表达猪流感病毒血凝素基因的重组伪狂犬病毒及应用 技术领域：本发明利用基因重组技术，构建可以表达H3亚型猪流感病毒HA基因的重组伪狂犬病毒作为疫苗，用于预防伪狂犬病和猪流感。
背景技术：伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)主要引起猪严重的神经学症状、呼吸道疾病和生殖障碍。该病呈全球性分布，其基因缺失弱毒株Bartha-K61株已被广泛用于伪狂犬病的防制。PRV基因缺失弱毒疫苗是美国和欧共体正式批准使用的第一个基因工程活疫苗，是应用最为广泛而成功的基因工程标记疫苗。PRV基因组全长140kb，含有的多个非必需基因均可插入外源DNA片段。携带不同病原保护性基因的PRV可望发展成为可同时抵抗两种或更多种猪传染病的多价疫苗。猪流感(Swine influenza，SI)是猪的一种急性高度传染性的呼吸道疾病，呈世界性分布流行，其临床特征有发热、沉郁、厌食、咳嗽、喷嚏、流鼻涕和结膜炎等。发病率可高达100％，但致死率低，且康复迅速。猪感染流感后机体抵抗力变弱，与外界的天然屏障遭到破坏，容易继发其它病毒或细菌的感染加重病情，出现一些复合症状如肺炎，进而使致死率增加，危害加重。此外，猪流感是引起种猪生殖障碍和育肥猪增重减慢的主要病原之一，每年给全球养猪业都造成了巨大的经济损失。
发明内容：
本发明要解决的技术问题：本研究的目的是以PRV Bartha-k61株为亲本毒，缺失其TK基因的部分，并插入带有CMV启动子的SIV HA基因，构建表达HA基因地重组PRV载体疫苗。
解决该技术问题的技术方案：
表达猪流感病毒血凝素基因的重组伪狂犬病毒，将H3亚型猪流感病毒血凝素HA基因插入gE基因缺失的伪狂犬病毒基因组TK基因中构建的重组伪狂犬病毒活载体疫苗。
所述的表达猪流感病毒血凝素基因的重组伪狂犬病毒，所述的重组病毒缺失gE基因。
所述的表达猪流感病毒血凝素基因的重组伪狂犬病毒，含有H3亚型猪流感病毒血凝素基因(HA)，该基因含有1701个碱基，编码566个氨基酸。
所述的表达猪流感病毒血凝素基因的重组伪狂犬病毒，插入的猪流感病毒HA基因的上游有CMV早期启动子。
所述的表达猪流感病毒血凝素基因的重组伪狂犬病毒，外源基因插入置换了TK基因中376bp的AccI片段。
上述的表达猪流感病毒血凝素基因的重组伪狂犬病毒用于制作预防伪狂犬病和猪流感的活载体疫苗。
附图说明：
图1，含LacZ报告基因的重组质粒pBdTK-Uni结构图。
图2，重组质粒pLTK-Uni的结构示意图。
图3，含猪流感病毒血凝素即HA基因的重组转移载体质粒pLTK-HA结构图。
图4，第一代重组伪狂犬病病毒rPRV-HA在Vero细胞上形成的蓝色蚀斑。
图5，重组病毒rPRV-HA的PCR鉴定。
图6，重组病毒rPRV-HA感染细胞后表达产物的Western-blot检测。
本发明的具体实施方式：
实施例1：
具体内容包括：
1、病毒和质粒
PRV Bartha-K61株由哈尔滨兽医研究所开发研究室提供，用PK-15细胞增殖。猪流感病毒A/Swine/Inner mogolian/547/2001(H3N2)由中国农科院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室提供，在9-11日龄SPF鸡胚上增殖病毒。pCR-Uni为真核表达载体，含有人巨细胞病毒(CMV)极早期启动子、多克隆位点和牛生长激素(BGH)polyA信号。
2、转移载体pBdTK-Uni的构建
用KpnI充分消化PRV Bartha-K61株基因组DNA，回收其J片段(约5.9kb)，将其克隆于pUC119的KpnI位点。分别用KpnI、PstI和BamHI进行单酶切和双酶切分析，绘制其J片段的物理图谱。经酶切分析证实，Bartha-K61株KpnI J片段反向插入pUC119，命名为pBTK5.9，经用PCR扩增证实，其中KpnI-PstI或KpnI-BamHI片段含有完整的TK基因，将此2.6kb的KpnI-PstI片段亚克隆于pUC119的KpnI/PstI位点，获得重组质粒pBTK2.6，用ABI PRISM377 DNA Seqencer测定插入片段的序列。通过序列分析发现，Bartha-K61株KpnI J片段KpnI-PstI片段约2.6kb，其中含有完整的UL24和UL23(即TK基因)编码序列以及UL25和UL22的部分编码序列，它们的相对位置和方向与其它α疱疹病毒相近。
