-(3-氯-苯基)-4，4-二甲基-1，4-二氢-3-氧杂-1，8-二氮杂-萘-2-酮，为白色固体(0.087g，80％)：mp 214-215℃；1H-NMR(DMSO-d6)δ10.9(s，1H)，8.56(d，1H，J＝2.35Hz)，8.06(d，1H，J＝2.35Hz)，7.86(t，1H，J＝2.35Hz)，7.72(td，1H，J＝9.4，2.35Hz)，7.54-7.44(m，2H)，1.69(s，6H)；MS(ESI)m/z 289([M+H]+，100％)；C17H17NO3的分析值：C，62.40，H，4.54，N，9.70.实测值：C，60.53，H，4.40，N，9.21。
实施例5
6-氯-3-硝基-吡啶-2-甲腈
将2，6-二氯-3-硝基吡啶和氰化亚铜在1-甲基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)中的混合物快速加热至180℃，并在该温度下强力搅拌维持15分钟。将混合物冷却至-10℃，将深棕色溶液倒入冰水(3.5L)，搅拌30分钟。收集绒毛状的棕色沉淀物，用水洗涤。干燥1.5小时后，用沸腾的甲苯(3×300mL)萃取潮湿的固体。合并的甲苯提取物用水和盐水洗涤，并干燥(MgSO4)，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/己烷结晶，得到标题化合物：mp 115-117℃；1H NMR(DMSO-d6)δ8.16(dd，1H，J＝8.7，3.0Hz)，8.82(d，1H，J＝9.0Hz)；MS(EI)m/z183/185(M+H)+；C6H2ClN3O2的分析值：C，39.26，H，1.10，N，22.89.实测值：C，39.47，H，1.38，N，22.77。
实施例6
3-氨基-6-氯-吡啶-2-甲腈
向2，6-二氯-3-硝基吡啶(4.8g，26.15mmol)在甲醇(60mL)和浓盐酸(25mL)中的溶液，缓慢加入铁粉(5.12g，91.53mmol)。添加结束后，混合物回流45分钟，然后倒入700mL H2O。对形成的浆料进行过滤，得到暗黄色固体。用浓氨水使滤液成为碱性，过滤形成的浆料，用乙醚萃取固体和滤液。合并的萃取物被干燥(MgSO4)并蒸发，得到标题化合物，为奶油色固体(2.8g，58％)：熔点162-165℃，它不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
实施例7
1-(3-氨基-6-氯-吡啶-2-基)-乙酮
在氮气下，向3-氨基-6-氯-吡啶-2-甲腈(0.75g，4.88mmol)的无水THF(25mL)溶液中加入溴化甲基镁(3M乙醚溶液，8.1mL，24.3mmol)。搅拌反应混合物30分钟，然后用水缓慢地淬灭，用5N HCl溶液进行处理。混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，有机萃取物用盐水洗涤，并干燥(MgSO4)。在去除溶剂后，残留物通过色谱法进行纯化，其中用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3)作为洗脱液，得到标题化合物，为绿色结晶固体：(0.71g，85％)：mp：108-110℃.1H NMR(DMSO-d6)δ2.51(s，3H)，7.28-7.39(m，4H)；MS(ESI)m/z 171/173(M+H)+；C7H7ClN2O的分析值：C，49.28，H，4.14，N，16.14.实测值：C，49.70，H，4.03，N，16.41。
实施例8
1-(3-氨基-6-氯-吡啶-2-基)-丙-2-醇
在氮气下，向1-(3-氨基-6-氯-吡啶-2-基)-乙酮的无水THF溶液中，加入溴化甲基镁溶液(3N乙醚溶液)。形成的反应混合物在室温下搅拌4小时，用水缓慢地淬灭，用0.5N HCl处理，然后搅拌30分钟，用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩并层析(使用乙酸乙酯/己烷(3.5∶6.5)混合物)，得到标题化合物，为白色晶体(0.45g，82％)：mp：118-121℃.1HNMR(DMSO-d6)δ1.45(s，6H)，3.35(s，1H)，5.51(s，1H)，5.68(s，1H)，7.02(s，1H)；MS((+)APCI)m/z187/189(M+H)+；C8H11ClN2O的分析值：C，51.48，H，5.94，N，15.01.实测值：C，51.22，H，5.99，N，14.47。
