铁皮石斛芽簇及其制备工艺和用途 【技术领域】
本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种铁皮石斛及其制备工艺和用途。背景技术
石斛是常用名贵中药，具有养阴清热、生津止渴、明目强身等多种功效，应用历史非常悠久。作为一种名贵中药，石斛除配伍入药外，近年来国内外对石斛进行了大量深层次的开发，对石斛的需求量也越来越大。
但由于石斛属植物自然繁殖率很低，加上人们长期无节制的采挖，造成野生资源严重贫乏。因此，石斛的栽培对缓解资源紧张局面、保护生物的多样性、满足人民医疗保健需要及出口创汇等起着责无旁贷的作用。
目前，对于石斛人工培育技术的研究主要集中在利用野生石斛种子苗的不同部位组织进行愈伤组织诱导和原球茎的诱导，然后从愈伤组织、原球茎直接分化培养，获取再生苗。但是，这些技术还存在许多不足之处：
1)培育时间较长，获取能符合移栽要求的种子苗或组织培养苗分别需10个月至12个月左右的时间；
2)移栽苗的成活率较低，一般为50％左右；
3)生长周期较长，人工栽培的植株需生长3-4年左右，才能采集作为药材；
4)愈伤组织的活性成分及有效含量低。野生石斛均用植株作为药材来源，其植株属于分化型产物，愈伤组织则属于未分化型培养物，而对很多药用植物的成分测定均证明末分化型愈伤组织的活性成分及有效含量低。
所以，如何开发一种既能缩短石斛的生长周期，又能保持活性成分相对稳定的培养技术，一直是研究人员所努力的方向。发明内容
本发明的目的，在于提供一种铁皮石斛芽簇，它生长速度快，其有效成分的含量与野生型石斛相似，而且能够保持有效成分含量相对稳定。
本发明的另一个目的，在于提供一种生长快速的铁皮石斛芽簇的制备工艺，主要是利用细胞水平诱变和细胞全能性地原理，动摇和改变其生长缓慢的特性。
本发明的另一个目的，在于提供一种铁皮石斛芽簇用于制造食用无菌干粉的用途。
本发明提供的制备铁皮石斛牙簇的方法，是根据细胞全能性的原理，植株的每一个离体细胞可以在适宜的培养条件下生长发育成与母体完全一样的植株：以及细胞变异原理，即细胞愈伤组织在离体培养过程中会发生无性系变异，对离体培养的细胞或愈伤组织给予诱变处理，可以增加变异范围和提高变异频率。因此，我们首先对石斛细胞或愈伤组织进行诱变以及引发无性系变异。
取野生铁皮石斛或种子苗，用其茎尖，芽尖，根尖作为外植体(这些组织内细胞的全能性强)，经表面灭菌(70-80％乙醇或灭菌灵)15-20分钟，切成薄片，置于无菌诱导培养基内(2/3 MS、500mg/L CH、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、2-4％蔗糖、0.6％琼脂)，经50天左右的培养，获得大量愈伤组织。愈伤组织置入液体培养基(2/3 N6、500mg/MlCH、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、NAA、3-5％山梨糖)。在摇床上培养30-40天(120转/分)，形成悬浮细胞或细胞团。培养温度22-25℃。在无菌条件下将经灭菌的80mg/L平阳霉素(一种安全低毒诱变剂)与愈伤组织或细胞团共培养12-24小时左右。
用悬浮细胞或愈伤组织进行2-3次继代培养，继代培养基为2/3 N6、500mg/L的CH、2，4-D、NAA、KT、3-4％蔗糖、0.6％琼脂。每代培养35-45天，培养温度22-25℃。
将经过继代培养的细胞团或愈伤组织和修复培养基(2/3 MS、15％椰汁、3-5％山梨糖)中浅层培养10天左右的经诱变处理的细胞团或愈伤组织先置于分化培养基(2/3 MS、NAA、KT、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、2-3％蔗糖、0.6％琼脂)上培养，40天后从各种再生物中选择芽簇型再生物。芽簇置于增殖培养基(2/3 MS或N6、500mg/L的CH、KT、6-BA、NAA、2-3％蔗糖)上形成芽簇群。通过上述技术培养可以使变异细胞分化形成再生物(包括芽簇)，这类再生物中含有生长速率快且有效成分及含量与野生铁皮石斛相近的变异型芽簇。