用EcoRI消化pBTK2.6后，用Klenow大片段酶补平并自连，得到pBTKΔE，再分别用NotI和HindIII消化缺失384bp(其中含有PstI和NotI位点)，以Klenow大片段酶补平后自连得到pBTKΔEΔH/P。这样，质粒pBTK2.6上的EcoRI、PstI、NotI和HindIII位点相继消失。用引物PsUni/PRUni(PsUni：5′-TTT TGC CGA TTTCGG CCT ATT GGT T-3′；PRUni：5′-GGA TAA CCG TAT TAC CGCCAC TGG TT-3′)扩增真核表达质粒pCR3-Uni，获得1kb左右的片段，其中含有CMV极早期启动子、多克隆位点和BGH polyA信号。用Klenow大片段酶补平，得到Uni-CMB。用AccI消化pBTKΔEΔH/P以缺失376bp(该片段的缺失导致XhoI位点的消失)，回收大片段，用Klenow大片段酶补平，再用碱性磷酸酶脱磷酸，与Uni-CMB相连接，获得TK基因缺失的PRV转移载体，命名为pBdTK-Uni。转移载体的物理图谱见图1。
3、转移载体pLTK-Uni的构建
用限制性内切酶Tth111I消化转移载体pBdTK-Uni，用Klenow大片段酶补平后，用碱性磷酸酶CIAP将载体去磷酸化；同时用内切酶SalI消化质粒pBL，获得含有SV40启动子和LacZ基因的DNA片段，将此片段用Klenow片段补平后，用T4 DNA Polymerase削平突出的末端然后用T4PNK对LacZ基因片段进行磷酸化后与上述的载体按摩尔比为1∶3 T4 DNA连接酶连接后，经限制性内切酶消化鉴定，获得含有蓝白筛选报告基因的通用转移载体，命名为pLTK-Uni。该通用转移载体含有PstI、NotI、XhoI、XbaI等可用的克隆位点(图2)。
4、转移载体pLTK-HA的构建
根据已发表的H3N2亚型SIVHA基因序列设计一对引物(Upper：5`-ATGAAGACTATCATTGCTT TGAGCTA-3`；Lower：5`-ATTCTCTAAATGCAAATGTTGCACCT-3`)。提取SIV RNA作为模板，经RT-PCR扩增HA基因并测序(图3)。将HA PCR产物与pMD18-T载体连接后转化感受态细菌，所得克隆菌经碱裂解法小量提取质粒，限制性内切酶消化后电泳分析，鉴定的阳性重组质粒命名为pTHA。
重新设计合成一对HA基因引物，上游引入PstI位点，下游引入NotI位点。
其序列为：Upper：5`-ATGCGTCGACTAGTATGAAG-3`，Lower：5`-ATTCTCTAAATGCAAATT-3`。以pTHA为模板，PCR扩增HA基因，PstI/NotI双酶切PCR产物后与同样处理的载体pLTK-Uni混合后用T4 DNA连接酶连接，转化感受态细胞，挑取单个克隆菌，提取质粒后PstI/BglII双酶切鉴定HA基因的正确插入，获得含有完整HA基因的阳性重组转移载体，命名为pLTK-HA(图3)。
5、转移载体质粒pLTK-HA和PRV DNA的共转染
按LipofectamineTM PLUS试剂盒说明书进行转染，所用溶液均不含有抗生素和血清。具体操作如下：取转移载体质粒2μl(2-3μg)、PRV DNA 1μl(约为1μg)、10μl PLUS试剂加入97μl OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温静置15min，另取脂质体Lipofectamine 10μl加入90μl OPTI-MEM中，轻轻混匀后室温静置15min。之后，将两者混合，室温静置30-45min。然后，将上述转染用细胞弃去上清，加入800μl OPTI-MEM和上述的200μl质粒-PRV-PLUS-脂质体混合液，轻缓混匀后，置于37℃、5％CO2培养箱中培养5h，然后吸出转染液，加入含有10％胎牛血清、青、链霉素各100U/ml的DMEM营养液(pH7.0)，继续培养至细胞完全出现病变后，收获细胞及其上清反复冻融三次后，置-20℃保存作为筛选种毒备用。