实施例9
6-氯-4，4-二甲基-1，4-二氢-3-氧杂-1，5-二氮杂-萘-2-酮
向1-(3-氨基-6-氯-3-硝基-吡啶-2-基)-丙-2-醇(0.3g，1.67mmol)的无水THF(20mL)溶液中，加入1，1’-羰基二咪唑(0.68g，4.12mmol)的无水THF(10mL)溶液。回流加热反应混合物3小时。用0.5N HCl处理，用盐水和水洗涤，干燥(MgSO4)，浓缩和用乙酸乙酯/己烷结晶，获得标题化合物，为白色晶状固体(0.2g，56％)：mp 175-178℃.1H NMR(DMSO-d6)δ1.60(s，6H)，7.30(d，1H，J＝8.41Hz)，7.41(d，1H，J＝8.41Hz)，10.47(s，1H)；MS((+)APCI)m/z 213(M+H)+；C9H9ClN2O2的分析值：C，50.84，H，4.27，N，13.17.实测值：C，50.99，H，4.28，N，12.98。
实施例10
将本发明的化合物用如下所述的相关试验进行测试，在体外试验中它们的效力范围为0.01nM到5μM，在体内试验中为0.001-300mg/kg。选定的例子是实施例4。
实施例4，hPR CV-1，IC50＝0.8μM
A.体外生物学
通过以下方法测定体外生物学：(1)竞争性放射性配体结合：用带有黄体酮作为放射性配体的A型人黄体酮受体；(2)共转染试验，可提供以促效剂EC50和拮抗剂IC50值表达的功能性活力；(3)T47D细胞增殖，这是提供促效剂和拮抗剂数据的另一种功能性试验；和(4)T47D细胞碱性磷酸酯酶试验，这也是一种提供促效剂和拮抗剂数据的功能性试验。
1.hPR结合试验：参考Pathirana，C.；Stein，R.B.；Berger，T.S.；Fenical，W.；Ianiro，T.；Mais，D.E.；Torres，A.；Glodman，M.E.，“来自海藻cymoplia barbata的非甾类人黄体酮受体调制剂”，J.SteroidBiochem.Mol.Biol.，1992，41，733-738进行。
2.CV-1细胞中的PRE-荧光素酶试验
本试验的目的是基于化合物在用人PR和PRE-荧光素酶质粒共转染的CV-1细胞中对PRE-荧光素酶报道分子活性的影响，确定化合物的促孕或抗孕效果。本试验中所用的材料如下：
a.培养基：生长培养基如下：含有10％(v/v)胎牛血清(热失活)、0.1mM MEM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mM GlutaMax(GIBCO，BRL)的DMEM(BioWhittaker)。试验培养基如下：含有10％(v/v)活性碳解吸的胎牛血清(热灭活)、0.1mM MEM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mM GlutaMax(GIBCO，BRL)的无酚红DMEM(BioWhittaker)。
b.细胞的培养、转染、处理和荧光素酶试验
将CV-1细胞原液维持在生长培养基中。用1.2×107个细胞、5mg pLEM质粒(在Sph1和BamH1位点插入hPR-B)、10mgpGL3质粒(在荧光素酶序列上游有两个PRE)，和50mg超声处理过的小牛胸腺DNA作为载体DNA(250ml)，进行共转染。
用Biorad Gene Pulser II在260V和1,000mF进行电穿孔。电穿孔后，将细胞重悬浮于生长培养基，并在96孔板上以40,000个细胞/孔(200μl)接种。培养过夜后，将培养基换成试验培养基。然后在试验培养基中用对照或测试化合物处理这些细胞。在3nM黄体酮时测定化合物的避孕活性。处理24小时后，弃去培养基，用D-PBS(GIBCO，BRL)洗涤这些细胞3次。各孔加入50μl细胞裂解缓冲液(Promega，Madison，WI)，平板在滴定平板振荡器(Lab Line Instrument，Inc)上振荡15分钟。用Promega的荧光素酶试剂测定荧光素酶的活性。
c.结果分析
各种处理重复至少4次。用对数换算的数据分析匹配于促效剂和拮抗剂模式的方差和非线性剂量应答曲线。用Huber加权法降低非正常值(outlier)的影响。用重新换算的数值计算EC50或IC50。在方差和非线性应答分析的两个单向分析中，使用JMP软件(SAS Institute，Inc.)。