选择增殖速度(鲜重增长量)快且健壮类型的芽簇群，取其一部分芽簇进行多糖和石斛生物碱等含量的测定。多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，用80％乙醇提取待测物中所含单糖、低聚糖及甙类等干扰性成份，再用水提取多糖类成份。多糖类在硫酸作用下，先水解成单糖分子并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物，以比色法测定多糖含量。因为石斛碱缺乏紫外吸收峰，所以生物碱含量的测定以石斛碱纯品为标准，采用溴甲酚绿法测定。经含量测定后从中选择多糖、生物碱、氨基酸和微量元素含量与野生石斛相近的芽簇群。这些有益变异可以通过无性繁殖途径保留和遗传下去。
由于变异细胞或变异体在发生主要变异时还会发生相连的或不相连的其他变异，以及分裂旺盛型细胞易对驯化条件产生适应性反应的特性，因此将优质芽簇群依次置于激素(如2，4-二氯苯氧乙酸)浓度从高到低再到零的驯化培养基上，25℃，每天12小时光照，每次培养40天左右。最后从无激素培养基(2/3 MS、500mg/L CH、3％蔗糖、0.6％琼脂)上选择生长速度快、有效成分含量高的芽簇群。
将驯化型(即适应无激素培养基)芽簇置于简单培养基(2/3 MS、2-3％蔗糖、0.6％琼脂)上，22-25℃培养，每天10-12小时光照(日光灯)，每月鲜重量增加1-2倍。按照上述方法，对每批芽簇均进行多糖含量和石斛生物碱含量测定，监测其有效成分及其含量的稳定性，保证其多糖含量和石斛生物碱含量与野生铁皮石斛相近。
经规模化生产获得的芽簇生长速率高，有效成分含量与原始芽簇相近，表明经多代(目前已达9代)培养后，芽簇的原有特性保持不变。
用本发明制备工艺生产的铁皮石斛牙簇可以用于制备无菌干粉。收集芽簇，去除培养基，用110℃干燥15分钟，然后80℃、24小时烘干，经测定其多糖和石斛碱含量与用冷冻干燥的方法制备的含量相接近。然后用钴60照射灭菌，最后获得铁皮石斛无菌干粉。
本发明的技术方案达到了如下的效果：
1、本发明的制备工艺获得的芽簇，经检验，其化学成分、有效成分含量及基本组织构造与野生铁皮石斛相近，并且保持良好的稳定性。
2、本发明的制备工艺有效地扩大了野生铁皮石斛替代物的来源；通过标准生产工艺，每月鲜重量增加1-2倍，3-4个月可成熟收割，而野生型石斛的生长周期为3-4年。随着生产规模扩大，还有望成倍提高。
3、此外，由于采用无激素、无菌培养工艺，生产的芽簇可按国际标准化生产工艺用于生产食用安全性好的无菌干粉，易于打入国际市场。附图说明
图1为铁皮石斛牙簇的制备流程图。具体实施方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明的技术特征。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
本发明下述实施例中所用的培养基中，
MS为一种培养基，其配方为(单位mg/L)：NH4NO3 1650、 KNO3 1900、 CaCL2.2H2O 440、MgSO4.7H2O 370、 KH2PO4 170、 KI 0.83、H3BO3 6.2、 MnSO4.4H2O 22.3、 ZnSO4.4H2O 8.6、Na2MoO4.2H2O 0.025、CuSO4.5H2O 0.025、 CoCL2.6H2O 0.025、Na2EDTA 37.3、 FeSO4.7H2O 27.8、 pH5.7。
N6为一种培养基，其配方为(单位mg/L)：KNO3 2830、 (NH4)2SO4 463、 CaCL2.2H2O 166、MgSO4.7H2O 185、 KHPO4 400、 FeSO4.7H2O 27.8、Na-EDTA 37.3、 MnSO4.4H2O 4.4、ZnSO4.7H2O 1.5、H3BO3 1.6、 pH5.8
实施例1 石斛细胞或愈伤组织的诱变及无性系变异