6、重组病毒的筛选和纯化
用含有10％胎牛血清的DMEM营养液将转染收获的种毒以10-1、10-2、10-3……十倍梯度稀释后，按每孔150μl接种85-95％铺满的Vero、PK15或IB细胞的六孔板。于37℃、5％CO2培养箱中培养1h，期间每隔10min轻摇混匀一次避免细胞变干。然后每孔加入3ml含有10％胎牛血清、1％甲基纤维素(Methylcellulose)的DMEM营养液。37℃继续培养直至镜下观察形成明显的蚀斑。然后将覆盖液体吸出并用灭菌PBS(pH7.4)洗涤三次，加入含有250μg/ml X-gal、1％琼脂糖、10％牛血清的营养液，于5％CO2 37℃培养箱中培养12-36h后，观察出现的蓝色蚀斑，显微镜复检后，挑取蓝色蚀斑放入1ml无血清的DMEM中，冻融三次后按上述的方法进行蚀斑纯化直至所有出现的病毒蚀斑均为蓝色(图4)。
7、重组病毒的PCR鉴定
提取病毒DNA，经HA特异性引物PCR扩增得到约为1.7kb的条带(图5)，证明SIV HA基因已经重组到伪狂犬病病毒基因组中。
8、HA蛋白在重组伪狂犬病病毒中的表达
用猪流感病毒的特异性血清进行Western-blot分析，结果表明从重组病毒感染的细胞中检测到大小约为75ku的反应条带，证明HA蛋白获得了表达并具有抗原反应活性(图6)。
表达猪流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒的构建，可以直接进行疫苗的研发，而且为进一步构建多价载体疫苗奠定了重要的基础。例如：①在此基础上，可以进一步插入其它病毒的保护性抗原基因，如猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5蛋白基因，猪瘟病毒E2基因，乙型脑炎病毒NS1基因或猪细小病毒VP2基因等制备多价载体疫苗。②根据这些重组病毒的特点均可建立疫苗免疫和病毒自然感染动物的鉴别诊断方法。
流行于猪体中的流感病毒主要有H1N1、H3N2、H1N2三种亚型，一直以来，在我国猪群中分布流行的流感病毒是以H3N2亚型为主的。序列及进化研究表明这些H3N2流感病毒均来源于类人样流感病毒。因为猪的上皮细胞同时拥有人和禽流感病毒结合的特异性受体，猪也就可同时感染两种病毒而成为流感病毒传播过程中的中间宿主。此外，普遍认为猪是不同宿主流感病毒发生基因重排而产生新的流感毒株的“混合器”。正因为如此，对地区性SIV的持续分离、分型及分子演化分析是一个地区或国家监控流感的至关重要的环节。而对SIV的防制也是控制新的流感毒株出现的重要措施。接种疫苗是防制SIV的最佳措施，各种亚型的猪流感灭活疫苗在流感的控制中发挥了重要的作用。但是灭活疫苗存在有免疫效果不确切、传代过程中容易发生变异等缺点。
HA是流感的主要免疫原性蛋白，以三聚体的形式呈纤突样存在于病毒囊膜中，接种动物可以诱导产生中和抗体和细胞毒性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞反应。抗HA抗体通过竞争性抑制病毒与细胞表面的唾液酸受体的结合，阻断病毒囊膜与内吞体膜的融合过程，从而阻止病毒对细胞的感染。HA是研究流感病毒免疫的主要靶抗原，单一接种基于HA的疫苗可以提供动物抵抗同一亚型病毒攻击的良好的保护力，但是对不同亚型之间的交叉保护效果不是很好。
实施例2：
表达H3亚型猪流感病毒HA基因的重组伪狂犬病毒的构建：
伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)归属于α疱疹病毒亚科，主要引起猪的伪狂犬病(PR)，该病以仔猪的神经学症状和妊娠母猪的生殖障碍为主要特征。目前世界上包括我国在内广泛使用的预防此病的疫苗均带有gE基因缺失的表型特征。猪流感(SI)是由A型流感病毒引起的猪的呼吸道疾病或疾病综合征，临床以仔猪的严重呼吸道疾病、妊娠母猪的流产和部分成年猪的死亡为主要特征。此外，猪是禽和人流感病毒均可感染的唯一动物，是不同来源流感病毒发生重组，产生新的流感毒株的中间宿主。因此，通过免疫接种预防猪流感对食品安全和公共卫生具有重要意义。