d.对照化合物
黄体酮和曲美孕酮(trimegestone)作为对照孕激素，RU486作为对照抗孕激素。所有对照化合物都在全剂量应答曲线中进行试验，并计算EC50或IC50值。表1.三个独立研究中对照孕激素的预计EC50、标准偏差(SE)和95％置信区间(CI)
EC50 95％CI
化合物 实验 (nM) SE 下限 上限
黄体酮 1 0.616 0.026 0.509 0.746
2 0.402 0.019 0.323 0.501
3 0.486 0.028 0.371 0.637
曲美孕酮 1 0.0075 0.0002 0.0066 0.0085
2 0.0081 0.0003 0.0070 0.0094
3 0.0067 0.0003 0.0055 0.0082表2.三个独立研究中抗孕激素RU486的预计IC50、标准偏差(SE)和95％置信区间(CI)
IC50 95％CI
化合物 实验 (nM) SE 下限 上限
RU486 1 0.028 0.002 0.019 0.042
2 0.037 0.002 0.029 0.048
3 0.019 0.001 0.013 0.027
促孕活性：与对照载体相比，使PRE-荧光素酶活性显著增加(p＜0.05)的化合物认为是有活性的。
抗孕活性：显著降低3nM黄体酮诱导的PRE-荧光素酶的活性(p＜0.05)的化合物。
EC50：能增加PRE-荧光素酶活性最大值一半时，化合物的浓度(默认为“nM”)及标准偏差。
IC50：能降低3nM黄体酮诱导的PRE-荧光素酶活性最大值一半时，化合物的浓度(默认为“nM”)及标准偏差。
3.T47D细胞的增殖实验
本实验的目的是用T47D细胞的细胞增殖实验来测定促孕和抗孕的效力。测定化合物对T47D细胞中DNA合成的作用。以下为本实验所用的材料和方法：
a.生长培养基：补充有10％(v/v)胎牛血清(未加热失活)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2mM GlutaMax(GIBCO，BRL)的DEME∶F12(1∶1)(GIBCO，BRL)。
b.处理培养基：补充有0.5％活性碳解吸的胎牛血清、100U/ml青霉素、200mg/ml链霉素和2mM GlutaMax(GIBCO，BRL)的无酚红的极限必需培养基(MEM)(#51200-038 GIBCO，BRL)。
c.细胞培养
将T47D细胞原液维持在生长培养基中。对BrdU掺入实验而言，将细胞以10,000个细胞/孔的量(在生长培养基中)将细胞置于96孔板(Falcon，BectonDickinson Labware)中。培养过夜后，将培养基换成处理培养基，在处理前再培养这些细胞24小时。将化合物原液溶解于适当的载体(100％乙醇或50％乙醇/50％DMSO)中，然后用处理培养基稀释，加给细胞。孕激素和抗孕激素对照化合物均以全剂量-响应曲线方式进行试验。载体的终浓度为0.1％。在对照孔中，细胞仅接受载体。在0.03nM曲美孕酮(对照孕激素促效剂)存在下测定抗孕激素。处理24小时后，弃去培养基，用10mM BrdU(Amersham Life Science，ArlingtonHeights，IL)在处理培养基中标记细胞4小时。
d.细胞增殖实验
当BrdU标记结束时，弃去培养基，按供应商的说明，用细胞增殖ELISA试剂盒(#RPN 250，Amersham Life Science)测定BrdU的掺入。简而言之，将细胞在含有固定剂的乙醇中固定30分钟，然后在封阻缓冲液中培养30分钟以降低背景。将过氧化物酶标记的抗BrdU抗体加到孔中，培养60分钟。用PBS漂洗细胞3次，用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物培养10-20分钟(取决于所测试的化合物的效力)。然后在各孔中加入25μl 1M硫酸以终止显色反应，5分钟内在450nm处用平板读数仪读取光密度。
e.结果分析
用平方根换算的数据，分析匹配于促效剂和拮抗剂模式的方差和非线性剂量应答曲线。用Huber加权法降低非正常值的影响。由重新换算的数值计算EC50或IC50。在方差和非线性剂量应答分析的单剂量和剂量应答分析中，使用JMP软件(SAS Institute，Inc.)。
f.对照化合物
曲美孕酮和甲羟孕酮醋酸酯(MPA)作为对照孕激素，RU486作为对照抗孕激素。所有对照化合物以全剂量应答曲线方式进行试验，并计算EC50或IC50值。