取野生石斛或种子苗，用其茎尖或根尖，经75％乙醇表面灭菌30秒，灭菌灵或漂白粉灭菌15分钟，无菌水洗净，置于诱导培养基(2/3 MS、水解酪蛋白(CH)500mg/L、NAA 1.0mg/L、IAA 0.1mg/L、KT 0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂)上培养45天以诱导形成愈伤组织。愈伤组织置入液体培养基(2/3 N6、CH 500mg/L、2，4-D 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、0.3％山梨糖)中，摇床(120rpm)培养35天，收集细胞团/小愈伤组织，加入80mg/L平阳霉素，培养24小时后，无菌水洗净后取出置入分化培养基(2/3 MS、NAA0.05mg/L、KT 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、2％蔗糖、0.6％琼脂)或将细胞团/愈伤组织置于继代培养基(2/3 N6、500mg/L CH、2，4-D 0.5mg/L、NAA0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂)上培养2-3代以诱发无性系变异，每代培养40天，然后取出置入分化培养基。诱导、分化及培养的温度均为22-25℃。
实施例2 石斛诱变细胞或愈伤组织的芽簇再生
将经诱变处理的细胞团或愈伤组织置于修复培养基(2/3 MS、15％椰汁、3％山梨糖)中于22-25℃浅层培养10天左右。然后置于分化培养基(2/3 MS、NAA 0.05mg/L、KT 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、2％蔗糖、0.6％琼脂)上22-25℃培养，待形成再生芽、再生苗等不同类型再生产物，40天后，从中选择芽簇。
实施例3 有效成分含量高和增殖速度快石斛芽簇的筛选
芽簇在增殖培养基上(2/3 N6、500mg/L CH、NAA 0.5mg/L、KT0.5mg/L、6-BA 0.5mg/L、2％蔗糖、0.6％琼脂)培养形成芽簇群。选择生长健壮、增长速度快的芽簇群，取其部分芽簇进行多糖含量测定(测定方法见《中草药》，1990，21(10)：10-12)，从中选择多糖含量高的芽簇。
选择多糖含量高的芽簇群再进行石斛生物碱测定(测定方法见《安徽农业大学学报》，1994，21(4)：503-506)从中选择生物碱含量高的芽簇群。
实施例4 石斛芽簇无激素培养的驯化
取优质石斛芽簇置于激素(2，4-二氯苯氧乙酸)含量较高的驯化培养基(2/3 MS、2，4-D 0.5mg/L、3％蔗糖、CH 500mg/L、0.6％琼脂)上培养40天，从中选取生长快的芽簇群；再置于激素含量较低的驯化培养基(2/3MS、2，4-D 0.05mg/L、3％蔗糖、CH 500mg/L、0.6％琼脂)上培养30天，从中选取生长快的芽簇群；最后置于无激素培养基(2/3 MS、3％蔗糖、CH500mg/L、0.6％琼脂)上培养30天，从中选取生长快且健壮的芽簇。以上培养温度均为22-25℃。
实施例5 石斛再生芽簇的稳定性实验
重复上述1-4的诱导再生过程，经5次重复，每次均筛选生长速率快且健壮的铁皮石斛芽簇，将每次筛选得到的芽簇进行有效成分的含量测定，结果如表1所示： 生长牙簇增殖速度 (鲜重增量倍/月) 多糖含量 生物碱含量芽簇1 2.0 20.23％ 230.31ug/g芽簇2 1.5 16.47％ 228.76ug/g芽簇3 1.7 15.73％ 228.57ug/g芽簇4 2.0 15.26％ 227.32ug/g芽簇5 1.6 14.68％ 225.41ug/g
而经检测，野生石斛的多糖含量约为19.15-20.30％，生物碱含量为225.45-230.58ug/g。
可见，本发明的铁皮石斛芽簇的诱导再生技术的重复性较好。
实施例6 石斛芽簇的工厂化培养
对无激素培养基上选择出的生长快、健壮型芽簇置于简单培养基(2/3MS、2％蔗糖、0.6％琼脂)上进行培养，每天用日光灯光照10-12小时，培养温度为20-25℃。
实施例7 铁皮石斛芽簇无菌干粉的制备
收集芽簇110℃干燥15分钟，然后于80℃、24小时的干燥处理或冷冻干燥箱中进行干燥处理。干燥型芽簇进行超细粉碎，干粉分装后用钴60照射灭菌(按照保健食品无菌指标)，获得无菌干粉。