1、本研究首先对SIV A/Swine/Inner mogolian/547/2001(H3N2)毒株(简写SWNM547)的HA基因进行了RT-PCR扩增与测序，结果表明HA基因包含完整的开放阅读框，全长1701bp，编码566个氨基酸残基。
2、克隆伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组中的KpnIJ片段，然后亚克隆其中的KpnI-PstI片段，缺失重组质粒中的EcoRI位点和NotI-HindIII片段；再用AccI切去378bp，在此缺失位置插入来源于pCR3-Uni的CMV启动子、多克隆位点和BGH polyA信号，构建了PRV转移载体pBdTK-Uni。在此基础上，进一步用Tth111I酶切后，补平插入带有SV40启动子的大肠杆菌β半乳糖苷酶报告基因(LacZ)，获得通用转移载体pLTK-Uni。然后定向亚克隆SIV HA基因于多克隆位点，获得重组转移载体pLTK-HA。
3、利用脂质体介导的方法，将pLTK-HA与PRV Bartha-k61基因组共转染于亚单层Vero细胞，依据报告基因LacZ在细胞中的表达，筛选蓝色蚀斑的重组病毒，经数次蚀斑纯化后，PCR鉴定、Western-blot分析。结果表明所获得的重组病毒(rPRV-HA)遗传性状稳定，在培养细胞中能稳定的表达与SIV HA具有相似生物学活性的外源蛋白。
4、此重组病毒为进一步制备抗猪流感和伪狂犬病的重组伪狂犬病毒活载体疫苗奠定了基础。
猪流感病毒A/Swine/Inner mogolian/547/2001(H3N2)株HA
基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列：
M K T I I A L S Y I L C L T F G Q D L P G N D N S T
1 ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGCTACATTCTCTGTCTGACTTTCGGACAGGACCTCCCAGGGAATGACAACAGTACA
A T L C L G H H A V P N G T I V K T I T D D Q I E V
79 GCAACACTGTGCCTGGGGCACCATGCAGTGCCGAATGGGACAATAGTGAAGACAATCACAGATGATCAGATTGAGGTG
T N A T E L V Q S S S T G K I C N N P H R I L D G R
157 ACTAATGCTACTGAGCTAGTTCAAAGCTCCTCAACAGGGAAAATATGCAACAATCCTCACAGGATCCTTGATGGAAGG
A C T L I D A L L G E P H C D V F Q N E T W D L F V
235 GCCTGCACATTAATAGATGCTCTACTGGGGGAACCTCATTGCGATGTCTTTCAAAATGAGACGTGGGACCTTTTTGTG
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313 GAGCGAAGCAATGCTTTCAGCAACTGTTACCCTTATGATATACCAGATTATGCATCCCTTAGGTCCCTAGTTGCCTCA
S G T L E F I T E G F T W T G V T Q N G G S S A C K
391 TCAGGCACATTGGAGTTCATCACTGAGGGTTTCACCTGGACAGGAGTAACTCAGAATGGAGGGAGCAGTGCTTGCAAA
R G P A N G F F S R L N W L T K S E S A Y P V L N V
469 AGAGGACCTGCTAACGGTTTCTTCAGTAGACTGAACTGGTTGACTAAATCAGAAAGCGCATACCCAGTGCTGAACGTG
T M P N N D N F D K L Y I W G V H H P S T N Q E Q T
547 ACTATGCCAAATAATGACAATTTTGACAAACTATACATCTGGGGAGTACACCACCCGAGCACAAATCAAGAACAAACC