表3.各研究中的预计EC50、标准偏差(SE)和95％置信区间(CI)
EC50 95％CI
化合物 实验 (nM) SE 下限 上限
曲美孕酮 1 0.017 0.003 0.007 0.040
2 0.014 0.001 0.011 0.017
3 0.019 0.001 0.016 0.024
MPA 1 0.019 0.001 0.013 0.027
2 0.017 0.001 0.011 0.024
表4.抗孕激素RU486的预计IC50、标准偏差(SE)和95％置信区间(CI)
IC50 95％CI
化合物 实验 (nM) SE 下限 上限
RU486 1 0.011 0.001 0.008 0.014
2 0.016 0.001 0.014 0.020
3 0.018 0.001 0.014 0.022
EC50：能增加BrdU掺入量最大值一半时化合物的浓度和标准偏差；
IC50：能使0.1曲美孕酮诱导的BrdU掺入量减少最大值一半时化合物的浓度和标准偏差。
4.T47D细胞碱性磷酸酶实验
本实验的目的是通过测定化合物对T47D细胞中碱性磷酸酶酶活性的作用，来鉴定孕激素或抗孕激素。以下为本实验所用的材料和方法。
a.培养基：补充有5％(v/v)活性碳解吸的胎牛血清(未加热失活)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM GlutaMax(GIBCO，BRL)的DMEM∶F12(1∶1)(GIBCO，BRL)。
b.碱性磷酸酶实验缓冲液：
I.0.1M Tris-HCl，pH 9.8，含有0.2％Triton X-100
II.0.1M Tris-HCl，pH 9.8，含有4mM磷酸对-硝基苯酯(Sigma)
c.细胞培养和处理：
将冷冻的T47D细胞在37℃水浴中解冻，并用培养基稀释至280,000个细胞/ml。在96孔板(Falcon，Becton Dickinson Labware)的各孔中加入180μl稀释的细胞悬浮液。然后在各孔中加入20μl以培养基稀释的对照或测试化合物。当测试孕激素拮抗剂活性时，在1nM黄体酮存在下加入对照抗孕激素或测试化合物。在37℃，5％CO2/湿润气氛中培养这些细胞24小时。
d.碱性磷酸酶酶实验
在处理结束时，弃去平板中的培养基，在各孔中加入50μl实验缓冲液I。将这些平板在滴定板振荡器上振荡15分钟。然后将150μl实验缓冲液II加到各孔中。在405nM测试波长，以5分钟为间隔测定光密度共30分钟。
e.结果分析：分析剂量应答数据
对参考和测试化合物，以剂量(X-轴)对酶反应的速度(斜率)(Y-轴)绘制剂量应答曲线。平方根换算的数据，用于分析匹配于促效剂和拮抗剂模式的方差和非线性剂量应答曲线。用Huber加权法降低非正常值的影响。由重新换算的数值计算EC50或IC50。在方差和非线性应答分析的单剂量和剂量应答分析中，使用JMP软件(SAS Institute，Inc.)。
f.对照化合物
黄体酮和曲美孕酮作为对照孕激素，RU486作为对照抗孕激素。所有对照化合物都以全剂量应答曲线方式进行试验，并计算EC50或IC50值。表5.三次独立实验中对照孕激素的预计EC50、标准偏差(SE)和95％置信区间(CI)
EC50 95％CI
化合物 实验 (nM) SE 下限 上限
黄体酮 1 0.839 0.030 0.706 0.996
2 0.639 0.006 0.611 0.669
3 1.286 0.029 1.158 1.429
曲美孕酮 1 0.084 0.002 0.076 0.091
2 0.076 0.001 0.072 0.080
3 0.160 0.004 0.141 0.181
表6.三次独立实验中对照抗孕激素RU486的预计IC50、
标准偏差(SE)和95％置信区间(CI)
IC50 95％CI化合物 实验 (nM) SE 下限 上限RU486 1 0.103 0.002 0.092 0.115
2 0.120 0.001 0.115 0.126
3 0.094 0.007 0.066 0.134
B.体内生物学
用大鼠蜕膜化模型进行最初的体内实验，它可用于测定促效剂和拮抗剂的促孕作用。二级体内实验是用大鼠排卵抑制模型，由于该模型尚还处于开发阶段因此未能获得详细报告。
1.大鼠蜕膜化实验：本流程的目的是评估孕激素和抗孕激素对大鼠子宫蜕膜化的作用，并对各种测试化合物的相对效力进行比较。以下为所用的材料和方法：
a.方法：将测试化合物溶解于100％乙醇中，并与玉米油(载体)混合。然后通过加热(～80℃)此混合物以蒸发掉乙醇，从而制备在油(MazolaTM)中的测试化合物原液。随后在处理动物之前，用100％玉米油或10％乙醇(在玉米油中)稀释测试化合物。当这两种载体相比较时，未发现蜕膜应答间的差异。
b.动物(RACUC流程#5002)
在手术后，从Taconic(Taconic Farms，NY)得到切除卵巢的成年雌性Sprague-Dawley大鼠(～60天龄和230g)。在处理前至少10天进行卵巢切除以降低循环系统中的性类固醇。将这些动物关养在12小时光亮/黑暗循环的房间内，并喂以标准大鼠饲料并任意给水。
c.处理
在处理前将大鼠称重并随机分组，每组4或5只。用含有测试化合物的0.2ml载体皮下注射大鼠的颈背，或以管饲法用0.5ml载体进行。每天处理这些动物1次，共7天。在测试抗孕激素时，在处理的前3天动物接受测试化合物和EC50剂量的黄体酮(5.6mg/kg)。在蜕膜刺激后，动物依旧接受黄体酮直至4天后解剖尸体。
d.剂量
按基于mg/kg平均组体重制备剂量。在所有研究中，包括仅接受载体的对照组。用半对数增加值确定剂量应答曲线(如0.1、0.3、1.0、3.0mg/kg...)。
e.蜕膜诱发
第三次注射后约24小时，通过用21G针刮擦反子宫膜(antimesometrial)腔内皮，从而在子宫的一个角诱发蜕膜。对角不进行刮擦从而作为未受刺激的对照。在最终处理约24小时后，通过CO2窒息处死大鼠，测量体重。取出子宫，清理掉脂肪。分别称重蜕膜(D-角)和对照(C-角)子宫角。
f.结果分析
由D-角/C-角计算蜕膜子宫角重量的增加，并用对数转换使方差的正态性和同质性最大化。用Huber M-估计量来降低剂量应答曲线拟合和方差单向分析中所观察到的非正常的转换值的影响。在单向ANOVA和非线性应答分析中，使用JMP软件(SAS Institute，Inc.)。
g.对照化合物
将所有孕激素对照化合物都以全剂量应答曲线方式进行试验，并计算对于子宫湿重的EC50值。
表7.各实验的预计EC50、标准偏差(SE)和95％置信区间(CI)
EC50 95％CI
化合物 实验 (mg/kg，s.c.) SE 下限 上限
黄体酮 1 5.50 0.77 4.21 7.20
2 6.21 1.12 4.41 8.76
3-酮去氧孕烯 1 0.11 0.02 0.07 0.16(3-Ketodesogestrel) 2 0.10 0.05 0.11 0.25
3 0.06 0.03 0.03 0.14
左炔诺孕酮 1 0.08 0.03 0.04 0.16
2 0.12 0.02 0.09 0.17
3 0.09 0.02 0.06 0.13
4 0.09 0.02 0.06 0.14
MPA 1 0.42 0.03 0.29 0.60
2 0.39 0.05 0.22 0.67
3 0.39 0.04 0.25 0.61
表8.三种对照化合物的剂量应答曲线中的预计平均IC50、
标准偏差和95％置信区间
EC50 95％CI
化合物 (mg/kg.s.c.) SE 下限 上限
黄体酮 5.62 0.62 4.55 7.00
3-酮去氧孕烯 0.10 0.02 0.07 0.14
左炔诺孕酮 0.10 0.01 0.08 0.12
表9.抗孕激素RU486的预计EC50、标准偏差和95％置信区间
IC50 95％CI
化合物 实验 (mg/kg，p.o.) SE 下限 上限
RU 486 1 0.21 0.07 0.05 0.96
2 0.14 0.02 0.08 0.27
浓度：实验中化合物的浓度(默认为：mg/kg体重)
给药路径：给予动物化合物的路径。
体重：动物的平均总体重(默认为：kg)。
D-角：蜕膜化子宫角的湿重(默认为：mg)。
C-角：对照子宫角的湿重(默认为：mg)。
蜕膜应答：[(D-C)/C]×100％
促孕活性：与对照载体相比，能显著(p＜0.05)诱发蜕膜作用的化合物被认为是有活性的。
抗孕活性：显著降低EC50黄体酮所诱发的蜕膜作用的化合物(p＜0.05)。
子宫重量的EC50：使蜕膜应答最大值增加一半时的化合物浓度(默认为mg/kg)。
子宫重量的IC50：使EC50黄体酮诱发的蜕膜应答最大值减小一半时的化合物浓度(默认为mg/kg)。
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