N L Y V Q A S G R V T V S T R R S Q Q T I I P N I G
625 AACCTGTATGTTCAAGCATCAGGGAGAGTCACAGTCTCTACCAGGAGAAGTCAGCAGACTATAATCCCGAATATTGGA
S R P W V R G Q P G R I S I Y W T I V K P G D V L V
703 TCTAGACCCTGGGTAAGGGGCCAGCCTGGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTTAAACCTGGGGACGTGCTGGTA
I N S N G N L I A P R G Y F K M R T G K S S I M R S
781 ATCAACAGTAATGGAAACCTAATCGCTCCTCGGGGTTACTTCAAGATGCGCACTGGGAAAAGCTCAATAATGAGGTCA
D A P I D T C I S E C I T P N G S I P N D K P F Q N
859 GATGCACCTATTGACACCTGTATCTCTGAGTGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAGCCCTTCCAAAAT
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937 GTAAACAAGATCACATACGGAGCATGTCCCAAGTATGTTAAGCAGAACACCCTGAAGTTGGCAACAGGGATGCGGAAT
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1015 GTACCAGAGAAACAAACCAGAGGCCTATTCGGTGCAATAGCAGGTTTTATAGAAAATGGATGGGAGGGAATGATAGAT
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1093 GGCTGGTATGGCTTCAGGCATCAAAATTCTGAGGGTACAGGACAAGCAGCAGACCTTAAAAGCACTCAGGCAGCCATT
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1171 GACCAAATCAATAGGAAATTGAACAGAGTGATTGAAAAGACGAATGAGAAGTTCCATCAAATCGAAAAGGAATTCTCC
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1249 GAAGTAGAAGGGAGGATTCAGGACCTTGAGAAATACGTTGAAGACACGAAAATAGATCTCTGGTCTTACAATGCGGAA
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1405 AGGCAACTGAGGGAAAATGCTGAAGACATGGGCAATGGTTGTTTCAAGATATACCACAAATGTGACAATGCTTGCATA
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1483 GAGTCAATTAGAAACGGGACTTATGATCATGATATATACAGAGACGAGGCATTGAACAACCGGTTCCAGATCAAAGGT
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1561 GTCGAACTAAAATCTGGATACAAAGACTGGATCCTGTGGATTTCCTTTGCCATATCATGCCTTTTGCTTTGTGTTGTT
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1639 TTGCTGGGTTTCATTATGTGGGCCTGCCAGAGAGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGA